На правах рукописи

Скрипникова Виктория Сергеевна

Активные в сверхмалых дозах

биорегуляторы тканей глаза

млекопитающих

03.00.23 биотехнология

03.00.04 биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва 2008

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Институте элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН и в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московском государственном текстильном университете им. А.Н. Косыгина»

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Игорь Александрович Ямсков доктор химических наук, профессор Борис Александрович Измайлов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Михаил Исаакович Штильман доктор химических наук, профессор Валерий Петрович Варламов

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии Наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится_2008 г. в _часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д.И. Менделеева (125047 Москва, Миусская пл., д. 9) в 443 ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан _ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 Шакир И.В.

Введение Актуальность работы Поиск новых физиологически активных веществ, установление закономерностей их действия в живых системах и создание на их основе фармакологических препаратов являются актуальными задачами биотехнологии.

Особый интерес представляют собой соединения, действующие в сверхмалых дозах (СМД), как с точки зрения установления механизма действия, так и с точки зрения перспектив применения.

В различных тканях млекопитающих, в том числе, в тканях глаза – роговице, хрусталике, сетчатке, пигментном эпителии (ПЭ), были обнаружены ранее не известные биорегуляторы, активные в СМД. Согласно результатам проведенных исследований биорегуляторы данной группы представляют собой низкомолекулярные, внеклеточно локализованные в тканях, белки, проявляющие значительную устойчивость к различным физико-химическим воздействиям:

изменению рН, температуры, действию хелатирующих агентов, протеаз.

Эти белки были названы регуляторными белками (РБ), потому что они оказывают влияние на основные биологические процессы: адгезию и миграцию клеток, клеточную пролиферацию и дифференцировку. Было установлено, что РБ стимулируют восстановительные и репаративные процессы в травмированных и патологически измененных тканях.

На основании результатов исследования специфической активности РБ была разработана концепция создания фармакологических препаратов нового поколения. Ряд таких препаратов доведен до практической реализации.

В настоящем исследовании впервые изучены биорегуляторы, выделенные из склеры, радужки, стекловидного и цилиарного тела. Был разработан метод очистки биорегуляторов, выделенных из тканей заднего отдела глазного бокала. Это позволило получить в высокоочищенном состоянии и охарактеризовать биорегуляторы не только для перечисленных выше тканей глаза, но и продолжить изучение ранее идентифицированных биорегуляторов сетчатки и ПЭ. Данные биорегуляторы перспективны как основа для создания фармакологических препаратов для лечения распространенных глазных заболеваний: миопии, глаукомы, иридитов, витреоретинальных патологий и др.

Целью настоящей работы явилось исследование состава, физико-химических свойств, биологической активности биорегуляторов, выделенных из склеры, радужки, стекловидного и цилиарного тела, а также пигментного эпителия и сетчатки глаза быка.

В отдельные задачи исследования входили:

1. Выделение и очистка биорегуляторов тканей глаза быка.

2. Изучение состава биорегуляторов тканей глаза.

3. Изучение физико-химических свойств биорегуляторов тканей глаза с помощью методов кругового дихроизма, динамического лазерного светорассеяния, атомно-силовой микроскопии.

4. Изучение мембранотропной и специфической биологической активности биорегуляторов тканей глаза.

5. Изучение механизма, лежащего в основе биологического действия биорегуляторов в сверхмалых дозах.

Новизна работы В тканях глаза быка: склера и ткани заднего отдела – радужка, стекловидное тело, цилиарное тело, впервые были идентифицированы действующие в СМД биорегуляторы. Показано сходство физико-химических свойств биорегуляторов, выделенных из тканей глаза и других тканей млекопитающих.

Впервые были разработаны модели органотипического культивирования склеры глаза тритона Pleurodeles waltl в составе заднего отдела глаза, целого глаза, а также в виде отдельно изолированной склеральной оболочки, на которых было изучено специфическое действие биорегулятора, выделенного из ткани склеры. Установлено, что данный биорегулятор в СМД оказывает протекторное действие на состояние склеры, а также ПЭ и сосудистой оболочки.

Впервые было показано, что активные в СМД биорегуляторы данной группы, выделенные из тканей заднего отдела глаза, имеют сложный состав. Например, для биорегулятора, выделенного из ПЭ, было установлено, что в его состав входит регуляторный пептид (РП) со значением молекулярной массы 4372 Да, а также модулятор, представляющий собой смесь белков со значениями молекулярных масс от 15 до 70 кДа. РП ответственен за проявление активности биорегулятора, в частности, определяет его мембранотропное действие, а модулятор – за проявление активности биорегулятора в СМД. Установлено, что образование комплекса «РП – модулятор» осуществляется по механизму белок-углеводного узнавания. Показана значимость наноразмерного состояния биорегулятора для проявления активности в СМД.

На культуре заднего отдела глаза было изучено специфическое действие в СМД биорегулятора, выделенного из ткани ПЭ. Установлено, что наиболее выраженный протекторный эффект наблюдается при действии комплекса «РП – модулятор», который выражается в поддержании межклеточных адгезивных взаимодействий, статуса дифференцировки клеток ПЭ, а также в увеличении их жизнеспособности. Полученные результаты являются основанием для разработки офтальмологических препаратов с использованием изученных биорегуляторов, выделенных из тканей глаза. Разработан экспресс-метод биотестирования офтальмологических препаратов, полученных на основе биорегуляторов.

Практическая значимость На основе биорегулятора, выделенного из склеры, разработан офтальмологический препарат «Висклерон», который предполагается использовать при глазных патологиях, обусловленных нарушением функции склеры, сосудистой оболочки и ПЭ. Одним из таких заболеваний является миопия. Предполагается, что такой препарат может быть эффективен при лечении миопии на начальной стадии развития у детей. Кроме того, предполагается, что данный фармакологический препарат будет эффективен при посттравматическом лечении глаз в качестве средства, предотвращающего образование шварт. В настоящее время препарат «Висклерон»

находится на стадии клинических испытаний в медицинских учреждениях г. Москвы. На такой же стадии клинических испытаний находятся и два других офтальмологических препарата – «Виретон» (на основе биорегулятора, выделенного из сетчатки), предназначенный для лечения отслойки и дистрофии сетчатки, а также других витреоретинальных патологий; «Вимакон» (на основе биорегулятора, выделенного из ПЭ), который предполагается использовать для лечения заболеваний, обусловленных патологическим состоянием ПЭ, в том числе макулодистрофии сетчатки.

На основании данных, полученных в настоящей диссертации, разработаны новые офтальмологические препараты: «Виридин», предназначенный для лечения патологий радужки;

«Витролон» – для лечения витреопатологий; «Вицилирон» – для лечения патологий, обусловленных нарушением водного обмена глаза. Предполагается, что данные препараты могут найти применение при лечении такого распространенного заболевания, как глаукома. В настоящее время эти три офтальмологических препарата находятся на стадии медико-биологических исследований.

Апробация результатов исследования Материалы диссертации доложены: на Четвертой Всероссийской научной internetконференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» Уфа, 15-25 декабря, 2005; на Ежегодных Международных молодежных конференциях ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», проходивших в г. Москве 14- декабря 2005 (V конференция), 24, 27 ноября 2006 (VI конференция), 12-14 ноября 2007 (VII конференция); на IV Международном Конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 3-7 июля, 2006; на VIII Съезде Украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова, г. Алушта, АР Крым, Украина, 24-28 сентября, 2007; на Научно-практической конференции «Нанотехнологии в диагностике и лечении патологии органа зрения», Москва, 23-24 апреля, 2008; на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск: «Арта», 11-15 мая, 2008; на Международной научнопрактической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», Казань, 15-16 сентября, 2008; на IV Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов», г. Алушта, АР Крым, Украина, 22-26 сентября, 2008; на конференции «Электромагнитные излучения в биологии БИО-ЭМИ-2008», Калуга, 23-25 октября, 2008; на IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз», Институт биохимической физики им. Н.М Эмануэля, РАН, Москва, 28-29 октября, 2008.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 164 страницах и включает следующие главы.

Введение, в котором рассмотрены актуальность, новизна, практическая значимость работы.

Обзор литературы посвящен описанию и систематизации результатов исследования группы биорегуляторов, активных в СМД; в отдельном разделе рассмотрено строение и функции тканей глаза.

Экспериментальная часть посвящена описанию материалов и основных методов, с помощью которых было проведено данное исследование.

Результаты и их обсуждение, глава, в которой представлены результаты, полученные при идентификации биорегуляторов в ткани склеры и тканях заднего отдела глаза, а также при исследовании их физико-химических свойств и изучении мембранотропной и специфической активности, проявляемой в СМД.

Заключение – раздел, в котором суммированы результаты исследования биорегуляторов тканей глаза, а также представлено практическое применение изученных биорегуляторов.

Выводы. Диссертация содержит 10 таблиц, 59 рисунков, 277 литературных ссылок.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из которых 6 являются оригинальными статьями.

Идентификацию биорегуляторов в тканях склеры, радужки, стекловидного и цилиарного тела осуществляли, используя экспериментальный подход, который был ранее разработан для исследования этих эндогенных биологически активных веществ. Данный подход заключается в применении определенных методов выделения биорегуляторов этой группы из тканей животных, методов очистки, биотестирования, а также изучения физико-химических свойств и специфической биологической активности.

Изучение биорегулятора, выделенного из ткани склеры глаза быка Биорегулятор был выделен и очищен из ткани склеры глаз быка, согласно ранее разработанной методике выделения и очистки биорегуляторов данной группы. На первой стадии исследования был получен тканевой экстракт склеры в Ca2+-содержащем растворе при 4°С, который далее фракционировали путем высаливания белков в насыщенном растворе сернокислого аммония. Полученную фракцию супернатанта разделяли методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ). В процессе очистки фракции, содержащие биорегуляторы, идентифицировали с помощью метода биотестирования, специально разработанного ранее для определения биологической