На правах рукописи

Хохлова

Ольга Николаевна

Патогенетическое и клиническое значение плазмоцитоидных дендритных клеток при

вирусном гепатите С у детей и взрослых

14.01.09 – инфекционные болезни

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва – 2013

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Центральный научноисследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель.

РЕЙЗИС Ара Романовна доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

ФЕКЛИСОВА Людмила Владимировна доктор медицинских наук, профессор ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им.

М.Ф.Владимирского», руководитель отдела детских инфекций КАЛЮЖИН Олег Витальевич доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им.

И.М.Сеченова» МЗ РФ, профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.А. Евдокимова» МЗ РФ

Защита диссертации состоится « 25 » октября 2013 года в _час.мин. на заседании диссертационного совета ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора по адресу: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, д. 3А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

Автореферат разослан «_» сентября 2013года.

Учёный секретарь диссертационного совета Горелов Александр Васильевич доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Вирусные гепатиты представляют серьёзную проблему здравоохранения, подлинную угрозу для человечества, ввиду повсеместного распространения гепатитов В, С, Д, наличия хронического носительства, а также тяжёлых и фульминантных форм и исхода в цирроз печени с угрозой малигнизации и развития гепатокарциномы [Покровский В.И., 1996-2004г.; Соринсон С.Н., 1996-1998г.; Михайлов М.И. и др., 1996-2004г.].

В настоящее время особенно тревожна ситуация с хроническим гепатитом С (ХГС): в мире насчитывается 180 миллионов (по некоторым данным до 500 миллионов) инфицированных людей, то есть от 3% до 8% всемирной популяции, и ежегодно выявляются новые 3-4 миллиона случаев. В связи с этим, изучение данной проблемы приобретает с каждым годом всё большую актуальность.

Наряду с огромными успехами, связанными с открытием возбудителя, внедрением молекулярно-биологических методов диагностики и возможностей противовирусной терапии [Михайлов М.И., 1990г.; Михайлов М.И., Шахгильдян И.В., Онищенко Г.Г., 2003г.; Мукомолов С.Л. и др., 1994г.], многое в проблеме вирусных гепатитов остаётся не изученным.

Для решения вопросов течения, прогрессирования и исходов вирусных гепатитов первостепенное значение имеет знание глубинных механизмов патогенеза этих заболеваний, в том числе особенностей иммунного ответа.

Одним из новейших и многообещающих направлений в понимании механизмов иммунного ответа при вирусных гепатитах является изучение недавно открытого уникального типа иммунных клеток - плазмоцитоидных дендритных клеток (ПДК), роль и значение которых, как возможных ключевых факторов патогенеза вирусных гепатитов, начали изучать лишь в самое последнее время.

ПДК являются отдельным видом клеток крови, близким по развитию и генетическому профилю общим дендритным клеткам, впервые описанным R.M. Steinman и Z.A. Cohn в 1973 году.

ПДК были открыты Cella M., Jarrosay D., Fecchetti F. et al ; Siegal F.P., Kadowaki N., Shodell M. et al в 1999году. Они имеют костномозговое происхождение и развиваются из стволовой клетки через ряд предшественников [Merad M., Manz M.G. 2009], в этом процессе основополагающую роль играет ген, названный Е2-2 [открыт в 2008 году Reizis B. et al], который регулирует этапы развития и дифференцировки ПДК. У здоровых людей ПДК обнаружены в крови и лимфоидных органах и в минимальных количествах присутствуют в других органах и тканях. Единственным органом, где они представительствуют и куда могут эффективно мигрировать в зрелом состоянии, является печень.

При активации во время воспалительного ответа ПДК мигрируют как в зону Т-клеток лимфоидных органов, так и в воспалённую ткань паренхимы [Cella M., Jarrossay F. et al 1999; Lai W.K., Curbishley S.M. et al 2007]. Эти клетки, генетически родственны дендритным клеткам и обладают морфологией плазматических клеток, в связи с чем имеют уникальную двойственную природу.

С одной стороны, ПДК являются основными естественными продуцентами интерферонов (ИНФ) I типа и способны продуцировать в 100-1000 раз больше интерферона –, чем другие типы клеток, в ответ на вирусемию, что ставит их на первое место, как принципиально важных участников антивирусного иммунного ответа [Cella M., Jarrosay D., Fecchetti F. et al 1999год, Kadowaki N., Shodell M. et al 1999]. Первый тип интерферона напрямую активирует натуральные киллеры, усиливая их цитотоксическую активность [Lee C.K., Rao D. T., Gertner R. 2000] и стимулирует продукцию интерлейкина-15 [Nguyen K.B., Salazar-Mather T.P. et al 2002], который играет роль в их пролиферации. С другой стороны, кроме продуцирования интерферона, ПДК могут напрямую взаимодействовать почти со всеми клетками иммунного типа, в том числе с антигенпрезентирующими дендритными клетками (АПК), обеспечивая отчётливый механизм их активации [Yoneyama H., Matsuno K., Matsuno N., Toda E. et al 2005], а также самостоятельно выступать в этом качестве.

Таким образом, характеризуясь сочетанием уникально быстрой и массивной продукции интерферона I типа с активацией презентации антигена, ПДК обладают одновременно свойствами как лимфоцитов, так и классических дендритных клеток, что позволяет им быть ключевым связующим звеном между врождённым и приобретённым иммунитетом [B.Reizis et al 2010].

Клинические работы по изучению ПДК появились в самое последнее время [Banchereau J., Palucka A.K. 2005; Vicari A. 2002; Pacrensny S. 2004; De Vries 2003]. Работы по изучению роли ПДК при вирусных гепатитах единичны и касаются только взрослых пациентов [Ito T., Kanzler H., Liu Y.J. 2006; Ulsenheimer A., Gerlach J.T., Jung M.C. et al 2005;Kanto T., Inoue M., Miyatake H.

2004]. У детей подобные исследования отсутствуют.

Всё это определяет актуальность и перспективность избранной нами темы, и явилось основанием для проведения настоящей работы.

Цель исследования Установление патогенетического и клинического значения плазмоцитоидных дендритных клеток (ПДК) при хроническом гепатите С у детей и взрослых.

Задачи исследования 1. Определить нормальные количественные показатели и функциональное состояние ПДК (выработка ими интерферона) у детей и взрослых.

2. Установить количество и функциональное состояние ПДК у детей с вирусным гепатитом С, в зависимости от течения и фазы инфекционного процесса, характера и стадии противовирусного лечения.

3. Исследовать те же параметры ПДК у взрослых пациентов, больных вирусным гепатитом С.

4. Выявить особенности и дать сравнительную характеристику изменений количества и функционального состояния ПДК у взрослых и детей, больных вирусным гепатитом С.

5. На основании полученных результатов сформулировать положения о роли ПДК в патогенезе вирусного гепатита С, их влиянии на течение инфекционного процесса, а также на эффективность противовирусной терапии (ПВТ).

Научная новизна 1. Впервые установлены нормальные количественные и функциональные показатели (интенсивность интерфероногенеза (ИФН-генез)) ПДК у здоровых детей и их соотношение с показателями у здоровых взрослых лиц.

2. Обнаружен феномен наличия в крови здоровых детей и взрослых ингибиторов ИФН - генеза в ПДК, в связи с чем ПДК здоровых лиц находятся в состоянии «покоя» (выработка ИФН в них не определяется).

3. Выявлено, что количественные и функциональные показатели ПДК у детей и взрослых, страдающих ХГС, достоверно отличаются от таковых у здоровых лиц, а также, что параметры ПДК в детском возрасте существенно отличаются от показателей у взрослых, больных ХГС.

4. Впервые продемонстрировано важное участие ПДК в патогенезе ХГС у взрослых и детей в виде тесной взаимосвязи количества и функции ПДК с вирусной нагрузкой, степенью цитолиза и фиброза, т.е. с основными факторами, определяющими течение и исход ХГС:

- Количество ПДК снижено у всех больных ХГС.

- Количество клеток обратнопропорционально уровню цитолиза (снижается при повышении активности трансаминаз).

- Степень снижения максимальна при продвинутом фиброзе (4 балла).

- Высокой виремии соответствует низкий интерфероногенез в ПДК.

5. Впервые установлено, что противовирусная терапия (ПВТ) существенно влияет на показатели ПДК: резко стимулирует ИФН - генез в ПДК в процессе терапии. Показано, что ответ на ПВТ закономерно связан с изменениями количества и функции ПДК, а степень подъёма выработки ИФН в ПДК может служить надёжным прогностическим тестом ответа на противовирусную терапию (заявка на патент № 2012157606 от 27.12.2012).

6. Продемонстрирован особый механизм воздействия ПВТ на характер иммунного ответа при ХГС: без неё состояние авиремии достигается максимальным напряжением ИФН - генеза в ПДК. Напротив, после ПВТ при достижении авиремии происходит нормализация функции 7. На основании полученных данных сформулированы новые научные положения о роли ПДК при ХГС, их влиянии на течение заболевания и эффективность противовирусной терапии.

Практическая значимость работы.

1. Установление нормальных параметров количества и функционального состояния ПДК у детей делает возможным использование этих методов в педиатрии.

2. Полученные данные могут служить дополнительными критериями оценки течения и прогнозирования исходов ХГС у детей и взрослых.

3. На основании результатов исследования предложен прогностический тест, который может служить критерием оценки эффективности проводимой терапии. Суть нового прогностического теста заключается в том, что степень повышения уровня ИФН - генеза в ПДК на 12ой неделе терапии является показателем её эффективности: повышение выработки ИФН в 2,6102 раз у взрослых и 1,2102 у детей позволяет надёжно (с достоверностью 96%) предсказать стойкий вирологический ответ (заявка на патент: рег. № 2012157606 от 27.12.2012).

Своевременная (в первые 12недель) оценка ответа на противовирусную терапию является важнейшей составляющей современной персонализированной терапии ХГС.

Внедрение результатов Результаты исследования внедрены в практику работы клинико-диагностического центра ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора и Детского Гастроэнтерологического Центра Департамента Здравоохранения г. Москвы.

Апробация материалов диссертации Результаты исследований были доложены на IV и V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (март 2012г и 2013г, Москва); XVII и XVIII Ежегодном Российском Конгрессе «Гепатология сегодня» (март 2012г и 2013г); на 18-й Российской Гастроэнтерологической неделе с международным участием (октябрь 2012г.); на Всероссийской конференции «Хочу всё знать по вирусным гепатитам» (декабрь 2012г.) Работа принимала участие и заняла I место в Конкурсе молодых ученых на V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (март 2013г.) и XVIII Ежегодном Российском Конгрессе «Гепатология сегодня» (март 2013г). Материалы работы приняты к публикации и постерному докладу на конференции «GASTRO 2013 APDW/WCOG Shanghai» (сентябрь 2013г.), а также к устному докладу на конференции «United European Gastroenterology Week Berlin» (октябрь 2013г.). United European Gastroenterology присудило автору работы звание «National Scholar Award 2013».

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 научные работы в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ и 1 работа в зарубежном журнале.

Личный вклад. Автор осуществлял планирование и принимал непосредственное участие в сборе анамнеза, осмотре, иммунологическом обследовании больных, в назначении патогенетической терапии. Лично автором проводилось регулярное наблюдение больных. Автором лично проведена оценка клинико-лабораторных, иммунологических, вирусологических показателей в динамике, на фоне проводимой ПВТ. Автором подготовлен аналитический обзор зарубежных и отечественных источников, осуществлен отбор методов исследования и статистическая обработка полученных результатов; проведен анализ и интерпретация данных, сформулированы выводы и практические рекомендации.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, выводы, список цитированной литературы, включающий 130 источников, приложение. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 49 таблицами; приведены 4 выписки из историй болезни.

Материалы и методы Данная работа проводилась в период с 2010 по 2012 г. в клиническом отделе инфекционной патологии ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (директор – академик РАМН, профессор В.И. Покровский), на базе научно-консультативного клинико-диагностического центра ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (заведующий – к.м.н. Чуланов В.П.) и лаборатории иммунологии СНИО ЭП СПИД (директор –академик РАМН, профессор Покровский В.В).

В амбулаторных условиях нами обследован 161 человек: 133 пациента, страдающих хроническим гепатитом С, в возрасте от 1,5 до 64 лет и 28 человек – здоровые лица в возрасте от 4 до лет. Кратность обследования больных хроническим гепатитом С составляла 1-3 раза. Здоровые лица обследованы однократно. Общее количество исследований – 184.

Под нашим наблюдением находилось 58 детей в возрасте от 1,5 до 18 лет и 75 взрослых пациентов в возрасте от 19 до 64 лет в различные фазы хронического гепатита С. Средний возраст детей 7,6 лет±0,27. Взрослые больные на момент обследования имели средний возраст 30 лет ±0,8.

В исследовании детей преобладали лица мужского пола (63,8%), тогда как у взрослых - лица женского пола (60%).

При хроническом вирусном гепатите С у обследованных детей преобладала репликативная фаза заболевания (86,2%), тогда как у взрослых больных соотношение репликативной фазы заболевания и нерепликативной составило 41% и 59% соответственно. Неактивный процесс (нормальные значения АлТ/АсТ) преобладал как у детей (62%), так и у взрослых (64%) больных ХГС.

Установлено, что в эпиданамнезе детей - 36,2% составили медицинские парентеральные вмешательства, но преобладал вертикальных путь заражения (46,6%). У 17,2% детей не удалось установить источник заражения. У взрослых, более чем в половине (53,3%) случаев установить источник заражения не было возможности, тогда как парентеральный путь заражения составил 44%, а у 2,7% отмечался вертикальный путь передачи ВГС. Необычно высокая частота вертикального пути передачи в нашем случае связана не с особенностями эпидпроцесса (вертикальная передача ВГС обычно не превышает 5-7%), а с характером выборки (концентрация таких пациентов в условиях гепатологического центра).

Как известно, для хронического гепатита С характерно длительное течение заболевания при скудной клинической картине. У наблюдавшихся нами пациентов клинические симптомы были минимальны, однако как у детей (44,8%), так и у взрослых (65,3%) отмечался довольно выраженный астенический синдром, жалобы на тяжесть в правом подреберье (20,7% и 52%), диспептический синдром (36,2% и 57%), наблюдалось увеличение печени (17,2% и 34,7%) и селезёнки (5,2% и 8% соответственно). Кожные покровы при ХГС были обычной окраски. Довольно часто встречалась сопутствующая патология в виде поражения желудочно-кишечного тракта (44,8% и 44%), аллергических заболеваний (13,8% и 14,7% соответственно). При этом обращает на себя внимание различие в относительной частоте отдельных клинических проявлений у взрослых и детей. Так, у детей все основные симптомы встречались существенно реже, чем у взрослых пациентов.

При ХГС у наших пациентов активность процесса была невысокой: средние значения показателя аланинтрансаминазы (АлТ) в целом не превышали 1,5 норм, и в группе детей статистически не отличались от таковых у взрослых. Также отмечено преобладание нормальных уровней трансаминаз, причём с одинаковой частотой как в группе детей - 62,1%, так и у взрослых пациентов У больных ХГС уровень вирусной нагрузки имеет большое значение как для течения и исходов заболевания, так и для решения вопроса о назначении противовирусной терапии. Более чем у половины (51,7%) наблюдавшихся нами детей определялся высокий уровень вирусной нагрузки, тогда как у взрослых больных отсутствие вирусной репликации (40%) и высокий уровень вирусной нагрузки (45,3%) определялись с примерно одинаковой частотой. Низкий уровень вирусной нагрузки был у трети больных детей (34,5%), у взрослых только 14,7% больных имели низкие уровни вирусной репликации.

Генетика вируса играет важную роль в патогенезе заболевания, ответе на противовирусную терапию и риске возникновения рецидива. Как у детей, так и у взрослых больных ХГС в нашем исследовании преобладал 1В генотип (63,8% и 65,3% соответственно). Несколько чаще у детей (24,1%), чем у взрослых (16%) встречался 3А генотип.

Степень выраженности фиброза является важным фактором при оценке прогноза заболевания и оптимизации лечения. В нашем исследовании большинству больных (77,4%) была проведена фиброэластография печени для определения уровня фиброза по шкале Метавир. По данным фиброэластографии, у обследованных нами детей отсутствовала группа с уровнем фиброза F3 и выше, тогда как у 12% взрослых пациентов определялась клинико-лабораторная картина цирроза печени. Процентный состав групп с минимальным уровнем фиброза был несколько выше у детей, чем у взрослых (74,1% и 58,7% соответственно).

Базовые методы обследования проводились в лаборатории ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (заведующий – к.м.н. Шипулин Г.А.) и в иммунологической лаборатории СНИО и ЭП СПИД (заведующий – академик РАМН, профессор Покровский В.В.) -Клинический анализ крови определялся на гематологическом анализаторе AST diff (производство Beckman Coulter).

-Биохимический анализ крови (определение АсТ и АлТ, билирубина, протромбинового индекса,уровня общего белка и белковых фракций и др. ) проводился при помощи тест-системы Abbott Diagnostics ARCHITECT.

Исследование маркёров репликации вируса гепатита С (РНК вируса гепатита С качественное и количественное исследование) и определение генотипа вируса в сыворотке проводилось на базе ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, в клинико-диагностическом отделении (зав. отд. - к.м.н. Чуланов В.П.). Для определения использовали метод полимеразной цепной реакции. РНК HCV определяли с использованием коммерческих наборов реагентов производства ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии»" Роспотребнадзора; Россия: «АмплиСенс HCV-Монитор-FL" и "АмплиСенс HCV-генотип-FL".

При необходимости уточнения диагноза, проведения дифференциальной диагностики с другими видами поражения гепатобилиарной системы и определения степени фиброза проводились дополнительные методы исследования: УЗИ брюшной полости, фиброэластография печени на аппарате «Фиброскан» и др. в соответствии с конкретными диагностическими задачами.

Специальные методы исследования.

Для определения количества и функции плазмоцитоидных дендритных клеток (ПДК) в периферической крови у детей и взрослых, больных хроническим вирусным гепатитом С, а также у здоровых лиц, использовались специальные методы исследования. Исследование проводилось на базе иммунологической лаборатории СНИ и ОЭП СПИД (заведующий академик РАМН, профессор Покровский В.В., зав. иммунологическим подразделением – к.м.н. Л.В. Серебровская).

Количественное (относительное и абсолютное количество) определение ПДК проводили методом проточной цитометрии, на цитофлуориметре EPICS XL (Beckman Coulter) с добавлением моноклональных антител (MaT-CD303 и MaT -CD123, производства фирмы Miltenyi Biotec) и частиц FlowCount (Beckman Coulter) для абсолютного счета.

Определение функционального состояния ПДК (выработка ими интерферона). Для получения супернатантов, плазмоцитоидные дендритные клетки обрабатывались специфическими стимуляторами, с последующим определением выработки интерферона. Стимуляция образцов периферической крови больных ХГС и здоровых лиц проводилась в инкубаторе при 370С и 5% СО2 с использованием специфических стимуляторов, таких как ODN2216 – синтетический олигонуклеотид, содержащий CpG ODN в определённых последовательностях, специфичный для распознавания TLR 9 и приводящий к сильному иммуностимулирующему эффекту-активации выработки интерферона в ПДК (InvivoGen, USA) и интерлейкин 3 (IL3) – полипептидный цитокин, относящийся к группе гранулоцитарно-макрофагальных колониестимулирующих факторов, применяемый для стимуляции и дифференцировки клеточного роста наиболее ранних предшественников кроветворных клеток.

Определение выработки ИФН в супернатанте клеток проводили методом иммуноферментного анализа, с использованием наборов реагентов ELISA.

Дополнительные специальные методы В связи с возникновением в ходе исследования ряда новых задач потребовалось применение дополнительных методов.

Для того, чтобы плазмоцитоидные дендритные клетки отмыть от плазмы крови, ПДК выделяли из стабилизированной гепарином (25 ед/мл) периферической крови у 4 здоровых доноров ( детей и 2 взрослых). Кровь, разведенную в 2 раза средой RPMI 1640, центрифугировали при 400g в течение 30 мин в градиенте плотности фиколл-ПАК. ПДК, образовавшие интерфазное кольцо, собирали и трехкратно отмывали в среде RPMI 1640. После каждой отмывки в 10кратном объёме среды клетки осаждали центрифугированием при 200g. Затем «отмытые» ПДК инкубировали при тех же условиях, что и не «отмытые», после чего, как было описано выше, собирали супернатант и определяли количественный уровень ИФН в исследуемых образцах.

Статистическая обработка результатов Статистическая обработка результатов проводилась при помощи статистической программы GraphPad Prism5 с определением средней величины (М) и ошибки средней величины (m). При определении достоверности различий применялись как параметрические, так и непараметрические критерии обсчёта полученных результатов. Для параметрических распределений применяли t- критерий Стьюдента и F критерий, при использовании непараметрических методов –критерий Манна-Уитни. Для разработки прогностического теста был применён многофакторный дискриминантный анализ результатов с использованием статистического пакета STATISTICA 7.

Результаты исследования.

Количественные показатели ПДК у здоровых детей и взрослых.

В работе впервые установлены нормальные количественные показатели ПДК у здоровых детей: абсолютное количество клеток в микролитре - 17,31±1,83, процентное количество клеток при выборке из 100 тыс. лимфоцитов - 0,38±0,04. Эта норма оказалась статистически отличима от нормальных показателей, полученных у взрослых - 10,25±1,75 и 0,27±0,05 соответственно (р=0,01 и р=0,05) Количественные показатели ПДК у больных ХГС По нашим данным, у детей, больных ХГС, отмечается снижение как абсолютного количества