На правах рукописи

КОЛОСОВ

Алексей Владимирович

РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЯ ВИРУСНЫХ

ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЗАЩИТЫ

РАСТЕНИЙ

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2011

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Трошкова Галина Павловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Щелкунов Сергей Николаевич доктор биологических наук, профессор Штерншис Маргарита Владимировна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт систематики и экологии животных Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск).

Защита состоится «11» ноября 2011 г. в 11.30 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

по адресу: 630559, р.п. Кольцово Новосибирского района Новосибирской области, тел. 8 (383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан « 5 » октября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Трошкова Г.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Членистоногие являются самыми многочисленными и широко распространенными среди представителей царства животных. Количество их видов по всему миру оценивается в пределах 4-6 млн. И хотя лишь небольшая часть членистоногих классифицируется как вредители, именно они наносят наибольший вред, уничтожая около 18 % мирового годового производства сельскохозяйственных культур, и способствуют потере почти 20 % запасов зерна. Ежегодный ущерб, причиненный ими, составляет около 100 млрд. долларов США. Некоторые культуры (виноград, хлопчатник, рис, многие овощные) вообще не удается возделывать без применения пестицидов. Однако из-за использования агрохимикатов с узконаправленным действием, главным образом на нервную систему, членистоногие были поставлены под сильное давление направленного отбора, что привело к широкому распространению устойчивости к пестицидам среди их популяций. На сегодняшний день резистентность у насекомых проявляется ко всем химическим классам инсектицидов, а также к микробным препаратам и регуляторам роста насекомых.

В связи с этим в развитых странах предпринимаются попытки ввести альтернативные системы земледелия, предусматривающие сокращение внесения минеральных удобрений и замену традиционных пестицидов на биологические средства защиты растений. У насекомых есть много природных врагов – это различные хищники, а также патогенные организмы, к которым относятся нематоды, бактерии, грибы и вирусы. Применение этих микроорганизмов в качестве микробных пестицидов может эффективно подавлять популяции насекомых-вредителей.

Наиболее привлекательными среди биопестицидов являются препараты на основе бакуловирусов. Ввиду особенностей своего жизненного цикла бакуловирусы обладают достаточной устойчивостью и могут существовать вне организма насекомого длительное время (до нескольких лет). Их специфичность часто ограничивается только одним видом насекомых, и они абсолютно безопасны для людей и животных.

Однако из-за медленного проявления эффекта действия бакуловирусов (в случае использования химических инсектицидов эффект проявляется быстро) основные пользователи рассматривают их как неэффективные, поскольку в первые 3–10 суток инфицированные гусеницы продолжают питаться и наносить ущерб. В настоящее время это отношение изменилось, и в качестве долговременной защиты сельскохозяйственных культур от вредителей все больше начинают применять именно бакуловирусные препараты. Для более активного развития этого вида биопестицидов необходимо повысить устойчивость вирусного агента в естественной среде и разработать эффективную технологию его производства.

Цели и задачи исследования Целью настоящей работы являлась разработка бакуловирусных энтомопатогенных препаратов для повышения эффективности контроля численности хлопковой совки (Heliothis armigera Hbn.) и непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.).

В процессе работы решались следующие задачи:

1. Выделение природных изолятов вирусов ядерного полиэдроза (ВЯП) НШ и ВЯП ХС, проведение с ними селекционной работы с целью получения вирусных штаммов и создания на их основе энтомопатогенных препаратов.

2. Разработка композиции рабочего раствора для бакуловирусных инсектицидов, повышающей их устойчивость к УФ-излучению.

3. Создание препарата для борьбы с хлопковой совкой на основе ВЯП и разработка технологии его производства.

4. Определение путей горизонтальной передачи вирусной инфекции внутри популяции гусениц.

5. Оценка эффективности бакуловирусных препаратов против непарного шелкопряда и хлопковой совки в условиях полевых испытаний.

Научная новизна и практическая значимость работы Получены и запатентованы новые штаммы бакуловирусов, высокопатогенные для вредителей сельского и лесного хозяйства.

Разработана новая композиция рабочего раствора для бакуловирусных препаратов, содержащая альгинат натрия, аскорбиновую кислоту, бычий сывороточный альбумин и хлорид кальция, значительно повышающая их устойчивость к УФ-облучению.

Создан и запатентован новый бакуловирусный препарат для борьбы с хлопковой совкой ВИРИН ХСК.

Впервые показаны пути горизонтального распространения инфекции ВЯП и необходимость искусственного внесения бакуловирусов в экосистемы для регуляции численности насекомых-вредителей.

Обоснована целесообразность применения высокопатогенных вирусных штаммов ВЯП НШ 2-85 и ВЯП ХС-17 для контроля численности непарного шелкопряда и хлопковой совки, соответственно.

Разработаны технические условия и новая технология производства препарата ВИРИН ХСК.

Проведены государственные полевые испытания препарата ВИРИН ХСК в республике Узбекистан, по результатам которых, в соответствии с «Положением о регистрационных испытаниях и регистрации пестицидов, агрохимбиопрепаратов и минеральных удобрений в Республике Узбекистан», на данный препарат получено регистрационное свидетельство № 1 А 123.

Практическая значимость данной работы: получены высокопатогенные вирусные штаммы, которые при использовании разработанной нами рецептурной формы рабочего раствора сохраняют свою эффективность в полевых условиях в течение длительного времени, что, в свою очередь, устраняет необходимость многократной обработки защищаемых культур. В настоящее время на основе разработанной технологии ведутся проектные работы по созданию опытного производства препарата ВИРИН ХСК.

Положения, выносимые на защиту Метод массового отбора позволяет получить штаммы ВЯП, обладающие высокой биологической активностью, и поддерживать их высокую патогенность для целевых насекомых. Применение этого метода наряду с контролем биологической активности используемого штамма ВЯП является важнейшим элементом производства препаратов на основе бакуловирусов.

Устойчивость ВЯП к УФ-излучению можно значительно повысить, используя композицию рабочего раствора, содержащую альгинат натрия, БСА, хлорид кальция и аскорбиновую кислоту.

Бакуловирусная инфекция способна передаваться от больных гусениц к здоровым, и жизнеспособность последних существенно зависит от степени их контакта с больными гусеницами.

Препарат ВИРИН-НШ на основе ВЯП НШ-2-85 обладает высокой биологической эффективностью и способен конкурировать с химическими инсектицидами.

Экологически безопасный препарат ВИРИН ХСК, созданный на основе штамма ВЯП ХС-17, превосходит по своим защитным и экономическим свойствам химические и биосинтетические инсектициды, применяющиеся для подавления численности хлопковой совки (Heliothis armigera Hbn.) на хлопковых полях.

Публикации и апробация работы По материалам диссертации опубликованы 6 статей, из них 5 в журналах списка, рекомендованного ВАК, получено 5 патентов на изобретения.

Результаты работы были представлены на 7 научных конференциях:

Отраслевое совещание «Биологические и технологические проблемы создания вирусных препаратов для интегрированной защиты растений», Кольцово, Новосиб. обл., 26-29 сент. 1989 г.; Международная научнопрактическая конференция «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней», Одесса, 12-16 сент.

1994 г.; Proceedings of the international conference: «Achievements of biotechnology for the future of mankind», Samarkand, June 11–14, 2001;

Международная научно-практическая конференция «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование», Иркутск, 27окт. 2004 г.; Международная научно-практическая конференция «Технологии создания биологических средств защиты растений на основе энтомофагов, энтомопатогенов, микробов-антагонистов и применения их в открытом и закрытом грунтах», Краснодар, 20-22 сент. 2006 г.; 28th Pakistan congress of Zoology, Faisalabad, Pakistan, March 18-20, 2008; Международная научно-практическая конференция «Интегрированная защита растений:

стратерия и тактика», Минск, 5-8 июля 2011 г.

Объём и структура диссертации Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 9 рисунков 23 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, 7 глав результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего отечественных и 114 иностранных источников, и приложения.

Личный вклад автора Получение штаммов энтомопатогенных ВЯП НШ и ХС, разработка технических условий выполнены лично автором. Лабораторный регламент производства препарата ВИРИН ХСК разработан автором при участии научного руководителя Трошковой Г.П. Рецептурная форма рабочего раствора препарата создана совместно с сотрудниками отдела «Коллекция культур микроорганизмов» ГНЦ ВБ «Вектор». Деляночные эксперименты и полевые испытания препаратов ВИРИН НШ и ВИРИН ХСК проведены «Алтайвитамины» г. Бийск, Института Защиты растений и Института Зоологии АН республики Узбекистан. Исследования микроструктуры вирусов были выполнены в отделе микроскопических исследований ГНЦ ВБ «Вектор» при участии автора в подготовке образцов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Получение штаммов ВЯП НШ и ВЯП ХС для создания на их основе энтомопатогенных инсектицидных препаратов Для получения штаммов ВЯП НШ обследовали 11 лесхозов Киргизии и Западной Сибири. Из образцов, собранных во время экспедиций, выделили новых изолятов этого вируса. В табл. 1 приведены данные экспериментов по определению биологической активности изолятов вируса на гусеницах третьего возраста лабораторной популяции.

Биологическая активность природных изолятов ВЯП НШ Обозначение изолята Биологическая активность ЛД50±2 (пэ/гус.) ВЯП НШ-Т ВЯП НШ-Н ВЯП НШ-К ВЯП НШ-К ВЯП НШ-К ВЯП НШ-К ВЯП НШ-Н ВЯП НШ- Установлено, что наибольшей биологической активностью обладает изолят ВЯП НШ-Н2: величина ЛД50 для него составляет 1,2104 пэ/гус. и достоверно отличается от значений этого показателя у других изолятов.

С целью повышения биологической активности выбранного изолята была проведена селекционная работа. Для этого использовали метод массового отбора с учетом следующих параметров: возраст, в котором погибшая гусеница была инфицирована; время гибели (на какие сутки после заражения погибла личинка); дозу вируса, которой инфицировали личинку.

На первом этапе в течение 6 пассажей при индивидуальном заражении личинок 4-го возраста дозой 1х105 пэ/гус. отбирали гусениц, погибших в течение 9 суток от момента заражения. Выделяли из них вирус, который использовали на следующем этапе.

На втором этапе снижали дозу заражения до 1104 пэ/гус. и на протяжении 5 пассажей отбирали гусениц по тому же принципу.

На третьем этапе дозой 1104 пэ/гус. инфицировали личинок 5 возраста и продолжали вести отбор по тому же признаку.

Сравнительные характеристики вируса до и после селекции приведены в табл. 2.

Сравнительные характеристики ВЯП НШ-Н2 до и после селекции Активность вируса Процент гибели гусениц, зараженных ВЯП Изолят селекции После селекции Из приведенных данных следует, что в результате проведенной селекции нам удалось:

- значительно снизить ЛД50 до 4,5102 пэ/гус. для личинок НШ третьего возраста;

- добиться 100 % гибели гусениц, зараженных в пятом возрасте, при дозе заражения 1,7105 пэ/гус.

Полученный в результате вирус был депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером ГКВ N 2156, запатентован как штамм ВЯП НШ-2-85 и впоследствии использован как активная основа инсектицидного препарата для ограничения численности непарного шелкопряда в природных популяциях.

В результате обследования хлопковых полей фермерских хозяйств Согдийской области Республики Таджикистан был выделен новый изолят ЛД50 = 1,5102 пэ/гус. (для гусениц ХС 3-го возраста лабораторной популяции), ЛВ50=4,5 суток при заражении дозой 1103 пэ/гус. Этот штамм в дальнейшем был запатентован как ВЯП ХС-17 и использовался в качестве активной основы препарата ВИРИН ХСК для борьбы с хлопковой совкой.

препаратов практическом применении определяется не только свойствами действующего агента, но также различными факторами внешней среды, способами нанесения препаратов и рецептурой их рабочих растворов.

С целью разработки оптимальной композиции рабочего раствора вирусного инсектицидного препарата нами были протестированы варианты сочетаний наиболее перспективных компонентов. Большинство авторов, проводивших исследования в этой области, указывали, что готовый к применению рабочий раствор вирусного инсектицида должен иметь надежный инертный носитель и содержать антиоксидант, нейтрализующий химически активные продукты облучения и вещества, которые могут способствовать инкапсуляции вируса.

использовали альгинат натрия (Alg), диальдегидкрахмал (ДАК), хитозан (Хит), а также поверхностно активные вещества – 2-цетилпиридинхлорид (2 ЦХл) и проксанол (F127). В нескольких композициях были испытаны адсорбирующие агенты (адъюванты): хлорид кальция (CaCl2) и гликохолат натрия (ГХолат). Для поддержания постоянного рН в препарат добавляли растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА), а аскорбиновую кислоту (Asc) применяли как антиоксидант.

Споры B. thuringiensis использовали в качестве модельного объекта.

Результаты испытаний защитных свойств исследованных композиций представлены в табл. 3.

Защитное действие этих композиций для B. thuringiensis оценивали по выживаемости спор после УФ-облучения в сравнении с контролем – суспензией спор в фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты испытания экспериментальных композиций для защиты ВЯП и B. thuringiensis от УФ-облучения Степень Композиции для вирусов Композиции для бактерий защиты Высокая: Alg, Asc, БСА, CaCl2; Alg, Asc, БСА, CaCl активность до Alg, Asc, БСА и после облучения не различаются Средняя: Alg, Asc, БСА, ГХолат; Alg, Asc, БСА, CaCl2, ГХолат;

активность Alg, Asc, БСА, Хит, F127; Alg, Asc, БСА, ГХолат, Хит, F снижается Alg, Asc, CaCl2;

только при Alg, БСА, CaCl2;

длительном ДАК, Asc облучении активность Alg, CaCl2, 2 ЦХл; Alg, БСА, CaCl2;

снижается, но Alg, Asc, БСА, Хит;

в отдельных Сажа случаях превышает контрольную.

активность ДАК, Asc, БСА, ГХолат;

препарата Alg, F127;

облучения не ДАК, Asc, БСА;

отличалась от ДАК, ГХолат;

контроля ДАК, 2 ЦХл;

Эффективность защитного действия экспериментальных композиций по отношению к вирусу оценивали по выживаемости инфицированных вирусом дистиллированной воде.

Тестирование различных рецептур на бактериальных спорах показало, что лучшая рецептура включает 4 вещества: альгинат натрия, хлорид кальция, бычий сывороточный альбумин и аскорбиновую кислоту. Данный состав совпадает с составом лучших защитных композиций для вируса.

предпочтительным является альгинат натрия. У диальдегидкрахмала, хитозана и ПАВ защитный эффект выражен значительно хуже. Также обязательными ингредиентами препарата являются антиоксидант – аскорбиновая кислота, хлорид кальция – как абсорбирующий агент и БСА.

Следует обратить особое внимание на тот факт, что защитный эффект этой композиции проявлялся и при низких конечных концентрациях ее ингредиентов (ВИРИН ХСК - 0,4%, альгинат натрия - 0,03 %, БСА - 0,01 %, хлорид кальция - 0,03 % и аскорбиновая кислота - 0,01 %). Эта препаративная композиция использовалась в дальнейшем при проведении полевых испытаний энтомопатогенных вирусных препаратов.

Отработка методов культивирования личинок насекомых на искусственной питательной среде препаратов на основе ВЯП была разработана технология производства бакуловирусов, которая включает следующие стадии: культивирование маточной линии насекомых, инфицирование насекомых, культивирование инфицированных гусениц на ИПС, сбор биомассы погибших гусениц, выделение и очистка вируса, получение готового препарата.

Одним из важнейших ее участков является культивирование насекомыхфитофагов – продуцентов бакуловирусов.

Искусственная питательная среда (ИПС) является одним из источников инфицирования насекомых в процессе их массового культивирования.

Контаминирующая флора снижает выход биоматериала и отрицательно влияет на его качество.

С целью подавления микрофлоры в ИПС обычно вводят ингибиторы роста микроорганизмов и консерванты, кроме того, для поверхностной стерилизации среды применяют УФ-облучение. Однако бактериостатический эффект, достигаемый этими приемами, значительно снижается за время жизненного цикла насекомого.

Многокомпонентность и сложность состава ИПС не позволяют применять традиционные тепловые методы стерилизации (автоклавирование, прокаливание), так как они вызывают необратимые изменения среды и ухудшают ее технологические свойства. Поэтому для этих целей нами было использовано электромагнитное поле (ЭМП) сверхвысокой частоты (СВЧ).

Мы провели эксперименты по определению эффективности применения СВЧ-обработки для стерилизации компонентов ИПС. Были протестированы ИПС, разработанные для питания личинок хлопковой совки с естественным уровнем загрязненности, а также модельные – с введением тест-культур E. coli и B. thuringiensis в предварительно стерилизованные составляющие стандартной ИПС. Обработку 0,5 кг компонентов ИПС проводили в ЭМП СВЧ мощностью 500 Вт при варьировании длительности экспозиции от 15 до 120 с. Эффективность стерилизации оценивали по общему микробному числу. Критерием питательной ценности среды служила масса куколок, плодовитость имаго при содержании личинок на средах, обработанных СВЧ, и контрольных.

Было показано (рис. 1), что гибель бесспоровых микроорганизмов (E. coli) достигает 100 % через 90 с.

Спорообразующие бактерии в течение 90 с сохраняли жизнеспособность в СВЧ-поле, но через 120 с наступала их полная инактивация. На кривой, изображающей динамику гибели микрофлоры в стандартной среде, содержащей как споровые, так и бесспоровые микроорганизмы, имеется «плато», соответствующее периоду устойчивости B. thuringiensis, но через 2 мин также обнаруживается 100 %-ный бактерицидный эффект.

Логарифм общего микробного Биологические показатели развития лабораторных культур хлопковой и капустной совок при содержании на среде, подвергнутой СВЧ-обработке, в сопоставлении с контрольными образцами свидетельствуют о сохранении питательных свойств ИПС для насекомых (табл. 4).

Биологические показатели культур насекомых при развитии на ИПС, Масса куколок ±2 (мг) Плодови- Масса куколок ±2 (мг) Плодовитость Варианты Опыт 355,4±13,1 361,5±7,6 1148±272 469,8±9,9 461,3±6,1 1395± (СВЧ) промышленном культивировании насекомых для снижения контаминации ИПС микрофлорой.

обычно наблюдается снижение жизнеспособности лабораторных популяций, и культура насекомых вымирает. Разработанная методика позволяла получать 30 генераций хлопковой совки с достаточно стабильными и высокими биологическими характеристиками (табл. 5).

Основные показатели развития хлопковой совки при ее непрерывном Контроль качества маточной линии насекомых проводили, используя коэффициент размножения, который не должен быть ниже 200. Величину коэффициента размножения рассчитывали по следующей формуле:

R=GKDFE, где R – коэффициент размножения;

G – выживаемость гусениц;

K – выживаемость куколок;

D – доля самок от общего числа имаго;

F – плодовитость одной самки;

E – доля фертильных яиц.

На основании этой методики были сформулированы исходные данные на проектирование установки по массовому разведению ХС, в состав которой вошли следующие элементы:

выращивания личинок насекомых (температура, влажность фотопериод);

- дозатор яиц жидкостной – для дозирования яиц совок в контейнеры (чашки Петри);

- камера для содержания имаго насекомых;

- контейнер 2-х ячеистый – для выращивания личинок насекомых;

- приставка дозатора ИПС – для распределения ИПС в контейнеры;

- устройство для стерилизации компонентов ИПС.

Разработка технологии производства бакуловирусных препаратов Помимо культивирования маточной линии процесс производства инсектицидов на основе ВЯП включает в себя инфицирование насекомых, сбор и очистку вирусной биомассы.

Одним из наиболее трудоемких этапов культивирования ВЯП является инфицирование личинок насекомых вирусом.

Рис. 2. Аэрозольная установка для заражения насекомых ВЯП.

1 – чашка Петри с ИПС и гусеницами; 2 – подставка для чашек с направляющими, по которой передвигаются чашки Петри с гусеницами; 3 – малая динамическая камера (МДК-2); 4 – распылитель прямого действия (РПД); 5 – отверстие, через которое из распылителя в камеру попадает аэрозоль, содержащий суспензию вируса; 6 – компрессор-установка УК25-1.6М (ТУ 64сборник с рабочей суспензией вируса; 8 – магнитная мешалка; 9 – перистальтический насос Для упрощения и механизации этого процесса нами была разработана методика аэрозольного инфицирования гусениц. Аэрозольная установка (рис. 2) была специально изготовлена для инфицирования гусениц, находящихся на ИПС в чашках Петри диаметром 100 мм. В состав установки входят распылитель прямого действия РПД-1 (4), подставка для чашек с направляющими (2) и аэрозольная камера (3). Подача воздуха в распылитель осуществляется с помощью компрессора (6). Подача рабочего раствора с вирусом из сборника (7), установленного на магнитной мешалке (8), осуществляется с помощью перистальтического насоса (9).

Аэрозольная установка позволяла одновременно инфицировать до гусениц, размещенных в чашке Петри. Время экспонирования насекомых в камере составляло 5-7 с.

Первоначально было проведено изучение устойчивости ВЯП при распылении. Для этого пробы аэрозоля отбирали на чистые чашки Петри, после чего устойчивость вируса определяли путем сравнения его биологической активности до и после распыления. Результаты этих исследований представлены в табл. 6.

Сравнительные характеристики биологической активности изолятов На основании этих результатов был сделан вывод о высокой устойчивости ВЯП при распылении и витании в аэрозоле.

В следующей серии экспериментов было проведено сравнительное инфицирование гусениц оральным и аэрозольным способами. При этом учитывались следующие параметры:

- биологическая эффективность (процент гусениц, погибших через 14 суток после заражения);

- выход вируса в расчете на 1 инфицированную гусеницу;

- трудоемкость;

- расход материалов.

достоверных различий в отношении «Выход вируса/Расход вируса» при использовании рассматриваемых способов инфицирования. Однако при компонентов сред.

Результаты сравнительного инфицирования гусениц оральным и ВЯП НШ через корм ВЯП НШ заражение ВЯП НШ через корм ВЯП НШ заражение Применение аэрозольного метода дало возможность механизировать и, как минимум, в 6 раз ускорить процесс инфицирования гусениц.

Исследование путей распространения бакуловирусной инфекции в естественных условиях Следующим этапом нашей работы являлось моделирование путей горизонтальной передачи вирусной инфекции в популяции непарного шелкопряда. Мы исследовали три возможные модели передачи вируса от зараженных гусениц непарного шелкопряда к незараженным:

1) Инфицированные и неинфицированные гусеницы содержались и питались совместно (возможен комплексный путь передачи инфекции:

контактный, оральный, воздушный).

2) Инфицированные и неинфицированные гусеницы находились в непосредственной близости друг с другом, но были лишены возможности совместно питаться (возможен воздушный путь передачи инфекции).

3) Неинфицированные гусеницы питались на листьях, на которых ранее находились инфицированные гусеницы (возможен оральный путь передачи инфекции).

Оценка эффективности путей передачи вирусной инфекции проводилась в 3 этапа: 1) подготовка гусениц-носителей инфекции; 2) моделирование перечисленных вариантов; 3) учет гибели насекомых в лабораторных условиях.

Бакуловирусную этиологию гибели гусениц определяли с помощью светового микроскопирования содержимого погибших гусениц. Результаты исследования путей горизонтальной передачи инфекции ВЯП представлены на рис. 3.

В положительном контроле мы наблюдали типичную динамику гибели гусениц от полиэдроза. В тестовых пробах гибель гусениц происходила не только от полиэдроза, но и от сопутствующих заболеваний. Гибель гусениц в отрицательном контроле была достоверно ниже любого из опытных вариантов. Кроме того, в контроле с незараженными насекомыми (контроль «-») и в опыте 2 (т) гусениц, погибших от полиэдроза, не было.

В положительном контроле мы наблюдали типичную динамику гибели гусениц от полиэдроза. В тестовых пробах гибель гусениц происходила не только от полиэдроза, но и от сопутствующих заболеваний. Гибель гусениц в отрицательном контроле была достоверно ниже любого из опытных вариантов. Кроме того, в контроле с незараженными насекомыми (контроль «-») и в опыте 2 (т) гусениц, погибших от полиэдроза, не было.

Рис. 3. Динамика гибели тестовых гусениц от полиэдроза. 1 – опыт 1 (т), комплексный путь передачи инфекции: инфицированные и неинфицированные гусеницы содержались и питались совместно;

2 – опыт 2 (т), воздушный путь передачи инфекции:

неинфицированные гусеницы, содержались в непосредственной близости, но без контакта с инфицированными гусеницами; 3 – неинфицированные гусеницы питались на листьях, на которых ранее находились инфицированные гусеницы; 4 – контроль «+»:

гусеницы, инфицированные вирусом; 5 – контроль «-»: гусеницы, не инфицированные вирусом В положительном контроле мы наблюдали типичную динамику гибели гусениц от полиэдроза. В тестовых пробах гибель гусениц происходила не только от полиэдроза, но и от сопутствующих заболеваний. Гибель гусениц в отрицательном контроле была достоверно ниже любого из опытных вариантов. Кроме того, в контроле с незараженными насекомыми (контроль «-») и в опыте 2 (т) гусениц, погибших от полиэдроза, не было.

Результаты наших исследований показали, что из рассмотренных моделей эффективными путями передачи бакуловирусной инфекции следует считать комплексный, при котором обеспечивался контакт между больными и здоровыми насекомыми при их совместном питании, и оральный, когда неинфицированные гусеницы питались на листьях, на которых ранее находились инфицированные гусеницы. Однако даже в отсутствии таких контактов нахождение в непосредственной близости зараженных гусениц приводило к снижению устойчивости здоровых насекомых к другим заболеваниям.

Полученные результаты свидетельствуют также и о том, что эпизоотии в популяциях на стадии нарастания численности спонтанно возникнуть не могут. Чтобы контролировать вредителя, необходимо искусственно вносить вирус в популяцию.

Полевые испытания препарата ВИРИН НШ С использованием разработанной нами технологии была изготовлена опытная партия препарата ВИРИН НШ на основе ВЯП НШ-2-85. Испытания вирусного препарата ВИРИН НШ были проведены на территории Абатского и Сорокинского лесхозов Тюменской области. Суммарно площадь обработанных очагов составила 15 тыс. га.

Испытания проводились с помощью наземно-очагового метода. Расход препарата составил 3 г на 1 га.

Интактные участки выбирались как в непосредственной близости от обработанных вирусом, так и на расстоянии десятков километров от них.

Учеты численности показали, что гибель насекомых, у которых диагностировался полиэдроз, на участках, обработанных вирусом, варьировала от 21 % до 74 %, а на необработанных – от 0 % до 32 %. В большинстве интактных участков, расположенных рядом с обработанными, достоверных различий в количестве погибших насекомых по сравнению с инфицированными участками отмечено не было, что можно объяснить миграциями непарного шелкопряда.

Часть насекомых, у которых микроскопически диагностировался полиэдроз, была поражена энтомофагами, отмечалась также гибель от смешанной вирусно-бактериальной инфекции. Сходные результаты были получены при применении коммерческого препарата “Gypchek” (США) против непарного шелкопряда в Германии.

На следующий год после дефолиации кроны деревьев практически полностью восстанавливались на всех участках. Численность непарного шелкопряда сокращалась до экономически незначимого уровня. Таким образом, испытания препарата показали, что наряду с недостатком, характерным для бакуловирусов, связанным с длительным инкубационным периодом, препарат обладает высокой биологической эффективностью.

Удовлетворительные результаты испытаний препарата ВИРИН НШ сделали возможным расширение зоны его применения: он использовался для биологического подавления непарного шелкопряда в Новосибирской области, Алтайском крае и Восточном Казахстане.

Полевые испытания препарата ВИРИН ХСК Испытания препарата ВИРИН ХСК проводились в течение двух лет на хлопковых полях Наманганской и Ташкентской областях Республики Узбекистан: в 2007 - 2008 годах. Обработку проводили с помощью ручного опрыскивателя К-90 и тракторного опрыскивателя ОВХ-28. Результаты, приведенные в табл. 8 свидетельствуют, что во всех случаях снижение численности на обработанных участках было достоверно выше, чем на контрольном участке. И уже через 7 суток количество вредителей снижалось до экономически безопасного уровня. Применение препарата с более высоким содержанием вируса приводило к более значительному снижению количества гусениц. Результаты, полученные после обработки хлопковых полей вирусным препаратом и химическим препаратом «Регент», достоверно не различаются.

Повторные испытания, проведенные в 2008 г. в других фермерских хозяйствах, подтвердили высокую эффективность препарата ВИРИН ХСК.

Объем условно-сохраненного урожая хлопчатника при применении ВИРИН ХСК составил 2,3 ц/га по сравнению с контролем, в то время как применение эталонного препарата повышало урожайность только на 1,5 ц/га.

Биологическая эффективность ВИРИН ХСК в борьбе с хлопковой совкой на хлопчатнике в фермерском хозяйстве «Дилфуза-Хасанбай-Зухрахон»

Чартакского района Наманганской области в 2007 г.

Вариант, тип Норма Число гусениц на 100 растений и процент выживших опрыскивателя расхода гусениц относительно исходной численности («Регент» 0,012 % КЭ) выполненный по стандартной методике по Э.И. Газиянц, представлен в табл. 9. Урожайность на поле, на котором не производились инсектицидные обработки, составила 29 ц/га. Стоимость хлопка взята по состоянию на июль 2010 г. – 200 $ США за 1 ц.

Рассчитанная экономическая эффективность в случае применения препарата ВИРИН ХСК оказалась почти на 25 % выше, чем при применении высокоэффективных пиретроидов, и составила около 425 $/га в сравнении с необработанным участком.

Следует отметить, что в 2008 г. при обследовании полей, обработанных препаратом ВИРИН ХСК в 2007 г., было установлено, что численность хлопковой совки не превышала экономически безопасного уровня. Таким образом, наблюдался пролонгированный эффект действия препарата ВИРИН ХСК. Следовательно, эффективность экологически безопасного препарата ВИРИН ХСК оказалась значительно выше, чем эффективность химических препаратов.

Расчет экономической эффективности применения препарата ВИРИН ХСК и пиретроидов по сравнению с контролем (не обработанным инсектицидами Показатели Затраты на уборку и транспортировку сохраненного урожая с 1 га, $ Реализационная стоимость прибавочного урожая хлопка-сырца с 1 га, $ Экономическая эффективность по условно чистому доходу, $/га По результатам испытаний данный препарат был включен в список разрешенных к применению в качестве инсектицидного препарата в Республике Узбекистан. На препарат ВИРИН ХСК получены патенты РФ и Казахстана.

1. Получены и запатентованы высокопатогенные для целевых насекомых вирусные штаммы ВЯП ХС-17 и ВЯП НШ-2-85. Показано, что важнейшими элементами производства вируса ядерного полиэдроза являются контроль биологической активности используемого изолята и проведение работ по поддержанию его высокой патогенности к целевому насекомому.

2. Разработана новая высокоэффективная композиция рабочего раствора для бакуловирусных препаратов, содержащая альгинат натрия, бычий сывороточный альбумин, хлорид кальция и аскорбиновую кислоту, значительно повышающая их устойчивость к УФ-излучению.

3. Создан и запатентован новый энтомопатогенный препарат ВИРИН ХСК для борьбы с хлопковой совкой, качественные характеристики которого отражены в технических условиях ТУ-2441-016-05664012-10. Разработаны и испытаны макеты оборудования для крупномасштабного культивирования насекомых и производства энтомопатогенных препаратов на основе ВЯП НШ и ВЯП ХС. Разработан лабораторный регламент на производство препарата «ВИРИН ХСК» ЛР 05664012-007-11.

4. Показаны пути горизонтального распространения инфекции ВЯП и необходимость искусственного внесения бакуловирусов в экосистемы для регуляции численности насекомых-вредителей.

5. Показана высокая эффективность препаратов ВИРИН ХСК и ВИРИН НШ при их полевых испытаниях как средства контроля популяций целевых насекомых (хлопковой совки и непарного шелкопряда). По результатам проведения государственных испытаний препарат ВИРИН ХСК рекомендован Государственной комиссией республики Узбекистан к применению для борьбы с вредителем хлопка – хлопковой совкой. В соответствии с «Положением о регистрационных испытаниях и регистрации пестицидов, агрохимбиопрепаратов и минеральных удобрений в Республике Узбекистан» на данный препарат получено регистрационное свидетельство № 1 А 123.

По своим защитным и экономическим показателям препарат ВИРИН ХСК превосходит традиционные химические и биосинтетические инсектициды.

Список научных работ опубликованных по теме диссертации 1. Горбунова Е.Е., Колосов А.В., Борисова О.Д., Зайцев Б.Н., Божко Н.А.

Сравнительная характеристика изолятов вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда // Вопросы вирусологии. - 1997. - № 1. - C. 41-43.

2. Ильиных А.В., Мамонтова С.А., Петров В.С., Колосов А.В. Регуляция численности непарного шелкопряда (Ocneria dispar L.) в Западной Сибири // Биотехнология. - 1997. - № 3. - C.45-47.

3. Колосов А.В., Ильиных А.В., Золина Е.Д., Борисова О.Д., Сергеев А.Н., Рыжиков А.Б., Ананько Г.Г. Сравнительное изучение аэрозольного и орального методов инфицирования гусениц непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.) вирусом ядерного полиэдроза // Вопросы вирусологии. – 1999. - № 4. - C. 183-186.

4. Хашимова М.Х., Ахмедова З.Ю., Хамраев А.Ш., Колосов А.В.

Биологическая эффективность препарата ВИРИН ХСК в борьбе с хлопковой совкой (Нelicoverpa armigera Нbn.) на посевах хлопчатника // Вестник НУУз.

- Ташкент, 2008. - № 4. - С. 124-125.

5. Колосов А.В., Косогова Т.А., Булычев Л.Е., Сергеев А.Н. Пути горизонтальной передачи бакуловирусной инфекции у непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.) // Вопросы вирусологии. – 2010. - № 5. - C.

43-47.

6. Колосов А.В., Кошелев Ю.А., Агзамова Х.К., Артыкбаев П.К., Залесов А.C., Трошкова Г.П. Исследование устойчивости вируса ядерного полиэдроза в окружающей среде // Современные наукоемкие технологии. – 2010. - № 9. С. 131-132.

Материалы научных конференций 7. Горбунова Е.Е., Караваев В.С., Иванова В.П., Колосов А.В. Технология получения вирусной биомассы ВЯП непарного шелкопряда. Отраслевое совещание «Биологические и технологические проблемы создания вирусных препаратов для интегрированной защиты растений». – Новосибирск, Россия.

- сент. 26-29, 1989. – С. 32.

8. Колосов А.В., Горбунова Е.Е. Технология получения вирусной биомассы вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда. Международная научнопрактическая конференция «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней» – Одесса, Украина. – сент. 12-16, 1994. – С. 180.

9. Божко Н.А., Колосов А.В., Горбунова Е.Е. Научно-технические аспекты разработки вирусных энтомопатогенных препаратов. Международная научно-практическая конференция «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней» – Одесса, Украина. – сент. 12-16, 1994. – С. 182.

10. Kolosov A.V., Ilyinykh A.V., Bakhvalov S.A., Petrova I.D., Petrov V.S., Kuzminov S.V. Regulation of Gypsy Moth (Lymantria dispar L., Lepidoptera:

Lymantriidae) Number in Birch Forests. Proceedings of the international conference: «Achievements of biotechnology for the future of mankind». – Samarkand, Uzbekistan. – June 11-14, 2001. – P. 76.

11. Колосов А.В., Тотменина О.Д., Косогова Т.А., Пугачев В.Г., Клячко Н.Л., Репин В.Е. Разработка систем защиты вирусов ядерного полиэдроза от влияния УФ-излучения и высыхания. Международная научно-практическая конференция «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование». – Иркутск. – окт. 27-28, 2004. – С. 33-34.

12. Колосов А.В., Косогова Т.А. Изучение передачи бакуловирусной инфекции между личинками непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.).

Материалы международной научно-практической конференции «Технологии создания биологических средств защиты растений на основе энтомофагов, энтомопатогенов, микробов-антагонистов и применения их в открытом и закрытом грунтах». – Краснодар. – сент. 20-22, 2006. – С. 147Косогова Т.А., Колосов А.В., Ананько Г.Г., Теплякова Т.В., Репин В.Е.

Исследование инфекционности бактерий, выделенных из погибших личинок колорадского жука, инфицированных энтомопатогенными нематодами.

Международная научно-практическая конференция «Технологии создания биологических средств защиты растений на основе энтомофагов, энтомопатогенов, микробов-антагонистов и применения их в открытом и закрытом грунтах». – Краснодар. – сент. 20-22, 2006. – С. 198-200.

14. Колосов А.В., Пугачев В.Г., Клячко Н.Л., Косогова Т.А., Репин В.Е.

Разработка систем защиты вирусов ядерного полиэдроза от влияния УФизлучения и высыхания. Международная научно-практическая конференция «Технологии создания биологических средств защиты растений на основе энтомофагов, энтомопатогенов, микробов-антагонистов и применения их в открытом и закрытом грунтах». – Краснодар. – сент. 20-22, 2006. – С. 460Kolosov A.V., Hashimova M.H., Hamraev A.Sh. The effect of the preparation VIRIN HSK against Helicoverpa armigera Hbn. 28th Pakistan congress of Zoology. March 18-20, 2008. - GC University. - Faisalabad, Pakistan. – P. 45.

16. Кошелев Ю.А., Колосов А.В., Хамраев А.Ш., Хашимова М.Х., Ахмедова З.Ю., Залесов А.С., Ильиных А.В. Контроль численности хлопковой совки (Helicoverpa armigera Hbn.) с использованием бакуловирусов.

Международная научно-практическая конференция посвященная 40-летию со дня организации РУП «Институт защиты растений» «Интегрированная защита растений: стратерия и тактика». – Минск. – июль 5-8, 2011. – С. 882Патенты на изобретения 17. Божко Н.А., Горбунова Е.Е., Петрова И.Д., Колосов А.В., Караваев В.С.

Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда, используемый для получения инсектицидов. Патент РФ № 2117701 от 31.07.1996, опубл.

20.08.1998 г.

18. Божко Н.А., Горбунова Е.Е., Петрова И.Д., Караваев В.С., Колосов А.В.

Штамм вируса ядерного полиэдроза капустной совки, используемый для получения инсектицидов. Патент РФ № 2153258 от 08.02.1999, опубл.

27.07.2000, БИ № 21.

19. Кошелев Ю.А., Рыжиков Г.А., Репин В.Е., Колосов А.В. Штамм вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn., используемый для получения инсектицидного препарата. Патент РФ № 2359031 от 10.12.07, опубл. 20.06.2009.

20. Кошелев Ю.А., Рыжиков Г.А., Репин В.Е., Колосов А.В. Залесов А.С.

Препарат для борьбы с хлопковой совкой. Патент РФ № 2396750 от 07.10.2008, опубл. 20.08.2010, БИ № 23.

21. Кошелев Ю.А., Рыжиков Г.А., Репин В.Е., Колосов А.В. Залесов А.С.

Препарат для борьбы с хлопковой совкой. Патент KZ № 23714 от 24.08.2009, опубл. 23.12.2010.

БСА – бычий сывороточный альбумин ВЯП – вирус ядерного полиэдроза ИПС – искусственная питательная среда КЭ – концентрат эмульсии ЛВ50 – время, за которое погибают 50 % насекомых ЛД50 – доза вируса, вызывающая 50 % гибель насекомых МДК – малая динамическая камера НШ – непарный шелкопряд (Lymantria dispar L.) ПАВ – поверхностно-активные вещества СВЧ – сверхвысокие частоты УФ – ультрафиолетовое (излучение) ХС – хлопковая совка (Helicoverpa armigera Hbn.) ЭМП – электромагнитное поле Bt – Bacillus thuringiensis