Рисунок 2 – Морфология мицелия штамма G. a.-04 Ganoderma applanatum.

Стрелками указаны: А – пряжки, Б – коралловидный мицелий; В – дикариотический мицелий; Г – тонкий мицелий Наиболее высокими показателями ростового коэффициента отличались штаммы T. versicolor. Штаммы, выделенные из плодовых тел 2-х и 3-х летнего возраста также были выделены в две группы: имеющие ростовой коэффициент на сусло-агаре от 85,60 до 94,50 и среднесуточную скорость роста 3, 25 – 3,85, штаммы, имеющие более низкие показатели ростового коэффициента (78,80-82,50) и среднесуточную скорость роста 2,80 – 3,5). Но наибольший ростовой коэффициент (103,40) на сусло-агаре отмечен у штамма В18/91 T. versicolor, выделенного в 1999 г. Среднесуточная скорость роста этого штамма составляла 4,93, а ростовой коэффициент 103, что, вероятно, связано с многолетним поддержанием штамма в лабораторных условиях в активном состоянии. Все штаммы T. versicolor хорошо культивируется на агаризованных питательных средах с образованием густого разветвленного, септированного мицелия, с многочисленными пряжками одиночного типа. Вегетативное спороношение не выявлено. Для дальнейших исследований был использован штамм В18/91 T. versicolor (рисунок 3).

Рисунок 3 - Морфология мицелия штамма В 18/91 Trametes versicolor. Стрелками указаны: А – мицелий разной толщины с пряжками; Б – пряжка и утолщение клетки мицелия; В – вздутия в районе септ; Г – скелетный мицелий с толстыми клеточными стенками; Д – дикарион; Е – дикариотический мицелий Оценка динамики роста мицелия изучаемых штаммов на агаризованных питательных средах показала, что максимальная колонизация субстратов достигается в различный период. Наилучшими агаризованными питательными средами, по показателям среднесуточной скорости роста и ростовому коэффициенту для культивирования Fomitopsis officinalis и Ganoderma applanatum являются сусловый агар и сусловый агар с добавлением 1% лиственничных опилок (таблица 1).

Таким образом, на основании показателей ростового коэффициента и среднесуточной скорости роста на всех питательных средах к быстро растущим был отнесен В 18/91 T. versicolor, тогда как штаммы Tyv-2006 F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum – к медленно растущим. Для накопления биомассы для штаммов Tyv- F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum следует использовать сусло с добавлением 1% лиственничных опилок, а для штамма 18/91 T. versicolor питательную среду, содержащую крахмал и декстрозу.

Таблица 1 – Ростовые показатели изучаемых штаммов базидиомицетов на агаризованных питательных средах Питательная среда Примечание: в числителе – показатель среднесуточной скорости роста штамма, в знаменателе – ростовой коэффициент Исследования влияния температуры на скорость роста штаммов показали, что для штамма Tyv-2006 F. оfficinalis наиболее оптимальной является температура 25- С, тогда как для роста мицелия штаммов G. applanatum и T. versicolor – 15-25 оС.

Гриб F. оfficinalis начал осваивать субстрат на сусловом агаре лишь при +25 оС, тогда как при росте на сусловом агаре с добавлением 1% лиственничных опилок – при С. Незначительный рост при самой низкой исследуемой температуре (+5 оС), был зафиксирован у гриба T. versicolor.

Следует отметить, что при понижении температуры культивирования до +15 оС изменялась морфология колонии штаммов G. applanatum и T. versicolor: воздушный мицелий становился рыхлым, паутинистым. Вместе с тем, более высокий (низкий) уровень среднесуточной скорости роста и ростового коэффициента изучаемых штаммов по отношению друг другу, имеет тенденцию сохраняться при всех температурах культивирования. Наиболее четко это прослеживается для штамма В 18/91 T. versicolor. Исследования показали, что по отношению к температуре роста штамм TyvF. оfficinalis, является стенотермным, а штаммы G.a.-04 G. applanatum и В 18/ T. versicolor эвритермными.

Исследование показали, что гриб T. versicolor способен расти в широком диапазоне значений рН питательной среды – от 3,5 до 7,5. Однако максимальные значения среднесуточной скорости роста 4,95, 4,80 и 4,55 мм для штамма В 18/91 отмечены на среде со значениями рН 5,5, 6,0 и 6,5. Максимальные значения скорости роста мицелия штаммов Tyv-2006 F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum отмечены в диапазоне значений рН среды от 5,5 до 6,5 мм. Рост не наблюдается при значением рН 3,5 и ниже, а для штамма F. оfficinalis и при 7,5.

Интенсивность развития грибов достоверно можно оценить по накоплению биомассы мицелия при выращивании на жидких питательных средах, т.к. на агаризованных питательных средах при равном диаметре колонии значительно отличаются по плотности и высоте. Как показали исследования, при поверхностном культивировании на жидкой питательной среде неохмеленное сусло, которая была использована для сравнительной характеристики штаммов, наибольшее накопление биомассы наблюдалось у штамма В 18/91 T. versicolor, что подтверждает его высокие ростовые характеристики (средний РК = 100).Так максимальное количество биомассы у штамма В 18/91 T. versicolor на 20 и 30-е сутки культивирования составило 21,70±0,28 и 23,01±0,54 г/л, тогда как у базидиомицетов G. аpplanatum и F. оfficinalis – 15,95±0, и 4,84±0,11 г/л, соответственно (рисунок 4).

Рисунок 4 – Динамика накопления биомассы мицелия чистой культуры базидиомицетов при жидкофазном поверхностном культивировании на пивном сусле, г/л Таким образом, при поверхностном культивировании на жидкой питательной среде неохмеленное сусло наибольшее накопление биомассы наблюдалось у штамма В 18/91 T. versicolor, что подтверждает его высокие ростовые характеристики на агаризованных питательных средах (средний РК = 100). Вторым, по интенсивности накопления биомассы мицелия, явился штамм G.a.-04 G. applanatum. Следует отметить, что извлеченная после культивирования мицелиальная пленка характеризовалась очень высокой плотностью и складчатой внутренней поверхностью. Самый низкий уровень накопления биомассы отмечен для штамма Tyv-2006 F. оfficinalis, количественный показатель биомассы которого на 40-е сутки культивирования составил лишь 5,22 г/л, но при добавлении в питательную среду 1% лиственничных опилок количество биомассы увеличилось в 2 раза.

Биохимический состав мицелия и плодовых тел базидиомицетов Большое значение для получения биомассы базидиомицетов имеет количество в нем белка, углеводов, липидов, витаминов, экстрактивных и минеральных веществ.

Биомассу мицелия для биохимического исследования наращивали путем жидкофазного культивирования на пивном сусле (4 оБ). Cодержаниt общего количества белка, углеводов и липидов определяли в мицелии 10, 20 и 30-ти суточного возраста медленно растущих штаммов Tyv-2006 F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum и 5, 10 и 15ти суточного мицелия быстро растущего штамма В 18/91 T. versicolor.

Для исследования качественного и количественного состава аминокислот, экстрактивных веществ, витаминов, золы и минерального состава в мицелии изучаемых штаммов был использован 30-ти суточный мицелий медленнорастущих штаммов Tyv-2006 F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum и 15-ти суточный мицелий штамма В 18/91 T. versicolor.

Одной из важных характеристик как плодовых тел, так и мицелия грибов является содержание экстрактивных веществ, которое дает возможность установить качество экстракта получаемого растительного сырья. Известно, что процесс извлечения экстрактивных веществ зависит от ряда факторов, таких как состав сырья, продолжительность экстракции и температура (Государственная фармакопея, 1989; Краснюк и др., 2006). Исследования показали, что суммарный выход экстрактивных веществ из мицелия и плодовых тел зависит от температуры и условий экстракции. Так, при температуре 20-22 оС количество экстрактивных веществ значительно ниже, чем при С. Время экстракции также влияет на выход экстрактивных веществ: так в условиях исчерпывающей экстракции (при 100 оС в течение 24-72 часов) повышается выход экстрактивных веществ из мицелия и плодовых тел всех изучаемых штаммов. Причем, количество экстрактивных веществ в мицелии гриба T. versicolor увеличивается в условиях исчерпывающей экстракции, по сравнению с холодной экстракцией в раз. Тогда как для всех остальных исследуемых образцов это соотношение составило 1:2 или 1:3 (таблица 2).

Таблица 2 – Количество экстрактивных веществ в мицелии и плодовых телах высших базидиомицетов полученных путем холодной (1), горячей (2) и исчерпывающей (3) экстракции, % Базидиомицет F. officinalis 40,96±0,33 51,09±0 71,58±1,12 3,59±0,07 8,36±0,20 8,48±0, G. applanatum 10,81±0,06 20,03±0,21 34,31±0,08 5,94±0,24 10,96±0,41 20,03±0, T. versicolor 3,39±0,16 15,30±0,04 23,33±0,35 3,56±0,13 8,92±0,27 18,45±0, Из представленной таблицы видно, что количество экстрактивных веществ в мицелии максимально у штамма F. officinalis, тогда как в плодовом теле – у гриба G.

applanatum.

Исследования по определению общего содержания белка показали, что наибольшее количество общего белка содержится в биомассе мицелия штамма Tyv- F. officinalis и с возрастом оно увеличивается и на 10, 20 и 30-е сутки культивирования и составляет 12,05, 14,34 и 15,68 %, соответственно. Содержание общего белка в мицелии этого гриба в 10 раз больше, чем в плодовых телах, количество которого составляет только 1,53 %. Полученные результаты по содержанию белковых веществ в плодовых телах F. officinalis согласуются с литературными сведениями (Ооржак и др., 2004; 2006), согласно которых количество белковых веществ зависит от возраста плодовых тел, и составляет от 4,84 до 1,39 %.

Доля общего белка в мицелии гриба G. applanatum на 10, 20 и 30-е сутки культивирования составляет 8,28, 10,03 и 10,74 %, соответственно, тогда как доля общего белка в плодовых телах составляет 9,95 %, т.е. количественные показатели доли общего белка в мицелии и плодовых телах гриба мало различаются. Незначительно с возрастом изменяется доля общего белка в мицелии гриба T. versicolor. Так после 5, 10 и 15-ти суток культивирования на пивном сусле количество общего белка в мицелии составило 13,04, 13,86 и 14,63 % соответственно, а в плодовых телах гриба T. versicolor доля белка составляет 7,25 %, что почти в два раза ниже, чем в мицелии.

Сравнительная оценка аминокислотного состава мицелия и плодовых тел всех изучаемых базидиомицетов показала, что в исследуемых образцах содержание аминокислот в мицелии превышает таковое в плодовых телах. Причем среди незаменимых аминокислот в мицелии исследуемых базидиомицетов преобладают такие как изолейцин, лейцин и тирозин, тогда как в плодовых телах базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor – лейцин и тирозин, а в плодовых телах F. officinalis изолейцин, лейцин, тирозин, треонин и валин. Общее количество незаменимых аминокислот от общей суммы аминокислот в чистой культуре мицелия грибов G. applanatum, F.

officinalis и T. versicolor составляет 25,4, 34,8 и 23,9%, тогда как в плодовых телах – 20,2, 37,0 и 34,6%, соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что только в плодовых телах гриба T. versicolor содержание незаменимых аминокислот от общего количества аминокислот превосходит почти на 30% этот показатель в мицелии. Среди заменимых аминокислот, как в мицелии, так и в плодовых телах большое количество гистидина, аспарагиновой и глютаминовой кислот.

Биологическую активность многих грибов связывают с наличием в них углеводов, в том числе гликанов, гетерогликанов, гликозаминогликанов. По современным представлениям углеводы цитозоля клеток грибов, выполняют множество функций (Феофилова, 1997; Щерба, 2004).

Изучение биохимического состава штаммов базидиомицетов показало, что наибольшее количество общего количества полисахаридов в мицелии изучаемых штаммов выявлено у гриба T. versicolor, причем количество легкогидролизуемых углеводов в мицелии значительно отличается от количества трудногидролизуемых углеводов. Количество легко- и трудногидролизуемых углеводов в мицелии различного возраста штаммов G. applanatum и T. versicolor различается недостоверно. У гриба F.

officinalis, напротив, количество как легкогидролизуемых, так и трудногидролизуемых полисахаридов возрастает при культивировании штамма (таблица 3).

Таблица 3 – Доля углеводов в мицелии изучаемых базидиомицетов различного возраста, % Продолжительность культивирования штамма, сут Fomitopsis officinalis Ganoderma applanatum Trametes versicolor Сравнительный анализ доли углеводов в плодовых телах изучаемых базидиомицетов показал, что плодовые тела гриба T. versicolor содержат наибольшее количество легко- и трудногидролизуемых углеводов, тогда как плодовые тела базидиомицетов G. applanatum и F. officinalis характеризуются более низким содержанием общего количества углеводов, суммарный выход составил соответственно – 50,7, 23,2 и 12,63 % (таблица 4).

Таблица 4 – Содержание углеводов в плодовых телах базидиомицетов, % Fomitopsis officinalis Ganoderma applanatum Trametes versicolor Таким образом, наиболее перспективным источником, не менее ценных по сравнению с белками, веществ углеводной природы является мицелий всех изучаемых штаммов, которые могут представлять интерес для создания биологически активных добавок, а также с целью обогащения кормов для сельскохозяйственных животных. Кроме того, олигосахариды могут являться биологически активными соединениями, обладающими противоопухолевой и антимикробной активностью (Чхенкели, 1998; 2005).

Важное место среди биологически активных веществ занимают липиды, причем их ценность тем выше, чем больше в их составе важных в биологическом отношении фосфолипидов. Проведенные исследования по определению количества общих липидов в мицелии изучаемых штаммов показали довольно широкий диапазон данных (от 1,02 до 7,47 % от а.с.с.). Содержание общего количества липидов в мицелии гриба F. officinalis значительно различается от возраста культуры. Так 10-суточный мицелий содержит общую долю липидов в 2,5 раза меньше, чем 30-ти суточная культура штамма. Содержание липидов в мицелии базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor в зависимости от возраста различается незначительно (таблица 5).

Таблица 5 – Содержание липидов в мицелии базидиомицетов, % Продолжительность штамма, сутки Fomitopsis officinalis Ganoderma applanatum Trametes versicolor Из представленной таблицы видно, что общей закономерностью является преобладающее количество нейтральных липидов в составе общей фракции мицелия всех изучаемых штаммов различного возраста. Причем четкой тенденции к увеличению или уменьшению их количественного показателя с возрастом не прослеживается.

Количество гликолипидов значительно изменяется в зависимости от возраста культуры у гриба F. officinalis. Так, 10-ти суточный мицелий содержит на 40 % гликолипидов меньше, чем 30-ти суточный мицелий. Содержание гликолипидов у базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor в зависимости от возраста различается недостоверно.

На долю фосфолипидной фракции 30-ти суточного мицелия гриба F. officinalis приходится лишь 3,9 %, что в 3 раза больше, чем его доля в 10-ти суточном мицелии гриба. Наиболее высоким синтезом фосфолипидов характеризовались культуры мицелия грибов T. versicolor и G. applanatum. Причем, содержание фосфолипидов в мицелии гриба G. applanatum и T. versicolor изменяется с возрастом примерно на 30%.

Сравнительный анализ количественного определения доли общих липидов в плодовых телах изучаемых базидиомицетов показал, что отличительной чертой гриба F. officinalis является высокое содержание в его плодовых телах – 29,3 %, тогда как плодовые тела базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor содержат лишь 4,14 и 1,90 %, соответственно (таблица 6).

Таблица 6 – Содержание липидов в плодовых телах базидиомицетов, % Fomitopsis officinalis Ganoderma applanatum Trametes versicolor Из представленной таблицы видно, что наибольшее количество фосфолипидов содержат плодовые тела гриба T. versicolor. Количественный показатель в 10 и 2, раза выше, чем содержание таковых у базидиомицетов F. officinalis и G. applanatum, соответственно. Таким образом, по количеству общих липидов и фосфолипидов, для практического использования в различных отраслях народного хозяйства (пищевой, фармацевтической промышленности, медицине, косметологии и др.), мицелий базидиомицетов F. officinalis, G. applanatum и T. versicolor может представлять большую значимость.

Одним из наиболее важных компонентов плодовых тел F. officinalis является агарициновая кислота. Последние исследования зарубежных авторов доказывают, что агарициновая кислота является соединением, которое индуцирует проницаемость митохондрий путем связывания с аденин-нуклеотидтранслоказой, т.е. может использоваться при раковых новообразованиях (Гаврилин и др., 2006). Проведенный сравнительный анализ УФ-спектроскопии образца мицелия F. officinalis 30-ти суточного возраста и стандартного образца агарициновой кислоты (Sigma OLDRICH, Германия) показал идентичность спектров опытного и стандартного образцов (рисунок 5).

Полученные нами результаты не согласуются с данными О.М. Ефименко (1965), которая отмечала, что 30-40-суточный мицелий Fomitopsis officinalis не содержит агарициновой кислоты. Следовательно, мицелий Fomitopsis officinalis может быть использован для получения биологически активного соединения агарициновой кислоты.

Рисунок 5 – Уф-спектры раствора порошка, полученного из мицелия гриба Fomitopsis officinalis и стандартного образца, и стандартного образца агарициновой кислоты Перспективным биотехнологическим способом получения мицелия грибов – продуцентов биологически активных веществ может быть твердофазная ферментация растительных материалов. Для массовой наработки биомассы грибов необходимым этапом исследований является подбор дешевых и экологически безопасных растительных субстратов. В этой связи перспективным источником сырья для ферментации могут служить отходы деревообрабатывающей промышленности и сельского хозяйства. Как показали результаты исследования, для всех изучаемых штаммов лучшим субстратом для культивирования явилось измельченное зерно пшеницы, тогда как на гидролизном лигнине рост не был отмечен. Штамм гриба F. officinalis утилизировал лиственничные опилки и кору пихты, а штамм гриба T. versicolor утилизировал кору, древесную зелень пихты и лиственничные опилки. Скорость роста штаммов и характер формирования воздушного мицелия на различных субстратах были не одинаковы. Изучаемый штамм гриба G. applanatum не утилизировал отходы деревообрабатывающей и гидролизной промышленности.

Проведенный факторный эксперимент с использованием различных композиций из субстратов показал, что для наращивания мицелия пштамма-продуцента F. officinalis необходимо использовать композицию растительного субстрата, где доля лигнина 60%, древесной зелени пихты и коры пихты по 20%; для штамма гриба T.

versicolor субстраты, где доля лигнина 20%, древесной зелени пихты и коры пихты по 40%.

Изучение токсичности и зоопатогенности штаммов-продуцентов биологически активных веществ, является обязательным условием для возможности их рекомендации в массовое производство. Водные экстракты из мицелия и плодовых тел F. officinalis, G. applanatum и T. versicolor отнесены к классу нетоксичных. Культуральные жидкости, содержащие продукты метаболизма, штаммов G.a.-04 G. applanatum и В 18/91 T. versicolor являются нетоксичными, тогда как метаболиты штамма Tyv- F. officinalis – высокотоксичные.

Исследование химического состава метаболитов штамма Tyv-2006 F. officinalis методом хромато-масс-спектрометрии показало высокое содержание нервного яда – гидроксиметилфурфурола, количество которого в образцах составляет 60,04 % что, возможно, и определяет их токсичность.

Антимикробная активность водных экстрактов из мицелия и плодовых Многие макромицеты являются продуцентами широкого спектра антибиотиков и препаратов противоопухолевого и иммуномодулирующего действия. Повышенному интересу к грибам этой группы способствовали многочисленные исследования, показавшие, что они могут стать незаменимыми источниками для получения лекарственных препаратов, имеющих антимикробную активность (Низковская, 1983; Бухало и др., 1996; Даниляк, 1996; Чхенкели, 1998; 2006; Sliva, 2006; Ziegenbein et.al., 2006;

Gao et.al., 2002; Ikewawa, 2003; Jeong et.al., 2008 и другие).

В настоящее время часто при инфекционных заболеваниях различной этиологии используются лекарственные средства, обладающие либо крайне низкой активностью, либо имеющие высокий процент резистентности в отношении основных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний. В связи с этим весьма актуальна задача поиска новых продуцентов антибиотических веществ и препаратов, активных в отношении микроорганизмов, имеющих множественную лекарственную устойчивость (Сидоренко, 2002; Яковлев, 2002). Изучение антимикробной активности водных экстрактов из мицелия показало, что все тест-культуры оказались чувствительными к биологически активным соединениям, экстрагируемым водой из мицелия гриба T.

versicolor. Водный экстракт из мицелия G. applanatum обладает антимикробной активностью в отношении всех взятых для эксперимента тест-культур, кроме микроорганизмов рода Staphylococcus, из мицелия лиственничной губки обладает антимикробной активностью в отношении S. aureus, B. subtilis, P. aeruginosa 114, E. coli k-12, S. typhimurium, L. monocytogenes и C. freundii (таблица 7).

Водный экстракт из мицелия штамма Tyv-2006 F. officinalis проявлял среднюю степень антимикробной активности к микроорганизмам S. aureus, S. typhimurium и C.

freundii. Тогда как, среди тест-культур обладающих средней чувствительностью к биологически активным соединениям, экстрагируемым водой из мицелия штамма G.a.-04 G. applanatum оказались лишь C. albicans и B. subtilis. Остальные тесткультуры показали слабую чувствительность к исследуемым экстрактам. Следует отметить, что степень активности водных экстрактов из мицелия штамма В 18/91 T. versicolor, оценивается как средняя ко всем тест-культурам, за исключением микроорганизмов E. coli k-12, L. monocytogenes и Citrobacter freundii, где зоны вокруг лунок были менее 12 мм в диаметре, что свидетельствует о слабой чувствительности штаммов к биологически активным соединениям, экстрагируемым водой из мицелия гриба T.

versicolor.

Исследование культуральных жидкостей изученных грибов F. officinalis, G.

аpplanatum и T. versicolor, покзали, что антимикробную активность в отношении всех используемых в эксперименте тест-культур проявляют только метаболиты F.

оfficinalis. Следует отметить, что метаболиты гриба F. officinalis обладающие антимикробной и фунгицидной активностью, являются высокотоксичными.

Таблица 7 – Антимикробная активность водных экстрактов из мицелия изучаемых базидиомицетов Staphylococcus aureus Staphylococcus cohnii Staphylococcus epidermidis Staphylococcus warneri Staphylococcus haemolyticus Candida albicans Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa Escerichia coli k- Salmonella typhimurium Listeria monocytogenes Citrobacter freundii Примечание: « – » - активность не выявлена Водные экстракты из плодовых тел гриба T. versicolor оказывают антимикробную активность в отношении грамположительных стафилококков, в частности коагулазоположительного S. aureus и коагулазоотрицательного S. haemolyticus, тогда как действия экстрактов из плодовых тел базидиомицетов F. officinalis и G. applanatum в их отношении не выявлено.

Полученные данные свидетельствуют о том, что культуры исследуемых базидиомицетов F. officinalis, G. applanatum и T. versicolor могут быть использованы как продуценты биологически активных веществ, обладающих антимикробной активностью.

Противоопухолевые свойства водных экстрактов из мицелия и плодовых Повышенному интересу к дереворазрушающим базидиомицетам способствовали многочисленные исследования, показавшие, что эти организмы могут стать незаменимыми источниками для получения лекарственных препаратов, имеющих иммуномодулирующую и противоопухолевую активность. Наиболее активными считаются полисахариды, стероидные соединения и каротиноидные пигменты, проявляющие модифицирующее действие на активность клеток врожденного иммунитета (Краснопольская, 2007; Феофилова, 1996; 2006; Щерба и др., 2007; Cui et.al, 2003; Cao et.al., 2004; Jiang te.al., 2007; Muller et.al., 2006; Sliva, 2006; Moradali et.al., 2006). Исследование показало, что водные экстракты мицелия и плодовых тел всех изучаемых штаммов базидиомицетов, в той или иной степени оказывают цитопатическое действие на опухолевые клетки АКЭ. Результаты исследования in vivo, проведенные на мышах линии ICR, показали, что водные экстракты мицелия F. officinalis и плодового тела G. аpplanatum обладали выраженной противоопухолевой активностью. Объем и концентрация живых клеток опухоли достоверно снижался по сравнению с группой мышей, получавших противоопухолевый препарат циклофосфан, и с контрольной группой мышей, не получавших препараты.

Наиболее выраженное достоверное торможение роста опухоли (ТРО) регистрируется при введении экстракта из мицелия F. officinalis и составляет 77 %. Полученные данные о противоопухолевом действии сибирских штаммов базидиомицетовых грибов открывают новые возможности и перспективы использования в комплексной терапии рака биологически активных веществ, получаемых из биомассы мицелия продуцентов.

ВЫВОДЫ

2. Относительное содержание белка в мицелии грибов F. officinalis и T. versicolor увеличивается в процессе культивирования; доля общего белка в биомассе мицелия штамма Tyv-2006 F. officinalis в 10 раз превосходит его содержание в плодовых телах.

Содержание белка в мицелии грибов G. applanatum и T. versicolor при культивировании изменяется незначительно; доля общего белка в мицелии штамма T. versicolor почти в два раза выше, чем в плодовых телах. В мицелии штамма G.a.-04 G. applanatum содержание белка на 10 % выше, чем в плодовых телах.

Качественный состав аминокислот белка мицелия базидиомицетов характеризуется преобладанием незаменимых аминокислот изолейцина, лейцина и тирозина. В плодовых телах базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor – обнаружены - лейцин и тирозин, а в плодовых телах F. officinalis - изолейцин, лейцин, тирозин, треонин и валин.

3. При культивировании изученных грибов возрастает количество трудногидролизуемых (37,63±0,98) и легкогидролизуемых (13,14±0,19) полисахаридов у штамма F. officinalis, у штаммов G. applanatum и T. versicolor эти различия не обнаружены.

Наибольшее количество легко- и трудногидролизуемых углеводов содержат плодовые тела гриба T. versicolor, плодовые тела базидиомицетов G. applanatum и F. officinalis характеризуются более низким содержанием общего количества углеводов, составляющее соответственно – 50,7, 23,2 и 12,63 %.

4. В процессе культивирования всех изученных штаммов изменяется общее содержание липидов в мицелии, причем в составе общей фракции мицелия различного возраста преобладали нейтральные липиды. Содержание липидов, как в мицелии, так и в плодовых телах базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor различалось незначительно, их соотношение составило 1:1. Доля общих липидов в плодовых телах гриба F. officinalis в 4 раза выше, чем в биомассе мицелия. В липидной фракции мицелия и плодовых тел F. оfficinalis идентифицирована агарициновая кислота.

5. Штаммы грибов различаются характером и скоростью роста на различных питательных субстратах. Увеличение выхода биомассы медленно растущего штамма Tyv-2006 F. оfficinalis достигалось после обогащения питательной среды лиственничными опилками.

6. Штаммы базидиомицетов F. officinalis, G. applanatum и T. versicolor могут быть использованы в качестве продуцентов биологически активных веществ, обладающих антимикробной активностью в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий. Антимикробной активностью в отношении грамположительных стафилококков отличались водные экстракты из биомассы мицелия и плодовых тел гриба T. versicolor и культуральная жидкость штамма Tyv-2006 F. оfficinalis. Противокандидозной активностью обладали водные экстракты мицелия T. versicolor и G.

applanatum. Водный экстракт из мицелия штамма Tyv-2006 F. officinalis проявлял избирательное действие в отношении к микроорганизмов.

7. Водные экстракты мицелия всех изученных штаммов и культуральные жидкости, содержащие продукты метаболизма штаммов G. applanatum и T. versicolor, не являются токсичным для теплокровных животных, тогда как метаболиты культуральной жидкости штамма F. оfficinalis высокотоксичны.

8. В опытах in vitro установлено, что водные экстракты из мицелия и плодовых тел гриба T. versicolor оказывают прямое цитопатическое воздействие на опухолевые клетки асцитной карциномы Эрлиха, тогда как экстракты из мицелия штаммов G. applanatum и F. оfficinalis – длительное цитопатическое действие. В опытах in vivo наиболее выраженное достоверное торможение роста опухоли оказывает водный экстракт из мицелия лиственничной губки (F. officinalis).

Для культивирования мицелия штаммов F. оfficinalis и T.

versicolor.разработаны оптимальные композиции растительных субстратов с использованием отходов промышленности лесоперерабатывающего комплекса. Лучшим субстратом для твердофазного культивирования мицелия исследованных штаммов базидиомицетов G. applanatum, F. оfficinalis и T. versicolor является измельченное зерно пшеницы. Полученная биомасса базидиомицетов может быть использована для получения биологически активных веществ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Садыкова В.С., Ковалева Г.К., Чижмотря Н.М., Гаврилова А.Г., Громовых Т.И., Новицкий И.А. Антимикробная активность грибов рода Trichoderma и Trametes в отношении патогенных микроорганизмов рода Staphylococcus // Сибирский медицинский журнал. – Иркутск, 2006. – Т. 66, №8. – С. 18-20.

2. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Биологические свойства и продуктивность нового штамма базидиомицета G.a.-04 Ganoderma applanatum (Pers. ex Wallr.) Pat // Вестник КрасГАУ. – Красноярск, 2008. - №1. – С. 70-73.

3. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Биологические свойства и продуктивность нового штамма базидиомицета Tyv-2006 Fomitopsis officinalis (Will.) Bond. et Singer // Вестник КрасГАУ. – Красноярск, 2009. - №1. – С. – 68-75.

4. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Изучение биологической активности и продуктивности на растительных субстратах сибирского штамма базидиомицета Trametes versicolor (L. Ex Fr.) Lloyd // Материалы Всероссийской конференции студентов и аспирантов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование». – Ярославль, 2006. – С. 260-262.

5. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Перспективы создания новых биотехнологий на основе сибирских штаммов базидиомицетов // Материалы Международной школыконференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» – Москва-Пущино, 2006.

– С.130-131.

6. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Новые альтернативные пути получения биологически активных веществ // Материалы городской научно-практической конференции «Развитие инновационной деятельности в промышленном комплексе города Красноярска». – Красноярск, 2007. – С. 74-76.

7. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Перспективы создания новых биотехнологий на основе сибирского штамма B 18/91 базидиомицета Trametes versicolor // Материалы II Международной научно-технической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы технологии живых систем». – Владивосток, 2007. – С.55-57.

8. Громовых Т.И., Ковалева Г.К., Садыкова В.С., Гаврилова А.Г. Противоопухолевые свойства макро- и микромицетов Средней Сибири // Современная микология в России. Тезисы докладов второго съезда микологов России. М: Национальная академия микологии. – 2008. – С. 517.

9. Громовых Т.И., Садыкова В.С., Ковалева Г.К., Кутафьева Н.П., Гайдашева И.И., Миронов А.Г., Пашенова Н.В. Коллекция чистых культур макро- и микромицетов средней Сибири – база для создания новых биотехнологий и образовательного процесса // Современная микология в России. Тезисы докладов второго съезда микологов России. М:

Национальная академия микологии. – 2008. – С. 109-110.

Ковалева Г.К., Садыкова В.С., Громовых Т.И., Инжеваткин Е.В. Биология, культивирование и лекарственные свойства Trametes versicolor // Высшие базидиальные грибы: индивидуумы, популяции, сообщества. Материалы юбилейной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.В. Горленко. М.: ВостокЗапад, 2008. – С. 190-191.

Патент 2007147074/13 (051610) RU МПК7 C12N 1/14 Штамм базидиомицета Fomitopsis officinalis ВКПМ F - 961, используемый для получения противоопухолевых препаратов / Т.И. Громовых, В.С. Садыкова, Е.В. Инжеваткин, Г.К. Ковалева, Л.И. Черепанова; заявл. 17.12.07 г.