На правах рукописи

ТЮРИНА

Елена Павловна

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ТЯЖЕСТИ ГЕСТОЗА

И ИХ ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА

14.03.03 – Патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва 2013

Работа выполнена на кафедре общей патологии и патологической физиологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»; на кафедре факультетской хирургии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарёва»

Научные консультанты: доктор медицинских наук профессор Дроздова Галина Александровна;

доктор медицинских наук профессор Власов Алексей Петрович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Радыш Иван Васильевич; заведующий кафедрой управление сестринской деятельностью медицинского факультета РУДН;

доктор медицинских наук профессор Пирожков Сергей Викторович; профессор кафедры патологической физиологии Первого московского государственного университета им. И. М. Сеченова;

доктор медицинских наук профессор Потемина Татьяна Евгеньевна заведующая кафедрой патологической физиологии ГБОУВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Минздрава России»

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Минздрава России

Защита состоится «18» декабря 2013 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.06 РУДН по адресу: 117198, г. Москва, ул. МиклухоМаклая, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РУДН по адресу:

117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6.

Автореферат разослан «_» 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Г. А. Дроздова доктор медицинских наук профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Проблема гестоза до настоящего времени привлекает внимание значительного числа исследователей, что связано с высокой (до 17частотой и осложнениями для матери и плода является одной из самых актуальнейших. (Сидорова И.С., 1996; Серов В.Н. и др., 1997; Кустаров В.Н., Линде В.А., 2000). По данным российских и зарубежных исследователей гестоз остается одной из ведущих причин материнской и перинатальной заболеваемости, смертности, а также инвалидизации новорожденных (Яцык Г.В., 1998; Герасимович Г.И., 2000; Абрамченко В.В., 1994, 2001; Ариас Ф., 1998;

Dongen P.W.J., 1977; Comino-Delgato R., 1986; Boes T.C.M., 1987; Adetoro O.O., 1990). Савельева Г.М. (1998) подчеркивает: – «Перинатальная смертность при гестозе составляет 10,0-30,0 %, а заболеваемость 463,0-780 % в зависимости от степени тяжести» (Башмакова Н.В. и др., 2002). Большое значение в увеличении показателей перинатальной заболеваемости и смертности при гестозе имеет вынужденное досрочное прерывание беременности, в связи с чем значительную актуальность приобретают вопросы пролонгирования беременности (Зильбер А.П., Шифман Е.М., 1997; Серов В.Н. и др., 2001; Ветров В.В., 2000;

Бабаев В.А. и др., 2002; Шарапова О.В., 2002).

Несмотря на многочисленные концепции по этиопатогенезу гестоза у беременных до настоящего времени многие аспекты остаются до конца не изученными. Так же нет единых подходов в прогностической оценке тяжести этой грозной патологии. Можно предположить, что далеко не последнюю роль в развитии этого грозного осложнения беременности играют патофизиологические механизмы клеточных мембран и организация биомакромолекул.

Одним из перспективных научных направлений в углубленном изучении патогенеза гестоза могут явиться изыскания на молекулярном уровне, в частности исследования фосфолипидной организации мембран клеток различных тканей, оценка структурно-функционального состояния гемоглобина.

Немаловажное значение для решения проблемы гестоза имеют знания по объективизации степени выраженности этой патологии. Решение этого вопроса позволит не только своевременно проводить диагностику, но и оценивать адекватность проведения комплексной терапии.

Цель работы. Оценить патогенетические факторы тяжести гестоза по нарушению липидного метаболизма и структурно-функционального состояния гемоглобина, дать их прогностическую оценку, на основе чего оптимизировать схемы терапии заболевания.

Основные задачи Изучить состав липидов плазмы и эритроцитов крови, фосфолипидного бислоя мембран клеточных структур плаценты при гестозе различной степени тяжести у беременных женщин.

При помощи РАМАН-скопии исследовать конформацию и свойства гемоглобина у беременных гестозом различной степени тяжести.

Выявить сопряженность липидных модификаций в эритроцитах со 3.

структурно-функциональными изменениями гемоглобина у беременных женщин.

Изучить выраженность эндогенной интоксикации, интенсивность перекисного окисления липидов, активность фосфолипазы А2 и показатели гипоксии в плазме крови, эритроцитах и тканях плаценты при гестозе у женщин.

Установить сопряженность расстройств липидного обмена и структурно-функциональных изменений гемоглобина с выраженностью интоксикационного синдрома у беременных с гестозом.

Дать оценку роли нарушений липидного метаболизма и структурно-функциональных изменений гемоглобина в прогрессировании гестоза у беременных.

Разработать новые критерии тяжести гестоза у беременных женщин, основанные на показателях липидного обмена и структурнофункционального состояния гемоглобина.

Дать патогенетическое обоснование оптимизированных схем терапии гестоза беременных, включающих препарат метаболического типа действия, по нарушению липидного метаболизма в плазме крови и эритроцитах, структурно-функционального состояния гемоглобина.

Научная новизна Установлено, что у беременных женщин при гестозе существенно изменяется липидный состав плазмы крови, эритроцитов, тканевых структур плаценты, что является основанием для утверждения важности липидных нарушений в патогенезе заболевания.

Клинико-биохимическими исследованиями выявлено, что количественные проявления нарушений липидного метаболизма коррелируют с тяжестью гестоза, выраженностью интоксикационного синдрома у беременных женщин.

Вне зависимости от тяжести гестоза расстройства в липидном спектре исследованных объектов носят однонаправленный характер, а наиболее существенные изменения в липидном гомеостазе выражаются в виде роста лизоформ фосфолипидов и уровня свободных жирных кислот, уменьшения содержания фракций липидов, обладающих антиоксидантным действием. Выявленные изменения липидного состава свидетельствуют о мембранодестабилизирующих процессах в организме беременных с гестозом.

Показано, что у беременных с гестозом качественные и количественные липидные перестройки в исследованных тканевых структурах происходят на фоне интенсификации процессов перекисного окисления липидов, снижения антиоксидантного потенциала, активизации фосфолипазы А2, гипоксии.

Установлено, что у беременных с гестозом отмечаются существенные изменения структурно-функционального состояния гемоглобина, проявляющиеся в виде увеличения относительного количества оксигемоглобина в эритроцитах, уменьшения относительной способности гемоглобина связывать лиганды, роста относительной способности гемоглобина выделять лиганды, снижения сродства гемоглобина к лигандам, повышения уровня колебания метиновых мостиков гемоглобина.

Показано, что изменения структурно-функционального состояния гемоглобина сопряжены с тяжестью гестоза у беременных. Диагностическими критериями тяжести заболевания служат показатели: сродство гемоглобина к лигандам и колебания метиновых мостиков гемоглобина.

Исследованиями выявлена сопряженность изменений состава фосфолипидного бислоя мембран эритроцитов со структурно-функциональными изменениями состояния гемоглобина.

Установлено, что применение препаратов метаболического типа действия способствует снижению выраженности интоксикационного синдрома у беременных с гестозом. Липидмодифицирующий эффект в исследованных тканях на фоне лечения наблюдается при гестозе легкой и средней тяжести, при тяжелой степени заболевания нарушенный липидный метаболизм резистентен к такому рода терапии.

Показано, что липидмодифицирующий эффект метаболической терапии гестоза беременных опосредован воздействием ее на интенсификацию свободнорадикальных реакций процессов перекисного окисления липидов, активность фосфолипазы А2, гипоксию.

Установлено, что на фоне антиоксидантной терапии происходит восстановление структурно-функционального состояния гемоглобина у беременных при гестозе легкой и средней тяжести.

На основе патофизиологической сопряженности липидных модификаций и изменений структурно-функционального состояния гемоглобина с тяжестью гестоза у беременных женщин аргументированы и предложены к практическому применению новые критерии тяжести заболевания, которые в наибольшей степени объективизируют тяжесть патологии и эффективность проводимой терапии.

Из числа показателей липидного метаболизма наиболее полно и адекватно отражает расстройства гомеостаза, в том числе мембранодестабилизирующие процессы, индекс хаотропности мембран эритроцитов, из ряда показателей структурно-функционального состояния гемоглобина – сродство гемоглобина к лигандам и колебания метиновых мостиков гемоглобина.

Практическая значимость работы Результаты проведенных исследований позволили установить, что важнейшими патогенетическими компонентами гомеостаза при гестозе у беременных женщин выступают системные нарушения липидного метаболизма и структурно-функционального состояния гемоглобина. Указанные нарушения коррелируют с тяжестью гестоза.

Выявлено, что применение традиционной комплексной терапии беременным с гестозом не позволяет корригировать изменения в указанных компонентах гомеостаза.

Установлено, что включение в терапию препаратов метаболического типа действия при гестозе патогенетически обосновано и приводит к существенному уменьшению расстройств липидного обмена и восстановлению структурнофункционального состояния гемоглобина.

Немаловажное значение для практики имеет факт, что из показателей модификаций липидного метаболизма индекс хаотропности мембран эритроцитов, а из ряда показателей структурно-функционального состояния гемоглобина - сродство гемоглобина к лигандам и колебания метиновых мостиков могут служить маркерами выраженности гестоза и эффективности его терапии.

Основные положения, выносимые на защиту В патогенезе гестоза важная роль принадлежит системным нарушениям липидного метаболизма и изменениям структурно-функционального состояния гемоглобина. Указанные нарушения коррелируют с тяжестью гестоза и выраженностью интоксикационного синдрома.

Вне зависимости от тяжести гестоза расстройства в липидном спектре плазмы крови, эритроцитов, тканевых структур плаценты носят однонаправленный характер. Наиболее существенные изменения в липидном гомеостазе выражаются в виде роста лизоформ фосфолипидов и уровня свободных жирных кислот, уменьшения содержания фракций липидов, обладающих антиоксидантным действием.

Изменения структурно-функционального состояния гемоглобина при гестозе у беременных женщин проявляются в виде увеличения относительного количества оксигемоглобина в эритроцитах, уменьшения относительной способности гемоглобина связывать лиганды, роста относительной способности гемоглобина выделять лиганды, снижения сродства гемоглобина к лигандам, повышения уровня колебания метиновых мостиков гемоглобина.

Применение препаратов метаболического типа действиям при гестозе легкой и средней тяжести приводят к системному положительному липидмодифицирующему эффекту и коррекции структурно-функционального состояния гемоглобина, при гестозе тяжелой степени – эффективность указанной терапии незначительная.

Патофизиологически обосновано, что в качестве маркеров выраженности гестоза и эффективности его терапии из показателей модификаций липидного метаболизма является индекс хаотропности мембран эритроцитов, а из ряда показателей структурно-функционального состояния гемоглобина – сродство гемоглобина к лигандам и колебания метиновых мостиков.

Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на научных конференциях Публикации. По теме диссертации опубликованы 50 работ, из них 22 в журналах, рекомендованных ВАК, 1 монография.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 232 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы (1-я глава), материалов и методов исследования (2-я глава), результатов собственных исследований (3–6-я главы), обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 227 отечественных и 94 иностранных источников. Диссертация содержит 46 таблиц и 72 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Основой работы явились клинические исследования. Для решения поставленных задач пациентки были разделены на две группы. Критериями набора в группы были возраст от 18 до лет, наличие гестоза у беременных, критерием исключения: хронические сопутствующие заболевания, многоплодная беременность, возраст моложе 18 и старше 40 лет. Все пациентки были подробно ознакомлены с дизайном исследования и давали добровольное согласие на его проведение.

В контрольной группе под наблюдением находилось 120 беременных, из них соответственно степени тяжести заболевания было сформировано три подгруппы: с гестозом легкой степени – 42 женщины (I-я подгруппа), средней степени тяжести – 44 беременных (II-я подгруппа) и тяжелой – 34 пациентки (III-я подгруппа).

В основной группе под наблюдением находилось 118 беременных, из них соответственно степени тяжести заболевания было сформировано три подгруппы: с гестозом легкой степени – 40 женщины (I-я подгруппа), средней степени тяжести – 43 беременных (II-я подгруппа) и тяжелой – 35 пациенток (III-я подгруппа).

Все беременные находились на стационарном лечении в городском родильном доме № 2 г. Саранска. Пациенткам первой и частично второй подгруппы помощь оказывали в отделении патологии беременных и дневном стационаре. Часть беременных со средней степенью гестоза и беременные с тяжелой формой заболевания получали почасовое лечение в палате интенсивной терапии. У пациенток последней подгруппы проводили интенсивную терапию и оценивали эффект от лечения в течение 4-6 часов, после чего решали вопрос о пролонгировании беременности согласно общепринятым рекомендациям (Серов В.Н. и др., 1997). Пациентки второй группы в дополнение к проводимой традиционной терапии получали цитофлавин (препарат метаболического типа действия).

Методы исследования Липиды из тканей плаценты, эритроцитов и плазмы крови экстрагировали хлороформметаноловой смесью (Хиггинс Дж. А., 1990), фракционировали методом тонкослойной хроматографии. Полярные фосфолипиды разделяли на пластинах фирмы «Merk» на стеклянной основе, нейтральные липиды – на силикагелевых пластинах для обращенно-фазной тонкослойной хроматографии (Хиггинс Дж. А., 1990; Vaskovsky V. E. et al., 1975). Молекулярный анализ проводили на денситометре Model GS-670 (BIO-RAD, США) с соответствующим программным обеспечением (Phosphor Analyst/PS Sowtware). Уровень спонтанного малонового диальдегида (МДА) – спектрофотометрическим методом в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Егоров Д. Ю., Козлов А. В., 1988); активность СОД – в реакции с нитросиним тетразолием (Гуревич В. С.

и др., 1990); активность ФлА2 – титрометрическим методом (Трофимов В. А., 1999). Определяли показатели эндогенной интоксикации: содержание молекул средней массы (МСМ) спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-46 при длинах волн 254 и 280 нм (Пикуза О. И., Шакирова Л. З., 1994); общую концентрацию альбумина (ОКА) и эффективную концентрацию альбумина (ЭКА) в сыворотке крови – флуоресцентным методом на специализированном анализаторе АКЛ-01 «Зонд» (Грызунов Ю. А., Добрецов Г. Е., 1994). Рассчитывали индекс токсичности (ИТ) плазмы крови по формуле:

ИТ=ОКА/ЭКА–1 (Грызунов Ю. А., Добрецов Г. Е., 1998). Измерение содержания пировиноградной кислоты (ПВК) производили при проведении реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (Кушманова О. Д., Ивченко Г. М., 1983). Содержание молочной кислоты (МК) определяли по реакции с параоксидифенилом (Меньшиков В. В., 1987). Определяли сорбционную способность эритроцитов (ССЭ) (Тогайбаев А. А. и др., 1988) и индекс их деформабельности (ИДЭ) (Федорова З. Д., 1986). Для изучения структурно функциональных характеристик гемоглобина использован метод РАМАН-спектроскопии с записью кривых РАМАН-спектра гемоглобина беременных. (Stein Р. et al., 1975; Kitagawa Т. et al., 1976; Choi S. et al., 1982; Wood B. R. et al., 2007).

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общепринятыми методами статистики с определением достоверности различий между данными в опытных и контрольной группах на основе расчета критерия Стьюдента и 2, корреляционную связь оценивали по критерию r. Выявленные закономерности и связи изучаемых параметров между группами и признаками были значимыми при вероятности безошибочного прогноза р=95 % и более.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На основе полученных фактических данных изменений в исследованных компонентах гомеостаза у здоровых беременных, при гестозе различной степени тяжести в процессе решения указанных выше задач, с одной стороны, предоставлялась возможным дать оценку роли нарушений липидного метаболизма и структурно-функциональных изменений гемоглобина в развитии и прогрессировании гестоза.

Важный акцент в работе сделан на изучение липидного метаболизма и структурно-функционального состояния гемоглобина.

Поясним, почему выбор пал на эти компоненты гомеостаза?

Объяснением служит факт, что одним из грозных негативных проявлений этой патологии беременных являются перинатальная заболеваемость, вынужденное досрочное прерывание беременности, которые могут привести даже к инвалидизации новорожденных. Общепризнан факт, что важнейшим патогенетическим компонентом указанных осложнений является гипоксия. Поэтому акцент исследований в работе сделан на изучение структурнофункционального состояния гемоглобина. Причем впервые такого рода исследования поставлены с привлечением РАМАН-спектроскопии гемоглобина.

Изучение свойств молекулы гемоглобина при помощи указанного способа является принципиально важным компонентом обследования беременных, так как рутинное определения уровня гемоглобина не дает адекватного представления об эффективности кислородного обеспечения тканей и зачастую приводит к неоправданному назначению препаратов железа, что приводит к ингибированию всасывания цинка, который, как известно, влияет на рост плода. Более того, железо усиливает образование свободных радикалов и может увеличивать риск развития гестоза.

При помощи такого способа представляется возможным зарегистрировать кривые РАМАН-спектра гемоглобина при возбуждении лазером 532 нм и определить соотношение полос с колебаниями связей порфирина. Причем колебания связей СаСb, CaN, CaNCa с разными видами симметрии зависят от степени окисления атома Fe и наличия шестого лиганда (О2, CO, NO, CN-). При окислении атома Fe2+ до Fe3+ полосы, связанные с колебаниями связей СаСb, CaN, CaNCa сдвигаются в более высокочастотную область. Аналогичный эффект на положение этих полос оказывает присоединение шестого лиганда, поскольку при этом лиганд (например, О2) оттягивает от атома Fe2+ электронную плотность и связи СаСb, CaN, CaNCa это «ощущают» как окисление Fe2+ до Fe3+.

Отношение интенсивностей полос, связанных с колебанием связей СаСb, CaN, CaNCa в молекулах оксигемоглобина и дезоксигемоглобина говорит о соотношении количеств оксигемоглобина и дезоксигемоглобина в крови беременных.

Отношение интенсивностей низко- и высокочастотных полос, связанных с колебанием связей CaCmH и CaCm, свидетельствует о соотношении количеств гемоглобина с растянутым и компактным порфирином. Последний параметр напрямую связан со сродством гемоглобина к лигандам. Таким образом, соотношение интенсивностей I1375/(I1355+I1375) является характеристикой относительного количества оксигемоглобина в крови. С учетом абсолютных интенсивностей полос 1548-1552 см-1 и 1580-1588 см-1 и интенсивностей полос см-1 и 1375 см-1, отношение интенсивностей I1355/I1550 отражает относительную способность всего гемоглобина в пробе связывать лиганды (в т.ч. О2). Соотношение I1375/I1580 отражает относительную способность гемоглобина выделять лиганды. Показатель относительной способности гемоглобина выделять лиганды у беременных с гестозом выше, чем у здоровых, и растет по мере возрастания тяжести гестоза. Отношение абсолютных интенсивностей (I1355/I1550)/(I1375/I1580) отражает сродство гемоглобина к лигандам, в первую очередь, О2. При проведении РАМАН-спектроскопии с использованием лазера 532 нм для сравнительного анализа спектров от мембранносвязанного и изолированного цитоплазматического гемоглобина предлагается рассчитать соотношение интенсивностей полос 1375 и 1172 см-1 (I1375/I1172). Полоса см-1 практически не проявляется в спектрах эритроцитов, полученных при возбуждении лазером 473 нм, однако она отчетливо видна на спектрах эритроцитов при возбуждении лазером 532 нм. Полоса 1172 см-1 появляется в результате асимметричных колебаний колец пирролов в оксигемоглобине (связи СаСb, СaN и СaNСa). Отношение I1375/I1172 несет информацию о выраженности симметричных и асимметричных колебаний пиррольных колец, а его изменение может быть связано с конформационными изменениями пирролов.

Таким образом, РАМАН-спектроскопия позволяет на молекулярном уровне оценить функциональное состояние гемоглобина, а также, что не менее важно, его потенциальные возможности.

Другим важнейшим компонентом работы является исследование липидного метаболизма при гестозе. Отметим, что этому виду обмена всегда уделялось должное внимание, в последнее же время – еще большее. Это обусловлено тем, что в настоящее время молекулярная биология обогащена знаниями о важнейшей роли клеточных биомембран в структурно-функциональной стабильности клеток в норме и их модификациях – при патологии, и рассматривается как основа болезни. Другим не менее значимым достижением медицинской науки являются знания о значимости мембранодестабилизирующих (мембранодеструктивных) процессов в патогенезе эндогенной интоксикации, которая, как указано выше, является одним из значимых компонентов гестоза у беременных.

В качестве объектов исследования нами выбраны ткани плаценты и эритроциты. Их выбор обусловлен тем, что эритроциты являются универсальным объектом для исследователей, поскольку они доступны для изучения, с одной стороны, а по их структурно-функциональному состоянию возможна характеристика клеток различных органов и тканей, поскольку их состояние, как известно, во многом является их отражением – с другой.

По отношению плаценты отметим, что ее ткани после родов также доступны для изучения (не требуется биопсия), с одной стороны, а по их структурному состоянию на молекулярном уровне возможно выявление одной из причин нарушения плодово-плацентарного кровотока.

Существенным аспектом работы, на наш взгляд, является то, что нам представилась возможным не только определить состояния фосфолипидного бислоя мембран клеток плаценты и эритроцитов, но и установить основные причины дестабилизации их липидного компонента. С этой целью изучена интенсивность процесса перекисного окисления липидов и активность фосфолипазы А2.

Отметим еще одну положительную сторону проведенного научного труда. Как указано выше, одним из основных объектов исследования являются эритроциты, в которых оценивалось не только структурно-функциональное состояние гемоглобина, но и состояние фосфолипидного бислоя мембран. Такой объем исследований позволял не только выяснить кислородтранспортные характеристики гемоглобина в целом, но и одну из причин их нарушения, поскольку от состояния биомембран эритроцитов во многом зависит насыщение его кислородом в легких и диффузия кислорода из эритроцитов в тканиакцепторы.

Анализ и обсуждение полученных результатов исследований показал ряд весьма значимых научных положений как в академическом, так и прикладном значении.

Безусловно, важнейшим из них является то, что при гестозе, как показали наши исследования, существенно изменяется липидный состав плазмы крови, эритроцитов, тканевых структур плаценты. Так, было выявлено, что при гестозе в плазме крови беременных происходит изменение липидного спектра, как качественного, так и количественного характера, что было зафиксировано