На правах рукописи

СЕРГЕЕВ

ОЛЕГ ВИТАЛЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЕ ЖИВОЙ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ

ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ДИАРЕИ СВИНЕЙ (ВАКЦИНА ВЕРРЕС-ЭДС) В

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва – 2014

Работа выполнена в лаборатории сравнительной вирусологии ФГБУ «Научноисследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант Доктор биологических наук, профессор Алипер Тарас Иванович

Официальные оппоненты: Валихов Алексей Федорович доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры генетики и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет имени К.А.Тимирязева» (ФГБОУ ВПО РГАУ-МСХА) Кузнецов Дмитрий Павлович доктор биологических наук, профессор, заместитель генерального директора по производству и технологиям РОАО Росагробиопром Куриннов Виктор Васильевич доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией диагностики ГНУ «Всероссийский научноисследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» (ГНУ ВНИИВВиМ)

Ведущая организация ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

(ФГБУ ВНИИЗЖ)

Защита диссертации состоится 9 октября 2014 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.011.01 на базе ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») по адресу:

123022, г.Москва, Звенигородское шоссе, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ВГНКИ» и на сайте http://www.vgnki.ru/graduate_course/dissertat Автореферат разослан « » 2014 г. и размещен на сайтах http://www.vgnki.ru/graduate_course/autoreferat и http://www.vak2/ed.gov.ru Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Букова Наталия Константиновна

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы Эпизоотическая диарея свиней (ЭДС) является высококонтагиозным вирусным заболеванием свиней, характеризующимся изнурительной диареей и дегидратацией организма.

Заболеванию подвержены свиньи всех возрастов, но наиболее восприимчивыми являются новорождённые поросята до двухнедельного возраста, смертность среди которых колеблется в пределах 30-100%. ЭДС по клиническим признакам, патологоанатомической картине и эпизоотологии очень сходна с трансмиссивным гастроэнтеритом свиней (ТГС). Фактически ТГС и ЭДС – заболевания-двойники, вызываемые двумя кишечными коронавирусами свиней, не имеющими антигенного родства. Оба заболевания характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью новорождённых поросят. Главными отличиями ЭДС являются отсутствие рвоты и более низкая смертность новорождённых поросят, более тяжёлое течение болезни у свиней в период откорма, а также латентное инфицирование и более медленное распространение. Летальность среди свиней, начиная с послеотъёмного возраста, составляет обычно 1-3 %. ЭДС, как правило, возникает внезапно и после одной или нескольких вспышек часто приобретает стационарный (энзоотический) характер.

В России ЭДС впервые обнаружена в крупных свиноводческих хозяйствах в 2006 г.

(НПО НАРВАК). В полевых условиях разные штаммы вируса ЭДС обладают различной вирулентностью. Штаммы вируса, циркулирующие в странах Азии, в целом характеризуются более высокой вирулентностью по сравнению со штаммами, циркулирующими в странах Европы [Sueyoshi et al., 1995; Song and Park, 2012]. Причина данной географической зависимости неясна. Существенные экономические потери, причиняемые ЭДС некоторым странам азиатского региона, явились основанием для интенсивного изучения заболевания и его возбудителя. Можно выделить следующие направления исследований по ЭДС, в которых достигнут наибольший прогресс: этиология, эпизоотология, иммунобиология, диагностика и специфическая профилактика. Результаты исследований в данных направлениях являются научной основой для разработки эффективных мер борьбы против ЭДС. Изучены иммунобиологические свойства вируса ЭДС, особенности его репродукции in vitro, строение вириона и вирусного генома.

Центральным звеном в научном и практическом отношении явилась разработка метода культивирования вируса ЭДС вне организма. Решение этой важной и трудной задачи обеспечило возможность его выделения и изучения, а также разработки и изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Размножение вируса ЭДС в культуре клеток позволило лишить его вирулентности при сохранении защитных свойств, а также обеспечило возможность оценивать его биологическую и антигенную активность, что определило успех при разработке средств специфической защиты. Размножение вируса ЭДС in vitro связано с необычным явлением в биологии вирусов. Линии клеток естественного хозяина – свиньи (СПЭВ, ПП, РК-15 и др.), высокочувствительные к вирусу ТГС, оказались нечувствительными к вирусу ЭДС. В то же время линия клеток Vero, произошедшая от естественно нечувствительного хозяина – обезьяны, оказалась чувствительной к вирусу ЭДС, но не к вирусу ТГС. При выделении полевого вируса ЭДС в культуре клеток Vero после нескольких пассажей его репликация сопровождается выраженным ЦПЭ. Однако в этой уникальной по чувствительности к вирусу ЭДС культуре клеток он накапливается в невысоком титре не выше 6,0 – 7,0 lg ТЦД50 /мл даже после продолжительной адаптации [Song et al., 2003]. Серийное пассирование вирулентных штаммов вируса ЭДС в культуре клеток быстро приводит к снижению и потере вирулентности и получению аттенуированных вакцинных штаммов [Kweon et al., 1999]. Молекулярной основой аттенуации вируса ЭДС и её необратимости при серийном размножении в культуре клеток считается делеция в последовательности вспомогательного гена ORF3.

Многие вопросы эпизоотологии ЭДС остаются невыясненными, в частности, частота латентного инфицирования и носительство вируса ЭДС различными технологическими и возрастными группами свиней. Известно, что в хозяйствах при ЭДС острая инфекция чаще, чем при ТГС переходит в хроническую форму [Pensaert and Yeo, 2006]. В качестве возможного объяснения этому и другим особенностям ЭДС можно считать тропизм вируса in vivo предпочтительное размножение вируса ЭДС в энтероцитах крипт тонкого кишечника свиней.

Предварительный диагноз ТГС/ЭДС ставят на основании клинических признаков, патологоанатомических изменений и эпизоотологических данных. Окончательный (этиологический) диагноз устанавливают на основании результатов лабораторных исследований. Лабораторная диагностика включает обнаружение вирусного антигена или вирусной нуклеиновой кислоты и специфических антител. Серологические методы, помимо диагностического значения, представляют ценность для оценки иммунитета в практических условиях. Наиболее чувствительным и специфическим методом дифференциальной диагностики ТГС/ЭДС является гнездовая (дуплексная) версию ПЦР [Kim et al., 2000, 2001].

Для дифференциации вирусов ЭДС и ТГС в практических условиях удобным оказался метод иммунохроматографии на стрипах [Kang et al., 2007].

Специфическая профилактика ЭДС представляет собой актуальную проблему для ряда стран с развитым свиноводством. Как и в случае ТГС, основу стратегии специфической профилактики ЭДС составляет пассивный лактогенный иммунитет, то есть иммунизация супоросных свиноматок и защита потомства антителами молозива и молока [Saif, Wesley, 1999]. Основным медиатором лактогенного иммунитета служит иммуноглобулин IgA, который нейтрализует вирус на поверхности слизистой оболочки и предупреждает развитие инфекции [Stokes, Waly, 2006]. Роль клеточного иммунитета в защите свиней от ЭДС не изучена [Song, Park, 2012].

Для специфической профилактики ЭДС в разных странах применяют различные живые инактивированной вакцины против ЭДС представляется экономически невыгодным внутримышечно, хотя одна группа авторов показала, что оральное введение вакцины приводит к более выраженному иммунитету у свиноматок и лучшей защите потомства от инфекции по сравнению с внутримышечным введением [Song et al., 2007]. Однако оральное введение неприемлемо при массовой вакцинации в условиях крупных свиноводческих хозяйств.

Существуют опасения некоторых исследователей, что напряжённость иммунитета, индуцированного некоторыми коммерческими живыми вакцинами, часто недостаточна, так как после вакцинации свиноматок вирус ЭДС выделяется с фекалиями у экспериментально зараженных поросят примерно так же, как у серонегативных поросят контрольной группы [Yuan et al., 1998]. Однако главным критерием практической ценности живых вакцин против ЭДС является их безопасность и эпизоотическая эффективность, которая тесно коррелирует с уровнем лактогенного иммунитета (титр ВНА в молозиве и молоке) у вакцинированных свиноматок.

Целью исследования являлась разработка эффективной живой вакцины против ЭДС и условий её применения в ветеринарной практике.

В задачи исследования входило:

1. Получить вакцинный культуральный штамм вируса ЭДС и изучить его антигенные (иммуногенные) свойства;

2. Определить генетическую основу аттенуации вируса ЭДС;

3. Оптимизировать условия размножения вакцинного штамма вируса ЭДС в перевиваемой культуре клеток;

4. Разработать условия изготовления и контроля живой сухой вакцины и режим её хранения;

5. Определить оптимальную схему вакцинации свиней в практических условиях;

лабораторных и производственных условиях;

7. Изготовить производственные серии вакцины и испытать их в неблагополучных по ЭДС хозяйствах;

8. Изучить возможность одновременной иммунизации свиней против ЭДС и ТГС;

9. Составить и утвердить нормативную документацию на живую сухую вакцину против ЭДС в установленном порядке.

Выявлено существенное различие между «вирусами-близнецами» ЭДС и ТГС при культивировании in vitro. Различие заключалось в том, что полевой вирус ЭДС вопреки общеизвестной закономерности не размножался в культуре клеток естественного хозяина – свиньи (линии клеток СПЭВ, ППС, РК-15), но размножался в культуре клеток нечувствительного вида – зелёной мартышки (линия клеток Vero). Вирус ЭДС размножался in vitro мене интенсивно, чем вирус ТГС. В культуре клеток Vero он накапливался незначительно даже после 40 пассажей (104,0 – 105,0 ТЦД50 / мл), что исключало возможность его использования для изготовления инактивированной вакцины. В результате пассирования полевого вирулентного вируса ЭДС в культуре клеток Vero получен авирулентный штамм ИС, отвечающий требованиям, предъявляемым к штаммам для изготовления живых вакцин.

Вирулентность полевого вируса ЭДС исчезла относительно быстро (после 26 – 28 пассажей в культуре клеток Vero) и связана с делецией в гене ORF3. Длительное пассирование аттенуированного штамма ИС в культуре клеток Vero (110 пассажей) сопровождалось лишь незначительным повышением его инфекционности (105,0 – 106,3 ТЦД50 / мл) при сохранении антигенности. При аттенуации различных вирусов такое явление наблюдается редко и свидетельствует о необычной стабильности антигенных свойств штамма ИС вируса ЭДС при длительной репликации in vitro.

Определены условия удовлетворительного накопления вакцинного штамма ИС в культуре клеток Vero. Различные изменения условий культивирования не привели к повышению его репликации.

Ревакцинация свиней сопровождалась повышением иммунного ответа. Наилучшие результаты получены при двукратном внутримышечном введении вакцины ИС в дозе 104, ТЦД50 с интервалом 15-20 дней.

Одновременное введение инактивированной вакцины против ТГС и живой вакцины против ЭДС сопровождалось подавлением иммунного ответа против обоих заболеваний.

Последовательное введение указанных вакцин супоросным свиноматкам с интервалом 21 день приводило к образованию выраженного иммунитета против каждого заболевания.

В период вспышки ЭДС (2008-2010 гг.) выявлены некоторые особенности течения болезни. В отдельных свиноводческих комплексах отмечена высокая заболеваемость свиней в период доращивания (>60%) и в период откорма (>90%), а также спонтанная латентная иммунизация свиноматок полевым вирусом и, как следствие, низкая заболеваемость поросят (около 20%) в возрасте до 2 недель.

На основании результатов исследований, представленных в диссертационной работе, впервые в России разработана и внедрена в ветеринарную практику сухая живая вакцина против эпизоотической диареи свиней (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) и определены условия её практического применения. Доказана безопасность и высокая эпизоотическая эффективность применения вакцины в промышленном свиноводстве. Разработаны и внедрены СТО на производственное изготовление сухой живой вакцины против ЭДС и инструкция по её применению. Вакцина ВЕРРЕС-ЭДС против эпизоотической диареи свиней используется в ветеринарной практике с 2008 года. Изготовление и применение вакцины проводится в соответствии с нормативной документацией, утверждённой и зарегистрированной в установленном порядке.

Экспериментальные исследования были выполнены автором лично либо при его непосредственном участии в коллективных работах. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в постановке целей и задач, планировании и проведении экспериментов и интерпретации полученных результатов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Основные положения диссертации опубликованы, доложены и одобрены на: заседаниях Учёного совета ООО Ветбиохим в 2008 – 2010 гг., заседаниях Учёного совета ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России, XVII Московском международном ветеринарном конгрессе (2009), V Международном конгрессе по вакцинам (Сиэтл, США, 2011).

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 11 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, в том числе 1 патент.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и практических предложений, списка литературных источников и приложений. Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 31 таблицу, 7 рисунков, 184 источника литературы.

1. Выбор культуры клеток для размножения вируса ЭДС с целью изготовления вакцины 2. Получение вакцинного штамма ИС вируса ЭДС в результате пассирования в культуре клеток 3. Оптимизация условий размножения вакцинного штамма ИС in vitro 4. Антигенность (иммуногенность) вакцинного штамма ИС при длительном пассировании в культуре клеток 5. Разработка живой сухой вакцины из аттенуированного штамма ИС 6. Изготовление и контроль живой сухой вакцины против ЭДС в лабораторных и производственных условиях 7. Разработка оптимальной схемы применения живой сухой вакцины против ЭДС в ветеринарной практике 8. Результаты применения живой сухой вакцины против ЭДС в производственных условиях

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.1. Вирус. Исходный вирулентный вирус ЭДС, использованный для аттенуации in vitro с целью изготовления вакцины или для экспериментального заражения поросят, представлял собой суспензию кишечного материала, взятого от поросят, инфицированных в полевых условиях. Вирус ЭДС первоначально был выделен от больных поросят в культуре клеток Vero.

В течение первых пассажей в этой культуре вирус размножался слабо без выраженного ЦПЭ.

Вирус 20 пассажа в культуре клеток Vero обладал выраженным ЦПЭ и имел титр 2,5 lg ТЦД50/мл.

2.1.2. Однослойные культуры клеток. Из флакона с выросшим клеточным монослоем удаляли ростовую среду, монослой промывали 1-2 раза раствором Версена (0,02%) и 1 раз смесью растворов Версена (0,02%) и трипсина (0,025%) в соотношении 4:1, затем выдерживали при 370С 5-10 мин. После отделения клеток от стенки флакона их разводили средой DMEM с сывороткой. Клеточную суспензию, содержащую 1-2 х 105 клеток/мл, вносили по 150 мл в 1, мл флаконы. Клетки всех линий выращивали в течение 3-4 дней при 370С. Срок формирования монослоя: 48-72 часа. Клетки СПЭВ выращивали на среде 199, остальные - на среде DMEM с сыворотки крови крупного рогатого скота (FetaClone) и антибиотиком (2 мкг/мл 5-10% гентамицина или 2,5 мкг/мл ципрофлоксацина). Клетки всех линий выращивали в течение 3- дней и пересевали с коэффициэнтом 1:4 – 1:5.

2.1.3. Выращивание вируса в культуре клеток. Для выращивания вируса использовали клетки Vero, покрывающие ростовую поверхность флакона на 95-100%. Клетки отмывали раствором Хэнкса и заражали вирусом с множественностью 0,1 ТЦД50 на клетку. Вирус вносили одновременно с поддерживающей средой (DMEM с антибиотиками без сыворотки), содержащей трипсин в концентрации 5 мкг/мл. Выраженный ЦПЭ развивался через 18-20 часов после заражения. В этот период (разрушение не менее 70% клеток монослоя) культивирование вируса прекращали, и сосуды с инфицированной культурой клеток интенсивно встряхивали. В случаях, когда на стенках культуральных сосудов оставалась значительная часть клеток, сосуды кратковременно замораживали. Вирус-содержащую культуральную суспензию сливали в пластиковые бутыли и хранили при минус 200-700С. Вирус ЭДС, адаптированный к культуре клеток Vero (титр 103,5 – 106,0 ТЦД50/мл), использовали для изготовления экспериментальных серий вакцины.

2.1.4. Титрование вируса в культуре клеток. Инфекционность вируса в жидком и лиофилизированном препаратах определяли методом титрования в культуре клеток Vero в 96луночных плашках. Клетки Vero в 96-луночных плашках выращивали стандартным способом в атмосфере 4% СО2. Концентрация клеток при посеве: 2-4 х 105 клеток/мл, в лунку вносили мкл клеточной суспензии, срок формирования монослоя: 24-48 ч. Перед внесением разведений вируса монослой в лунках промывали 1-2 раза раствором Хэнкса. Серийные 10-кратные разведения вируса готовили в среде DMEM, содержащей трипсин (5 мкг/мл) и гентамицин ( мкг/мл). Разведения от 10-1 до 10-5 вносили в отмытые от ростовой среды лунки по 100 мкл, каждое разведение в 4 лунки. Плашки инкубировали при 37 0С, 4% СО2. Результаты титрования вируса учитывали через 48-72 ч. Титр вируса определяли по методу Рида-Менча и выражали в единицах ТЦД50 /мл.

2.1.5. Экспериментальные животные. Аттенуацию вируса, безопасность, антигенность и иммуногенную активность вакцинного препарата оценивали на супоросных свиноматках, новорожденных поросятах, откормочных свиньях и лабораторных животных. Новорожденных поросят содержали под своими матерями или изолированно в искусственных условиях сразу после рождения. Поросят в возрасте 30-35 и 65-70 дней содержали в течение всего опыта технологическими группами. В качестве лабораторных животных использовали морских свинок. Свиней всех возрастов прививали с помощью шприца-полуавтомата с силиконовой насадкой вместо иглы.

2.1.6. Сбор и приготовление образцов для исследований. Пробы сыворотки крови, молозива и молока свиней исследовали серологическими методами до и после вакцинации.

Кровь брали из наружной ушной вены в стерильные флаконы и выдерживали 2 часа в термостате при 37° С, затем выдерживали в течение ночи при 4° С. Сыворотку отделяли центрифугированием при 1500 об/мин в течение 20 мин. Молозиво и молоко брали в стерильные флаконы. Для получения молозива/молока свиноматкам внутривенно вводили 50 ед окситоцина. Каждую пробу получали не менее чем из трех долей вымени. Полученные пробы центрифугировали в режиме 19000 об/мин в течение 2 часов, после чего собирали среднюю фракцию, содержащую сыворотку. Все пробы до исследования хранили при минус 20° С.

2.1.7. Реакция нейтрализации вируса. Реакцию нейтрализации использовали для оценки антигенной активности вакцинного вируса по уровню вируснейтрализующих антител (ВНА) в сыворотке крови свиней до и после вакцинации и в молозиве (молоке) свиноматок, взятом в день опороса и в последующие дни.

Для реакции нейтрализации вируса использовали культуру клеток Vero со сплошным монослоем в 96-луночных пластиковых планшетах, предварительно отмытые от ростовой среды средой ДМЕМ.

Пробы иммунной сыворотки крови свиней предварительно инактивировали при 56 0 С мин. Пробы молозива/молока замораживали, оттаивали и обезжиривали центрифугированием при 3000 об/мин 10 мин. Затем готовили серийные 2- или 10-кратные разведения на среде ДMEM с антибиотиком.

Для активации вируса ЭДС в суспензию, содержащую вирус, добавляли трипсин до концентрации 20 мкг/мл и инкубировали 30 мин при 370С. Активированный вирус разводили средой ДMEM до концентрации 2-4 х 103 ТЦД50/мл и смешивали с равным объёмом серийного разведения сыворотки или молозива. После инкубации 1 ч при 37 0С смесь вирус-сыворотка вносили в отмытые от ростовой среды лунки с монослоем по 100 мкл. Доза вируса в каждой лунке составляла 100-200 ТЦД50. Смесь каждого разведения сыворотки вносили в 4 лунки.

Клетки со смесью вирус-сыворотка инкубировали 1 ч при 370С в атмосфере 4% СО2, после чего смесь удаляли, монослой отмывали от сыворотки и вносили поддерживающую среду ДMEM с трипсином (5-10 мкг / мл) по 100 мкл в лунку. Планшеты инкубировали при 37 0 С, 4% СО2.

Результаты реакции учитывают через 5 суток при наличии ЦПЭ в культуре, заражённой вирусом в рабочем разведении без сыворотки (контроль +) и отсутствии ЦПЭ в лунках с незаражённой культурой клеток (контроль –).

2.1.8. Изготовление сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС. Стабилизирующие среды. С целью уменьшения потери активности в результате сушки вирусную суспензию смешивали с одной из трёх стабилизирующих (защитных) сред, использованных в работе: декстраново-желатиновой, пептонно-желатозной и молоком.

Декстраново-желатиновую среду готовили следующим образом. В 2/3 конечного объёма бидистилированной воды вносили компоненты в следующем порядке (в граммах на 1 л воды): гидрофосфата калия 1,25, дигидрофосфата калия 0,5, желатина 30, декстрана 50, сорбита 50, сахарозы 30, гидролизата казеина 20. Каждый следующий компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После доведения рН до 7,3-7,4 2М гидроксидом калия добавляли бидистиллят до конечного объёма и автоклавировали при 121-1250 С в течение мин.

Пептонно-желатозную среду готовили смешиванием равных объёмов двух растворов.

Первый раствор содержал (в порядке растворения) дигидрофосфат калия 0,27%, лактозу 10% и пептон 10%. Второй раствор содержит дигидрофосфат калия 0,27% и желатозу 4%. Для растворения компонентов смеси нагревают или оставляют на ночь. рН обоих растворов доводят до 7,3-7,4 2М гидроксидом калия. После автоклавирования при 121-1250 С 30 мин растворы смешивали.

Молоко готовили альтернативно двумя способами. 1) Сухое обезжиренное молоко стерилизовали гамма-облучением интенсивностью 2 млн рад. Растворяли в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,3-7,4) в весовой пропорции 1:6, затем центрифугировали суспензию в 50-мл центрифужных пробирках при 5 000 об/мин в течение мин. 2). Коммерческое пастеризованное молоко 2,5 или 3,2 % жирности стерильно разливали в 50-мл центрифужные пробирки, однократно замораживали-оттаивали, затем центрифугировали суспензию в 50-мл центрифужных пробирках при 5 000 об/мин в течение 10 мин. После проверки рН (7,2-7,4) супернатант сливали и смешивали с вирусной суспензией или хранили в замороженном виде.

Вирусную суспензию смешивали с декстраново-желатиновой средой в отношении 0,7 :

0,3, с пептонно-желатозной средой или молоком - в отношении 1 : 1.

Лиофилизация вакцины. Смесь культурального вируса со стабилизирующей средой расфасовывали вручную (малые объёмы) или на автоматической линии по 1 мл во флаконы объёмом 3 см3, устанавливали на каждый флакон резиновую пробку с пазами для удаления влаги.

Для сушки в лабораторной установке Christ Alpha расфасованную вакцину предварительно замораживали в холодильнике при минус 600-70 0С в течение 16 ч, затем помещали в сушильную установку. При производственной сушке расфасованную вакцину замораживали в установке Christ Epsilon перед началом сублимации. Сразу после расфасовки в один или два флакона с вакциной помещали датчики температуры. Замораживание проводили в течение 6-8 ч до достижения в материале температуры полного замораживания, минус 500 С или ниже.

Лиофилизацию проводили при значениях вакуума в камере около 0,16 мБар в течение не менее 50 ч. После удаления из препарата около 90% влаги проводили досушивание при температуре 30-350С в течение 15 ч. По окончании лиофилизации флаконы герметично укупоривали непосредственно в камере сублиматора с помощью прижимных плит, после чего камеру заполняли атмосферным воздухом. После определения вакуума и остаточной влажности флаконы с сухой вакциной закатывали алюминиевыми колпачками.

2.1.9. Определение параметров сухой вакцины. Вакцина считается пригодной для практического применения только при наличии вакуума во флаконах. Поэтому все флаконы с сухой вакциной проверяли на наличие вакуума с помощью аппарата Д’Арсонваля. Светящийся разряд во флаконах свидетельствовал о наличии вакуума.

Определяли уменьшение массы сухой вакцины после досушивания её по ГОСТ № – 89 (СТ СЭВ 6279 – 89). Массовая доля влаги в сухой вакцине должна быть в пределах 1-4%.

6 флаконов с сухой вакциной, содержащих вакуум, выдерживали в течение 7 суток при 370 С. По истечении этого срока определяли активность вируса в усреднённой пробе титрованием вируса в культуре клеток.

2.1.10. Выделение вирусной РНК. Для выделения РНК из монослоя и суспензии культуры клеток использовали методику выделения с тризолом (Gibco ВRL, Life Technologies).

Для жидких образцов: к 500 мкл образца добавляли 500 мкл тризола и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем добавляли 200 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и снова инкубировали 10 мин. при комнатной температуре. Центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4° С. Отбирали верхнюю РНК-содержащую водную фазу и добавляли к ней равный объем 100% изопропанола. Инкубировали при минус 20° С в течение 20 мин. Центрифугировали 15 мин., 13000 об/мин при +4°С. Образовавшийся осадок РНК промывали дважды 75% этанолом, подсушивали при 37° С в течение 20-30 минут и растворяли в 30-40 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC).

Для монослоя и тканевых образцов: на монослой клеток наносили тризол из расчета 37,5 мкл на 1 см2 культуралыюй поверхности, дожидались отделения монослоя от поверхности чашки, переносили суспензию клеток в тризоле в микроцентрифужную пробирку (1,5 мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5-10 минут. Затем добавляли 200 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и снова инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Для разделения фаз центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4°С. Затем отбирали верхнюю РНК-содержащую водную фазу и добавляли к ней равный объем 100% изопропанола. Инкубировали при минус 20° С в течение 20 минут, центрифугировали минут, 13000 об/мин при +4° С. Образовавшийся осадок РНК промывали и растворяли, как указано выше.

2.1.11. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ - ПЦР) для детекции генома вируса ЭДС. В работе использовали метод множественной ПЦР, позволяющий обнаружение и различение геномов вирусов ТГС и ЭДС в одной пробе. Две пары праймеров, последовательности которых приведены ниже, подобраны на основе геномных последовательностей штамма CV777 вируса ЭДС и штамма Purdue вируса ТГС. Специфические праймеры были подобраны таким образом, чтобы исключить перекрёстные реакции для этих двух вирусов и неспецифические реакции. Условия проведения реакции отрабатывали на матрице двух референтных штаммов вируса ТГС, ТМК и Miller, и референтного штамма CV777 вируса ЭДС. Последовательности праймеров соответствуют консервативным участкам гена мембранного белка (М) вируса ЭДС и гена нуклеокапсида (N) вируса ТГС. Размеры специфических фрагментов соответствуют 412 п.н. и 612 п.н. для вирусов ЭДС и ТГС.

Последовательности праймеров приведены ниже.

М, прямой праймер: 5’-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3’ М, обратный праймер: 5’-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3’ N, прямой праймер: 5’-GATGGCGACCAGATAGAAGT-3’ N, обратный праймер: 5’-GCAATAGGGTTGCTTGTACC-3’ Состав реакционной смеси: 1 мM MgSO4, 50 мM Tрис-HCl (pH 8,3), 1,5 мM MgCl2, 0,01% желатина, 0,1% тритона Х-100, 0,25 мМ смеси четырёх дезокси-нуклеотид-трифосфатов (dNTPs), 2,5 ед. Taq-полимеразы, 2,5 ед. обратной транскриптазы (AMV-ревертазы), по 0, мкМ каждого праймера и 2–5 мкл РНК-содержащего препарата. Вода – до 25 мкл.

Режим проведения реакции. 1 цикл обратной транскрипции: 420 С – 45 мин, 940 С – мин; 40 циклов амплификации: 940 С – 30 сек, 550С – 30 сек, 720 С – 30 сек; 1 цикл общей элонгации: 950 С – 30 сек, 600 С – 30 сек, 720 С – 10 мин; охлаждение до 00С.

ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия).

2.1.12. Определение нуклеотидной последовательности гена ORF3 вируса ЭДС. Для секвенирования гена ORF3 по двум цепям использовали праймеры, разработанные Song с соавторами [2003]. Нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера при помощи секвенирования ПЦР-продукта с использованием набора Big Dye Terminator Сусlе Sequencing Kit (Аррlied Biosystems) согласно инструкции изготовителя. Электрофорез ДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе АВI РRISМ 3130 Genetic Analyzer (Аррlied Biosystems, США).

2.1.16. Компьютерный анализ полученных последовательностей. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ BioEdit (version 7.0.0. Copyright© 1997-2004) и программы SeqMan из пакета программ Lasergene (version 7.1.0.(44) Copyright © 1993-2006).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Культуральные свойства и aттeнуация полевого изолята вируса ЭДС с целью получения вакцинного штамма. Полевой вирус эпизоотической диареи свиней (ЭДС) был передан в ЗАО НПО НАРВАК в виде культуральной жидкости. Данный вирус был выделен в культуре клеток Vero из кишечника больного поросёнка и к моменту передачи прошёл шесть серийных пассажей в культуре клеток Vero.

Серийное пассирование вируса в культуре клеток Vero и оценка его аттенуации. Прежде всего, предстояло выяснить культуральные и вирулентные свойства полученного вируса.

Выявление спектра чувствительных линий клеток естественного хозяина представляло интерес с целью выбора наиболее пригодного клеточного субстрата для исследовательских и производственных целей. На первом этапе исследовали чувствительность линий клеток СПЭВ и ППК, используемых в работе с вирусом ТГС. В отличие от линии клеток Vero, обе линии клеток оказались нечувствительными к вирусу ЭДС. Поэтому для дальнейших исследований и прежде всего для аттенуации вируса ЭДС использовали линию клеток Vero.

В процессе решения различных задач вирус ЭДС прошёл более 100 серийных пассажей в культуре клеток Vero. Размножение вируса постоянно сопровождалось характерным ЦПЭ, который выражался в интенсивном формировании вакуолизированных синцитиев, сливающихся в симпласты (рис. 1). По мере пассирования период наступления выраженного ЦПЭ постепенно сокращался, а накопление вируса постепенно повышалось. Так, в течение первых 20 пассажей вирус накапливался в титре 3,0-3,5 lg ТЦД50/мл, а после 40 пассажей титр вируса был в пределах 4,0-5,0 lg ТЦД50/мл.

Выраженный ЦПЭ наступал через 18 ч, а разрушение монослоя – через 24-26 ч после заражения (табл. 1).

Таблица 1. Инфекционность и цитопатическая активность штамма ИС в зависимости от длительности пассирования в культуре клеток Vero Рис. 1. Цитопатогенный эффект вируса ЭДС в культуре клеток Vero. Увеличение А. Незаражённые клетки в монослое.

Б. Монослой через 15 ч после заражения вирусом.

В. Монослой через 20 ч после заражения вирусом.

Результаты проведенных исследований (табл.1) показали, что время наступления цитопатического эффекта и накопления вируса зависели от длительности пассирования и множественности заражения культуры клеток Vero. После 80 пассажей вирус накапливался максимально в титре 5,50 – 6,50 lg ТЦД50/мл.

Начиная с 40 пассажа, вирус периодически использовали для изготовления экспериментальных образцов живой вакцины.

С целью аттенуации полевой вирус серийно пассировали в культуре клеток Vero.

Вирулентность культурального вируса ЭДС на уровне 15, 26 и 30 пассажей в культуре клеток Vero изучали в опытах на 2-3-дневных безмолозивных поросятах, полученных от свиноматок, серонегативных к вирусам ЭДС и ТГС. Культуральную вируссодержащую жидкость поросятам вводили орально в объёме 2 мл. Доза вируса составляла 3,33 lg ТЦД50 (15 пассаж) и 3,66 lg ТЦД50 (26 и 30 пассажи). Вирус 15 пассажа вызвал слабовыраженную диарею через 16 часов после введения, которая прекратилась через 48 часов. У поросят, которым ввели вирус пассажа, отклонений от нормального состояния не отмечали в течение всего периода наблюдения. Безмолозивные поросята, которым ввели вирус 30 пассажа, оставались нормальными в течение всего периода наблюдения (7 дней).

Из результатов этого опыта следует, что после 25-30 серийных пассажей в культуре клеток Vero вирус ЭДС полностью утратил вирулентность для новорождённых поросят.

Авирулентный штамм вируса ЭДС получил название ИС. В дальнейшем его использовали в исследовательских целях и разработке живой вакцины.

Антигенность штамма ИС в зависимости от длительности аттенуации вируса. Антигенные свойства штамма ИС, аттенуированного в культуре клеток Vero, определяли на серонегативных к вирусу ЭДС поросятах послеотъёмного возраста (35-40 дней). Поросят иммунизировали внутримышечно, однократно. Через 21 день после введения вируса определяли титр ВНА в сыворотке крови.

В первом опыте вирус, прошедший 40 пассажей в культуре клеток Vero, вводили в дозе 4,0 и 5,0 lg ТЦД50. Введение вируса вызывало образование ВНА в титре 1:32 – 1:40 и 1:60 – 1: соответственно дозе инокуляции. Данные этого опыта показали антигенность вакцинного штамма вируса ЭДС для свиней, степень которой зависит от дозы вакцины.

В следующем опыте с целью определения возможного диапазона пассирования вакцинного штамма ИС без снижения его антигенной активности исследовали вирус 40, 60 и пассажей в культуре клеток Vero. Вирусом одного уровня пассажа прививали группу 35-40дневных поросят, которых в соответствии с технологией в период доращивания содержали в одном секторе (53-71 голов). Доза иммунизации составляла 4,0 lg ТЦД50. Титр ВНА в сыворотке крови определяли у 5 поросят из каждого сектора.

Результаты исследования показали, что штамм ИС, прошедший 40, 60 и 80 пассажей в культуре клеток Vero, не различается по антигенной активности для свиней. Поросята, иммунизированные вирусом всех трёх уровней пассажа, развили антительный ответ сходной интенсивности. Титр ВНА составлял 1:30 – 1:40 (табл. 2).

Таблица 2. Антигенность штамма ИС в зависимости от длительности пассирования Пассаж прививочного привитых До иммунизации После иммунизации Примечание. В скобках указан уровень ВНА в среднем по каждой группе поросят Таким образом, вследствие аттенуации вируса ЭДС получен авирулентный штамм, обладающий выраженной антигенностью.

Изменения в геноме штамма ИС вируса ЭДС как результат адаптации к культуре клеток Vero. Адаптация и размножение вируса ЭДС в культуре клеток Vero сопровождается мутациями в неструктурном вирусном гене ORF3. Целью настоящего исследования являлось изучение изменений, произошедших в гене ORF3 штамма ИС в ходе его адаптации к размножению в культуре клеток Vero. Для этого сравнивали первичную структуру гена ORF трёх вариантов вируса: штамма ИС, прошедшего 70 и 110 пассажей в культуре клеток (соответственно ИС70 и ИС110), и полевого изолята. В качестве референс-последовательности была взята последовательность гена ORF3 прототипного штамма CV777 вируса ЭДС (GenBank, NCBI, номер доступа Z24733).

Сравнение последовательностей ORF3 ИС70, ИС110 и CV777 выявило делеции размером 29 и 38 нуклеотидов в 5’-концевом участке гена соответственно ИС70 и ИС110.

2.2.2. Оптимизация условий массового культивирования вируса. Для изготовления вакцинных препаратов большой интерес представляет повышение выхода культурального вируса. С целью получения максимально возможного выхода штамма ИС вируса ЭДС изучали зависимость накопления вируса в культуре клеток Vero от различных факторов: 1) состояния культуры клеток, 2) наличия следов сыворотки в среде, 3) дозы заражения и 4) способа культивирования (роллерная или статическая культура). Серию опытов проводили с длительно адаптированным вирусом (50-60 пассажей), обладающим выраженной репродукцией (значения инфекционной активности 4,50 – 5,50 lg ТЦД50/мл).

Клетки Vero выращивали в 1,5 л матрасах или в роллерных сосудах ёмкостью 3 л. В культуру клеток, выращенную в 1,5 л матрасах или в 3 л роллерных сосудах, вносили соответственно по 150 или 250 мл поддерживающей среды DMEM c антибиотиком и трипсином (5 мкг / мл). Культуру клеток, выращенную различным способом, заражали вирусом одновременно и инкубировали при 370С до выраженного цитопатогенного эффекта (поражение не менее 80% клеток монослоя).

Состояние культуры клеток. Сравнивали накопление вируса ЭДС в культуре клеток Vero в зависимости от интенсивности клеточного роста (формирование монослоя на 85-90 и на 95После удаления ростовой среды и однократного промывания монослоя клеток раствором Хэнкса в культуральные сосуды вносили поддерживающую среду ДМЕМ, содержащую трипсин (5 мкг / мл) и вирус 75-85 пассажа (0,1 ТЦД50 / клетка). Накопление вируса определяли через 18 ч после заражения при ярко выраженном ЦПЭ. Инфекционную активность вируса определяли титрованием в культуре клеток Vero.

Из результатов, представленных в таблице 3, видно, что в культуре клеток с более развитым монослоем вирус накапливается в большем титре. Наблюдения также показали, что возраст заражаемого монослоя Vero в пределах 48 - 96 ч имеет меньшее значение для накопления вируса ЭДС, чем численность (плотность) клеток в монослое.

Таблица 3. Накопление вируса в зависимости от интенсивности формирования Так как перед заражением при смене ростовой среды на поддерживающую в ней могут остаться следы сыворотки крови, которая угнетает репродукцию вируса ЭДС, представлялось целесообразным изучить значение такой возможности. Перед заражением однослойной культуры вирусом остатки ростовой среды, содержащей сыворотку, удаляли однократным промыванием раствором Хэнкса (20-25% объёма ростовой среды). В качестве контроля использовали культуру клеток без промывания раствором Хэнкса перед заражением.

Вирус (0,1 ТЦД50/клетка) вносили вместе с поддерживающей средой. Накопление вируса в культуре определяли через 18 ч после инкубирования. В культуре клеток, отмытой от ростовой среды, титр вируса был выше в 30-50 раз по сравнению с титром вируса в неотмытой культуре (табл. 4). Это, вероятно, связано с частичной нейтрализацией трипсина остатками сыворотки ростовой среды.

Таблица 4. Влияние удаления следов ростовой среды перед заражением Зависимость накопления вируса от дозы заражения. После удаления ростовой среды и однократного промывания раствором Хэнкса культуру клеток заражали вирусом с множественностью 0,1; 0,01; 0,001 и 0,0001 ТЦД50/клетка. Через 18 ч во всех заражённых культурах развился ЦПЭ, характерный для вируса ЭДС. Интенсивность ЦПЭ коррелировала с заражающей дозой вируса. Все культуры клеток инкубировали до развития выраженного ЦПЭ.

Результаты этого исследования (табл. 5) показали прямую зависимость накопления вируса от дозы заражения независимо от уровня пассажа. Накопление вируса было множественностью заражения 0,01 и 0,1 ТЦД50/клетка.

Таблица 5. Накопление вируса ЭДС при различной дозе заражения Культивирование вируса ЭДС в роллерных и статических условиях. Культуру клеток Vero, сформировавшую монослой на 95-100% в статических матрасах объёмом 1,5 л и в роллерных бутылях объёмом 3 л, после удаления ростовой среды использовали для выращивания вируса ЭДС.

Вирус 82-86 пассажей с исходным титром 5,50-6,00 lg ТЦД50 /мл вносили в дозе 0, ТЦД50 /клетка вместе с поддерживающей средой (содержащей трипсин в концентрации мкг/мл) после удаления следов ростовой среды. В каждом опыте заражали по 3-5 сосудов со статической или роллерной культурой. Урожай вируса собирали через 18 ч после заражения при ярко выраженном ЦПЭ.

Результаты исследования представлены в таблице 6. По накоплению вируса ЭДС оба способа культивирования практически не различались между собой.

Таблица 6. Накопление вируса в зависимости от способа культивирования Номер Размножение штамма ИС в других линях клеток и в сублиниях клеток Vero. Данное исследование было проведено с целью возможного выявления высокопродуктивной линии клеток для производственного размножения штамма ИС вируса ЭДС. Изучали способность указанного штамма к размножению в культуре клеток перевиваемых линий различного происхождения (PK15, SK6, IB-RS2, MARC-145 и HRT). Прежде всего, интересовала возможность накопления вакцинного штамма в большем титре по сравнению с его накоплением в культуре клеток Vero.

Исходным материалом являлся штамм ИС 90 - 100 пассажа в культуре клеток Vero (5,50 – 6, lg ТЦД50 / мл). Размножение вируса в клеточных культурах различного происхождения определяли в течение нескольких серийных пассажей. Культуры клеток выращивали в пластиковых матрасах ёмкостью 50 см3.

Для заражения брали культуры клеток, сформировавшие монослой на 90-100% (24 - 48 ч после пересева). Перед заражением монослой дважды промывали от ростовой среды. В сосуды с отмытым монослоем вносили 10 мл соответствующей ростовой среды без сыворотки, содержащей вирус в дозе 0,1-1,0 ТЦД50 на клетку и трипсин в концентрации 5 мкг/мл. За развитием ЦПЭ наблюдали в течение 96 часов. В качестве контроля использовали те же культуры клеток, не заражённые вирусом, а также заражённую и незаражённую культуру клеток Vero. Культуры замораживали в период развития ЦПЭ, а при его отсутствии – через часов после заражения. После размораживания культуральную жидкость использовали для очередного пассажа в гомологичной линии клеток (серийные пассажи).

Результаты адаптации вируса к новым линиям клеток учитывали по развитию ЦПЭ, биопробе в культуре Vero и с помощью ПЦР анализа.

Из данных, приведенных в табл. 7, видно, что из 6 исследованных линий клеток чувствительными к размножению штамма ИС после 100 пассажей в культуре клеток Vero оказались две линии: IB-RS2 и MARC-145.

В культуре клеток МАRC-145 штамм ЭДС прошёл пять серийных пассажей, максимальная активность вируса (4,23 lg/мл) была в первых двух пассажах. В ходе дальнейшего пассирования в данной культуре активность вируса снижалась и в пятом пассаже составила около 3,00 lg/мл.

В культуре клеток IB-RS2 вирус прошёл восемь серийных пассажей, максимальная активность была отмечена в шестом пассаже (4,76 lg/мл).

Результаты данного исследования показали, что из всех использованных культур клеток только Vero удовлетворяющем требованиям изготовления живой вакцины. Только культуру клеток Vero использовали в дальнейшем для производственного культивирования вируса.

Таблица 7. Чувствительность различных линий клеток к размножению вакцинного Пассаж Культура Происхождение вируса клеток Примечание. + наличие ЦПЭ, + сомнительный результат, - отсутствие ЦПЭ, НИ – не исследовали Так как предыдущее исследование показало, что для массового культивирования штамма ИС пригодна только культура клеток Vero, было целесообразно сравнить его накопление в культуре различных доступных сублиний клеток Vero. Культуру клеток Vero трёх сублиний: испанской, английской и российской (Vero B) выращивали и заражали в одинаковых оптимальных условиях. Из представленных в табл. 8 данных видно, что накопление вируса было сходным во всех использованных сублиниях клеток Vero. Любая из этих трёх сублиний клеток пригодна для производственного культивирования штамма ИС вируса ЭДС.

заражения Накопление сублинии, lg ТЦД50 / мл 2.2.3. Разработка технологии изготовления и контроля живой сухой вакцины в экспериментальных условиях. Предыдущие исследования позволили получить два важных результата, определивших дальнейшую стратегию разработки средств специфической профилактики ЭДС. Титр культурального вируса ЭДС повысился в ходе серийного пассирования в культуре клеток Vero, однако не достиг уровня, пригодного для изготовления инактивированной вакцины (> 107,0 ТЦД50/мл). Серийное пассирование полевого вируса ЭДС в культуре клеток Vero относительно быстро (25-30 пассажей) привело к потере вирулентности, что было установлено в опыте на новорожденных поросятах. После потери вирулентности аттенуированный штамм вируса ЭДС ещё в течение длительного серийного пассирования в культуре клеток Vero сохранял выраженные антигенные и иммуногенные свойства. Эти данные определили возможность и целесообразность разработки живой вакцины на основе аттенуированного штамма ИС вируса ЭДС.

Были изготовлены экспериментальные серии живой вакцины против ЭДС: восемь серий сухой и три серии замороженной вакцины для проведения испытаний на безвредность (реактогенность) и сохранность в сухом и замороженном состояниях.

Живая вакцина против ЭДС получила название вакцина ВЕРРЕС-ЭДС.

лиофилизации вакцины, допустимый срок хранения сухой вакцины и сохранность жидкой вакцины в замороженном состоянии.

Сохранность вируса ЭДС в процессе изготовления сухой вакцины. При производстве и использовании живых вакцин важное значение уделяется так называемой «холодовой цепи».

Целью данного раздела работы являлась разработка способа производственного изготовления биологическую активность вакцинного вируса. Максимальное сохранение биологической активности вакцинного вируса в сухом препарате является особенно важным, если учесть, что в культуре клеток он накапливается в относительно низком титре (5,50 – 6,50 ТЦД50/мл). Для достижения этой цели необходимо было выбрать: наиболее эффективную для данного вируса стабилизирующую среду, оптимальный режим лиофилизации и метод ускоренной оценки стабильности сухой вакцины.

В процессе изготовления сухой вакцины определяли титр вируса до смешивания со стабилизатором, после смешивания со стабилизатором, после замораживания (перед сушкой), сразу после сушки и после испытания сухой вакцины методом ускоренного старения. В качестве исходного материала для приготовления сухой вакцины использовали вирус 45 - пассажей в культуре клеток Vero c титром 5,50 - 6,33 lg ТЦД50 / мл.

Среда высушивания. Сравнивали протективную эффективность трёх защитных сред при лиофилизации вируса. Состав и способ приготовления сред №1, №2 и №3 и смешивание их с вирусной суспензией описан в главе 1.5 раздела «Материалы и Методы». Лиофилизацию вируса со всеми вариантами защитной среды проводили одновременно в аппарате Christ Alpha.

Протективный эффект трёх защитных сред по биологической активности вакцинного штамма оценивали сразу после лиофилизации.

Из представленных данных видно, что активность вируса ЭДС снижалась ещё на начальной стадии - после добавления стабилизирующей среды и последующего замораживания (табл. 9). Потеря активности вируса на этой стадии со средой №1, №2 и №3 соответственно составляла 0,00 – 0,24, 0,33 – 0,50 и 0,00 – 0,34 lg ТЦД50 / мл.

В процессе высушивания с защитной средой №1 или №2 вирус терял 0,50 - 0,84 lg ТЦД50 / мл, а с защитной средой №3 - 0,66 – 0,84 lg ТЦД50 / мл.

Таким образом, суммарное снижение активности вируса по сравнению с исходной культуральной суспензией составило 0,66 - 0,84; 1,00 – 1,24 и 0,84 – 1,00 lg ТЦД50 / мл при использовании соответственно защитной среды №1, №2 и №3.

Для оценки стабильности вакцинного препарата в будущем при длительном хранении проводили испытание методом «ускоренного старения» (370С, 7 суток). В ходе ускоренного старения активность вируса снижалась на 1,00; 1,43 – 1,53 и на 1,33 – 1,66 lg ТЦД50 / мл соответственно в препаратах с защитной средой №1, №2 и №3.

Результаты проведённых исследований показывают, что наиболее эффективной из испытанных защитных сред является декстраново-желатиновая (среда №1, табл. 9).

Дополнительно была проведена сушка вирусной культуральной суспензии с консервированным концентрированным молоком (табл.10). Вирусную суспензию смешивали с концентрированным молоком в отношениях 1:1, 2:1 и 4:1. Образцы сушили в сублиматоре Christ alpha. В качестве контроля одновременно сушили смеси вируса с декстрановожелатиновым и пептонно-желатозным стабилизаторами в соответствующих пропорциях.

Таблица 9. Активность вируса ЭДС при высушивании с тремя защитными средами Защитная среда Декстрановожелатиновая желатозная обезжиренное Таблица 10. Активность вируса при сушке с концентрированным молоком Содержание молока в вирусной суспензии, % Из результатов этих исследований, представленных в табл. 10, видно, что концентрированное молоко (обезжиренное и необезжиренное) в качестве защитной среды менее пригодно по сравнению с другими защитными средами. Увеличение концентрации молока в смеси не приводило к улучшению сохранности вируса в сухом препарате. Однако молоко хорошо защищало вирус при замораживании.

воспроизводимости результатов изготовления сухой вакцины и дальнейшего изучения её свойств при хранении изготовили восемь экспериментальных серий сухой вакцины ВЕРРЕСЭДС. В качестве защитной среды использовали декстраново-желатиновый стабилизатор.

Лиофилизацию экспериментальных серий вакцины проводили в аппарате Christ Alpha, каждая серия насчитывала 80 – 100 флаконов.

Установлено, что после смешивания с защитной средой активность вируса снижалась не больше, чем на 0,16 lg ТЦД50 / мл, а в результате высушивания – на 0,50 – 0,84 lg ТЦД50 / мл.

Суммарное снижение активности вируса по сравнению с исходной культуральной суспензией составляло 0,50-1,00 lg ТЦД50 /мл. В результате ускоренного старения инфекционная активность вируса в сухой вакцине снижалась на 1,00–1,23 lg ТЦД50 / мл (табл. 11).

Таблица 11. Изменение активности вируса в процессе изготовления экспериментальных Примечание. В скобках указано снижение инфекционной активности вируса по сравнению с предыдущим этапом изготовления вакцины Эти данные согласуются с результатами, приведёнными в табл. 9, и свидетельствуют о воспроизводимости выбранного режима изготовления сухой вакцины. Выбранный режим использовали в дальнейших исследованиях, а также при изготовлении производственных серий сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС.

Сохранность вакцинного штамма в сухой вакцине. Для определения срока годности вакцины образцы всех восьми экспериментальных серий помещали на хранение при 2-80 С (согласно инструкции по применению вакцины ВЕРРЕС-ЭДС). Через различный срок хранения (3, 6, 9 и 12 месяцев) определяли биологическую активность вакцины. Все серии вакцины, как указано выше, также были испытаны в режиме ускоренного старения.

Результаты этого исследования приведены в табл. 12.

Таблица 12. Активность вируса в экспериментальных сериях сухой вакцины Серия Через каждые три месяца хранения активность вируса в сухой вакцине снижалась на 0,00 - 0,33 lg ТЦД50 / мл, за 12 мес. хранения активность вируса снижалась на 0,50 – 0,83 lg ТЦД50 / мл. При испытании в режиме ускоренного старения активность вируса в вакцине снижалась на 1,00 – 1,23 lg ТЦД50 / мл (в большинстве случаев на 1,00 lg ТЦД50 / мл).

Изучение стабильности сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС при испытании в режиме ускоренного старения в сравнении с её сохранностью при 2 - 80 С в течение 12 мес. показало ценность данного метода для предварительной оценки будущей стабильности вакцины при длительном хранении. Так, испытание 8 серий сухой вакцины методом ускоренного старения показало снижение титра инфекционности на 1,00 – 1,23 lg ТЦД50 / мл (в среднем на 1,00 lg), тогда как те же серии вакцины через 12 месяцев хранения при 2-80 С снижали активность на 0,50-0,83 lg ТЦД50 / мл (в среднем на 0,70 lg). Из результатов этого исследования можно сделать следующее заключение: если при ускоренном старении сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС биологическая активность вакцинного штамма вируса снижается на 1,00 lg ТЦД50 / мл, можно с большой долей вероятности утверждать, что при хранении в течение 12 мес. при 2-80 С его активность снизится не больше, чем на 0,83 lg ТЦД50 / мл.

Таким образом, метод ускоренного старения представляет интерес как экспресс метод оценки новых стабилизаторов, режимов сублимации и в целом качества сухих вакцин.

Контроль вакцины на безвредность и реактогенность. Безвредность аттенуированного штамма ИС и сухой вакцины проверяли на морских свинках массой 350-400 г. Испытуемые препараты вводили однократно внутримышечно в область бедра. Вакцинный вирус и сухую вакцину вводили трём морским свинкам в дозе 4,0 lg ТЦД50 в объёме 2 см3. За морскими свинками наблюдали в течение 10 дней. Все испытуемые препараты: вакцинный вирус 36 - пассажей и сухая вакцина серий 1 и 2 оказались безвредными при контроле на морских свинках.

2.2.4. Разработка способа применения живой вакцины против ЭДС. Для иммунизации свиней против ЭДС в производственных условиях необходимо было определить схему введения вакцины. В связи с этим на данном этапе работы изучали антигенность вакцинного штамма в зависимости от способа введения, прививочной дозы вируса и кратности вакцинации.

Способ введения вакцины. В качестве предварительного этапа провели оценку применения живой вакцины против ЭДС на серонегативных свиньях двух технологических групп:

супоросных свиноматках (возраст 3,5–4 года) и поросятах послеотъёмного возраста (35- последовательности применения живой и инактивированной «кишечной» вакцины.

культуральной жидкости (активность 5,0–6,0 lg ТЦД50/мл) иинактивированную «кишечную»

вакцину против ЭДС (табл. 13).

Таблица 13. Схема применения двух вакцинных препаратов вакцинации Примечания. Орально: вакцинный вирус в дозе 5,66 lg ТЦД50 свиноматкам (№1 и №2) или 5,0 lg ТЦД50 поросятам; В/М жив.: живой вакцинный вирус внутримышечно в дозе 5,0 lg ТЦД50;

В/М инакт.: инактивированная вакцина внутримышечно в объёме 5 мл.

Наличие и выраженность иммунитета определяли по титру ВНА в сыворотке крови свиней через 21 день после вакцинации и через 15 дней после ревакцинации.

ВНА в высоком титре обнаружены в сыворотке крови и молозиве вакцинированных свиноматок, а также в сыворотке крови их потомства.

Титр ВНА в молозиве при вакцинации по схеме 1 был выше, чем по схеме 2 (табл. 14).

Высокий титр ВНА в крови новорождённых поросят указывает на эффективную передачу колостральных антител потомству. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии преимущества ревакцинации супоросных свиноматок инактивированной вакциной против ЭДС.

Таблица 14. Сероконверсия у вакцинированных свиноматок и колостральный