САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ФИЗИКОВА

Анастасия Юрьевна

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ПРОТЕИНКИНАЗЫ PHO85p В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ

МИТОХОНДРИЙ У ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE И PICHIA

PASTORIS

Специальность 03.02.07- генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете, в лаборатории биохимической генетики кафедры генетики и селекции.

Научный руководитель: доктор биологических наук Самбук Елена Викторовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Сойдла Тыну Рихович Институт цитологии РАН кандидат биологических наук Сайфитдинова Алсу Фаритовна Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН Ведущее учреждение: Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН

Защита диссертации состоится "11" марта 2010 г. в 14 часов на заседании совета Д 212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, СанктПетербург, Университетская наб. 7/9, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета

Автореферат разослан "_" 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 212.232. кандидат биологических наук Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В основе адаптации микроорганизмов к условиям среды лежат изменения уровня экспрессии генов, которые влияют как на метаболизм, так и на структурную организацию клетки. Химический состав цитоплазмы оказывает существенное влияние на функцию эндосимбионтов.

Митохондрии, в свою очередь, определяют пластичность метаболизма эукариотической клетки и обеспечивают адаптацию к воздействиям физических или химических факторов за счет регуляции синтеза АТФ, накопления активных форм кислорода и апоптоза. Изучение генетических механизмов, регулирующих функционирование митохондрий и стабильность митохондриальной ДНК (мтДНК), является актуальным направлением фундаментальных исследований.

Изучение дрожжей-аскомицетов позволяет исследовать механизмы регуляции функций митохондрий в зависимости от метаболического состояния эукариотической клетки. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris отличаются способом утилизации углерода: S. cerevisiae являются факультативными анаэробами, а метилотрофные дрожжи P. pastoris – облигатными аэробами.

Центральную роль в процессе передачи сигнала об изменениях окружающей среды играет фосфорилирование белков. Циклин-зависимые протеинкиназы (CDK), в том числе Pho85р, выступают важными регуляторами как клеточного цикла, так и транскрипции, обеспечивая прохождение клетки через фазу G1/S, контроль полярности клеток, экспрессию генов метаболизма фосфата и передачу сигналов об изменениях окружающей среды (Carroll a.

O’Shea, 2002).

Для большинства облигатных аэробов необходимым условием выживания является наличие функционально активных митохондрий. У человека делеции, дупликации или точковые мутации мтДНК могут стать причиной наследственных и спорадических заболеваний. В клетках дрожжей S. cerevisiae структура митохондриальных нуклеоидов подвергается ремоделированию с помощью метаболически регулируемых бифункциональных белков (Hsp60p, Kgd2p, Ilv5p). В настоящее время механизмы поддержания стабильности мтДНК, а также клеточные процессы, опосредованные ядерномитохондриальными генетическими взаимодействиями, исследованы недостаточно.

Целью исследования являлось изучение сигнальной системы, обеспечивающей адаптацию митохондрий к изменениям концентрации фосфата у дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris. В ходе работы решали следующие задачи: (1) сравнительная характеристика фенотипов мутантов pho85 дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris; (2) определение частоты возникновения спонтанных мутаций мтДНК на фоне pho85 и динамики накопления дыхательнонекомпетентных (Gly-/[pet-]) клонов у штаммов pho85; (3) изучение влияния дизрупции гена PHO85 на поляризацию, транспорт митохондрий, а также на стабильность нуклеоидов; (4) поиск супрессорных мутаций и мультикопийных супрессоров дыхательной некомпетентности, возникающей на фоне мутаций pho85.

Научная новизна исследования. Впервые продемонстрирована роль компонентов PHO-регулона в контроле стабильности мтДНК дрожжей S.

cerevisiae. Показано, что дыхательная некомпетентность, возникающая на фоне дизрупции гена PHO85, обусловлена нарушением распределения нуклеоидов между материнской и дочерней клетками, и селективным преимуществом клеток [rho0] на среде с глюкозой и высокой концентрацией фосфата.

Выявлено, что дизрупция гена PHO85 приводит к нарушению структуры цитоскелета в клетках дрожжей S. cerevisiae, вызывая качественные и количественные изменения в составе фракции термостабильных белков цитоскелета. Показано, что у дрожжей S. cerevisiae дополнительные мутации в генах PHO4, PHO81, PHO84 и PHO87, возникающие на фоне дизрупции pho85, нормализуют транспорт фосфата в клетку и восстанавливают дыхательную компетентность. Отсутствие протеинкиназы Pho85р у дрожжей S. cerevisiae приводит к снижению рН матрикса митохондрий, что свидетельствует об изменении мембранного потенциала митохондрий. Выявлено, что сверхпродукция белка внутренней мембраны митохондрий Dic1p, обеспечивающего выведение фосфата из матрикса митохондрий, приводит к стабилизации мтДНК у штаммов pho85 дрожжей S. cerevisiae. Показано, что ген ILV5, кодирующий белок компактизации мтДНК, является мультикопийным дыхательной некомпетентности мутантов PHO85. В ходе супрессором выполнения диссертационной работы были получены штаммы Р. pastoris с делецией гена PHO85 и проведена фенотипическая характеристика полученных мутантов. Делеция гена РНО85 у P. pastoris приводит к конститутивному синтезу кислой фосфатазы (КФ), чувствительности к ионам кальция, повышенному уровню гликогена, но, в отличие от S. cerevisiae, не влияет на частоту возникновения термочувствительных мутаций и на стабильность мтДНК.

Практическая ценность. Чувствительность штаммов с делецией pho85 к повышенным концентрациям кальция позволяет использовать ген PHO85 в качестве нового селективного маркера при создании штаммов-продуцентов гетерологичных белков дрожжей Р. pastoris.

Штаммы и плазмиды, полученные в данной работе, используются при выполнении исследовательских работ студентами и аспирантами биологопочвенного факультета.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях «Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting»

(Гётебург, Швеция 2003; Братислава, Словакия 2005; Торонто, Канада 2008;

Манчестер, Великобритания 2009); международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, Пущино, 2006); III и V cъездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004 и 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 – в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Работа изложена на 183 страницах и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы ( наименований). Работа содержит 9 таблиц и 46 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы. Генотипы штаммов дрожжей, использованных в работе, приведены в таблице 1.

Таблица 1. Основные штаммы, использованные в работе S. cerevisiae:

МАТа ade2–101 ura3–52 his3–200 leu2–3, 112 lys2–801 trp1– YM 1-GRF18 MAT his3–1-11,15 leu2-3,112 pho BWG1-7a MAT ade1–100 his1 leu2 ura MATa his7-2 leu2-3, 112 ura3 bik1::ura3-29RL trp1-1UAG ade2C-YUNI 1Г-П4405 MAT his7–1 met13-A1 ura3 leu2- P. pastoris:

GS 3-GS Плазмиды. Для получения дизрупции и делеции гена PHO85 у штаммов S.

cerevisiae и P. pastoris использовали плазмиды pDEL85–URA3, pDEL85-LEU2 и pFA3 (Самбук и др., 2003; Физикова и др., 2009). Для конструирования (URL:http://www.unipat.pu.ru/Patents/description.php?numberin=1660388), pEGFPC3 (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) и pRS426 (URL:http://www.genomewww.stanford.edu/vectordb/vector_descrip). Принцип конструирования плазмиды pMM-EGFP был предложен ранее (Okamoto et al., 1998). Для поиска мультикопийных супрессоров дыхательной некомпетентности на фоне дизрупции pho85 использовали банк на основе плазмиды pGP564 (Yeast Genomic Tiling Collection, Open biosystems).

Методы. В работе использовали традиционные методы генетики дрожжей и стандартные среды (Захаров и др., 1984; Evans, 1996). Для отбора колоний eryR использовали среду ERY: 3% глицерин, 1% дрожжевой экстракт, 0,5% пептон, 25 мМ натрий-фосфатный буфер (pH 6.5), эритромицин 4 г/ л. Отбор гомоплазмических eryR мутантов и оценку частоты мутаций мтДНК на одно клеточное деление проводили по методикам, предложенным ранее (Foury, 2007). Оценку частот возникновения дыхательно-некомпетентных клонов на фоне pho85 проводили по методике, предложенной ранее (Phadnis et al., 2006).

Выделение ДНК, генетическую трансформацию, гидролиз эндонуклеазами рестрикции, выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей, лигирование и гель-электрофорез проводили в стандартных условиях (Sambrook, 2001;

Остерман, 2002). Для получения последовательности CIT1, кодирующей промотор и сигнальный пептид цитратсинтазы, и последующего конструирования плазмиды pMM-EGFP проводили ПЦР с праймерами к CIT1:5/-acgcgtcgacgttcacattgccttttt-3/ и 5/-gctcgccactatagtagcgccatggcatg-3/. Для конструирования мультикопийной плазмиды pRS426-ILV5 проводили ПЦР с cgggatccgcttggttttctggtc-3/. Для подтверждения сохранения дизрупции штаммов [pho85::URA3/ pho85::LEU2] проводили ПЦР с праймерами к гену PHO85: 5/gccctaggacgtagactcgtaagcccgtagctt-3/, 5/-atgaaatcagagtagaatgctggagatctcg-3/. Для фенотипической характеристики штаммов с дизрупцией гена PHO85 (PhoC) использовали методику качественного определения активности КФ (Самсонова и др., 1975). Качественное определение уровня гликогена проводили по методике, предложенной ранее (Zurita-Martinez a.Cardenas, 2005).

Выделение тропомиозина в составе фракции термостабильных белков проводили по методике, предложенной ранее (Drees et al., 1995). Определение pH матрикса и межмембранного пространства митохондрий проводили по методике предложенной ранее (Saliola et al., 2004). Электрофорез белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях проводили по стандартной методике (Laemmli, 1970; Остерман, 2002). Визуализацию актина дрожжей родамин-фаллоидином и мтДНК с помощью DAPI проводили по стандартным методикам(Johnson а. Nogueira, 1981; Massardo et al., 2000).

Цитологические препараты анализировали в условиях, указанных ранее (Самбук и др., 2005). Для подсчета количества актиновых бляшек на клетку использовали стандартные методы вычисления медиан и доверительных интервалов для медиан, достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (U-критерий). Оценку ошибок и разности средних и относительных величин рассчитывали при помощи стандартных методов, с использованием параметрического критерия Стъюдента (Гланц, 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.Фенотипическая характеристика мутантов pho85Pp у дрожжей P. pastoris.

Штамм дрожжей P. pastoris 3-GS115 трансформировали плазмидой pFA3/ PvuII и отбирали трансформанты His-Leu+. У трансформантов определяли активность рКФ. Все трансформанты характеризовались конститутивным синтезом рКФ, что соответствует фенотипическому проявлению мутации гена pho85 S. cerevisiae.

У дрожжей S. cerevisiae на фоне мутаций pho85 наблюдается накопление гликогена, отсутствие роста на средах с высокой концентрацией кальция и средах с пролином в качестве единственного источника азота, а также накопление термочувствительных и дыхательно-некомпетентных клеток (Самбук и др., 2003). При изучении аналогичных фенотипических проявлений у мутантов pho85Pp дрожжей P. pastoris оказалось, что к общим проявлениям мутаций генов-ортологов дрожжей P. pastoris и S. cerevisiae можно отнести конститутивный синтез КФ, накопление гликогена на средах с высокой концентрацией фосфата, чувствительность к повышенной концентрации хлорида кальция в среде, зависимость роста от источника азота в среде. В отличие от сахаромицетов, у дрожжей P. pastoris делеция в гене РНО85 не оказывает выраженного влияния на частоты возникновения дыхательнонекомпетентных и термочувствительных мутаций, что, возможно, объясняется особенностями метаболизма двух видов дрожжей (Рис. 1).

митохондрий, а также митохондрий между материнской и дочерней клетками.

Изучение влияния дизрупции гена PHO85 на частоту мутаций в мтДНК.

pho85::LEU2 плазмиды pDEL85-LEU2/ PvuII и отбирали трансформанты PhoCLeu+ (pho85::LEU2) и Pho+Leu+ (PHO85) для контроля. Отобранные трансформанты инкубировали в течение 2 суток на среде с глицерином для селекции дыхательно-компетентных клеток, после чего клетки рассевали на среды с глюкозой для получения индивидуальных колоний. Через 3 дня с чашек смывали по 23-35 колоний каждого штамма и высевали полученные суспензии отдельных колоний на сектора одинаковой площади на чашки с полной средой.

Штаммы инкубировали в течение ночи и печатали на среду ERY. Через 10 дней подсчитывали частоту eryR клонов. Для штамма 8C-YUNI101 частота возникновения eryR на клеточное деление (a) соответствовала (4,4±4,3)*10-6, а