[
На правах рукописи
КОЗЛОВА
Александра Дмитриевна
РАЗРАБОТКА ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ
ПАРВОВИРУСА И ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНОРЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ
03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2014
Работа выполнена в отделе генодиагностики инфекционных болезней животных отделения биологических лекарственных средств и биотехнологии федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») Доктор биологических наук, профессор
Научный руководитель:
Обухов Игорь Леонидович Гаврилов Владимир Андреевич,
Официальные оппоненты:
доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, профессор кафедры биотехнологии ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им.
К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ им.К.И.Скрябина) Малоголовкин Александр Сергеевич, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной вирусологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии» (ГНУ ВНИИВВиМ) ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский
Ведущая организация:
и технологический институт биологической промышленности Россельхозакадемии» (ГНУ ВНИТИБП)
Защита диссертации состоится «24» апреля 2014 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.011.01 на базе ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ВГНКИ».
Автореферат разослан «_» марта 2014 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Букова Н.К
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИАСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.Парвовирус свиней (ПВС) и вирус репродуктивно-респираторного синдрома (РРСС) являются вирусными этиологическими агентами репродуктивных патологий свиноматок, которые широко распространены в мире.
Так по данным Ковалишина В.Ф. среди импортируемого поголовья репродуктивная патология в 28% случаев вызвана вирусом РРСС (наиболее распространенный вирусный этиологический агент) и в 4% – парвовирусом, в случае респираторной патологии вирус РРСС является этиологическим агентом в 60% случаев и уступает по распространенности только цирковирусу 2 типа [Ковалишин В.Ф., 2009].
Для ПВС и РРСС характерны аборты, рождение мертвых, мумифицированных и нежизнеспособных поросят [Bachmann, P.A. et al., 1975; Surez P. et al., 1994; Dokland, T., 2010; Molitor, T.W. et al., 1983]. Иногда наблюдают коинфицирование животного [Ануфриев, П.А. и др., 2003].
Парвовирусная инфекция и РРСС могут протекать в виде бессимптомного носительства. При этом животные-вирусоносители выделяют вирус в окружающую среду и являются источниками заражения здоровых животных. Поэтому для эффективной диагностики данных заболеваний необходимо использование современных методов лабораторной диагностики.
Классическим методом диагностики вирусных болезней является выделение вируса на культуре клеток, однако, этот метод длительный, дорогостоящий и трудоемкий. В РФ широко применяются ИФА и РТГА для обнаружения специфических антител. Данные методы не позволяют дифференцировать поствакцинальные антитела от постинфекционных, выявлять вирусоносителей при обследовании вакцинированного поголовья и исследовать сперму. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод, обладающий высокой специфичностью и чувствительностью, позволяющий выявлять вирусный геном даже при низкой вирусной нагрузке в любом биологическом материале.
Важной задачей является своевременное выявление ПВС, который может длительное время персистировать в стаде и проявляться только у супоросных свиноматок, не имеющих иммунитета к данному возбудителю.
Таким образом, разработка диагностикумов для выявления ПВС и вируса РРСС являются актуальными направлениям ветеринарной диагностики.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы являлась разработка тест-систем для выявления ДНК парвовируса свиней и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реальном времени».
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Подобрать праймеры и зонды, оптимизировать условия ПЦР для обнаружения НК парвовируса свиней и вируса РРСС, создать рекомбинантные положительные контроли.
2. Определить аналитическую специфичность и чувствительность тест-систем.
3. Провести комиссионные испытания, утвердить нормативную документацию и внедрить в лабораторную практику тест-системы для выявления парвовируса свиней и генотипирования вируса РРСС.
4. Идентифицировать ПВС и провести филогенетический анализ вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов на территории РФ.
Научная новизна работы.
Сконструированы оригинальные праймеры и зонды для амплификации и детекции ДНК ПВС и генотипирования РРСС.
Разработана тест-система на основе метода ПЦР в «реальном времени», обладающая 100% специфичностью и аналитической чувствительностью – 5х102 коп/мл ДНК парвовируса свиней в суспензии фекалий, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5х103 коп/мл в сперме.
Разработана тест-система на основе метода ПЦР в «реальном времени», обладающая 100% специфичностью и аналитической чувствительностью – 103 коп/мл РНК вируса РРСС в крови, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5х10 3 коп/мл в сперме.
При проведении филогенетического анализа установлено, что нуклеотидные последовательности вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов, отличаются от вакцинных штаммов и относятся к первому и второму субтипам европейского генотипа вируса.
В результате секвенирования показано, что нуклеотидные последовательности вируса РРСС из свинокомплексов отличаются от последовательностей штаммов, входящих в состав отечественных и зарубежных вакцин, применяемых для профилактики данной болезни на территории нашей страны.
Практическая значимость работы.
Разработана нормативная документация по применению следующих тест-систем: 1) «ПВС» для выявления ДНК парвовируса свиней; 2) «РРСС» для выявления и генотипирования вируса РРСС методом полимеразной цепной реакции.
ПЦР-тест-система «ПВС» для выявления ДНК парвовируса свиней методом полимеразной цепной реакции в «реальном времени» внедрена в ветеринарную практику с 2010 года, тест-система «РРСС» для генотипирования вируса РРСС – с 2013 года.
Рекламаций на данные тест-системы не поступало.
При проведении сравнительного анализа ПЦР-наборов, применяемых на территории РФ, установлено, что разработанная тест-система «ПВС» имеет в 100 раз большую чувствительность, чем тест-система №1 и в 10 раз, чем тест-система №2. Показано, что только тест-система «РРСС» в образцах из 16–ти неблагополучных свинокомплексов выявляла вирус РРСС в отличие от тест-систем №1, №2 и имела чувствительность в 10 раз выше, чем наборы реагентов №3 и №4 в 4-х пробах патматериала.
Основные положения, выносимые на защиту Разработанная тест-система для выявления ДНК парвовируса свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» обладает 100% специфичностью и выявляет 5х102 коп/мл ДНК парвовируса свиней в суспензии фекалий, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5х103 коп/мл в сперме.
Разработанная тест-система «РРСС» для генотипирования вируса РРСС обладает 100% специфичностью и выявляет 103 коп/мл РНК вируса РРСС в крови, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5х103 коп/мл в сперме.
Филогенетический анализ вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов на территории РФ в 2009-2013гг.
Сравнительный анализ чувствительности и специфичности тест-систем, применяемых в отечественной ветеринарной практике.
Публикации.
По результатам работы опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах рекомендуемых ВАК (1 статья в печати).
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 120 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2003»), и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение собственных исследований, выводы. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и таблицами. Приложение к диссертации содержит разработанную нормативную документацию, подтверждающую результаты исследований, их научно-практическую ценность. Список литературы включает 151 источник, в том числе 144 иностранных.
Апробация результатов работы Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях Ученого совета ФГБУ «ВГНКИ» (2010-2013 гг.), научных семинарах ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (2010-2013гг.). Основные материалы диссертации были опубликованы и доложены на III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010г.); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010г.); 11-й молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2011г.); международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения»
международным участием «Молекулярная диагностика - 2014» (Москва, 2014г.).
Личный вклад соискателя Представленная диссертационная работа является результатом собственных научных исследований автора.
Автор выражает благодарность за участие в выполнении отдельных фрагментов диссертации и техническую поддержку сотрудникам: к.б.н. Яцентюк С.П. (ФГБУ ВГНКИ), к.б.н. Астаховой Т.С. (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии), к.б.н. Кулешову К.В.
(ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии), Войцеховской Я.А. (институт медицины труда), Браславской С.И. (институт медицины труда).
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы парвовируса свиней ВЛ-94, вируса РРСС NADC-8 (американский генотип). Вакцина эмульсионная инактивированная против репродуктивнореспираторного синдрома (шт. КПР-96 европейского генотипа) и парвовирусной инфекции свиней (шт. ВЛ-94), ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; Вирусвакцина против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (шт. БД европейского генотипа), ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; Вакцина «Amervac» против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, живая (шт. VP046 европейского генотипа), «Laboratorios Hipra S.A.», Испания; Вакцина «Суиправак–PRRS» против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, инактивированная (шт. 5710 европейского генотипа). «Laboratorios Hipra S.A.», Испания; Вакцина «Прогрессис» против репродуктивно-респираторного синдрома свиней инактивированная эмульгированная (шт. Р120 европейского генотипа), «Merial», Франция; Вакцина «Порцилис PRRS» против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, живая сухая (шт. DV европейского генотипа), «Intervet International B.V.», Нидерланды.Специфичность тест-систем проверяли также на штаммах цирковируса свиней типа (НПО «Нарвак»), вируса болезни Ауески (шт. ГНКИ, Арский, МБА), вируса классической чумы свиней (шт. Синлак, ГМ-94, ЛК-ВНИИВМ), вируса трансмиссивного гастроэнтерита (НПО «Нарвак»), ротавируса типа А (шт. РП-82) и на НК из образцов биоматериала от животных, инфицированных вирусом африканской чумы свиней и вирусом эпидемической диареи. Использовали также штаммы и изоляты бактерий:
Mycoplasma hyopneumonia, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynovia; Brucella suis;
Chlamydia suis; Chlamydophila pecorum; Haemophilus parasuis; Lawsonia intracellularis;
Actinobacillus pleuropneumoniae; Bordetella bronchiseptica; Pasterella multocida; Leptospira interrogans; Listeria monocytogenes; Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium; Escherichia coli; Campylobacter jejuni; Salmonella choleraesuis;
Salmonella Dublin, Staphylococcus aureus; Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Streptococcus suis, Clostridium perfringens, Klebsiella pneumoniae.
Биологический материал, использованный в работе, получен из 27 хозяйств Белгородской, Ростовской, Томской, Московской, Курской, Ульяновкой областей, а также республик Чувашии и Башкортостан с 2009 по 2013гг. Во всех хозяйствах у животных наблюдались различные репродуктивные и/или респираторные нарушения.
Экстракцию НК проводили методом осаждения изопропанолом («Рибо-преп», Амплисенс, Россия) и на микроцентрифужных колонках («QIAamp Viral RNA mini kit» и «QIAamp DNA mini kit», Qiagen, Германия).
Праймеры. Анализ нуклеотидных последовательностей ПВС и вируса РРСС представленных в базе данных GenBank проводили с помощью программы VectorNTI Suite 9.0.0 (AlignX). Специфичность выбранных олигонуклеотидов изучали с помощью компьютерной программы BLAST on-line.
ПЦР проводили в объеме 25 мкл. Реакционная смесь для выявления парвовируса свиней содержала 10 мкл ПЦР-смеси-1-FRT PPV, 5 мкл ПЦР-буфера-С, 0,5 мкл полимеразы (TaqF) и 10 мкл ДНК пробы. Реакционная смесь для дифференцирования вируса РРСС содержала 10 мкл ОТ-ПЦР-смеси-1-FRT PRRSV, 5 мкл ПЦР-буфера-C, 0, мкл полимеразы (TaqF), 0,25 мкл ТМ-ревертазы, 0,25 мкл RT-G-mix-2 и 10 мкл РНК пробы. Анализ полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения прибора.
Для конструирования рекомбинантных контролей использовали те же праймеры, что и для разработки тест-систем. Проводили клонирование ДНК и кДНК в плазмиду pGEM-t и фаг gt10. Копийность клонированных препаратов ДНК/кДНК оценивали методом лимитирующих разведений с использованием программы Quality.
Очистку продуктов ПЦР для проведения секвенирования проводили набором реагентов «Рибо-сорб» (Амплисенс, Россия), основанном на модифицированной методике аффинной сорбции на силикагелевом сорбенте по Boom R.
Секвенирование фрагментов амплификации выполняли на базе ФГБУ ВГНКИ и ФБУН ЦНИИЭ методом циклического секвенирования по Сэнгеру с набором ABI PRISM Big Dye Terminator v.1.1 («Applied Biosystems», США), согласно инструкции изготовителя c использованием капиллярного автоматического секвенатора Appleid Biosystems 3500XL Genetic Analyzer или Appleid Biosystems 3130xl Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США).
Анализ полученных хроматограмм проводили с использованием программы «BioEdit» версии 7.0.8. Филогенетический анализ. Корректировку хроматограмм проводили в BioNumerics v.6.6. Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили на основании выравнивания аминокислотных последовательностей с помощью пакета скриптов Revtrans.
множественному выравниванию нуклеотидных последовательностей проводили в MEGA v.5.05. В результате была выбрана двухпараметрическая модель Кимуры [Kimura M., 1980]. Гомологию нуклеотидных последовательностей оценивали в MEGA v.5.05.
Филогенетическое дерево и постериорную вероятность формирования монофилетических групп проводили с использованием программного обеспечения Mr.Bayes v.3.1.
2.2.1. Разработка тест-систем для выявления ДНК парвовируса свиней Выбор специфических праймеров и зондов для амплификации и детекции ДНК ПВС.
На основе литературных данных и анализа нуклеотидных последовательностей, представленных в базе данных GenBank, в качестве гена-мишени выбран ген NS1.
Характеристики олигонуклеотидов представлены в табл. 1.
Таблица 1. Характеристика олигонуклеотидов для амплификации и детекции ДНК Название олигонуклеотида Длина (п.н.) GC-состав Результат амплификации ДНК парвовируса регистрируется на канале JOE/Yellow, а ВКО – на канале FAM/Green.
Для оценки специфичности олигонуклеотидов использовали гетерологичные штаммы и изоляты, указанные в разделе «Материалы и методы», а также геномную ДНК свиньи. В результате экспериментов доказано наличие специфической амплификации в образце, содержащем ДНК шт. ВЛ-94 ПВС, и отсутствие неспецифической амплификации 48 гетерологичных штаммов и ДНК генома свиньи.
При отработке условий ПЦР определили, что оптимальная концентрация праймеров составила 0,4 пмоль/мкл и зонда от 0,2 пмоль/мкл. Условия амплификации: 95°С – 15 мин;
5 циклов 95°С – 10с, 60°С – 20с, 72°С – 10с; 40 циклов 95°С – 10с, 55°С – 20с, 72°С – 10с с детекцией результатов амплификации при 55°С по каналам FAM/Green, JOE/Yellow. Тестсистема адаптирована под приборы Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия), Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия), iCycler iQ и iQ5 (Bio-Rad, США).
Контрольные образцы служат для предотвращения получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов.
Для контроля качества экстракции НК из биологического материала и исключения ложноотрицательных результатов в каждую пробу на этапе экстракции ДНК вводили экзогенный неконкурентный внутренний контрольный образец (ВКО). Добавление ВКО на начальной стадии анализа позволяет контролировать качество выполнения всех этапов ПЦР-исследования. В качестве ВКО использовалась генно-инженерная конструкция на основе фага.
Для исключения ложноположительных результатов на этапе экстракции НК введен отрицательный контрольный образец (ОКО). ОКО служит для оценки возможной контаминации реактивов и перекрестной контаминации между пробами при экстракции НК. В качестве ОКО использовали PBS.
Амплификацию и детекцию ВКО проводили с помощью отдельной пары праймеров и зонда одновременно со специфической мишенью.
В качестве отрицательного контрольного образца (К-) этапа амплификации в пробирку вносили 10 мкл ТЕ-буфера. Появление флуоресцентного сигнала в Kсвидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными.
В качестве положительного контроля этапа амплификации использовали образец, содержащий генно-инженерные конструкции на основе плазмиды pGEM-t, несущую участок гена-мишени парвовируса свиней, и на основе фага gt10, несущую участок ДНК ВКО, включающий область праймеров и зондов. Отсутствие амплификации положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР.
Анализ аналитической чувствительности тест-системы проводили на образцах суспензии фекалий, сыворотки крови, суспензии внутренних органов и спермы свиней, содержащих от 5х104 до 5х102 коп/мл рекомбинантного контроля, полученного путем клонирования гена-мишени в фаг.
Аналитическая чувствительность тест-системы при выделении ДНК методом осаждения изопропанолом составила 5х102 коп/мл для суспензии фекалий, сыворотки крови и суспензии селезенки свиньи (рис. 1), при выделении из спермы – 5х103 коп/мл.
2.2.2. Разработка тест-системы для выявления и генотипирования вируса РРСС Выбор специфических праймеров и зондов для амплификации и детекции РНК вируса РРСС. В качестве мишени выбран ген ORF7. Для амплификации РНК вируса американского генотипа выбраны два праймера и зонд. Для амплификации РНК вируса европейского генотипа выбрана одна пара праймеров, но вследствие высокой вариабельности российских изолятов для флуоресцентной детекции продуктов реакции подобраны два зонда, комплементарные одному и тому же участку гена ORF7, но отличающие по нуклеотидным последовательностям (табл. 2.).
Таблица 2. Характеристика олигонуклеотидов для выявления и генотипирования Результат амплификации кДНК вируса РРСС европейского генотипа регистрируется на канале JOE/Yellow, вируса РРСС американского генотипа – на канале ROX/Orange, ВКО – на канале FAM/Green.
Анализ специфичности олигонуклеотидов проводили на штаммах и изолятах, указанных в разделе «Материалы и методы», а также на ДНК генома свиньи. В результате экспериментов доказано наличие амплификации штаммов вируса РРСС европейского и американского генотипов с соответствующими им праймерами и зондами и отсутствие неспецифической амплификации ДНК гетерологичных штаммов и геномной ДНК свиньи.
Оптимизация условий ПЦР. Амплификацию проводили по программе: 50°С – мин, 95°С – 15 мин; 5 циклов 95°С – 10с, 63°С – 20с, 72°С – 10с; 40 циклов 95°С – 10с, 63°С – 20с, 72°С – 10с с детекцией результатов амплификации при 63°С по каналам FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange. Для получения высокой чувствительности тестсистемы температуру отжига варьировали от 60С до 68С. В качестве РНК-матрицы использовали последовательные 10-ти кратные разведения РНК штаммов VP046 и NADCи клинических образцов (европейского генотипа), приготовленные на суммарном образце геномной ДНК свиньи. Клинические образцы содержали различные нуклеотидные замены в областях комплементарности олигонуклеотидов, которые были подтверждены секвенированием.
При температуре отжига 60С наблюдалось снижение эффективности амплификации из-за неспецифического отжига праймеров на ДНК генома свиньи. При температуре отжига 65-68С наблюдалось снижение «разгорания» зондов. Наивысшая эффективность амплификации и «разгорания» зондов наблюдалась при температуре отжига 63С.
Тест-система адаптирована под приборы Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия), Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия), iCycler iQ и iQ5 (Bio-Rad, США).
Контрольные образцы введены такие же, как в тест-системе ПВС с небольшими отличиями. ВКО является генно-инженерной конструкцией на основе ms2 фага.
Положительный контроль этапа амплификации состоит из генно-инженерных конструкций на основе плазмиды pGEM-t, несущих участки генов-мишеней ВКО и каждого генотипа вируса РРСС.
Анализ аналитический чувствительности тест-системы проводили на образцах сыворотки крови, спермы и суспензии внутренних органов, содержащих шт. VP046 и шт.
NADC-8 в известной концентрации. Концентрацию вируса определяли с помощью калибраторов, представляющих собой препараты, полученные путем вставки участка гена-мишени вируса обоих генотипов в плазмиду pGEM-t.
Чувствительность при исследовании сыворотки крови и суспензии патматериала составила 103 коп/мл, спермы – 5х103 коп/мл для каждого генотипа (рис. 2).
Рис.2 Графики накопления флуоресцентного сигнала при определении чувствительности тест-системы для генотипирования вируса РРСС.
Подбор условий экстракции НК из спермы с использованием метода осаждения изопропанолом. Для оценки эффективности удаления ингибиторов из замороженной спермы сравнивали качество выделения ВКО при разведении спермы в 2 и в 4 раза на PBS-буфере с центрифугированием образцов и без центрифугирования, с последующей экстракцией НК методом осаждения изопропанолом. Наилучшие результаты были получены при разведении образцов в 4 раза PBS и центрифугировании 5 мин при 6500 g.
При этом удалялась значительная часть ингибиторов и не снижалась аналитическая чувствительность.
Использование наборов Qiagen Экстракция НК на колонках позволяет автоматизировать метод, избежать разведения образца и повысить эффективность экстракции НК. Проводили сравнение качества очистки НК при экстракции методом осаждения изопропанолом (коммерческий набор «Рибо-преп») и с использованием колонок (коммерческий набор «QIAamp Viral RNA mini kit»). Экстракцию РНК проводили согласно инструкциям к наборам. Исследовали образцы спермы, содержащие РНК вируса РРСС в низкой концентрации. ПЦР проводили, как описано в разделе «Материалы и методы».
РНК вируса РРСС была обнаружена в 4 из 6 образцов спермы при экстракции набором Qiagen и в 2 из 6 образцов при экстракции набором «Рибо-преп» (рис. 3). Кроме того при экстракции РНК на колонках наблюдали улучшение эффективности амплификации.
набором «Рибо-преп»
При сравнении эффективности экстракции НК из сыворотки крови и суспензии селезенки свиньи наборами реагентов «Рибо-преп», «Qiaamp Viral RNA mini kit» и «QIAamp DNA mini kit» показали, что при одновременной экстракции РНК и ДНК из биологических образцов «Рибо-преп» и «QIAamp Viral RNA mini kit» работают одинаково. Набор реагентов «QIAamp DNA mini kit» показал меньшую эффективность экстракции вирусной НК. Для автоматизированной экстракции НК выбрали набор реагентов «QIAamp Viral RNA mini kit».
В связи с распоряжением директора ФГБУ «ВГНКИ» №9-р от 26.04.2011г.
экспертиза биологических лекарственных средств для животных в рамках государственной регистрации и сертификации была дополнена идентификацией производственных штаммов и созданием библиотеки молекулярно-генетических паспортов. В соответствии с этим исследовали 6 вакцин против РРСС, указанных в разделе «Материалы и методы» (3 живые и 3 инактивированные вакцины). В одной из вакцин выявлено несоответствие заявленному генотипу вируса.
2.2.5. Исследование биологического материала от свиней Для подтверждения специфичности тест-систем протестировали 75 образцов ( проб сыворотки крови от свиней разных возрастных групп и 20 образцов влагалищных смывов от ремонтных свинок) от здоровых животных из 5 хозяйств Курской, Ростовской, Тульской, Новгородской областей.
Ни в одном из данных образцов не было получено положительного результата на парвовирус свиней или вирус РРСС. Полученные данные подтверждают специфичность разработанных тест-систем.
Обнаружение образцов, содержащих ДНК ПВС Для проверки тест-систем нами протестировано 679 образцов (кровь, сыворотка крови, патматериал, абортированные плоды, плацента, послед, влагалищные смывы, смывы с уретры хряка, назальные смывы, слюна, сперма, фекалии) от больных животных (репродуктивные и респираторные заболевания) из 27 хозяйств 8 областей РФ. ДНК ПВС обнаружили в 116 образцах, что составило 16,9% исследованных проб (табл.3).
Также протестировано 98 образцов фекалий и 5 образцов кишечников от животных с заболеваниями ЖКТ из 9 хозяйств Белгородской области для выявления скрытого носительства ПВС. ДНК ПВС обнаружена в 31 пробе (28 проб фекалий и 4 образца кишечника) из 7 хозяйств. Это показывает циркуляцию возбудителя в стадах.
Положительные результаты, полученные при исследовании биологических образцов из разных хозяйств, были подтверждены секвенированием.
Обнаружение образцов, содержащих РНК вируса РРСС Тестирование тест-системы для дифференциации вируса РРСС проводили на образцах (те же образцы, на которых проводили проверку тест-системы «ПВС» кроме образцов фекалий). РНК вируса РРРС европейского генотипа обнаружена в 208 образцах из 16 хозяйств, что составило 31,3%, РНК вируса РРСС американского генотипа не выявлена. Результаты исследований представлены в табл. 3 (обнаружение в разных видах биологического материала) и 4 (распределение по хозяйствам).
Таблица 3. Результаты исследований методом ПЦР в «реальном времени» в кровь / сыворотка 9 / 229 1 (11,1%) / 47 (20,5%) 9 (100%) / 114 (49,8%) влагалищные *патматериал – смесь паренхиматозных органов Таблица 4. Результаты исследований методом ПЦР в «реальном времени» в различных хозяйствах Белгородская обл.
* – в данных хозяйствах вирус РРСС не выявлен Расследование вспышек, вызванных вирусом РРСС Во время вспышки РРСС в Белгородской области в июле 2010 года нами было исследовано 25 образцов (3 пробы абортплодов, 1 плацента, 4 патматериала, 1 легкое от павших животных и 16 сывороток крови от свиней подозрительных на РРСС по клиническим признакам). В 21 пробе, что составило 84%, обнаружили вирус РРСС европейского генотипа (результаты подтверждены секвенированием).
В феврале 2012 г. в другом хозяйстве Белгородской области произошла вспышка РРСС (репродуктивная патология у свиноматок, большой падеж животных). При исследовании 16 образцов (6 образцов патматериала, 9 абортплодов, 1 образец последа) РНК вируса РРСС европейского генотипа выявили в 15 пробах. В хозяйстве предположили, что источником вируса были закупленные для осеменения импортные хряки. Для ПЦР-исследования отобрали 13 образцов спермы и 9 назальных смывов от данных хряков. РНК вируса РРСС обнаружили в 3 образцах спермы. В мае от этих же хряков для подтверждения диагноза исследовали еще 59 проб спермы. РНК вируса РРСС обнаружили в 4 образцах. Все полученные результаты подтверждены секвенированием.
На основании полученных данных установлено, что источником вируса РРСС в хозяйстве являются закупленные хряки.
Секвенирование образцов, содержащих РНК вируса РРСС Для секвенирования амплифицировали участок длиной 472 н.п. включающий ген полностью и часть некодирующего 3’ конца. Получены нуклеотидные ORF последовательности для 61 образца из 15 хозяйств. Для одного из хозяйства (№20) расшифровать нуклеотидную последовательность не удалось из-за низкой вирусной нагрузки.
Филогенетический анализ вируса РРСС В основном нуклеотидные последовательности вируса РРСС, из разных свинокомплексов, совпадали между собой, их гомология составила 98,7-100%.
Исключением было только хозяйство №25, где наблюдали одновременную циркуляцию двух разных вариантов вируса РРСС. Гомология на нуклеотидном уровне для данных последовательностей составила 82,7%, а на белковом 87,3%.
Филогенетический анализ проводили по ORF7, так как результаты молекулярной эволюции, полученные для консервативных областей генома, обладают большей достоверностью. В работе использовали полученные нами сиквенсы и данные нуклеотидных последовательностей вируса РРСС России, Беларуси и стран Европы, представленные в базе данных GenBank.
Как видно на представленных данных (рис.4) субтип 1 гетерогенен и подразделяется на несколько филогенетически близких групп нуклеотидных последовательностей (кластеров).
Последовательности образцов, полученные нами из Белгородской области в 2010гг, также как и более ранние (1997, 2000гг.), представленные в GenBank группируются в один кластер субтипа 1. В хозяйстве BLG2 образцы, полученные в 2011 и 2012гг, имели 92,5% гомологии, в то время гомология образцов полученных в одно время составила 99,7-100%. Также в этот кластер входят и последовательности образцов из Башкирии. Последовательности, полученные нами в 2012г, филогенетически совпадают с последовательностями 2005г., представленными в GenBank.
Нуклеотидные последовательности ORF7 вируса РРСС образцов из Курской области (2012-2013гг), полученные нами формировали единую группу с образцами из Белгородской области. Последовательности из Курской области 2000г из GenBank вместе с образцами из Белоруссии образовывали третий субтип европейского генотипа. Эти различия связаны с тем, что в исследованные нами хозяйства Курской области завозили животных из Белгородской области (информация получена из хозяйств).
Нуклеотидные последовательности ORF7 вируса РРСС образцов из Томской области и республики Чувашии, как полученные нами (2011-2012гг), так и представленные в GenBank (2005г.), принадлежали к субтипу 2. Причем, последовательности образцов, полученные из одного хозяйства Томской области (№25), формировали две разные ветви, что доказывает одновременную циркуляцию двух вариантов вируса в одном хозяйстве.
Рис.4 Филогенетический анализ вирусов РРСС, выделенных на территории РФ и представленных в базе данных Точками показаны нуклеотидные последовательности образцов, полученные в нашей лаборатории. A-D – кластеры субтипа1.
Кроме описанных выше образцов к нам поступили ПЦР-положительные образцы из Омской области от больных, ранее вакцинированных (Порцилис PRRS, «Intervet International») животных. Необходимо было типировать полевой изолят от вакцинного штамма. В результате филогенетического анализа данные образцы не попали в группу лелистад-подобных вирусов, к которой относятся вакцинные штаммы. Гомология между исследуемым образцом и вакцинным штаммом на нуклеотидном уровне составила 87,85%. Это показало, что РРСС вызван полевым изолятом, а не вакцинным штаммом Ни одна из полученных нами или представленных в GenBank российских последовательностей не попала в кластер лелистад-подобных вирусов, к которому относятся вакцинные штаммы. В результате секвенирования показано, что нуклеотидные последовательностей штаммов, входящих в состав отечественных и зарубежных вакцин, применяемых для профилактики РРСС на территории нашей страны.
Анализ биологического материала на наличие смешанных инфекций Вирусные инфекции часто протекают в смешанной форме. В нашей работе коинфицирование вирусами РРСС и ПВС наблюдали в 45 образцах (5 хозяйств), что составило 21,47%, одновременное выявление ДНК ЦВС и РНК вируса РРСС регистрировали в 71 пробе (34% образцов, содержащих РНК вируса РРСС). Также образцы патматериала, содержащие РНК вируса РРСС были исследованы на наличие РНК вируса гриппа А. Данный возбудитель был выявлен только в одном хозяйстве.
Для поиска бактериальных патогенов исследовали образцы патматериала и легких, так как большинство возбудителей (Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Pasterella multocida) имеют тропность к паренхиматозным органам и не выявляются в других биологических образцах.
Самым распространенным бактериальным патогеном в образцах патматериала, содержащих РНК вируса РРСС, была Mycoplasma hyorhinis. Данный возбудитель регистрировали в 11 хозяйствах из 12, зараженных вирусом РРСС (36 проб из 52). ДНК Mycoplasma hyopneumoniae выявили только в одном хозяйстве.
Вторым по распространенности бактериальным возбудителем была Pasterella multocida. ДНК этого микроорганизма обнаружили в 19 из 52 образцов (8 хозяйств из 12).
ДНК Chlamydiaceae выявили в 13 образцах из 5 хозяйств, а ДНК Actinobacillus pleuropneumoniae в 8 пробах из 5 хозяйств.
Наиболее часто, в 92,3% проб, были одновременно выявлены НК нескольких возбудителей, как вирусных, так и бактериальных. Причем в 78,8% исследованных образцов регистрировали три и более патогена одновременно. В некоторых образцах регистрировали до 6 патогенов одновременно.
В период с 12.05.2010 г по 14.05.2010 г и с 13.06.2011г по 17.06.2011г в соответствии с приказом Руководителя Россельхознадзора № 53 от 20.03.2006 были проведены комиссионные испытания тест-систем для выявления ПВС и генотипирования вируса РРСС методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для комиссионных испытаний была сформирована стандартизованная панель шифрованных образцов, состоящая из 19 образцов (штаммы ПВС, вируса РРСС и гетерологичные штаммы и изоляты). Результаты комиссионных испытаний подтвердили, что тест-системы «ПВС» и «РРСС» показали 100% специфичность и высокую чувствительность - 0,15 lg ТЦД50/ml и 10 коп/мл соответственно. Документация на тестсистемы «ПВС» (СТО 00494189-0054-2011 и инструкция по применению тест-системы, согласована 23.11.2011) и «РРСС» (СТО 00494189-0058-2011 и инструкция по применению тест-системы, согласована 23.11.2011) согласована по ТК454.
2.2.6 Сравнительный анализ чувствительности и специфичности наборов для Сравнение с набором реагентов №1 (производство Россия) проводили на 10кратных разведениях ПКО ПВС набора реагентов №1, приготовленных на ТЕ-буфере.
Чувствительность разработанной тест-системы «ПВС» составила 2х102 коп/мл, а чувствительность набора реагентов №1 – 2х104 коп/мл. Таким образом, разница в чувствительности между разработанной тест-системой и набором регентов №1 составила 100 раз.
Сравнение с набором реагентов №2 (производство Россия) проводили на шт. ПВС ВЛ-94 и клинических образцах, полученных из разных хозяйств РФ. При сравнении 10кратных разведений штамма ВЛ-94, приготовленных на ТЕ-буфере, обе тест-системы показали одинаковую чувствительность 5х102 коп/мл. При исследовании 10-кратных разведений образца, содержащего ДНК ПВС, приготовленных на суспензии селезенки свиньи, чувствительность набора реагентов №2 оказалась в 10 раз ниже тест-системы «ПВС». Возможно, это связано с конкуренцией специфической мишени с эндогенным ВКО, который имеет существенно более высокую концентрацию и такую же длину ампликона.
2.2.7. Сравнительный анализ чувствительности и специфичности наборов Сравнение с наборами реагентов №1 и №2 для выявления вируса РРСС проводили на 10-кратных разведениях шт. VP046 и шт. NADC-8 вируса РРСС на сыворотке крови свиней. Экстракцию РНК проводили набором реагентов «Рибо-преп». Чувствительность тест-систем «РРСС» и №1 совпала только при выявлении вируса РРСС европейского генотипа. Однако набор реагентов №1 не показал положительного результата при исследовании шт. NADC-8 американского генотипа, хотя согласно инструкции по применению данный набор должен выявлять оба генотипа вируса. Чувствительность тестсистем «РРСС» и №2 на обоих генотипах составила 7х102 коп/мл.
При сравнении на биологических образцах, содержащих вирус РРСС европейского генотипа, полученных из разных хозяйств РФ и имеющих различные нуклеотидные замены (подтверждено секвенированием) наборы реагентов №1 и №2 не выявили ни одного положительного образца.
Сравнение с набором реагентов №3. Чувствительность тест-систем «РРСС» и набора реагентов №3 на штаммах VP046 и NADC-8 составила 5х102 коп/мл.
При анализе биологических проб наблюдали разницу в эффективности амплификации на ряде образцов. Так, образец №825 тест-система «РРСС» интерпретирует образец как положительный, а набор реагентов №3 – как отрицательный (рис.5). При анализе 10-кратных разведений на ряде образцов наблюдали похожие результаты.
Рис. 5. Анализ работы тест-системы «РРСС» и набора реагентов №3 на биологических образцах.
Сравнение с набором реагентов №4 (производство Франция). Чувствительность набора реагентов №4 на штаммах VP046 и NADC-8 составила 5х104 коп/мл (в 15 раз ниже, чем «РРСС»). При сравнении на биологических образцах набор реагентов №4 обладает меньшей эффективностью амплификации на ряде образцов, чем тест-система «РРСС»
(рис.6).
В наборе реагентов №4 внутренний эндогенный контроль (геномная ДНК свиньи) амплифицируется только в образцах патологического материала (содержащего большое количество клеток свиньи), в пробах сыворотки крови внутренний контроль определяется как отрицательный. Таким образом, все пробы сыворотки крови, не содержащие РНК вируса РРСС согласно инструкции должны интерпретироваться как невалидные.
Набор реагентов «РРСС»
Набор реагентов № Рис. 6. Сравнение наборов реагентов «РРСС» и №4. 1,2,4,5,6 – биологические образцы (номера одинаковы для обоих наборов реагентов), 3 – шт. VP046, 7 – шт. NADCВЫВОДЫ 1. Разработана и внедрена в ветеринарную практику тест-система «ПВС» для выявления ДНК парвовируса свиней методом ПЦР в «реальном времени», обладающая 100% специфичностью и имеющая чувствительность 5х102 коп/мл ДНК парвовируса свиней в суспензии фекалий, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5х коп/мл в сперме.
2. Разработана и внедрена в ветеринарную практику тест-система «РРСС» для генотипирования вируса РРСС методом ПЦР в «реальном времени», обладающая 100% специфичностью и имеющая чувствительность 103 коп/мл РНК вируса РРСС в крови, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5х103 коп/мл в сперме.
3. При проведении филогенетического анализа вируса РРСС установлено, что нуклеотидные последовательности образцов, полученных из свинокомплексов РФ в 2009гг, относятся к первому и второму субтипам европейского генотипа вируса и не входят в кластер лелистад-подобных вирусов, к которому относятся вакцинные штаммы.
4. В результате секвенирования вируса РРСС показано, что нуклеотидные последовательности вирусов из неблагополучных свинокомплексов отличаются от последовательностей штаммов, входящих в состав отечественных и зарубежных вакцин, применяемых для профилактики РРСС на территории нашей страны.
5. При проведении сравнительного анализа ПЦР-наборов, используемых в отечественной ветеринарной практике, установлено, что разработанная тест-система «ПВС» имеет в 100 раз большую чувствительность, чем набор реагентов №1 и в 10 раз, чем набор реагентов №2. Показано, что только тест-система «РРСС» в образцах из 16–ти неблагополучных свинокомплексов выявляет вирус РРСС в отличие от наборов №1, №2 и имеет чувствительность в 10 раз выше, чем наборы №3 и №4 на 4-х образцах.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Для практического использования предлагаются следующие нормативные документы, разработанные в ходе выполнения научных исследований по теме диссертации:1. Инструкция по применению тест-системы «ПВС» для выявления парвовируса свиней методом полимеразной цепной реакции (согласована по ТК 454 23.11.2011);
2. Технические условия на тест-систему «ПВС» для выявления парвовируса свиней методом полимеразной цепной реакции (СТО 00494189-0054-2011);
генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом полимеразной цепной реакции (согласована по ТК 454 23.11.2011);
4. Технические условия на тест-систему «РРСС» для выявления и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом полимеразной цепной реакции (СТО 00494189-0058-2011).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИИ
Козлова, А.Д. Применение ПЦР в «реальном времени» для выявления цирковирусной инфекции свиней и ассоциированных с ней парвовирусного заболевания и репродуктивно-респираторного синдрома свиней / А.Д. Козлова, Т.С. Астахова, И.Л.Обухов // Сборник тезисов XI молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» – 2011. – С. 25-27.
репродуктивных нарушений свиней: парвовируса и вируса репродуктивнореспираторного синдрома / А.Д. Козлова, Т.С. Астахова, И.Л. Обухов // Материалы международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века:
инновации, опыт, проблемы и пути их решения» – 2011. – С. 107- Козлова, А.Д. Применение ПЦР для выявления патогенов, сочетанных c репродуктивно-респираторным синдромом свиней в 2009 – 2013 гг. / А.Д. Козлова, Т.С.
Астахова, И.Л. Обухов // Молекулярная диагностика-2014, Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием – 2014. – в печати Козлова, А.Д. Филогенетический анализ российских изолятов вируса РРСС / А.Д. Козлова, Т.С. Астахова, И.Л. Обухов // Молекулярная диагностика-2014, Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием – 2014. – в печати Козлова. А.Д. Применение Полимеразной Цепной Реакции для выявления парвовирусной инфекции свиней / А.Д. Козлова, Т.С. Астахова, И.Л. Обухов // Ветеринария. – 2012. – №1. – С. 56- Козлова. А.Д. Выявление вирусных возбудителей репродуктивной патологии свиней: парвовирус свиней, вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней, цирковирус свиней 2 типа / А.Д. Козлова, Т.С. Астахова, И.Л. Обухов // Ветеринария. – 2012. – №4. – С. 57- Козлова. А.Д. Выявление и генотипирование вируса РРСС методом ПЦР в «реальном времени / А.Д. Козлова, Т.С. Астахова, И.Л. Обухов // Ветеринарный врач. – 2012. – №3 – С. 27- Козлова, А.Д. Филогенетический анализ изолятов вируса РРСС, выделенных на территории РФ в 2009-2013гг / А.Д. Козлова, Т.С. Астахова, К.В. Кулешов, И.Л.
Обухов // Ветеринария. – 2014. – в печати.
«