На правах рукописи

Горбунова Анна Валерьяновна

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ

ХАРАКТЕРИСТИК У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ

ПРИ АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ

СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2014 2

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова»

Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

Мамаев Николай Николаевич, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Зарицкий Андрей Юрьевич, доктор медицинских наук, профессор, директор Института гематологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный медицинский исследовательский центр им.

В.А.Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Мартынкевич Ирина Степановна, доктор биологических наук, руководитель лаборатории молекулярной генетики Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» Федерального медико-биологического агентства Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится “_” 2014г. в _часов на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при Российском НИИ гематологии и трансфузиологии ФМБА России по адресу:

191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-ая Советская, д.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии

Автореферат разослан “_” _ 2014 г.

Ученый секретарь специализированного совета РосНИИГТ доктор медицинских наук Т.В.Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования Хронический миелолейкоз (ХМЛ) – это заболевание крови опухолевой природы, основным проявлением которого является пролиферация гемопоэтических стволовых клеток, на начальных этапах заболевания способных к созреванию. При ХМЛ в опухолевых клетках выявляется так называемая Филадельфийская (Ph) хромосома (Nowell P.C. et al., 1960). Это специфическое нарушение кариотипа возникает вследствие сбалансированной реципрокной транслокации t(9;22)(q34;q11). На молекулярном уровне возникновение Ph-хромосомы приводит к возникновению химерного гена BCRABL, кодирующего конститутивно активную тирозинкиназу (Melo J.V. et al., 2007). В ряде экспериментов было продемонстрировано, что активность белка BCR-ABL необходима для поддержания лейкемического фенотипа клеток (Daley G.Q. et al., 1990; Kelliher M.A. et al., 1990; Heisterkamp N. et al., 1990).

Исследования патогенеза ХМЛ на молекулярном уровне позволили подобрать низкомолекулярные соединения, способные специфически связываться с белком BCR-ABL и подавлять его тирозинкиназную активность.

Ингибиторы тирозинкиназ показали чрезвычайно высокую эффективность как в исследованиях in vitro и in vivo, так и в клинической практике. C 2001 года ингибитор тирозинкиназ иматиниб используется в качестве первой линии терапии при ХМЛ.

Открытие и внедрение в клиническую практику таргетных ингибиторов тирозинкиназы BCR-ABL стало одним из наиболее заметных достижений в современной онкологии. Тем не менее, терапия ингибиторами тирозинкиназ эффективна далеко не у всех больных ХМЛ. Во-первых, не удается получить стойких длительных ремиссий у пациентов в фазе акселерации и бластного криза. Во-вторых, острой проблемой остается первичная и вторичная резистентность к ингибиторам тирозинкиназ, развивающаяся в 20 – 30 % случаев (Cortes J. et al., 2007; Kantarjian H. et al., 2007).

В настоящее время у больных ХМЛ в фазе акселерации и бластного криза, а также при развитии резистентности к ингибиторам тирозинкиназ второго поколения показано проведение аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (аллоТГСК) периферической крови или костного мозга (Gratwohl A. et al., 2006). АллоТГСК является одним из эффективных методов лечения многих злокачественных заболеваний миелоидной и лимфоидной тканей (Афанасьев Б.В. и соавт., 2002, 2007;

Абдулкадыров K.M. и соавт., 2004; Зубаровская Л.С. и соавт., 2001; Румянцев А.Г. и соавт., 2003; Савченко В.Г. и соавт., 2010). Накопленный за более чем лет опыт применения аллоТГСК в практике лечения ХМЛ показал, что, несмотря на огромные достижения в развитии таргетной терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ, аллоТГСК до сих пор остается единственным методом, который позволяет достичь полного излечения у больных ХМЛ.

На эффективность аллоТГСК у больных ХМЛ влияют как клинические факторы, характеристики пациента и особенности режима трансплантации, так и молекулярно-биологические свойства опухолевых клеток. Развитие резистентности к ингибиторам тирозинкиназ, также как и прогрессия заболевания, ассоциированы с широким спектром молекулярно-биологических изменений в лейкозных клетках. Наиболее изученным механизмом развития резистентности к ингибиторам тирозинкиназ при ХМЛ считается появление мутаций в киназном домене гена BCR-ABL. Частота мутаций BCR-ABL, по данным разных исследований, варьирует от 30% до 90% в зависимости от фазы заболевания и методов детекции мутации (Gorre M.E. et al., 2001; Hochhaus A. et al., 2004). Молекулярно-биологические механизмы, ведущие к развитию резистентности и прогрессии заболевания, во многом схожи между собой. В частности, в проведенных в последнее время исследованиях была выявлена роль гиперэкспрессии гена EVI1 как при прогрессии заболевания, так и при развитии резистентности к ингибиторам тирозинкиназ (Ogawa S. et al., 1996, 1997; Paquette R.L. et al., 2011; Daghistani M. et al., 2010). Показано, что гиперэкспрессия EVI1 ассоциирована с резистентностью к химиотерапии у больных острыми миелоидными лейкозами и миелодиспластическим синдромом, а также с прогрессией и переходом к метастазированию ряда солидных опухолей (Valk P.J. et al., 2004; Groschel S. et al., 2010).

Степень разработанности темы исследования Прогностическое значение клинических факторов и характеристик пациентов в отношении эффективности аллоТГСК у больных ХМЛ изучено достаточно подробно. В шкалу рисков входят стадия заболевания на момент трансплантации, возраст пациента, длительность периода болезни до трансплантации, а также тип донора и сочетание по полу донора и реципиента (Gratwohl A. et al., 1998).

В то же время, прогностическое значение молекулярно-биологических факторов, ассоциированных с прогрессией заболевания и резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ, в отношении эффективности аллоТГСК у больных ХМЛ изучено значительно меньше. Так, немногочисленны и противоречивы данные о прогностическом значении мутаций в киназном домене гена BCRABL, неясно значение уровня экспрессии гена BCR-ABL. Неясно также прогностическое значение уровня экспрессии гена EVI1 при аллоТГСК у больных ХМЛ.

Цель исследования Изучить молекулярно-генетические характеристики больных хроническим миелолейкозом с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ и определить их прогностическое значение при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Задачи исследования 1. Изучить мутационный статус гена BCR-ABL и экспрессию его транскриптов р210 и р190 у больных ХМЛ с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ 2. Исследовать особенности экспрессии гена EVI1 у больных хроническим миелолейкозом с резистентностью и с оптимальным ответом на терапию ингибиторами тирозинкиназ 3. Изучить взаимосвязь между уровнем экспрессии гена EVI1 и структурным и функциональным состоянием гена BCR-ABL 4. Оценить прогностическое значение наличия мутаций в гене BCR-ABL и экспрессии его транскриптов при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных хроническим миелолейкозом 5. Определить прогностическое значение гиперэкспрессии гена EVI1 при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с хроническим миелолейкозом Научная новизна исследования Впервые установлено значение высокого уровня экспрессии гена EVI как фактора, имеющего неблагоприятное прогностическое значение при аллоТГСК у пациентов с ХМЛ, резистентных к ингибиторам тирозинкиназ в отношении увеличения частоты пост-трансплантационных рецидивов. Впервые обнаружена ассоциация между повышенным уровнем экспрессии гена EVI1 у больных ХМЛ и предшествующей терапией ингибиторами тирозинкиназ второго поколения. Впервые установлено, что повышенный уровень экспрессии EVI1 характерен для пациентов с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ, не имеющих мутаций в киназном домене гена BCR-ABL.

Определены также спектр и частота мутаций в киназном домене гена BCR-ABL, обнаружены ранее не описанные сложные нарушения структуры (комплексные делеции) BCR-ABL, изучена динамика возникновения мутантного клона и предложен метод более чувствительной детекции мутации T315I.

Теоретическая и практическая значимость работы Полученные в результате исследования данные дополняют систему знаний о молекулярно-биологических механизмах патогенеза хронического миелолейкоза и развития резистентности к ингибиторам тирозинкиназ.

Определение уровня экспрессии гена EVI1 перед проведением аллоТГСК у больных ХМЛ позволяет осуществлять дифференцированный подход к планированию терапии в пред- и пост-трансплантационном периоде. В частности, это открывает возможность для выявления пациентов с высоким риском развития пост-трансплантационных рецидивов, которые нуждаются в своевременной противорецидивной и иммуноадоптивной терапии.

Предложенный метод высокочувствительной детекции мутации T315I гена BCR-ABL с помощью ПЦР в реальном времени позволяет выявить пациентов, имеющих показания к проведению аллоТГСК, на несколько месяцев раньше, чем это может быть сделано стандартным методом прямого секвенирования по Сэнгеру.

Методология и методы исследования Научная методология исследования основывается на системном подходе к изучаемой проблеме и комплексном рассмотрении процессов патогенеза и терапии заболеваний крови опухолевой природы. В работе использованы молекулярно-биологические, статистические, а также клинические и общенаучные методы исследования.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Высокий уровень экспрессии гена EVI1 характерен для резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ больных ХМЛ, не имеющих мутаций в киназном домене гена BCR-ABL.

2. Высокий уровень экспрессии гена EVI1 имеет неблагоприятное прогностическое значение в отношении частоты развития рецидивов и продолжительности безрецидивной выживаемости после аллоТГСК у больных ХМЛ с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ.

3. Высокий уровень экспрессии гена EVI1 и поздняя стадия заболевания (фаза акселерации или бластный криз) на момент трансплантации являются независимыми предикторами менее продолжительной безрецидивной выживаемости.

4. Мутации в киназном домене гена BCR-ABL, в том числе T315I, а также высокий уровень экспрессии BCR-ABL, в исследованной группе пациентов не имели негативного прогностического значения в отношении общей и безрецидивной выживаемости после аллоТГСК у больных ХМЛ, резистентных к ингибиторам тирозинкиназ.

Внедрение результатов исследования в практику Основные положения диссертации внедрены в практическую и научноисследовательскую работу на кафедре гематологии, трансфузиологии и трансплантации Первого Санкт-Петербургского государственного гематологического отделения Санкт-Петербургского государственного бюджетного учреждения здравоохранения "Детская городская больница №1".

Степень достоверности и апробация результатов работы Степень достоверности полученных результатов проведенных исследований определяется достаточным количеством выполненных наблюдений с использованием современных методов и подтверждена адекватными поставленным задачам методами статистической обработки данных.

«Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток», посвященном памяти Р.М. Горбачевой (Санкт-Петербург, 2011), XIX Wilsede Meeting «Modern trends in human leukemia» (Гамбург, 2012), 38 Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation (Женева, 2012), 39 Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation (Лондон, 2013), Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярногенетические и иммуногенетические методы диагностики в практике врача гематолога» (Санкт-Петербург, 2013).

По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Личный вклад автора Автором лично проведены анализ литературных данных и планирование диссертационного исследования, выполнены молекулярно-генетические исследования, включая определение уровня экспрессии гена EVI1 и мутационного статуса гена BCR-ABL, осуществлены статистический анализ, обобщение и интерпретация экспериментальных данных.

Структура работы Диссертационная работа изложена на 141 странице текста и состоит из введения, главы обзора литературы, главы описания методики, главы результатов исследования, главы обсуждения, выводов, практических рекомендаций и библиографии. Список литературы включает 63 источника на русском языке и 194 источника на иностранном языке. Работа содержит рисунков и 15 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включено 92 больных ХМЛ с резистентностью к терапии ингибиторами тирозинкиназ, находившихся на лечении в Институте детской онкологии, гематологии и трансплантологии имени Р.М. Горбачевой Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад.

И.П. Павлова и гематологических клиниках г. Санкт-Петербурга и СевероЗападного региона РФ.

Возраст больных варьировал от 4 до 80 лет (медиана 50 лет). В исследованной группе пациентов было 45 (49%) мужчин и 47 (51%) женщин. В хронической фазе ХМЛ находилось 73 (79%) пациента, а в фазе акселерации и бластного криза - 19 (21%) пациентов. В контрольную группу включены больных ХМЛ, достигших оптимального ответа на терапию иматинибом.

АллоТГСК была проведена у 35 пациентов с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ. Трансплантации были выполнены в Институте детской онкологии, гематологии и трансплантологии имени Р.М.Горбачевой Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова в период с 2008 по 2012 гг. Возраст больных на момент проведения трансплантации варьировал от 8 до 58 лет (медиана 36 лет). В исследованной группе пациентов преобладали мужчины - 24 (71%) мужчин и 11 (29%) женщин.

Особенностью изучаемой группы пациентов было значительное преобладание больных с высокими значениями индекса Gratwohl, только (12%) пациента имели значения индекса менее 3. Таким образом, подавляющее большинство больных относилось к группе высокого риска при проведении аллоТГСК. В первой хронической фазе ХМЛ на момент трансплантации находилось 12 (34%) больных, во второй и третьей хронических фазах – (34%) больных, в фазе акселерации 7 (20%) больных и в фазе бластного криза (12%) больных. Диапазон времени от постановки диагноза до проведения аллоТГСК колебался от 6 до 100 месяцев (медиана 38 месяцев).

Все пациенты в качестве первой линии терапии получали иматиниб.

После развития резистентности к иматинибу или его непереносимости больной (59%) получил ИТК второго поколения: дазатиниб – 13 (37%), нилотиниб – 7 (20%) и босутиниб - 1 (3%). Семь (20%) пациентов после развития резистентности к первому ИТК второго поколения получали второй ИТК второго поколения.

Трансплантации от донора-родственника были произведены у 16 (44%) пациентов, а от неродственного донора – у 19 (56%). В качестве подготовки к трансплантации у 11 (29%) пациентов был использован миелоаблативный режим кондиционирования (бусульфан и циклофосфан), а у 24 (71%) пациентов режимы кондиционирования со сниженной интенсивностью (бусульфан и флударабин, мелфалан и флударабин). Источником трансплантата являлись костный мозг или стволовые клетки периферической крови.

Профилактику острой РТПХ проводили комбинациями иммуносупрес-сивных препаратов, причем у 20 (57%) больных на основе циклоспорина, а у 14 (40%) – такролимуса.

Исследование молекулярно-генетических характеристик пациентов проводили на образцах тотальной РНК, выделенной из периферической крови и костного мозга больных до проведения аллоТГСК. Реакцию обратной транскрипции осуществляли с использованием случайных гексамерных праймеров. Относительная экспрессия транскриптов p210 и р190 гена BCR-ABL и гена EVI1 была определена методом ПЦР в реальном времени с использованием в качестве контрольного гена ABL. Относительную экспрессию определяли как соотношение числа транскриптов изучаемого гена к числу транскриптов контрольного гена в процентном выражении. Амплификацию проводили на приборах IQ Cycler (BioRad) по технологии TaqMan с детекцией сигнала на каналах FAM и JOE.

Мутационный статус гена BCR-ABL определяли с помощью метода прямого секвенирования. Последовательность кДНК киназного домена амплифицировали в два этапа и затем секвенировали в обоих направлениях с использованием реактивов Big Dye 3.1. и прибора ABI3100 (Applied Biosystems, США). Нуклеотидную последовательность сравнивали с референсной последовательностью транскрипта c-abl1 (NCBI Reference Sequence:

NM_005157.4).

Аллель-специфичную ПЦР для детекции точечной мутации T315I и количественной оценки содержания мутантных транскриптов проводили в два этапа. На первом этапе амплифицировали фрагмент химерного транскрипта p210 гена BCR-ABL, на втором этапе использовали ПЦР в режиме реального времени c аллель-специфичными праймерами. Для дискриминации нормальной и мутантной последовательностей были подобраны два обратных аллельспецифичных праймера, один прямой праймер, а также проба, содержащая флуорофор и гаситель для детекции сигнала в режиме реального времени.

Статистическую обработку данных проводили в пакетах STATISTICA 10.0 и R. Для сравнения различий в непрерывных данных использовали непараметрический U-тест Манна-Уитни. Категориальные данные оценивали с помощью двухстороннего точного теста Фишера. Анализ общей и безрецидивной выживаемости проводили по методу Каплан-Майер, используя лог-ранк-тест для оценки достоверности различий. Многофакторный анализ выполняли с помощью метода регрессии Кокса. Статистически достоверными считали различия при значимостях p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведенное исследование состоит из двух взаимосвязанных частей. В первой части были изучены молекулярно-биологические характеристики больных ХМЛ с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ, а во второй - их влияние на результаты аллоТГСК.

Молекулярно-генетические характеристики больных ХМЛ с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ В центре нашего внимания находились два гена, вовлеченных в патогенез ХМЛ – BCR-ABL и EVI1. В исследование были включены три характеристики, описывающие состояние гена BCR-ABL у больных ХМЛ: 1) уровень относительной экспрессии основного транскрипта, вовлеченного в патогенез ХМЛ (р210); 2) коэкспрессия транскрипта р190, возникающего при ХМЛ за счет альтернативного сплайсинга; и 3) наличие мутаций в киназном домене гена, ассоциированных с резистентностью к ИТК. Кроме того, был изучен уровень экспрессии гена EVI1.

Экспрессия транскриптов р210 и р190 гена BCR-ABL Экспрессия типичного для ХМЛ транскрипта р210 гена BCR-ABL была обнаружена у всех включенных в исследование пациентов с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ (n=92). Уровень экспрессии p210 BCR-ABL относительно контрольного гена ABL значительно варьировал, медиана составила 98, диапазон от 1 до 474 копий BCR-ABL на 100 копий ABL.

Коэкспрессия химерного транскрипта p190 в исследованной группе была отмечена у половины больных, причем уровень экспрессии p190 относительно экспрессии гена ABL был низким (медиана 1,0, диапазон 0,02 - 12,7). Наличие коэкспрессии р190 было ассоциировано с высоким уровнем экспрессии р (p= 0,015).

Была обнаружена тенденция к более высокой частоте встречаемости коэкспрессии р190 BCR-ABL в группе пациентов в фазе акселерации и бластного криза по сравнению с группой в хронической фазе, однако наблюдаемая тенденция не достигла уровня статистической значимости (р=0,191).

Спектр и частота мутаций в киназном домене гена BCR-ABL При исследовании мутационного статуса гена BCR-ABL методом прямого секвенирования у 36 из 92 (38%) пациентов с резистентностью к ИТК были выявлены различные мутации, представляющие собой замены единичных нуклеотидов в последовательности ДНК.

В общей сложности было обнаружено 13 различных мутаций, частота встречаемости которых значительно варьировала. Полный спектр и частота выявленных мутаций представлены на рисунке 1. C наиболее высокой частотой имели место мутации T315I (26%), G250E (18%), Y253H (13%), F317L (11%), E255K (8%) и F359C (5%). У пяти (13%) пациентов были обнаружены двойные мутации.

Почти все мутации касались участков молекулы белка BCR-ABL, непосредственно взаимодействующих с ИТК. Распределение мутаций по функциональным участкам киназного домена BCR-ABL было следующим: 48% мутаций были локализованы в Р-петле (G250, Q252, Y253, E255) и 6 % (Н396) в А-петле.

Рис. 1. Спектр и частота мутаций в киназном домене гена BCR-ABL у больных ХМЛ с резистентностью к ИТК В единичных наблюдениях были отмечены более сложные структурные нарушения гена, в частности делеции нескольких аминокислотных оснований.

Так, у одного из пациентов помимо мутации T315I были обнаружены три делеции - del P296-G303, del L341-I347 и del G383-T389. Пространственное расположение делеций в структуре белка BCR-ABL было таково, что белок с этими делециями должен был полностью утратить тирозинкиназную активность. Между тем, у пациента имела место резистентность как к иматинибу, так и к ИТК второго поколения, что косвенно свидетельствовало в пользу того, что утраченную тирозинкиназную активность BCR-ABL могут полностью компенсировать BCR-ABL-независимые механизмы патогенеза ХМЛ и резистентности к терапии ИТК.

Детекция мутации T315I гена BCR-ABL методом аллельспецифичной ПЦР.

Развитие резистентности к ингибиторам тирозинкиназ посредством появления мутаций в киназном домене гена BCR-ABL представляет собой эволюционный процесс, в ходе которого те клоны лейкозных клеток, которые приобретают мутации, получают преимущество в пролиферации в присутствии соответствующего ИТК и, вследствие этого, постепенно вытесняют другие клоны. Мы исследовали динамику этого процесса у пациента с первичной резистентностью к иматинибу с помощью ретроспективного анализа методами прямого секвенирования и аллель-специфичной ПЦР серии образцов периферической крови, полученных в разное время в течение одного года наблюдения (рис. 2).

Рис. 2. Динамика уровня экспрессии транскриптов T315I(+) у пациента с резистентностью к ИТК Как видно из данных, представленных на рис. 3, очень небольшой клон клеток с мутацией T315I был впервые обнаружен у пациента спустя три месяца с момента установления первичной резистентности к иматинибу. По данным аллель-специфичной ПЦР, размер клона не превышал 0,2% всех BCR-ABL позитивных клеток, а методом прямого секвенирования мутация не выявлялась, поскольку пороговый уровень чувствительности этого метода составляет около 20%. После смены терапии на дазатиниб на фоне снижения уровня экспрессии BCR-ABL был зафиксирован быстрый рост мутантного клона. В итоге, через шесть месяцев уже 92% клеток имели мутацию T315I и мутация впервые была детектирована с помощью прямого секвенирования.

На данном примере видно, что аллель-специфичная ПЦР позволяет выявлять клетки с мутацией T315I на 3-6 месяцев раньше, чем стандартный метод прямого секвенирования, что даёт возможность на более ранних сроках начать поиск донора для предстоящей аллоТГСК.

Экспрессия гена EVI Уровень экспрессии гена EVI1 был определен у 92 больных ХМЛ с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ. Группу сравнения составили пациентов, достигших полного молекулярного ответа. В результате проведенного анализа между этими группами пациентов были обнаружены статистически значимые различия по уровню относительной экспрессии гена EVI1 (рис. 3). При этом анализ коэкспрессии гена EVI1 и транскрипта р210 гена BCR-ABL показал отсутствие статистически значимой корреляции в исследуемой группе пациентов (p = 0,112).

Рис. 3. Уровень экспрессии гена EVI1 в зависимости от ответа на терапию ИТК Далее, при сравнении групп пациентов с детектируемой экспрессией и без экспрессии транскрипта р190 гена BCR-ABL мы обнаружили, что наличие коэкспрессии транскрипта р190 было ассоциировано с более высоким уровнем экспрессии гена EVI1 (p = 0,045, рис. 4). Кроме того, было показано, что в группе пациентов с мутациями BCR-ABL (n=36) по сравнению с группой, не имевших мутаций (n=56), уровень экспрессии EVI1 был значительно ниже (р=0,044, рис. 4).

Рис. 4. Взаимосвязь уровня относительной экспрессии гена EVI1 и коэкспрессии транскрипта p190 гена BCR-ABL (слева), а также мутационного статуса гена BCR-ABL (справа) Таким образом, нам впервые удалось показать, что гиперэкспрессия гена EVI1 характерна для резистентных к ИТК пациентов, не имеющих мутаций в киназном домене гена BCR-ABL. Это наблюдение указывает на возможную роль гиперэкспрессии гена EVI1 в развитии BCR-ABL-независимой резистентности к ингибиторам тирозинкиназ. По-видимому, углублённое исследование этих механизмов крайне необходимо как для поиска путей преодоления резистентности лейкозных клеток к ТКИ, так и для дальнейшего изучения роли EVI1 в развитии самой резистентности.

Анализ влияния молекулярно-генетических факторов на эффективность аллоТГСК у больных ХМЛ с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ В нашей группе аллоТГСК была проведена у 35 больных ХМЛ с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ. При этом было изучено влияние молекулярно-биологических характеристик на эффективность аллоТГСК. В качестве критериев эффективности терапии использовали следующие показатели: 1) общую выживаемость больных; 2) безрецидивную выживаемость; 3) частоту достижения полного молекулярного ответа; 4) частоту развития пост-трансплантационных рецидивов; 5) смертность по причинам, связанным с пост-трансплантационными осложнениями; и 6) смертность по причине прогрессии основного заболевания.

Прогностическое значение уровня экспрессии транскрипта р BCR-ABL Для анализа влияния уровня экспрессии p210 BCR-ABL в предтрансплантационном периоде на результаты аллоТГСК пациенты были разделены на две группы: 1) группа с высоким уровнем экспрессии (выше медианы); и 2) группа с низким уровнем экспрессии (ниже медианы). Следует отметить, что между этими группами пациентов статистически достоверных различий по возрасту, полу, стадиям заболевания, индексу Gratwohl и предшествующей терапии ИТК отмечено не было.

Анализ влияния уровня экспрессии транскрипта p210 BCR-ABL на общую и безрецидивную выживаемость после аллоТГСК не выявил статистически значимого влияния этого фактора. Однолетняя общая выживаемость в группах пациентов с высоким и низким уровнем экспрессии BCR-ABL составила 47 и 48%, соответственно (р=0,95), безрецидивная же выживаемость была несколько выше в группе пациентов с низким уровнем экспрессии BCR-ABL (41% против 31%, р = 0,56).

Кроме того, анализ влияния уровня экспрессии р210 BCR-ABL на другие показатели эффективности аллоТГСК у больных ХМЛ также не показал статистически значимых различий в частоте достижения полного молекулярного ответа, цитогенетических рецидивов, развития острой и хронической РТПХ, связанной с осложнениями аллоТГСК смертности и смертности по причине прогрессии основного заболевания.

Прогностическое значение коэкспрессии транскрипта р190 BCR-ABL Для анализа влияния экспрессии транскрипта р190 BCR-ABL на результаты аллоТГСК пациенты были разделены на группы с коэкспрессией p190 (наличием детектируемого с помощью ПЦР в реальном времени транскрипта р190) и с отсутствием коэкспрессии p190. Исследование показало, что в первой группе пациентов общая и безрецидивная выживаемость были отчётливо ниже, чем во второй - однолетняя общая выживаемость составила и 55% (р = 0,38), а безрецидивная выживаемость – 14 и 46% (р = 0,08), соответственно.

Помимо тенденции к более короткой безрецидивной выживаемости, в группе пациентов с коэкспрессией р190 мы также наблюдали тенденцию к более низкой частоте достижения полного молекулярного ответа (р = 0,07).

Что касается статистически значимых различий между двумя изучаемыми группами пациентов по частоте цитогенетических рецидивов, развитию острой и хронической РТПХ, смертности от пост-трансплантационных осложнений и смертности по причине прогрессии заболевания, их обнаружено не было.

Прогностическое значение мутаций в киназном домене гена BCRABL Мутационный статус гена BCR-ABL перед проведением аллоТГСК был определен у 27 больных методом прямого секвенирования. Мутации в киназном домене BCR-ABL были обнаружены у 16 (58%) пациентов. Были выявлены мутации T315I (n=10), Y253H (n=2), G250E (n=1), F317L (n=1) и V299L (n=1). У одного пациента было обнаружено две мутации - F359V и F317L.

Анализ выживаемости пациентов с ХМЛ после аллоТГСК показал, что наличие мутаций в гене BCR-ABL не оказывало влияния на общую и безрецидивную выживаемость в исследуемой группе пациентов. Так, однолетняя общая выживаемость в группе пациентов с мутациями BCR-ABL составила 42%, а в группе без мутаций – 40% (р = 0,51). Что касается однолетней безрецидивной выживаемости, она составила 33 и 29% (р = 0,83), соответственно.

Частота достижения ПМО после аллоТГСК и частота цитогенетических рецидивов также не были ассоциированы с наличием или отсутствием мутаций в гене BCR-ABL. Интересно отметить, что в группе пациентов, имеющих мутации BCR-ABL, РТПХ развивалась реже (р = 0,08).

Десять больных в исследуемой группе имели мутацию T315I, причём негативного влияния этой мутации на общую и безрецидивную выживаемость пациентов отмечено не было. Более того, в группе пациентов, имевших эту мутацию, общая и безрецидивная выживаемость были даже чуть выше, чем в группе без мутаций, хотя статистически значимого различия выявлено не было (рис.5). Однолетняя общая выживаемость составила 48% в группе с мутацией T315I и 38% в группе без этой мутации (р = 0,91), а однолетняя безрецидивная выживаемость, соответственно, 38 и 27% (р = 0,62). В то же время, была выявлена тенденция к большей частоте достижения полного молекулярного ответа после аллоТГСК у пациентов с мутацией T315I, где у 9 из 10 больных был достигнут ПМО.

Таким образом, из представленных данных следует, что наличие мутаций в киназном домене гена BCR-ABL, обуславливающих резистентность к ингибиторам тирозинкиназ, в том числе мутации T315I, в исследованной группе пациентов не оказывало неблагоприятного влияния на результаты аллоТГСК у больных ХМЛ.

Рис. 5. Безрецидивная выживаемость больных ХМЛ после аллоТГСК в зависимости от наличия мутации T315I в гене BCR-ABL Прогностическое значение уровня экспрессии гена EVI Для оценки прогностического значения уровня экспрессии гена EVI1 при аллоТГСК пациенты были разделены на группы с высокой (выше медианы) и с низкой (ниже медианы) его экспрессией. Значимых различий по полу, возрасту, стадии заболевания, предшествующей терапии ИТК, индексу Gratwohl и типу донора в эти группах пациентов не было.

Анализ влияния уровня экспрессии гена EVI1 на результаты аллоТГСК у пациентов с ХМЛ выявил тенденцию, не достигшую уровня статистической значимости, к большей частоте достижения полного молекулярного ответа в группе пациентов с низким уровнем экспрессии гена EVI1 по сравнению с группой с высоким уровнем его экспрессии (84% против 57%, соответственно, р = 0,13). В то же время группы пациентов с высоким и низким уровнями экспрессии EVI1 достоверно различались по частоте развития посттрансплантационных рецидивов заболевания. Цитогенетические рецидивы были зафиксированы у 9 (64%) пациентов с высоким уровнем экспрессии EVI и только у 2 (15%) больных с низким уровнем экспрессии EVI1 (р = 0,02).

Повышенная частота рецидивов, ассоциированная с высоким уровнем экспрессии EVI1 в предтрансплантационном периоде, отражается на безрецидивной выживаемости больных ХМЛ после аллоТГСК. В частности, анализ выживаемости показал, что безрецидивная выживаемость у больных с высоким уровнем экспрессии гена EVI1 достоверно короче, чем у больных с низким уровнем его экспрессии (р = 0,04, рис. 6). Вместе с тем, статистически значимых различий в общей выживаемости между двумя сравниваемыми группами больных обнаружено не было.

Рис. 6. Безрецидивная выживаемость больных ХМЛ после аллоТГСК в зависимости от уровня экспрессии гена EVI1 (выше и ниже медианы) Для оценки независимости прогностического значения уровня экспрессии гена EVI1 в отношении безрецидивной выживаемости был проведен однофакторный и многофакторный анализ, в который кроме уровня экспрессии гена EVI1 были включены известные по литературным данным факторы, влияющие на исход аллоТГСК у больных ХМЛ: значение индекса Gratwohl (1 и 2 против 3 и более), стадия заболевания (первая хроническая фаза против более поздних), возраст (менее 35 лет и более 35 лет), интервал времени от установления диагноза до проведения трансплантации (менее 36 месяцев и более 36 месяцев) и тип донора (родственный против неродственного).

Результаты однофакторного анализа показали, что в данной группе пациентов предикторами, статистически достоверно влияющими на безрецидивную выживаемость больных, были высокое значение индекса Gratwohl (p=0,029), а также стадия акселерации или бластного криза на момент трансплантации (p = 0,037). Особенностью изучаемой группы пациентов было значительное преобладание больных с высокими значениями индекса Gratwohl, только пациента имели значения индекса менее 3, что не позволило включить этот показатель в многофакторный анализ. Исходя из этого, в многофакторный анализ на основе модели пропорциональных рисков Кокса были включены только уровень экспрессии гена EVI1 и стадия заболевания. Результаты анализа, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что эти факторы имеют независимое прогностическое значение.

Результаты многофакторного анализа безрецидивной выживаемости больных Высокий уровень экспрессии EVI1 3,93 1,17 – 13,2 0, В то же время, между группами пациентов с высоким и низким уровнем экспрессии EVI1 не было обнаружено значимых различий ни по продолжительности общей выживаемости, ни по частоте смертности по причине пост-трансплантационных осложнений и прогрессии основного заболевания.

Таким образом, нами было установлено, что высокий уровень экспрессии гена EVI1 имеет неблагоприятное прогностическое значение в отношении частоты развития рецидивов и продолжительности безрецидивной выживаемости после аллоТГСК у больных ХМЛ, резистентных к ингибиторам тирозинкиназ. При этом высокий уровень экспрессии гена EVI1 и поздняя стадия заболевания (фаза акселерации или бластный криз) на момент трансплантации являются независимыми предикторами менее продолжительной безрецидивной выживаемости. В то же время, мутации в киназном домене гена BCR-ABL, в том числе панрезистентная мутация T315I, а также высокий уровень экспрессии BCR-ABL, в исследованной группе пациентов не обнаружили негативного прогностического значения ни в отношении как общей, так и безрецидивной выживаемости после аллоТГСК у больных ХМЛ, резистентных к ингибиторам тирозинкиназ. Необходимо также отметить, что по нашим данным наиболее важными прогностическими факторами в отношении общей и безрецидивной выживаемости больных ХМЛ с резистентностью к терапии ИТК после аллоТГСК является стадия заболевания и высокое значение индекса Gratwohl, в то время как влияние молекулярно-биологических характеристик пациентов на результаты аллоТГСК было выражено значительно меньше. Так, из четырех исследованных характеристик, только одна, а именно, уровень экспрессии гена EVI1, достоверно влияла на безрецидивную выживаемость, в то время как на общую выживаемость ни одна из них достоверного влияния не оказывала.

ВЫВОДЫ

1. Уровень экспрессии гена BCR-ABL у больных ХМЛ, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ, варьирует в широком диапазоне.

Коэкспрессия транскрипта p190 гена BCR-ABL была обнаружена у половины больных ХМЛ с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ. Коэкспрессия транскрипта р190 статистически достоверно ассоциирована с высоким уровнем экспрессии основного транскрипта р210 BCR-ABL.

2. Мутации в киназном домене гена BCR-ABL были обнаружены у 38% пациентов с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ. В исследованной группе имели место 13 различных мутаций, затрагивающих 9 аминокислотных остатков в белке BCR-ABL. Чаще других встречались мутации T315I (26%), G250E (18%), Y253H (13%), F317L (11%), E255K (8%) и F359C (5%). В единичных наблюдениях были отмечены более сложные структурные нарушения гена, в том числе делеции нескольких аминокислотных оснований.

3. Разработанная в лаборатории методика аллель-специфичной ПЦР позволила выявлять клетки с мутацией T315I на 3-6 месяцев раньше, чем это можно сделать стандартным методом прямого секвенирования.

4. Уровень экспрессии гена EVI1 статистически достоверно повышен у пациентов с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ по сравнению с пациентами с оптимальным ответом на терапию.

5. Повышенный уровень экспрессии гена EVI1 у больных с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ достоверно ассоциирован с отсутствием мутаций в киназном домене гена BCR-ABL и наличием коэкспрессии химерного транскрипта р190 гена BCR-ABL.

6. Прогностического значения мутаций в киназном домене гена BCRABL, в том числе T315I, уровня его экспрессии, а также наличия коэкспрессии транскрипта р190 в отношении общей и безрецидивной выживаемости, а также частоты рецидивов и частоты достижения полного молекулярного ответа у пациентов с ХМЛ после аллоТГСК выявлено не было.

7. Высокий уровень экспрессии гена EVI1 в предтрансплантационном периоде обладает статистически достоверным неблагоприятным влиянием на результаты аллоТГСК у больных ХМЛ, увеличивая частоту посттрансплантационных рецидивов и сокращая безрецидивную выживаемость.

При этом уровень экспрессии EVI1 имеет независимое от стадии заболевания прогностическое значение.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Перед проведением аллоТГСК у больных ХМЛ рекомендуется проводить оценку уровня экспрессии гена EVI1 в периферической крови.

Больным с повышенным уровнем экспрессии EVI1 оправдано своевременное проведение противорецидивной терапии в посттрансплантационном периоде.

Целесообразно включение исследования наличия мутации T315I методом ПЦР в реальном времени в молекулярно-генетический мониторинг терапии ХМЛ с целью более раннего выявления пациентов, нуждающихся в проведении аллоТГСК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

цитогенетических факторов на эффективность аллогенной трансплантации костного мозга у больных хроническим миелолейкозом / А.В. Горбунова, Т.Л.

Гиндина, Е.В. Морозова, И.М. Бархатов, Н.Н. Мамаев, Б.В. Афанасьев // Клиническая онкогематология. - 2013. – T.6. - N.4. – C. 445-450.

2. Мамаев, Н.Н. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при остром миелоидном леикозе с транслокациеи t(8;21)(q22;q22) / Н.Н. Мамаев, А.В. Горбунова, Т.Л. Гиндина, И.М. Бархатов, С.Н. Бондаренко, М.Ю.

Аверьянова, О.В. Пирогова, О.В. Голощапов, Е.В. Кондакова, Б.В. Афанасьев // Клиническая онкогематология. - 2013. – T.6. - N.4. – C. 439-444.

3. Гиндина, Т.Л. Два новых наблюдения 8p11 миелопролиферативного синдрома с транслокациями t(6;8)(q27;p11) и t(8;9)(p11;q34), делецией гена FGFR1 и гиперэкспрессией гена EVI1: теоретические и клинические аспекты / Т.Л. Гиндина, Н.Н. Мамаев, В.В. Байков, И.М. Бархатов, А.В. Горбунова, С.Н.

Бондаренко, О.А. Слесарчук, М.Ю. Аверьянова, О.С. Успенская, Б.В.

Афанасьев // Гематология и трансфузиология. - 2013. – N.4. – C. 13-17.

4. Горбунова, А.В. Детекция мутации T315I в гене BCR-ABL у пациентов с хроническим миелолейкозом с помощью аллель-специфичной ПЦР / А.В.

Горбунова, К.В. Лепик, И.М. Бархатов // Вестник гематологии. – 2013. – Т.9. – N.2. – C.14.

5. Mamaev, N. The results of HSCT in patients with EVI1-positive leukemias and myelodysplastic syndromes transplanted without remission / N. Mamaev, A.

Gorbunova, T. Gindina, E. Morozova, I. Barkhatov, E. Nikolayeva, M. Vlasova, E.

Kondakova, S. Bondarenko, N. Stancheva, B. Afanasyev // 39th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation. London // Bone Marrow Transplantation. - 2013. – V.48 (Suppl.2). – P. 5533-5534 (R1510 abstract).

6. Gindina, T. Two new cases of the FGFR1-related myeloid and lymphoid neoplasms / T. Gindina, N. Mamaev, A. Gorbunova, S. Bondarenko, M. Vlasova, E.

Nikolaeva, B. Afanasyev // Chromosome Research. – 2013. – V. 21. – Supp.1. – S.

72-73.

7. Мамаев, Н.Н. Лейкозы и миелодиспластические синдромы с экспрессией гена EVI1: теоретические и клинические аспекты / Н.Н. Мамаев, А.В. Горбунова, Т.Л. Гиндина, И.М. Бархатов, Н.Н. Вайнюнская, Е.В.

Морозова, Е.В. Кондакова, С.Н. Бондаренко, О.А. Слесарчук, В.Н. Вавилов, Б.В. Афанасьев // Клиническая онкогематология 2012. – Т.5. - N.4. – C. 361Gorbunova, A. Frequent EVI1 overexpression in imatinib-resistant CML patients with non-mutated BCR-ABL / A. Gorbunova, I. Barkhatov, N. Mamaev, T.

Gindina, E. Morozova, B. Afanasyev // XIX Wilsede Meeting. Modern Trends in Human Leukemia. - 2012. - Р. 87.

9. Mamaev, N. Cytogenetic and molecular characteristics of post-transplant relapses in patients with acute leukaemias / N. Mamaev, T. Gindina, E. Semyenova, V. Ovetchkina, A. Gorbunova, E. Morozova, M. Vlasova, S. Bondarenko, E.

Nikolaeva, N. Stancheva, N. Osipova, B. Afanasyev // 38th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation. Geneva, Switzerland. // Bone Marrow Transplantation. - 2012. – V. 47 (Suppl. 1). – S117 (adstract).

10. Mamaev, N. Biology and Therapy of Leukemias and Myelodysplastic Syndromes (MDS) with Higher EVI1 Gene Expression / N. Mamaev, A. Gorbunova, I. Barkhatov, T. Gindina, E. Morozova, E. Kondakova, V. Vavilov, S. Bondarenko, B. Afanasyev // Myeloid Neoplasms: Approaching Cure ELN Frontiers Meeting. P.26.

11. Мамаев, Н.Н. Теоретические и клинические аспекты эпигенетических изменений при миелодиспластических синдромах и острых нелимфобластных лейкозах / Н.Н. Мамаев, Е.В. Морозова, А.В. Горбунова Теоретические и клинические аспекты эпигенетических изменений при миелодиспластических синдромах и острых нелимфобластных лейкозах // Вестник гематологии. - 2011.

- Т.7. - №3. – С. 12 – 21.

12. Gorbunova, A. Metaanalysis of gene expression in acute myeloid leukemia/ A. Gorbunova, N. Mamaev // Cellular Therapy and Transplantation. V. 3. - N. 12 – P.108.

13. Gorbunova, A. Structural modeling of BCR-ABL drug resistance mutations/ A. Gorbunova, Yu. Porozov // Proc. Moscow Conference on Computational Molecular Biology. - 2011. - P.291-292.