На правах рукописи

КУВАЕВА ТАТЬЯНА МИХАЙЛОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА БИОСИНТЕЗ

L-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ В PANTOEA ANANATIS И

ESCHERICHIA COLI

03.01.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

Работа выполнена в лаборатории №3 Закрытого Акционерного Общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика»

кандидат биологических наук

Научный руководитель:

Каташкина Жанна Иосифовна.

Козлов Дмитрий Георгиевич

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, ФГУП «ГосНИИГенетика».

Голденкова-Павлова Ирина Васильевна доктор биологических наук, профессор РГАУ-МСХА имени М.К. Тимирязева.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится «_» 2013 года в 1400 на заседании диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИГенетика»

Автореферат разослан «_» 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета:

кандидат химических наук, доцент Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы В настоящее время L-аспарагиновая кислота (L-Асп) находит широкое применение в пищевой, химической промышленности и медицине (Magnuson at al., 2007; Иежица и Спасов, 2007; Cash et al., 2010). Для химической промышленности L-Асп является перспективной “технологической платформой” для синтеза биодеградируемых полимеров и аминированных аналогов таких мировых химических “бестселлеров”, как 1,4-бутандиол, тетрагидрофуран и гамма-бутиролактон, используемых в производстве ПАВ, ингибиторов образования минеральных отложений в водных системах, ингибиторов коррозии, супер-абсорбирующих полимеров, усилителей роста растений, растворителей и пластмасс (Werpy and Petersen, 2004; Hasson at al., 2011).

Современное промышленное производство L-Асп основано на ферментативном аминировании фумаровой кислоты с использованием иммобилизованного фермента аспартазы или иммобилизованных бактериальных клеток с высокой аспартазной активностью. Кроме того, L-Асп получают из малеиновой кислоты в мембранной реакторной системе с использованием бактериальных клеток с высокими активностями малеат изомеразы и аспартазы (Yukawa et al., 2010). В обоих случаях, в качестве исходного сырья используются продукты переработки нефти (фумарат, малеат), что существенно ограничивает перспективы использования данной технологии в связи с растущими ценами на нефтепродукты. В этой связи микробиологический синтез L-Асп из возобновляемых и дешевых углеводов (по аналогии с известными примерами биотехнологического производства L-глутаминовой кислоты (L-Глу), L-лизина, и т. д.) мог бы стать перспективной альтернативой современному производству L-Асп из субстратов, получаемых из нефти.

Pantoea ananatis AJ13355 – новый объект биотехнологии. Эта бактерия первого уровня био-безопасности, принадлежащая к роду Enterobacteriacea, обладает хорошими ростовыми характеристиками на простых средах с глюкозой или сахарозой. Она способна расти при умеренно низких значениях рН среды (от 4,5) в присутствии насыщающих концентраций L-Глу (Moriya et al., 1999) и устойчива к высоким концентрациям ряда других органических кислот. В настоящее время на основе штамма AJ13355 сконструирован продуцент L-Глу и внедрён в производство новый процесс ферментации, при котором культивирование клеток сопровождается кристаллизацией конечного продукта (Izui et al, 2003; Izui et al, 2006). P. ananatis AJ13355 можно рассматривать как перспективную био-платформу для производства различных метаболитов с низкой изоэлектрической точкой, таких как L-Глу, L-Асп и др.

Поэтому исследование метаболизма данной бактерии и решение задач метаболической инженерии с целью создания штаммов-продуцентов на её основе является актуальной и практически значимой задачей.

Цель и задачи работы Диссертационная работа посвящена изучению генетических факторов, влияющих на биосинтез L-Асп клетками P. ananatis и поиску альтернативных путей ассимиляции аммония для продукции аминокислот в штаммах энтеробактерий Escherichia coli и P. ananatis.

В ходе работы решались следующие задачи:

1. теоретически реконструировать и экспериментально подтвердить функциональность путей биосинтеза и катаболизма L-Асп клетками P. ananatis;

2. выявить генетические факторы, необходимые для продукции L-Асп в клетках P. ananatis;

3. изучить возможность использования природного гена gdhA для увеличения продукции L-Асп штаммом-продуцентом P. ananatis;

«биосинтетические» (аммонийфиксирующие) аспартатдегидрогеназы из бактерий, принадлежащих к первому уровню биологической безопасности;

';

аспартатдегидрогеназы в качестве дополнительного фермента, обеспечивающего ассимиляцию аммония клетками E. coli.

Научная новизна и практическая значимость работы Проведена теоретическая реконструкция путей биосинтеза и катаболизма L-аспарагиновой кислоты клетками P. ananatis. Проведена экспериментальная проверка функционирования предсказанных путей в P. ananatis, выявлены генетические модификации, необходимые для продукции L-Асп, и осуществлено конструирование штамма, продуцирующего L-Асп.

В ходе работы обнаружено, что идентифицированная ОРС gdhA из P. ananatis кодирует НАДН-зависимую глутаматдегидрогеназу. Показано, что усиление экспрессии данной ОРС комплементирует отсутствие глутаматсинтазы. Впервые показаны преимущества использования НАДНзависимой глутаматдегидрогеназы для продукции L-Асп.

В работе клонированы гены аспартатдегидрогеназ из бактерий Polaromonas sp., Rhodopseudomonas palustris и Bradyrhizobium japonicum;

соответствующие ферменты очищены и биохимически охарактеризованы.

Согласно полученным данным, ферменты из B. japonicum и R. palustris могут быть отнесены к анаболическим, участвующим в ассимиляции аммония.

Введение аспартатдегидрогеназы из B. japonicum в штамм-продуцент L-аргинина на основе E. coli привело к увеличению продукции в 2 раза.

Публикации и апробация работы По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК, и 2 патента РФ. Материалы диссертации дважды докладывались автором на конкурсе работ молодых сотрудников НИИ Аджиномото-Генетика (Москва, 2008; Москва, 2010).

Апробация диссертации состоялась на совместном семинаре Научнотехнического совета НИИ Аджиномото-Генетика и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП ГосНИИгенетика 20 мая 2013 года.

Структура и объем работы Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на страницах, включая _ рисунков и таблиц. Список цитируемой литературы содержит источников, в том числе на русском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Теоретическая реконструкция и экспериментальная проверка путей биосинтеза и катаболизма L-аспарагиновой кислоты в Pantoea ananatis Объектом исследования является бактерия Pantoea ananatis из семейства Enterobacteriaceae. Природный штамм P. ananatis AJ13355 был селектирован в 1990-х годах из почвы чайной плантации Ивата-Ши (Япония) по способности к росту на умеренно кислой среде в присутствии насыщающих концентраций L-Глу и прошел тест на биологическую безопасность.

В 2002 году была определена полная нуклеотидная последовательность генома P. ananatis AJ13355, после чего силами нашей лаборатории была составлена его подробная аннотация. Данный геном состоит из двух кольцевых молекул ДНК: 4555536 п.н. хромосомы (NCBI GenBank: AP012032.1) и п.н. плазмиды pEA320 (NCBI GenBank: AP012033.1) (Hara et al., 2012).

На основе анализа полной нуклеотидной последовательности и полученной аннотации были реконструированы возможные пути биосинтеза и катаболизма L-Асп в клетках P. ananatis AJ13355 (Рисунок 1). Для построения данной схемы учитывались известные метаболические карты для E. coli и S. typhimurium как наиболее изученных представителей энтеробактерий.

Практически все идентифицированные открытые рамки считывания (ОРС) P. ananatis были ортологичны белкам из E. coli с высокой степенью идентичности по аминокислотной последовательности, за исключением ОРС глутаматдегидрогеназы и глутаматсинтазы.

В данной работе была проведена экспериментальная проверка предложенной схемы биосинтеза и катаболизма L-Асп в P. ananatis, включавшая конструирование штаммов, содержащих делеции ключевых генов предполагаемых путей, анализ фенотипа полученных мутантов, и, в ряде случаев, измерение активности соответствующих ферментов.

Для конструирования делеций использовали метод Red-зависимой интеграции полученных в ПЦР двухцепочечных фрагментов ДНК, ранее успешно адаптированный для использования в P. ananatis силами нашей лаборатории (Katashkina et al., 2009). Для получения штаммов с множественными делециями использовали метод переноса маркированной мутации с помощью электропорации геномной ДНК. Данные по фенотипам основных полученных мутантов суммированы в таблице 1.

Рисунок 1 – Предполагаемая схема путей биосинтеза и катаболизма L-Асп в P. ananatis AJ13355 и ее сравнение с метаболической картой E. coli. Курсивом черного цвета указаны названия гомологичных кодирующих рамок P. ananatis и E. coli; красным цветом отмечены кодирующие рамки P. ananatis, не имеющие гомологов в E. coli; зеленым цветом отмечены гены E. coli, отсутствующие в геноме P. ananatis. Сокращения: Глюкозо-6Ф – глюкозо-6фосфат; ФЕП – фосфоенолпируват; Пир – пируват; Ацетил-КоА – ацетил-коэнзим А; ОА – оксалоацетат; -кГ – -кетоглутарат; Сук-КоА – сукцинил-коэнзим А.

Было обнаружено значительное сходство рассматриваемого метаболизма у P. ananatis и E. coli, а именно: 1) Идентифицированные ОРС P. ananatis aspC и tyrB действительно кодируют ферменты, обладающие активностью аспартатаминотрансферазы. Реакция аспартатаминотрансферазы является ключевой для биосинтеза L-Асп в P. ananatis. 2) Показано, что идентифицированная ОРС ppc действительно кодирует ФЕП-карбоксилазу. Как и в E. coli, ФЕП-карбоксилаза из P. ananatis ингибируется L-аспартатом, а инактивация гена ppc приводит к строгой ауксотрофии по L-Глу. 3) Подтверждено функционирование предсказанных ОРС P. ananatis gltA и sucA, кодирующих цитратсинтазу и субъединицу компонента Е1(0) -кетоглутаратдегидрогеназы соответственно.

Синтез глутамата. В результате анализа генома P. ananatis было предсказано наличие ключевых компонентов для двух альтернативных путей синтеза L-Глу: 1) с помощью глутаматдегидрогеназы, и 2) с помощью совместного функционирования глутаматсинтазы и глутаминсинтазы (ГС/ГОГАТ путь). В геноме P. ananatis были идентифицированы ОРС, кодирующие белки, ортологичные известным глутаматдегидрогеназе GdhA из Thermotoga maritima (Kort et al., 1997) (аминокислотная идентичность 54%) и глутаминсинтазе GlnA из E. coli (Alibhai and Villafranca, 1994) (аминокислотная идентичность 90%). Также была обнаружена ОРС gltB, кодирующая белок, ортологичный большой субъединице предполагаемой глутаматсинтазы из Agrobacterium tumefaciens (68% аминокислотной идентичности).

В клеточном экстракте дикого штамма P. ananatis SC17(0), выращенного в аэробных условиях на минимальной среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода, обнаруживалась активность глутаматсинтазы (0,039 ± 0,002) Е/мг, что подтверждает присутствие в клетках активного фермента. (В работе за 1 Е активности принимали убыль 1 мкмоль субстрата или образование 1 мкмоль продукта за 1 мин.) В то же время, активность глутаматдегидрогеназы в тестируемых условиях (с НАД(Н) или НАДФ(Н) в качестве кофакторов) была ниже детектируемого уровня