на правах рукописи

Лавыш Дарья Геннадиевна

Транскрипционные стратегии phiEco32-подобных

бактериофагов

специальность (03.01.07) – молекулярная генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

МОСКВА – 2013

Работа выполнена в Лаборатории регуляции экспрессии генов мобильных элементов прокариот Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук и в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук.

Научный руководитель: Северинов Константин Викторович доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Миронов Андрей Александрович доктор биологических наук, профессор, заведущий лабораторией биоинформатики, факультет Биоинженерии и Биоинформатики, Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования “Московский Государственный Университет им.М.В.

Ломоносова” Летаров Андрей Викторович, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией вирусов микроорганизмов, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н.Виноградского Российской академии наук

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.

Скрябина Российской академии наук

Защита диссертации состоится “” ноября 2013 г. в _ час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: г. Москва, ул. Вавилова дом 34/5, первый этаж.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН), по адресу 119 991, г. Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан “” октября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук Грабовская Любовь Сергеевна

Общая характеристика работы

Актуальность работы. На сегодняшний день отсеквенировано около бактериофагов, геном которых представлен двухцепочечной ДНК. Геномы фагов очень быстро эволюционируют. Параллельно эволюционируют защитные механизмы бактерий. Изучение механизмов, которые используются бактериофагами для преодоления защитных клеточных функций и обеспечения экспрессии фаговых генов за счет систем клетки-хозяина не только расширяют наши знания о вирусах, но и позволяют получить данные о работе жизнененно важных бактериальных ферментов и, в частности, о возможности их ингибирования. Данная работа посвящена исследованию механизмов регуляции транскрипции у недавно выделенной группы phiEco32-подобных бактериофагов. На основании имевшихся к началу настоящей работы данных можно было предполагать, что в экспрессии генов всех phiEco32-подобных фагов принимает участие закодированный в вирусном геноме -фактор. Белок gp36 – -фактор бактериофага phiEco32 был частично охарактеризован к началу данной работы1. В ходе нашей работы был охарактеризован белок gp47 – -фактор бактериофага 7-11, который является наиболее удаленным родственником фага phiEco32. Несмотря на то, что последовательности промоторов, узнавание которых обеспечивается gp47, отличаются от gp36-промотров, использованный в работе метод сравнительного анализа оперонной организации геномов бактериофагов позволил идентифицировать и охарактеризовать промоторы фага 7-11 и изучить динамику накопления мРНК, синтезированной с этих промотров.

В геномах бактериофагов группы phiEco32 произведен поиск генов, кодирующих ингибиторы хозяйской РНК-полимеразы. В геномах фагов, близкородственных phiEco32, обнаружен ген, кодирующий гомолог ранее охарактеризованного ингибитора транскрипции gp79 фага phiEco32. Для эволюционно более далеких фагов подгруппы 7идентифицирован новый фактор, который, возможно, способствует диссоциации Savalia D., Westblade L.F., Goel M., Florens L., Kemp P., Akulenko N., Pavlova O., Padovan J.C., Chait B.T., Washburn M.P., Ackermann H.-W., Hushegian A., Gabisonia T., Molineux I., Severinov K. (2008) Genomic and proteomic analysis of phiEco32, a novel Escherichia coli bacteriophage. J. Mol. Biol.

377:774 – холофермента РНК-полимеразы, содержащей основную -субъединицу бактерий, тем самым стимулируя образование холофермента, содержащего -фактор фага. На основании полученных данных можно выдвинуть общие предположения о стратегии регуляции транскрипции у фагов phiEco32-группы, количество известных представителей которой быстро увеличивается.

транскрипционных стратегий phiEco32-подобных бактериофагов. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1) Идентифицировать и изучить динамику накопления транскриптов ранних 70-зависимых промоторов бактериофага phiEco32 в ходе инфекции и изучить механизм переключения транскрипции со средних на поздние gp36-зависимые промоторы фага.

сегодняшний день phiEco32-подобных фагов.

3) Изучить временную регуляцию экспрессии генов phiEco32-подобного последовательность, узнаваемую холоферментом РНК-полимеразы, содержащим этот фактор, и провести поиск дополнительных факторов транскрипции, закодированных в геноме бактериофага 7-11.

Научная новизна. На основании ранее полученных данных и результатов данной работы, охарактеризован процесс регуляции транскрипции бактериальных и фаговых генов в ходе инфекции бактериофагом phiEco32. Впервые охарактеризован сигма фактор gp47, закодированный в геноме бактериофага 7-11, и определены промоторы, узнаваемые холоферментом РНК-полимеразы, содержащим gp47. Идентифицированы 70-промоторы бактериофагов phiEco32 и 7-11. Получены данные, указывающие на то, что белок gp98 бактериофага 7-11, возможно, является анти-сигма-фактором и обеспечивает переключение ранней транскрипции на позднюю gp47-зависимую транскрипцию.

Практическая значимость работы. Полученные в данной работе результаты имеют в основном фундаментальное значение, однако некоторые из них могут найти и практическое применение. Результаты исследования расширяют представления о транскрипционных стратегиях бактериофагов, о промоторах альтернативных -факторов и механизмах взаимодействий белков бактериофагов с РНК-полимеразой бактерий.

Охарактеризованные в данной работе белки в перспективе могут быть использованы для создания ингибиторов бактериальной РНК-полимеразы.

Публикации и апробация работы. Работа прошла апробацию на Ученом совете Института молекулярной генетики РАН. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, включая 2 статьи в международных рецензируемых журналах. Результаты работы были представлены на 4 конференциях, в том числе на трех тематических международных конференциях “Microbial Viruses”, “Viruses of Microbes” и “5th Congress of European Microbiologists (FEMS 2013)”.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературных данных, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает 185 источников. Работа содержит 26 рисунков и 4 таблицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение активности 70-зависимых промоторов в ходе инфекции бактериофагом В нашей лаборатории было показано, что ранние РНК бактериофага phiEco синтезируются с 5-ой по 10-ую минуты инфекции. Мы предположили, что их синтез осуществляется с 70-зависимых промоторов. Их поиск осуществляли программой Genome Explorer2, используя паттерн, описывающий -10 и -35 элементы 70-промоторов.

Последовательности, похожие на 70-промоторы, были обнаружены перед генами 37, 57, Mironov AA, Vinokurova NP, Gel’fand MS. Software for analyzing bacterial genomes. Mol Biol (Mosk) 2000;34:253–262.

124 и 128. Для экспериментального подтверждения того, что эти полседовательности являются 70-промоторами, тотальная РНК, выделенная из зараженных фагом phiEco клеток, была проанализирована методом удлинения праймера. В качестве праймеров использовали олигонуклеотиды, комплементарные участкам ДНК phiEco32, расположенных поблизости от предсказанных 70-промоторов. В качестве контроля и для того, чтобы подтвердить предположение об ингибировании хозяйских генов в процессе инфекции, анализировали активность 70-промоторов, расположенных перед бактериальными генами ompX и rpsU с использованием соответствующих праймеров.

Продуктов удлинения праймеров, отжигающихся перед генами 57 и 37, обнаружено не было. Однако, был обнаружен продукт удлинения праймера, отжигающегося перед предсказанным промотором внутри гена 128 и три продукта удлинения праймера, отжигающегося перед предсказанными промоторами гена 124. Также были обнаружены продукты удлинения праймеров, специфичных к хозяйским генам. 5'-концы РНК, соответствующих всем обнаруженным продуктам реакции удлинения праймеров, находились на расстоянии около 10 нуклеотидов от -10 элементов предсказанных промоторов phiEco32, что подтверждает результаты предсказаний.

наибольшее количество РНК детектируется на 5-10 минутах инфекции, а во время и поздней стадий инфекции 70-транскрипты как бактерии-хозяина, так и средней ранних генов фага не детектируются. Данные динамики накопления РНК ранних генов подтверждают данные, ранее полученные методом дот-гибридизации.

Таким образом, ранние гены phiEco32 транскрибируются 70–холоферментом РНКполимеразы как минимум с 4-х промоторов фага. На поздних стадиях инфекции происходит ингибирование активности 70–промоторов как бактерии-хозяина, так и ранних промоторов фага.

2. Изучение регуляции активности средних и поздних gp36-зависимых промоторов В геноме бактериофага phiEco32 присутствуют шесть промоторов, узнаваемых холоферментом РНК-полимеразы, содержащим -фактор gp36, закодированный в геноме бактериофага. Несмотря на то, что все эти промоторы имеют практически идентичный консенсусный элемент TAATGTATA в -10 области, данные промоторы расположены и перед средними, и перед поздними генами. Таким образом, возникает вопрос, как достигается отличающийся временной профиль активности средних и поздних генов. В ходе данной работы нами проведен детальный анализ временной экспрессии gp36зависимых генов бактериофага. На рисунке 1 (дорожки 1-5) показана динамика накопления gp36-зависимых средних и поздних транскриптов фага в ходе инфекции. Как видно, продукты средних промоторов детектируются на 15-ой минуте инфекции, их количество достигает максимума к 20 минутам, а затем резко уменьшается. Продукты поздних промоторов детектируются с 20-ой минуты инфекции и продолжают накапливаться до 30-ой минуты, когда начинается лизис зараженных клеток.

Мы предположили, что различную динамику средних и поздних промоторов может обеспечивать дополнительный транскрипционный фактор. На рисунке 1 (дорожки 2’-5’) показана динамика накопления средних и поздних транскриптов phiEco32 в клетках, обработанных ингибитором трансляции хлорамфениколом на 12-ой минуте инфекции.

Сравнение динамики транскриптов из обработанных и необработанных хлорамфениколом клетках показывает, что ингибирование синтеза средних белков приводило к продолжающемуся накоплению средних транскриптов. Динамика поздних транскриптов существенно не изменялась, однако количество этих транскриптов было ниже, чем в эксперименте без хлорамфеникола (скорее всего это обусловлено ингибированием синтеза белков репликации, т.е. меньшим количеством ДНК матриц для транскрипции). Таким образом, полученные данные указывают на то, что продукт одного из средних генов phiEco специфически ингибирует транскрипцию средних генов в поздний период инфекции.

3. Общая схема регуляции транскрипции генов в ходе инфекции бактериофагом phiEco На основании полученных в нашей лаборатории данных можно предложить следующую общую схему регуляции транскрипции генов бактериофага phiEco32. Ранние гены фага экспрессируются как минимум с 4-х промоторов, узнаваемых 70-холоферментом РНКполимеразы. Далее синтезируется ингибитор 70-транскрипции – белок gp79 (продукт раннего гена). Скорее всего, именно он осуществляет ингибирование 70-транскрипции как хозяйских генов, так и ранних генов фага1. Ген 36, скорее всего, экспрессируется с ранних 70промоторов, а затем холофермент, содержащий gp36, транскрибирует свой собственный ген с промотора перед геном 40, а также другие средние гены с промотора, расположенного перед геном 68. Далее транскрипция средних gp36-зависимых генов ингибируется за счет действия фактора, выявленного в ходе эксперимента с добавлением хлорамфеникола, после чего холофермент РНК-полимеразы, содержащий gp36, осуществляет транскрипцию только с поздних промоторов, расположенных перед генами 6, 13, 26 и 58. Вопрос о том, что обеспечивает более позднее включение поздних промоторов и в чем заключается дифференциальная чувствительность средних и поздних промоторов к ингибитору средней транскрипции остается открытым.

3. Сравненительный анализ организации геномов phiEco32-подобных фагов Геном бактериофагов 7-11 и phiEco32 представлен двуxцепочечными ДНК. Размер генома бактериофага 7-11 составляет 89919 пн3 против 77554 пн у phiEco32. Бактериофаги phiEco32 и 7-11 инфицируют филогенетически близкие энтеробактерии – штамм Escherichia Kropinski A.M., Lingohr E.J., Ackermann H.-W. (2011) The genome sequence of enterobacterial phage 7-11, which possesses an unusually elongated head. Arch Virol.156(1):149-51.

coli 55 и Salmonella enterica серовар Newport, соответственно. Сравнение генома бактериофагов 7-11 и phiEco32 обнаруживает, что продукты 34 генов (20%) фага 7- гомологичны белкам бактериофага phiEco32.

Все гены бактериофага 7-11, которые являются гомологами генов бактериофага phiEco32, расположены в том же порядке, что и соответствующие гены фага phiEco32. Первый кластер – это поздние гены, кодирующие структурные белки и белки упаковки ДНК, они экспрессируются в одном направлении и занимают около 1/3 генома у обоих фагов. Второй кластер – средние гены, среди которых находятся предсказанные гены ДНК-полимеразы, белков нуклеотидного обмена, -субъединиц и др. Кластер ранних генов представлен генами, которые не имеют гомологов в базах данных. Средние и ранние гены транскрибируются в противоположном относительно кластера поздних генов направлении.

Во время проведения наших исследований бактериофагов phiEco32 и 7-11, были опубликованы геномы еще трех родственных бактериофагов:

(1) Бактериофаг NJ01 инфицирует энтеробактерию Serratia marcescens. Геном этого фага имеет длину 77448 пн. В геноме аннотировано 136 открытых рамок считывания4.

(2) Бактериофаг KBNP135 инфицирует штамм E. coli KBP135. Геном этого фага имеет длину 77315 пн. В геноме аннотировано 115 открытых рамок считывания5.

(3) В базе данных геномов NCBI так же появился геном phiEco32-подобного бактериофага, инфицирующего Cronobacter sakazakii, - vB_CsaP_GAP52 (далее – “GAP52“).

Геном имеет длину 76631 пн. В геноме аннотировано 115 открытых рамок считывания.

На основании филогенетического анализа phiEco32-подобных фагов мы сделали вывод, отдельную подгруппу названную нами “подгруппой 7-11”. Бактериофаг KBNP135 занимает промежуточное положение, однако, основываясь на анализе продуктов генов фага, мы отнесли его к “подгруппе phiEco32”. Результаты анализа геномов всех известных на сегодня phiEco32Li Y, Chen M, Tang F, Yao H, Lu C, Zhang W. (2012) Complete genome sequence of the novel lytic avian pathogenic coliphage NJ01. J Virol. 86(24):13874-5.

SW, Ha MA, Kim KS, Kim TH, Jang HB, Cha IS, Park SB, Kim YK, Jung TS. (2012) Complete genome sequence of the bacteriophages ECBP1 and ECBP2 isolated from two different Escherichia coli strains. J Virol. 86(22):12439-40.

подобных фагов представлены на рисунке 3. Гены отнесены к определенному временному классу, основываясь на экспериментальных данных для генов фага phiEco32. Если ген не имеет гомолога, он не раскрашен. Гомологи между подгруппой phiEco32 и 7-11 соединены линиями, проведенными между генами фагов. Как видно из рисунка 3, наиболее консервативной является зона поздних генов, а наиболее вариабельной – зона ранних генов.

Рис. 3. Сравнение геномов phiEco32-подобных бактериофагов.

Схематично представлены геномы фагов phiEco32 (NC_010324.1), NJ01 (NC_018835.1), KBNP135 (NC_018859.1), 7-11 (NC_015938.1) и GAP52 (NC_019402.1). Гены обозначены стрелками, идентифицированные в ходе данной работы 70-промоторы и промоторы сигма факторов бактериофагов – флажками. Цвет генов соответствует предполагаемой стадии экспрессии данного гена, основываясь на данных для бактериофага phiEco32. Гомологи внутри группы phiEco32 и внутри подгруппы 7-11 раскрашены в цвет, а гомологи 7-11 и phiEco32 соединены линиями. Гены, кодирующие транскрипционные факторы, обозначены фиолетовым (gp36 и его гомологи), розовым (gp47 и его гомолог), и оранжевым (gp79 и его гомологи).

4. Биоинформатический анализ транскрипционных стратегий phiEco32-подобных Все phiEco32-подобные бактериофаги кодируют ECF -фактор. Сигма факторы, кодируемые NJ01 и KBNP135, практически идентичны gp36 фага phiEco32. В геноме phiEco32-подобных бактериофагов NJ01 и KBNP135 идентифицируются последовательности, идентичные консенсусу gp36-промотора phiEco32. Каждая из таких последовательностей находится перед генами, гомологичными первым генам средних или поздних оперонов phiEco32 (таблица 1) и, следовательно, тоже играет роль gp36-промотора в этих фагах. Все найденные промоторы очень консервативны. Удивительно, что варианты gp36-промотора phiEco32 TAATGTAgA и aAATGTATA встречаются именно перед гомологами генов 6 и 68, соответственно, во всех проанализированных геномах, что может указывать на их функциональное значение (однако данный полиморфизм не может обеспечивать функциональную разницу между средними и поздними промоторами фагов).

Таблица 1. Средние и поздние промоторы бактериофагов подгруппы phiEco32, узнаваемые холоферментом РНК-полимеразы, содержащим gp36 phiEco32, или соответствующий гомолог.

Цветом показаны принадлежность промотора к определенному временному классу: красный – позднему, зеленый – среднему.

Аминокислотная последовательность -фактора бактериофага 7-11 – белка gp47 сильно отличается от последовательности gp36 phiEco32 и его ближайших родственников. Тем не менее gp47 может играть ту же роль в развитии фага 7-11, что gp36 – в развитии phiEco32.

Предсказанный сигма фактор бактериофага GAP52 родственен gp47, однако их последовательности различаются друг от друга больше, чем последовательности gp36подобных белков фагов phiEco32 подгруппы.

В геномах фагов NJ01 и KBNP135 так же присутствует гены, кодирующие гомологи ингибитора 70-транскрипции – gp79 (рисунок 3), однако подобных генов в геномах 7-11 и GAP52 не обнаруживается.

транскрипционная стратегия бактериофага 7-11 по ряду моментов отлична от ранее изученной нами транскрипционной стратегии бактериофага phiEco32.

5. Идентификация gp47-промоторов бактериофага 7- На основании того, что пять из шести генов фага phiEco32, перед которыми расположены gp36-промоторы, имеют гомологов в геноме фага 7-11, было выдвинуто предположение о том, что в некодирующих участках непосредственно перед этими генами фага 7-11 или перед первыми генами оперонов, в состав которых входят эти гены-гомологи, находятся gp47промоторы, обеспечивающие среднюю и позднюю транскрипцию фага. Для проверки этого предположения, была предсказана оперонная структура предполагаемых средних и поздних генов 7-11 (таблица 2) и идентифицированы межгенные участки, в которых могли бы находиться промоторы.

Таблица 2. Предсказание оперонов для поздних и средних генов бактериофага 7-11. В скобочках указаны возможные альтернативные границы оперона.

Выбранные межгенные участки фага 7-11, указанные в таблице 2, не содержали мотивов, похожих на промоторные элементы известных бактериальных промоторов или gp36промоторов. Для экспериментального подтверждения существования промоторов перед предсказанными оперонами поздних и средних генов 7-11 была выделена тотальная РНК из незараженной культуры Salmonella Newport, а также из зараженной культуры на 5-oй, 10-oй, и далее каждые 10 минут до 60-oй минуты инфекции, когда зараженные клетки начинали лизировать. Активность всех предполагаемых промоторoв проверили методом удлинения праймеров. На рисунке 4 представлены результаты реакций удлинения тех праймеров, для которых удалось обнаружить продукты реакции удлинения. Как видно из рисунка, продукты удлинения праймеров наблюдались в межгенных участках перед генами 1, 8, 16 и 48.

Кинетика накопления продуктов соответствовала позднему классу экспрессии (продукты накапливаются начиная с 40 минуты инфекции и присутствуют вплоть до конца инфекции).

Рис. 4. Анализ экспрессии поздних генов бактериофага 7-11 во время инфекции Salmonella Newport.

Продукты РНК с предполагаемых gp47-промоторов Р1, Р8, Р16 и Р48 идентифицировали методом удлинения праймера с использованием РНК, выделенной из инфицированных клеток (время инфекции указано над рисунком). Слева нанесены продукты реакций удлинения индивидуальных праймеров, специфичных к различным генам 7-11 (продукты подписаны сбоку), на тотальной суммарной РНК, выделенной из зараженных клеток. Продукты реакций удлинения праймеров указаны стрелочками.

6. Определение консенсусной последовательности поздних промоторов 7- Для определения точек транскрипционного старта продукты реакции удлинения праймера на тотальной РНК, выделенной до инфекции и на 40-ой минутах инфекции, были нанесены рядом с соответствующими сиквенс-реакциями (рисунок 5). На основании выравнивания последовательностей перед 5'-концами определенных продуктов реакции удлинения праймеров удалось выявить консенсус, состоящий 2-х элементов: GTAA и CTA.

Данный консенсус является слабым, что объясняет почему он не мог быть найден биоинформатически избыточно параметризированными программами поиска мотивов без дополнительной экспериментальной информации. Можно предположить, что данный консенcус соответствует последовательности, узнаваемой холоферментом РНК-полимеразы, содержащим gp47. В таком случае, стартовая точка транскрипции находится на расстоянии пн от консенсус элемента CTA предполагаемых промоторов P1, P8, P16 и на 4 пн для промотора P48.

последовательности поздних генов бактериофага 7-11.

(a) Продукты сиквенс-реакций и продукты реакции удлинения праймеров, полученные на тотальной РНК, выделенной на 0 и 40 минуте инфекции разделяли электрофорезом в 6% ПААГе, содержащем 8М мочевину с последующей визуализацией результатов с помощью фосфоимиджера (б) Консенсус промоторной последовательности, высота каждой буквы соответствует степени ее консервативности. Внизу приведены нуклеотидные последовательности перед стартами транскрипции генов 1, 8, 16, 48, красным отмечены стартовые точки транскрипции, выделены консенсусные элементы позднего промотора.

7. Gp47 является -фактором, обеспечивающим позднюю транскрипцию 7- Наиболее близкородственными белками для gp47 являются предсказанные субъединицы бактерий Planctomyces brasiliensis, Bacillus azotoformans и Vibrio alginolyticus.

Интересно, что gp36 является более дальним гомологом gp47, чем белки из бактерий, указанных выше. Чтобы убедится в том, что gp47 действительно взаимодействует с РНКполимеразой, мы клонировали ген 47 в экспрессионный вектор pET19b, наработали и очистили рекомбинантный белок gp47 с 6-ю гистидинами на C-конце. Методом нативного гельэлектрофореза мы показали, что рекомбинантный белок gp47 действительно связывается с кор-ферментом РНК-полимеразы E. coli.

Далее активность gp47 была проверена in vitro на матрицах ДНК, содержащих последовательности перед генами 1, 8, 16 и 48. Как видно из рисунка 6 (дорожка 4), при добавлении gp47 к кор-ферменту РНК-полимеразы E. coli наблюдалось появления ярких полос, соответствующих специфической инициации транскрипции. Далее были проведены реакции удлинения соответствующего праймера с РНК, синтезированной in vitro. Точки старта, определенные ранее для поздней РНК фага в зараженных клетках, совпадали со стартовыми точками, наблюдаемыми in vitro. Полученный результат не только подтверждает наше теоретическое предположение о наличии gp47-зависимого промотора перед генами 1, 8, 16 и 48, но и доказывает, что gp47 действительно является -фактором, ответственным за позднюю транскрипцию фага.

8. Определение области плавления gp47-промотора Мы проанализировали область плавления поздних промоторов 7-11 в пристутсвии холофермента РНК-полимеразы c gp47 методом перманганатного футпринта. Для всех исследованных промоторов область плавления ДНК включает в себя стартовую точку транскрипции, а также район консенсусной последовательности в районе -6.

Рис. 7. Определение области плавления промоторов поздних генов фага 7-11 в присутствии сигма-фактора gp47.

Продукты перманганатного футпринтинга на ДНК (-), на ДНК инкубированной с РНКполимеразой (core) и на ДНК, инкубированной с gp47-РПК-полимеразой (core+gp47). Справа указана последовательность ДНК, красным отмечена область плавления (в соответствии с реакцией секвенирования). Продукты разделяли электрофорезом в 6% ПААГе, содержащем 8М мочевину с последующей визуализацией результатов с помощью фосфоимиджера.

Аффинность gp47 к РНК-полимеразе была проанализирована в опытах по конкуренции с флуоресцентно меченной 70-субъединицей за взаимодействие с кор-ферментом РНКполимеразы. Так как в составе холофермента флуоресцентно меченный район 70субъединицы находится рядом с сайтом связывания с рифампицином, флуоресценция 70субъединицы уменьшается при образовании холофермента (за счет тушения флуорофором рифампицина, черная кривая на рисунке 8). Как и ожидается, степень тушения флуоресценции 70-субъединицы зависит от взаимных количеств кор-фермента и 70-субъединицы (красная кривая). Синяя кривая показывает, что если связанный с рифампицином кор-фермент преинкубировать с gp47, а потом добавить меченную наблюдается т.к. РНК-полимераза уже связана с gp47. Даже после 1 часа совместной инкубации 70-субъединица не связывается с РНК-полимеразой. Если РНК-полимеразурифампицин добавить к прединкубированным 70-субъединице и gp47, то тушение флуоресценции происходит (зеленая кривая), но оно ненамного меньше, чем то, которое наблюдается при том же соотношении 70субъединицы и кор-фермента, но в отсутствии gp (красная кривая). Так как опыт по совместному связыванию проводился в условиях, когда концентрация gp47 была в 8 раз больше концентрации 70-субъединицы, можно сделать вывод о том, что формирование комплекса РНК-полимеразы с 70-субъединицей происходит быстрее, чем формирование комплекса gp47 с РНК-полимеразой. Однако, если комплекс с gp47 уже образовался, то 70-субъединица не способна вытеснить связанный gp47 (синяя кривая). Иными словами, фактор gp47 обладает высокой аффинностью к кор-ферменту РНКполимеразы, однако, сам по себе не может конкурировать с 70-субъединицей, что указывает на возможность участия дополнительного транскрипционного фактора, необходимого для переключения взаимодействия РНК-полимеразы с 70-субъединицей на взаимодействие с gp47.

Рис. 8. Определение аффинности gp47 к РНК-полимеразе. Временная зависимость изменения сигнала флуоресценции при инкубации 70-РНК-полимеразы с gp47, описание эксперимента в тексте.

промоторов фага 7- Программой Genome Explorer2 в области предполагаемых ранних и средних генов бактериофага 7-11 предсказаны промоторы, последовательности которых незначительно отличаются от консенсуса 70промотора. Они находятся перед генами 47, 58, 70, 99, 102, 119, 123, 147, и 151 (перед последним предсказываются 3 промотора) фага 7-11. Активность этих промоторов в процессе инфекции проверена реакцией удлинения праймера на РНК, выделенной из клеток Salmonella Newport на разных стадиях инфекции. Транскрипты промоторов перед генами 70, 99, 151. Перед геном 151 активны в наших условиях проведения инфекции 2 из 3-х предсказанных промотора. Все транскрипты начинают накапливаться на 5 минуте инфекции. Затем их количество сокращается. Исключение составляет лишь транскрипт с промотора, расположенного перед геном 70. По-видимому, данная мРНК очень стабильна и не подвергается деградации на поздних стадиях. Таким образом, ранняя транскрипция бактериофага 7-11 осуществляется как промоторой.

Так как бактериофаг 7-11 не кодирует гомолога ингибитора 70-транскрипции gp79, было выдвинуто предположение, что в геноме 7-11 закодирован негомологичный белок с аналогичной функцией. Все гены бактериофага 7-11, которые имеют гомологов в геноме бактериофага phiEco32, расположены в том же порядке относительно друг друга, что и гены phiEco32. Мы предположили, что аналог gp79 может быть закодирован в соответствующей области средних генов фага 7-11. Из кандидатов мы исключили те гены, которые имеют гомологов с генами фагов подгруппы phiEco32, а также гены, кодирующие белки весом более 10 кДа. Из оставшихся 2-х кандидатов — генов 98 и 100 – мы выбрали ген 98, т.к. перед геном 99 есть экспериментально подтвержденный 70-промотор, который активен по 30 минуту инфекции, а белок, который влияет на 70-транскрипцию должен быть ранним, т.к.

ингибирование активности ранних 70-промоторов происходит начиная с середины инфекционного цикла.

Ген 98 был клонирован в экспрессионный вектор pET19b, и его продукт, рекомбинантный белок gp98, наработан и очищен. Gp98 не влиял на gp47-транскрипцию in vitro. Однако, gp98 ингибировал 70–транскрипцию после предварительной инкубации 70субъединицы c gp98 (рисунок 9). Обнаруженный эффект был не велик и нуждается в дальнейшем исследовании. На данный момент, мы предполагаем, что gp98 мог бы являться анти-сигма-фактором бактериофага 7-11.

12. Общая схема регуляции транскрипции генов в ходе инфекции бактериофагом 7- На основании полученных нами данных, можно предложить следующую схему регуляции транскрипции генов бактериофага 7-11. Ранние гены фага транскрибируются с начала инфекции до 20 минуты с по крайней мере четырех промоторов, узнаваемых 70холоферментом РНК-полимеразы клетки-хозяина. Продукт ранних генов – белок gp98, вероятно, способствует вытеснению 70-субъединицы из комплекса с РНК-полимеразой, что способствует образованию gp47-холофермента. Белок gp47 является сигма фактором, который в комплексе с хозяйской РНК-полимеразой осуществляет транскрипцию с поздних промоторов 7-11, которые характеризуются консенсусной последовательностью: WGTAAKKNTWK-(11)YRCTANW. По-видимому, отдельного среднего класса промоторов у 7-11 не существует.

Нами был проведен поиск последовательностей, подобных консенсусу gp47-промотора фага 7в геноме фага GAP52. Последовательности, похожие на консенсус gp47-промотора 7-11, найдены перед и в генах 1, 111, 110, 107, 106, 98, 96, 95, 92, 86, 80, 71, 59, 48, 46 и 10 GAP52. При этом непосредственно перед генами-гомологами генов, перед которыми находятся gp47-промоторы фага 7-11, таких последовательностей не обнаруживается (за исключением гена 1). Таким образом, мы считаем, что сигма фактор фага GAP52 осуществляет транскрипцию с промоторов, отличных от консенсуса gp47 промоторов.

ВЫВОДЫ

Обнаружены и охарактеризованы четыре 70-промотора бактериофага phiEco32, с которых осуществляется экспрессия ранних генов. Показано, что во время средней и поздней стадии инфекции бактериофагом phiEco32 происходит ингибирование ранних промоторов фага и клетки-хозяина. Установлено, что в переключении экспрессии gp36зависимых средних генов на поздние гены бактериофага phiEco32 участвует дополнительный транскрипционный фактор.

2. Проведено сравнение всех известных на сегодняшний момент phiEco32-подобных фагов. Определены промоторы, узнаваемые холоферментами, содержащими сигма субъединицы, закодированные в геномах phiEco32-подобных фагов.

3. Определен консенсус поздних промоторов бактериофага 7-11. Охарактеризован сигма фактор бактериофага 7-11 – gp47, ответственный за транскрипцию поздних генов.

Обнаружены и охарактеризованы четыре 70-промотора бактериофага 7-11, с которых осуществляется экспрессия ранних генов. Показано, что активность ранних промоторов 7-11 ингибируется на поздней стадии инфекции.

5. Идентифицирован транскрипционный фактор gp98, который, возможно, является анти-сигма-фактором.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах:

1) Pavlova, O., Lavysh, D., Klimuk, E., Djordjevic, M., Ravcheev, D. A., Gelfand, M. S., Severinov, K., Akulenko, N. (2012) Temporal regulation of gene expression of the Escherichia coli bacteriophage phiEco32. J Mol Biol, 416(3): p. 389-99.

2) Glukhov AS, Krutilina AI, Shlyapnikov MG, Severinov K, Lavysh D, Kochetkov V. V., McGrath J. W., de Leeuwe C., Shaburova O. V., Krylov V. N., Akulenko N.V., Kulakov L.A. (2012) Genomic analysis of Pseudomonas putida phage tf with localized single-strand DNA interruptions. PLoS ONE. 7: e51163.

Материалы конференций:

3) Lavysh D., Pavlova O., Akulenko N., Borukhov S., Severinov K. “Transcription regulation of bacteriophage PhiEco32”. p.66. International conference “Microbial Viruses: Genomics, Evolution and Applications in Ecology, Biotechnology and Medicine”, 2011, Belfast, UK.

4) Лавыш Д.Г., Северинов К.В. “Изучение механизмов действия ингибиторов транскрипции бактериофагов phiEco32 и 7-11”. Конференция “Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты”, 2012, Москва, ИБГ РАН.

5) Lavysh D., Severinov K. “Regulation of transcription of Salmonella Newport bacteriophage 7-11”. International conference “Viruses of Microbes”, 2012, Brussels, Belgium.

6) Lavysh D., Severinov K. “Identification of promoter sequences in the genome of phiEco32like bacteriophage 7-11”. FEMS Congress'13, 2013, Leipzig, Germany.