На правах рукописи

КОНЬКОВА Елена Петровна

ВЛИЯНИЕ РАСТВОРИТЕЛЯ НА СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

КОЛЛАГЕНА И НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДА

Специальность 01.04.17 – Химическая физика, горение и взрыв,

физика экстремальных состояний вещества

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Волгоград 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный университет»

Научный руководитель – доктор физико-математических наук, профессор Аникеев Борис Васильевич.

Научный консультант доктор физико-математических наук, профессор Белоненко Михаил Борисович.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, доцент Бабкин Владимир Александрович, профессор кафедры математических и естественно-научных дисциплин ФГБОУ ВПО «Волгоградский государственный архитектурно-строительный университет»

Себряковский филиал;

кандидат физико-математических наук, доцент Сыродоев Геннадий Алексеевич, доцент кафедры общей физики ФГБОУ ВПО «Волгоградский государственный социально-педагогический университет».

Ведущая организация Санкт-Петербургский государственный национальный университет Информационных Технологий, Механики и Оптики.

Защита состоится «12» октября 2012 года в 1530 часов на заседании диссертационного совета Д 212.029.08 при Волгоградском государственном университете по адресу: 400062, г. Волгоград, ул. Богданова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Волгоградский государственный университет».

Автореферат разослан «_» сентября 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук В.А. Михайлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Развитие патологического процесса сопровождается изменением содержания всегда присутствующих в биоткани флуорохромов: коллагена, никотинамидадениндинуклеотида и флавинадениндинуклеотида. Коллаген является структурным белком биоткани. Коферменты никотинадениндинуклеотид и флавинадениндинуклеотид участвуют в обеспечении клетки энергией. Все клеточные процессы протекают в присутствии воды, естественного растворителя биоткани. Исследование спектральных свойств данных флуорохромов в воде, чье содержание меняется в процессе жизнедеятельности клеток, имеет фундаментальное значение, являясь частью общей проблемы биологического действия слабых физико-химических факторов.

Цель работы исследование влияния флуктуаций молекул воды на УФвидимые спектры коллагена и никотинамидадениндинуклеотида.

Научная новизна:

1. Конфигурационное уширение первого синглетного перехода у фенилаланила (~20нм), пролила (~30нм) и гистидила (~40нм) проявляется слабее, чем у глицила (~100нм), глутамила (~100нм) и метионила (~120нм).

2. Увеличение полярности фенилаланила, пролила, гистидила, глицила, глутамила и метионила приводит к батохромным сдвигам их первых синглетных преходов.

3. В результате понижения порядка связи с атомом азота пиридинильного кольца у никотинамида исчезает поглощение в области 260нм и появляется поглощение в области 340нм.

4. Флуктуационное движение молекул воды в ближайшем окружении комплекса “аденин-восстановленный никотинамид” приводит к изменению энергий нижних электронных состояний аденина и восстановленного никотинамида и делокализации возбуждения между ними.

5. Разложение спектра флуоресценции биоткани по истинным контурам флуоресценции коллагена, никотинамидадениндинуклеотида восстановленного и флавинадениндинуклеотида позволяет учесть немонотонный характер их флуоресценции и избежать неоднозначности, возникающей при использовании их натурных контуров.

Достоверность. Исходя из главных физических принципов, ограничений и допущений квантовой химии, путем собственных численных экспериментов и анализа данных независимых исследований устанавливались границы применения конкретного квантово-химического метода, оценивалась погрешность проводимых расчетов. Выявлялись условия, при которых простые подходы обеспечивают правильный результат, и случаи, требующие перехода к более высокому уровню приближения. Формировалось знание того, какие параметры и каких молекул следует вычислять конкретным методом. В итоге выбор моделей, приближений, задание исходных данных в численных экспериментах осуществлены на основе понимания достоинств и недостатков использованных методов. Для полученных численных результатов проведены широкая апробация, критическое соотнесение с результатами имеющихся натурных экспериментов и известными литературными данными.

Научная и практическая значимость. Решена задача по повышению уровня достоверности спектральных исследований биоткани, имеющая существенное значение для флуоресцентной диагностики.

Положения, выносимые на защиту:

1. Доминирующие в комплексе “аденин-восстановленный никотинамид” силы имеют ван-дер-ваальсову природу.

2. Безызлучательный перенос энергии возбуждения в комплексе осуществляется по индуктивно-резонансному механизму.

3. В молекуле никотинамидадениндинуклеотида возможно существование направленного синглет-синглетного переноса энергии возбуждения от аденина к восстановленному никотинамиду.

Апробация результатов проведена на международных конференциях: «SFM»

(Саратов, 2006, 2009); «Лазеры. Измерения. Информация» (Санкт-Петербург, 20092010); «Лазерно-информационные технологии в медицине, биологии и геоэкологии» (Новороссийск, 20092010); «Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии» (Москва, 2010); «Современные проблемы молекулярной биофизики» (Санкт-Петербург, 2011).

Личный вклад автора. Выбор направления исследования определялся совместно с научным руководителем. Результаты получены автором лично. Анализ и интерпретация результатов осуществлялись совместно с научным руководителем и консультантом. Положения диссертации опубликованы автором лично и в соавторстве.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, 64 рисунка и состоит из введения, четырех глав, заключения, списка использованной отечественной и иностранной литературы, включающего 115 наименований.

Публикации. Основные результаты и выводы диссертации изложены в статьях отечественных изданий из перечня ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение кратко информирует о причинах, основных этапах и результатах проведенного научного поиска.

В первой главе «Объект и методы исследования» представлены сведения об объекте исследования и использованных квантово-химических методах.

Вторая глава «Спектр поглощения коллагена в присутствии воды» посвящена исследованию спектральных характеристик коллагена в присутствии воды.

структурных единиц, субъединиц, сохраняющих ее основные свойства, является общепринятым приемом. В настоящей работе данный прием предлагается для исследования спектральных характеристик белка в естественных условиях водного окружения.

Рис. 1. Электронный спектр поглощения для стандартных методов точности обеспечивается массовость применения и максиодиночной молекулы коллагена (сверху) и первые синглетные переходы остатков (снизу) с учетом кратности возможных затратах времени и ресурсов МО ЛКАО методы изначально исходят из делокализованной природы молекулярных орбиталей, поэтому разумным критерием фрагментации органических молекул представляется сохранение целостности структур сопряженных углеводородов: исключается перекос в сторону переоценки эффекта локализации и недоучета делокализации. С учетом сказанного электронный спектр поглощения коллагена представлялся суперпозицией рассчитанных в неэмпирическом приближении электронных спектров аминокислотных остатков с учетом кратности их повторения в составе макромолекулы. В полуэмпирическом приближении рассчитаны (рис. 1) вероятности и длины волн первых синглетных переходов остатков. Из рис.

1 видно, что наиболее вероятные переходы в УФ-видимой области принадлежат фенилаланилу, пролилу, гистидилу, глицилу, глутамилу и метионилу, вследствие чего они являются преимущественно определяющими флуоресцентные свойства коллагена, спектрально значимыми. Поскольку в результате естественного отбора сохранились структуры оптимальные для выполнения своих специфических функций, можно ставить вопрос о биологическом смысле данных остатков. При решении прикладных задач, представляющих научный интерес для создания новых технологий в медицине, важно проследить тенденции формирования спектра макромолекулы коллагена в зависимости от водного окружения каждого спектрально значимого остатка и выявить взаимосвязь: геометрия спектроскопические характеристики физиологические функции. В полуэмпирическом приближении рассчитаны (рис. 2) длины волн первых синглетных переходов значимых остатков в растворе с различной концентрацией. В результате локальных флуктуаций формируются различные конфигурации водного окружения остатка, вследствие чего наблюдается конфигурационное уширение, которое характеризуется среднеквадратичным отклонением длины волны от усредненного по конфигурациям значения. Из рис. 2 видно, что конфигурационное уширение первого синглетного перехода у фенилаланила (~20нм), пролила (~30нм) и гистидила (~40нм) проявляется слабее, чем у глицила (~100нм), глутамила (~100нм) и метионила (~120нм).

Рис. 2. Зависимости длин волн первых синглетных переходов: глицила, метионила, глутамила (слева); пролила, гистидила, фенилаланила (справа) от концентрации раствора Объясняется данный факт следующим образом. При наличии в структуре растворенной молекулы цикла, определяющего *переходы в УФ-видимой области, внутри цикла, в отличие от линейной молекулы, имеется область пространства, не доступная для молекул растворителя. Таким образом, меньшее влияние растворителя на фенилаланил, пролил и гистидил обусловлено присутствием циклов в их структуре, в отличие от глицила, глутамила и метионила. Изменение конфигурации молекул воды влечет изменение в и метионила приводит к батохромным сдвигам их первых синглетных переходов. Переход электрона на более высокий уровень при поглощении есть отдаление части отрицательного заряда в общем нейтральной молекулы остатка от положительного. Очевидно, что при большем пространственном поглощаемой энергии. Таким образом, длиРис. 3. Аппроксимация зависимостей ны волн первых синглетных переходов федипольного момента и длины волны нилаланила, пролила, гистидила, глицила, первого синглетного перехода глицила от концентрации раствора В третьей главе «Спектр поглощения восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида в присутствии воды» исследуются спектральные характеристики никотинамидадениндинуклеотида восстановленного. Имеющие более двух сопряженных двойных связей молекулы поглощают в области 260нм. Численный эксперимент показал, что в результате понижения порядка связи с атомом азота пиридинильного кольца у никотинамида исчезает поглощение в области 260нм и появляется поглощение в области 340нм. Таким образом, наличие или отсутствие двойной связи с атомом азота пиридинильного кольца определяет поглощение никотинамида в ультрафиолетовой или видимой области соответственно. Путем постепенного уменьшения размеров фрагментов никотинамидадениндинуклеотида восстановленного установлено, что его субъединицами в ближней УФ и видимой области являются аденин и восстановленный никотинамид. Ab initio спектр никотинамидадениндинуклеотида восстановленного использовался (рис. 4) для тестирования полуэмпирических спектров субъединиц. Затем полуэмпирическое приближение применялось при расчете спектров сольватированных субъединиц. Моделирование периодических граничных условий соответствовало непрерывным с постоянной плотностью макроскопическим условиям натурного эксперимента. Из рис. 4 видно, что присутствуют обычные для аденина (200, 260 и 270нм) и никотинамида (230 и 260нм) области поглощения. При малых (~10) расстояниях между молекулами большую вероятность приобретает процесс коплексообразования. Характерные переходы никотинамидадениндинуклеотида восстановленного на 291 и 425 нм трактовались как проявление комплексообразования аденина и восстановленного никотинамида. Расчет электронных переходов при правильно обеспечивалось за счет разРис. 4. Сопоставление натурных спектров с рассчитанныличных концентраций. Опми электронными: аденина, никотинамида, восстановлентимальная стратегия чисного никотинамида и никотинамидадениндинуклеотида должна моделировать естественные условия натурного эксперимента. В натурном эксперименте необходимым условием взаимодействия органических молекул является пространственное соответствие. Именно взаимодействие органических молекул с молекулами воды в своем ближайшем окружении, число которых не постоянно, придает им соответствующую форму. Поскольку для комплексования необходимо эффективное расстояние, моделировался достаточно трированный раствор. Наличие общей сольватной оболочки (молекулы воды не проникают между аденином и никотинамидом) свидетельствовало о соблюдении естественных условий. Рибоза и остаток фосфорной кислоты, удерживавшие субъединицы на естественном расстоянии, не включались (рис. 5) в расчет. Взаимное сопоставление полученных в разных полуэмпирических приближениях результатов расчетов позволило выбрать приближение, обеспечившее для характерных переходов наилучшее совпадение с данными ab initio расчета.

образующих его субъединиц от концентрации водного раствора представлены на рис. 6. Для каждой концентрации проводилась минимизация статистическая интерпретация. ПоРис. 5. Периодическая ячейка с никотинами- скольку в натурном эксперименте нададениндинуклеотидом восстановленным при блюдаются усредненные значения, концентрации раствора 50 % (слева) и 51 % конфигурации моделировали непрерывно меняющуюся в естественных условиях форму никотинамидадениндинуклеотида. Вода является полярным растворителем, Рис. 7. Разложение по спектрам НАДН, ФАД, коллаэнергий нижних электронных гена экспериментального спектра флуоресценции обсостояний аденина и восстаразца цервикальной ткани шейки матки при эктопии взаимодействие приводит к переходу электронного возбуждения из одной группы молекул в другую в пределах элементарной ячейки. Аналогично, колебания возбужденного электронного поля аденина воспринимаются восстановленным никотинамидом, что приводит к переносу электронного возбуждения.

вклад флуорофора (% Рис. 8. Вклады коллагена, НАДН и ФАД в спектр флуоресценции цервикальной ткани в зависимости от ее состояния Таким образом, характер зависимости длины волны первого синглетного перехода комплекса “аденин-восстановленный никотинамид” от концентрации водного раствора объясняется экситонной теорией. Перенос обусловлен взаимодействием мгновенных диполей, наведенных за счет колебаний зарядовой плотности в комплексе; безызлучательный (значительные концентрации раствора) перенос энергии возбуждения в комплексе осуществляется по индуктивно-резонансному (электронные облака не перекрываются) механизму и делокализует возбуждение. В результате образуется комплексное возбужденное состояние – экситон. Возбуждение делокализуется между Таблица 1. Отношения вкладов коллагена, НАДН и аденином и восстановленным ФАД в зависимости от состояния цервикальной ткани Кроме того, вероятность направленного переноса энергии от коротковолновых к длинноволновым поглощающим центрам у гетероциклических соединений коррелирует с вероятностями соответствующих электронных переходов. В свою очередь, из рис. 4 видно, что вероятность перехода на 425нм выше, чем на 291нм. Таким образом, в молекуле никотинамидадениндинуклеотида возможно существование направленного синглет-синглетного переноса энергии возбуждения от аденина к восстановленному никотинамиду.

Четвертая глава «Флуоресцентная диагностика биоткани по отношению истинных вкладов коллагена, никотинамидадениндинуклеотида и флавинадениндинуклеотида» демонстрирует возможности приколлаген вклад флуорофора (% Рис. 9. Вклады коллагена, НАДН и ФАД в спектр флуоресценции слизистой оболочки желудка при различных стадиях по- спектр, поскольку криражения вая моделирует только часть, приходящуюся на максимум интенсивности, а данные по максимумам и формам натурных контуров весьма противоречивы. Неоднозначность возникает в результате разной спектральной чувствительности, передаточной функции и разрешающей способности приборов, используемых разными авторами. Разложение спектра флуоресценции биоткани по истинным контурам флуоресценции коллагена, никотинамидадениндинуклеотида восстановленного и флавинадениндинуклеотида позволяет (рис. 7) учесть неТаблица 2. Отношения вкладов коллагена, монотонный характер их флуоресНАДН и ФАД при различных стадиях поражения ценции и избежать неоднозначнослизистой оболочки желудка Степанова. Расчет электронных спектров поглощения являлся первым приближением. Электронно-конфигурационные полосы представлялись в виде гауссовых кривых с шириной 100нм. Таким образом, контуры флуоресценции коллагена, НАДН и ФАД воспроизводились из однозначных аналитических зависимостей, что свидетельствует о корректности решения обратной спектральной задачи. При этом отсутствовала необходимость привлекать дополнительные сведения об объекте, возникающая при использовании натурных контуров, получаемых со случайными ошибками и в различных условиях. Следовательно, найденные истинные контуры флуоресценции коллагена, никотинамидадениндинуклеотида восстановленного и флавинадениндинуклеотида являются (рис. 89) достоверно информативными спектральными характеристиками. Использующая линейную комбинацию истинных контуров коллагена, НАДН и ФАД наилучшая аппроксимация получена для спектров флуоресценции от здоровых и находившихся в состоянии разной степени тяжести цервикальных тканей шейки матки [4], [5] и слизистой оболочки антрального отдела желудка [6]. Выявлены значимые различия отношений интенсивностей флуоресценции коллагена, НАДН и ФАД при рассмотренных состояниях (табл. 12).

В заключении перечислены основные результаты и выводы диссертации:

1. Меньшее влияние растворителя на фенилаланил, пролил и гистидил обусловлено присутствием циклов в их структуре, в отличие от глицила, глутамила и метионила.

2. Длины волн первых синглетных переходов фенилаланила, пролила, гистидила, глицила, глутамила и метионила пропорциональны их дипольным моментам.

3. Наличие или отсутствие двойной связи с атомом азота пиридинильного кольца определяет поглощение никотинамида в ультрафиолетовой или видимой области соответственно.

4. Характер зависимости длины волны первого синглетного перехода комплекса “аденин-восстановленный никотинамид” от концентрации водного раствора объясняется экситонной теорией.

5. Истинные контура флуоресценции коллагена, никотинамидадениндинуклеотида восстановленного и флавинадениндинуклеотида являются достоверно информативными спектральными характеристиками.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. http://chem.donnu.edu.ua/student/methodic/phys_methods/chapter2_2.html 2. Михайловуло К.И., Серченя Т.С., Киселева Е.П. и др. Взаимодействие молекул неоникотиноида имидаклоприда и его структурных аналогов с сывороточным альбумином человека // Журнал прикладной спектроскопии. – 2008. –Т. 75, № 3. http://www.stolaf.edu/people/muth/Appendix%20III.pdf 4. Chernova S.P., Kasimov O.V., Кuznetsova L.M. et al. Ex vivo and phantom fluorescence spectra of human cervical tissue // Proceedings of SPIE. 2000. V. 4001.

P. 290-298.

5. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях.

Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1984.

6. Гираев К.М., Ашурбеков Н.А., Меджидов Р.Т. Стационарная спектроскопия биотканей in vivo: флуоресцентные исследования некоторых патологических состояний // Оптика и спектроскопия. 2003. Т. 95, № 5. С. 874.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Конькова, Е.П. Уширение и сдвиг длинноволновой полосы поглощения аминокислот в полярном растворителе / Е.П. Конькова, Р.Ш. Затрудина // Вестник СПбГУ. Сер. 4. Физика. Химия. – 2011. – Вып. 4. – С. 139144.

2. Конькова, Е.П. Пофрагментный метод в теории электронных спектров растворов биополимеров / Р.Ш. Затрудина, Е.П. Конькова // Химическая физика и мезоскопия. – 2011. – Т. 13, № 4. – С. 577586.

3. Конькова, Е.П. Влияние воды на проявление внутримолекулярных взаимодействий в молекуле NADH / Е.П. Конькова, Р.Ш. Затрудина // Вестник СПбГУ.

Сер. 4. Физика. Химия. – 2011. – Вып. 4. – С. 145151.

4. Конькова, Е.П. Спектр поглощения NADH как суперпозиция спектров аденина и никотинамида / Б.В. Аникеев, Р.Ш. Затрудина, Е.П. Конькова // Химическая физика и мезоскопия. – 2011. – Т. 13, № 3. – С. 425431.

5. Конькова, Е.П. Спектр поглощения НАДН по данным эксперимента и квантово-химического расчета / Е.П. Конькова // Научно-технический вестник СПбГУ ИТМО. – 2011. – Т. 76, Вып. 6. – С. 8892.

6. Конькова, Е.П. Перенос энергии в молекуле НАДН / Е.П. Конькова, М.Б. Белоненко // Наносистемы: физика, химия, математика – 2012. – Т. 3, № 3. – С.