На правах рукописи

Гула Елена Александровна

ИНТЕНСИВНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗИНА С

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МУТАНТНОГО ШТАММА Lactococcus lactis.

Специальность: 03.00.23 – «Биотехнология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2009 1

Работа выполнена в Московском государственном университете инженерной экологии (МГУИЭ) на кафедре «Экологическая и промышленная биотехнология»

Научный руководитель: -Сергеева Алла Владимировна, кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: -Авчиева Пенкер Бабаевна, доктор технических наук, профессор -Складнев Дмитрий Анатольевич, доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: ОАО «Государственный Научный Центр по Антибиотикам»

Защита состоится 14 апреля 2009 года на заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им.Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., д.9, ауд.443.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им.Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан « 11 » марта 2009г.

Ученый секретарь Диссертационного совета ДМ 212.204. кандидат технических наук И.В.Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Бактериоцин низин, продуцируемый определенными штаммами молочнокислых бактерий Lactococcus lactis, широко используется как биологический консервант в пищевой промышленности во многих странах, включая страны ЕС, и обладает статусом GRAS - как безопасный консервант. В настоящее время существуют три крупных производителя низина: Aplin & Barrett Ltd. (Beaminster, Doset, Великобритания), производящий продукт НизаплинR, Chr. Hansen A/S (Hoersholm, Дания), производящий КризинR и Silver elephant (Китай).

Потребность в низине растет пропорционально мировому продовольственному рынку. В настоящее время в России потребление низина составляет 3-4 т/год, и потребности в нем постоянно растут. Все это свидетельствует о динамично развивающемся рынке сбыта природных консервантов и, в частности, низина.

Низин обладает достаточно высокой стоимостью, поэтому вопрос о снижении затрат на его производство имеет значительный коммерческий интерес. В связи с этим селекция высокопродуктивных штаммов-продуцентов низина, модернизация технологического процесса, удешевление сырья и улучшение технико-экономических показателей процесса получения биоконсерванта являются актуальными.

Цель работы Целью работы является получение штамма Lactococcus lactis subsp. lactis – продуцента низина, обладающего повышенной продуктивностью, а также усовершенствование технологии производства этого бактериоцина.

Основные задачи:

- на основе штамма L.lactis subsp. lactis (№ патента: 2151796) получить мутантный штамм с повышенной способностью к низинобразованию;

- произвести сравнительную характеристику мутантного и исходного штаммов культуры L.lactis subsp. lactis по физиологическим и биохимическим признакам;

- оптимизировать состав ферментационной среды для выращивания МКБ путем замены сухого обезжиренного молока на соевую муку, в качестве альтернативного более дешевого белкового субстрата;

- оптимизировать процесс приготовления ферментационной среды для выращивания МКБ с целью повышения выхода целевого продукта и сокращения времени, затрачиваемого на ультрафильтрацию в условиях промышленного производства низина.

- определены условия поддержания штамма в продуктивном состоянии в течение длительного времени;

- впервые получен оригинальный штамм Lactococcus lactis subsp. lactis BcrR75, устойчивый к антибиотику бацитрацину (BcrR-20мкг/мл), характеризующийся повышенной способностью к низинобразованию и сокращенным временем ферментации;

-показано, что мутация устойчивости к бацитрацину L.lactis привела также к увеличению скоростей потребления лактозы и накопления молочной кислоты, ослаблению эффекта катаболитной репрессии, повышению устойчивости мутантного штамма к окислительному стрессу.

- разработан способ подготовки альтернативной среды для выращивания L.lactis, содержащей протеолизат соевой муки, при котором сокращается время приготовления среды и обогащается состав среды необходимыми культуре питательными компонентами;

Практическая значимость:

- подобрана альтернативная среда для выращивания L.lactis, содержащая гидролизат соевой муки, что позволяет избежать использования дорогостоящего пищевого сырья – молока, и, следовательно, снизить стоимость питательной среды в 4 раза;

- предложены новые условия фильтрации питательной среды на стадии осветления, который приводит к сокращению времени фильтрации в 1,5 раза и увеличению выхода низина на 26%, за счет дополнительного обогащения питательной среды пептидами;

- полученный штамм L.lactis subsp. lactis BcrR75 в настоящее время используется в промышленном производстве низина на ООО «Фирма «МАКОФАРМ» в г.Лотошино.

Себестоимость продукта от использования предложенного штамма в технологии получения низина снизилась на 27%.

Апробация работы:

Результаты диссертации докладывались: на 10 и 11-ой Пущинской школеконференции молодых ученых: Биотехнология-наука XXI века, г.Пущино, 2006, 2007гг.; на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ, Москва, 2007г., на научной конференции студентов и молодых ученых МГИЭ, Москва, 2008г.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы:

Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты экспериментов и их обсуждение, описание технологии производства низина, экономическую оценку технологии низина, выводы, список литературы. Диссертация изложена на 133 страницах, содержит 24 таблицы и 28 рисунков. Список литературы включает 199 наименований.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы положения, выносимые на защиту, научная новизна, сведения о личном вкладе соискателя.

В обзоре литературы рассмотрены биогенез и основные свойства бактериоцина низина А. Описан метаболизм и физиологические аспекты биосинтеза низина А. Отражены пути метаболизма углеводов и катаболитной репрессии в клетках Lactococcus lactis. Обобщены и проанализированы работы, в которых отмечалось, что культуры, устойчивые к полипептидному антибиотику бацитрацину, обладают повышенным уровнем биосинтеза. Обобщены патентные данные о производстве низина в России и за рубежом. Анализ литературных данных позволил сформулировать задачи данного исследования.

Объектом исследования являлись штаммы Lactococcus lactis subsp.lactis ВКПМ В-7699 (патент 2151796, РФ, 1999) и полученные на его основе мутанты. Глубинное культивирование проводили в качалочных колбах объемом 250 мл (50 мл среды) на ротационных качалках (220-250 об/мин) и в лабораторном ферментере «Biotech» с системой термо- и рН-статирования, объемом 4 л (мешалка турбинного типа, об/мин), при температуре 30±1°С. По окончании ферментации количество низина в культуральной жидкости определяли методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus coagulans ВСБ 15-204. В качестве стандарта использовали импортные препараты «Низаплин» и «Кризин». Определение редуцирующих веществ проводили методом Бертрана и методом ТСХ. Аминокислотный анализ проводили с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель 105» (фирма «Люмекс»). Все экспериментальные исследования проведены не менее чем в трех повторностях. Для статистической оценки результатов использовали расчет дисперсии воспроизводимости относительного отклонения величины, усредненной по большому массиву экспериментов, расчет доверительных интервалов средних значений и разницы двух значений.

Проведена работа по подбору защитной среды для хранения молочнокислых бактерий-продуцентов низина. В результате проведенных исследований из нескольких вариантов сред была выбрана среда для определения молочнокислых микроорганизмов MRS+глицерин, при хранении на которой при -18°С культура сохраняла жизнеспособность и способность к образованию низина в течение года. Результаты по уровню низинобразования и жизнеспособности глубинных культур при хранении в замороженном состоянии представлены в табл.1.

Низинобразующая способность и уровень выживаемости клеток ность, % от контроля Таким образом, среда MRS+глицерин позволяет поддерживать культуры L.lactis – продуценты низина в замороженном виде длительное время, значительно снижая количество пересевов, риск инфицирования, трудоемкость при проведении селекционных работ в больших объемах.

3.2. Получение нового высокопродуктивного штамма.

Одним из приемов повышения эффективности экспорта целевого продукта из клетки является селекция продуцента на устойчивость к веществу, структурнородственному целевому продукту и удаляемому из клетки схожей системой иммунитета. Наше внимание привлекла работа, в которой говорилось, что экспорт пептидного антибиотика бацитрацина, образуемого Bacillus licheniformis, осуществляется АВСтранспортером, и амплификация генов, кодирующих этот транспортер, ведет к повышению биосинтеза бацитрацина.

Отбор устойчивых к бацитрацину вариантов L.lactis проводили на агаризованной среде М17 с добавлением нарастающих концентраций бацитрацина (AppliChem) 4, 8, 12, и 16 мкг/мл. Варианты, выросшие на среде с 16 мкг/мл бацитрацина, имели ослабленный рост и слабую способность к синтезу низина. Варианты, устойчивые к 4- мкг/мл бацитрацина были повторно пассированы через моноклоновый рассев с проверкой на устойчивость к бацитрацину. Устойчивые варианты (100 клонов) хранили при -18°С на среде MRS+глицерин.

В результате были отобраны 4 варианта, показавшие наибольшую активность, по сравнению с исходным штаммом и сохраняющие устойчивость к бацитрацину, по крайней мере, в 5 поколениях. Активность этих вариантов представлена на рис.1.

Характеристика исходного штамма и полученных мутантов Также была изучена изменчивость этих вариантов по признаку низинобразования (рис. 2 и табл. 2). Вариант №75 обладал большей активностью по сравнению с другими вариантами (табл.2), что объясняется преобладанием в популяции этого варианта Активность низина, % от контроля на у исходного штамма L.lactis (К) и BcrR-мутантов при культиСравнение ферментационных характеривировании в колбах (среда ФС).

вариантов, % Рис. 2. Изменчивость мутантов (клов то время как у исходного штамма максимум нов) по уровню низинобразования, (в % к уровню низина в контроле). биосинтеза наступил только к 20 часу. В период между 8 и 16 часами ферментации скорость потребления лактозы и скорость титрования (отражающего степень образования лактата) в культуре мутанта 75 выше, чем в культуре исходного штамма.

Активность, МЕ/мл Скорость расхода NaOH, Проведена повторная проверка чувствительности мутанта 75 к бацитрацину.

Мутант 75 хранился при -18°С на среде с глицерином в течение 8 месяцев. В качестве контроля использовался исходный штамм. Проверка осуществлялась путем высева культур на чашки Петри на твердую агаризованную среду MRS без и с содержанием бацитрацина 10 и 20мкг/мл. Чашки Петри инкубировали при 30°С в течение 48 часов.

По количеству выросших колоний судили о чувствительности культуры к данному антибиотику. Результаты представлены в таблице 3.

Из полученных результатов видно, что мутант 75 сохранил свою устойчивость к бацитрацину, что является важным признаком для подтверждения его в качестве самостоятельного штамма.

Среды Без бацитрацина С целью выявления новых физиологических различий между исходным штаммом и мутантом 75 было изучено влияние Н2О2 на их жизнеспособность. Впервые обнаружено, что в результате мутации резистентности к бацитрацину повышалась устойчивость штамма BcrR75 к окислительному стрессу – явление ранее не описанное для микроорганизмов, устойчивых к бацитрацину. Если на среде с Н2О2 титр мутанта 75 составлял около 5х108 КОЕ/мл, то титр исходного штамма - около 2х103 КОЕ/мл.

3.3.4. Биосинтез низина при утилизации различных углеводов При культивировании в среде ФС лактококки в качестве основного источника углерода и энергии используют лактозу. Чтобы выяснить зависимость продуктивности мутанта 75 от различных углеводных субстратов, было проведено культивирование продуцентов в колбах на модифицированной среде MRS, содержащей разные углеводы в концентрации 2%. Результаты этих опытов представлены в таблице 4.

Повышенная продуктивность мутанта 75 проявилась при утилизации всех испытанных углеводов. Однако, если при потреблении мальтозы, декстрина, сахарозы, лактозы и галактозы активность низина в культуре мутанта превышала таковую в культуре исходного штамма на ~50%, то при утилизации глюкозы она была выше на 74 %, чем в культуре исходного штамма.

Известно, что глюкоза оказывает репрессирующее действие не только на утилизацию других углеводов, но и на биосинтез вторичных метаболитов, в том числе и антибиотиков. В связи с этим возникло предположение, что эффект катаболитной (глюкозной) репрессии (КР) ослаблен у мутанта 75 в большей степени, чем у исходного штамма, с чем и связана, по крайней мере, частично, его повышенная продуктивность.

Чтобы убедиться в этом, были проведены эксперименты с целью определения чувствительности роста продуцентов к 2-деоксиглюкозе (2-DOG), аналогу глюкозы, и влияния глюкозы на потребление другого углевода, подверженного катаболитной репрессии. Изучение влияния 2-DOG на рост исходного штамма в среде MRS с глюкозой выявило еще одно различие между этими культурами. В лог-фазе роста мутант проявил большую резистентность к 2-DOG (2 мкг/мл), чем исходный штамм. Чувствительность к 2-DOG оценивали по значениям оптической плотности суспензии клеток, растущих в среде без и с 2-DOG (таблица 5).

Оптическая плотность суспензий клеток исходного штамма и мутанта Косвенно это указывает на нарушение фосфоенолпируват-транспортной системы переноса глюкозы. В случае этого нарушения у мутанта 75 должен измениться и эффект КР. Чтобы проверить это был получен мутант (из исходного штамма), устойчивый к 2-DOG (мутант DOGR). В качестве углевода, утилизация которого подвержена эффекту КР, была выбрана рибоза, четко разделяемая от глюкозы, что облегчает количественное определение этих сахаров методом ТСХ. При росте исходного штамма, мутанта 75 и мутанта DOGR в среде MRS с глюкозой (0,5%) и рибозой (0,5%) потребление рибозы в лог-фазе активнее в культуре мутанта 75, чем в культуре исходного штамма, а в культуре мутанта DOGR активнее, чем культуре мутанта 75 (табл. 6).

Интенсивность потребления глюкозы, напротив, слабее в культуре мутантов, чем у исходного штамма.

Потребление сахаров (рибоза и глюкоза) исходным штаммом и мутантами Штамм, мутант доверительный интервал среднего значения ± 5% Эти данные свидетельствуют об ослаблении КР потребления рибозы, наиболее выраженной в культуре мутанта DOGR.

Исследование динамики процессов роста, потребления глюкозы и накопления низина в культурах исходного штамма и мутанта DOGR в период лог-фазы при ферментации в среде MRS (с 1% глюкозы) показало снижение скорости потребления сахара и скорости роста клеток и повышение продукции низина в культуре мутанта DOGR, по сравнению с культурой исходного штамма (рис. 7, 8 и 9). Удельная продуктивность (МЕ / 1010 КОЕ) в течение 4-часового периода в культуре мутанта выше приблизительно на 80%, чем в культуре исходного штамма (рис.9). Следовательно, ослабление КР сказалось не только на процессах потребления глюкозы и роста, но и специфически на интенсивности биосинтеза низина.

Титр, 10^9 КОЕ/мл Все эти отличительные (от исходного штамма) признаки дают основание считать мутант самостоятельным штаммом L.lactis BcrR 75.

По ранее разработанной технологии продуцент низина выращивали на молочной гидролизованной ферментационной среде, отфильтрованной на ультрафильтрах с диаметром пор 15кДа.

На данном этапе было исследовано влияние условий фильтрации ферментационной среды (различный диаметр пор ультра- и микрофильтра) на биосинтез низина.

Испытывали четыре варианта ферментационных сред:

1. Нативная без фильтрации 2. Отфильтрованная на ультрафильтрах с диаметром пор 15 кДа 3. Отфильтрованная на ультрафильтрах с диаметром пор 50 кДа 4. Отфильтрованная на микрофильтрах с диаметром пор 0,14мкм Ферментации проводили в 4-х литровом ферментере «Biotech» с системой термо- и рН статирования при 30°С и рН=6,8. Объем посевного материала составлял 10% от объема ферментационной среды. После проведения ферментации культуральную жидкость (КЖ) фильтровали на микрофильтрах с размером пор 0,14мкм и определяли активность низина. Результаты представлены в таблице 7.

Технологические параметры 3-х режимов осветления среды культивирования,% от контроля доверительный интервал среднего значения ± 8% При ферментации на среде без фильтрации и на среде, осветленной на фильтрах с диаметром пор 0,14мкм, биосинтез низина выше на 26 и 25%, соответственно, чем на среде, осветленной на фильтрах с диаметром пор 15 кДа (контрольная среда). Но скорость микрофильтрации неосветленной КЖ на 29% ниже, чем контрольной. В то же время, скорости микрофильтраций контрольной КЖ и КЖ после очистки на фильтрах 50кДа и 0,14мкм сопоставимы между собой. Следовательно, использование среды, отфильтрованной на микрофильтрах с диаметром пор 0,14мкм в качестве ферментационной более эффективно для биосинтеза низина, чем на среде, осветленной на фильтрах 15кДа, без существенного ухудшения скорости микрофильтрации КЖ.

В дальнейших исследованиях для фильтрации ферментационной среды использовали фильтры с диаметром пор 50кДа и 0,14мкм.

3.4.2. Оптимизация ферментационной среды по составу В последние годы в связи с резким сокращением поголовья коров, в стране на продовольственном рынке наблюдается дефицит молока. В связи с этим цены на молоко возросли в несколько раз, что привело к существенному повышению себестоимости биоконсерванта. Для того чтобы исключить использование пищевого сырья (молоко) при культивировании L.lactis мы попытались заменить гидролизат молока на гидролизат соевой муки. Предварительные исследования показали, что по составу незаменимых аминокислот, необходимых для роста лактобактерий и биосинтеза низина, соевая мука близка к молоку, при этом ее стоимость в 4 раза ниже.

На первом этапе испытывали гидролизат соевой муки и режимы гидролиза:

продолжительность гидролиза различными протеолитическими ферментами.

В состав опытной среды входили соевая мука (4%) и сыворотка (4%). Контрольная среда содержала молоко – 3% и сыворотку – 4%.

Гидролиз среды с соевой мукой осуществляли при 55°С протеолитическими ферментами алкалазой, нейтразой и протосубтилином в рекомендуемых дозах в течение 1, 2.5 и 4 часов. Результаты биосинтеза низина при использовании гидролизованных сред приведены в таблице 8.

Биосинтез низина на гидролизованных средах с соевой мукой.

Гидролиз соевой муки алкалазой оказался наименее эффективным для биосинтеза низина. Приближенные к контролю результаты были получены при использовании протеолитических ферментов нейтразы и протосубтилина. С учетом стоимости ферментов наилучшим вариантом можно считать гидролиз протосубтилином. Продолжительность гидролиза протосубтилином достаточна в течение 1 часа.

Дальнейшая работа по оптимизации условий гидролиза включала изучение влияния количества протосубтилина, температуры и продолжительности гидролиза для среды, состава: соевая мука – 4%, сыворотка – 4%, фермент протосубтилин. Результаты опыта представлены в таблице 9. Наибольшая активность низина наблюдается при культивировании в среде, протеолиз которой осуществляли протосубтилином в концентрации 0,84%, в течение 1часа и температуре 40°С.

Оптимизация стадии протеолиза питательной среды по признаку низинобразования Кол-во фермента, Температура Время гидролиза, Активность низина, На следующем этапе была проведена работа по подбору оптимальной концентрации сыворотки в ферментационной среде. Испытывали следующие варианты сред (таблица 10):

Варианты ферментационных сред при варьировании компонента «сыворотка»

Ферментацию проводили в качалочных колбах. Результаты опыта представлены на рис.10. Наибольшая активность низина наблюдалась при ферментации на среде, содержащей 4% соевой муки и 4% сыворотки.

% от контроля Рис.10. Биосинтез низина в средах с различной концентрацией сыворотки Варианты ферментационных сред при варьировании компонента «соевая мука»

Был проанализирован аминокислотный состав опытной среды, содержащей 4% соевой муки и 4% сыворотки и контрольной среды, содержащей 3% сухого обезжиренного молока.

Активность низина, % от контроля Рис.11. Биосинтез низина в средах с различной концентрацией соевой муки Аминокислотный состав ферментационных сред на основе молока и соевой муки Далее было испытано влияние условий фильтрации питательной среды, содержащей соевую муку (с использованием фильтров с диаметром пор 50кДа и 0,14мкм) на биосинтез низина. Ферментация проводилась в качалочных колбах. Результаты опыта представлены на рис.12 и в таблице 13.

Биосинтез низина в контрольной и альтернативной ФС Ферментационная среда Вид фильтрации Активность низина, МЕ/мл Активность низина, % от контроля Рис.12 Биосинтез низина в контрольФИЛЬТРАЦИЯ 0,14 мкм ной (молочной) () и альтернативной () ферментационных средах Значительное снижение активности наблюдается при ферментации в гидролизате соевой муки, осветленного на фильтрах с диаметром пор 50кДа.

Это может объясняться менее интенсивным гидролизом соевого белка протосубтилином, нежели молочного белка алкалазой.

В таблице14 показан состав альтернативной питательной среды для культивирования Lactococcus lactis и продукции низина.

В настоящее время на заводе в г.Лотошино проводятся ферментации с использованием мутанта 75 и предложенной технологии приготовления ферментационной среды для культивирования продуцента низина. Данные нововведения позволяют улучшить технологические показатели процесса и повысить выход конечного продукта по сравнению с используемой ранее технологией.

Экономическая оценка себестоимости низина при использовании в производстве мутанта 75 и предложенной альтернативной среды представлены в таблицах 15 и 16.

Экономический эффект при использовании мутантного штамма L.lactis BcrR Себестоимость продукции, руб/кг При использовании мутанта BcrR75 себестоимость препарата «БИЗИН 1000»

снижается на 27%.

Экономический эффект при использовании предложенной альтернативной среды для культивирования мутантного штамма L.lactis BcrR При замене сухого молока (3%) на соевую муку (4%) и фермента алкалазы (0,1%) на протосубтилин (0,84%) себестоимость препарата «БИЗИН 1000» снижается на 13%.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Предложены защитная среда и условия для длительного хранения молочнокислых бактерий-продуцентов низина, при которых культура сохраняет свои биосинтетические способности в течение 12 месяцев.

Впервые получен мутантный штамм Lactococcus lactis BcrR, резистентный к 20мкг бацитрацина, с уровнем низинообразования на 40% выше по сравнению с исходным штаммом и меньшей продолжительностью ферментации.

3. Установлено, что мутация устойчивости к бацитрацину L.lactis привела к повышению продукции низина А, увеличению скорости роста, увеличению скоростей потребления лактозы и накопления молочной кислоты, ослаблению эффекта катаболитной репрессии, повышению устойчивости к окислительному стрессу.

4. Предложены новые условия подготовки ферментационной среды для выращивания L.lactis. При использовании на стадии фильтрации среды микрофильтров 0,14мкм вместо ультрафильтров 15кДа скорость фильтрации увеличивается в 1,5 раза, а выход низина увеличивается на 27%.

5. Предложен альтернативный вариант питательной среды для выращивания L.lactis, при использовании которой себестоимость единицы продукции снижается на 13%.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гула, Е.А. Среда для поддержания и длительного хранения молочнокислых бактерий Lactococcus lactis – продуцентов низина / Е.А. Гула, А.В. Сергеева, Н.И.

Кудрина, Е.Ю. Попова // Биология – наука XXI века: сб. тезисов 10-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. – 2006. –С.336.

2. Гула, Е.А. Подбор среды для поддержания и длительного хранения молочнокислых бактерий Lactococcus lactis – продуцентов низина / Е.А. Гула, Е.И. Мельникова, Н.И. Кудрина, Л.П. Минаева, А.В. Сергеева // Сборник научных трудов МГУИЭ:

Вып.3. – 2006. – С. 131-136.

3. Гула, Е.А. Увеличение продукции низина путем активации транспорта полипептидного лантибиотика из микробной клетки у мутантов Lactococcus lactis / Е.А.

Гула, А.В. Сергеева, Л.П. Минаева, В.В. Бирюков // Биология – наука XXI века: сб. тезисов 11-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. – 2007.

–С.194.

4. Гула, Е.А. Генетическая модификация штамма Lactococcus lactis с целью получения суперпродуцента биоконсерванта низина / Е.А. Гула, А.В. Сергеева // Всероссийская выставка научно-технического творчества молодежи НТТМ: сборник научных докладов. – 2007. –С.255-257.

5. Гула, Е.А. Генетическая модификация штамма Lactococcus lactis для промышленного получения бактериоцина низина / Е.А. Гула, А.В. Сергеева // Научная конференция студентов и молодых ученых МГУИЭ 2008. – 2008. – С. 35.

6. Гула, Е.А. Мембранные технологии получения биоконсерванта низина / Е.А.

Гула, А.В. Сергеева // Доклады молодых ученых и студентов МГУИЭ. – 2008. – С. 35.

7. Гула, Е.А. Низин - природный консервант / Е.А. Гула, А.В. Сергеева, В.В.Бирюков // Масложировая промышленность. – 2009. - № 1. – С. 24-25.