На правах рукописи

Майорова Татьяна Дмитриевна

ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННАЯ ДИНАМИКА

НЕЙРОМЕДИАТОРНЫХ ВЕЩЕСТВ

И РАЗВИТИЕ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ В ОНТОГЕНЕЗЕ

СТРЕКАЮЩИХ

03.02.04 – зоология

03.03.05 – биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

Работа выполнена на кафедре эмбриологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук Мелехова Ольга Петровна

Научный консультант: кандидат биологических наук Косевич Игорь Арнольдович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Воронежская Елена Евгеньевна ФГБУН Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН кандидат биологических наук Краус Юлия Александровна кафедра биологической эволюции биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова

Ведущая организация: ФГБУН Зоологический институт РАН

Защита диссертации состоится 14 октября в 15.30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.20 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет, ауд. М-1.

Факс: 8(495)939-43-09, e-mail: [email protected]

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ им М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан сентября 2013 г.

Учный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.Б. Солдатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Тип Стрекающие (Cnidaria) характеризуется наиболее примитивной нервной системой среди Истинных Многоклеточных.

Простота тканевой организации стрекающих позволяет предположить, что эти животные сохранили в себе черты, присущие предковым формам. Вместе с тем для ныне живущих представителей отмечено значительное Cnidaria разнообразие строения и широкий спектр функций нервной системы. Динамика организации нервной системы в течение онтогенеза стрекающих представляет особый интерес, поскольку большинство представителей этого типа характеризуются сложным жизненным циклом, включающим закономерное чередование бесполого и полового размножения (полипоидную и медузоидную стадии, соответственно). Таким образом, исследование закономерностей формирования нервной системы в онтогенезе стрекающих является актуальным направлением современной биологии развития низших многоклеточных.

Наиболее изученными классами стрекающих являются Hydrozoa (гидроидные) и Anthozoa (кораллы), в то время как классу Scyphozoa (сцифоидные) было уделено значительно меньше внимания. Исследование нервной системы стрекающих минимально охватывает представителей класса сцифоидных, так же как и представителей отряда Thecaphora класса гидроидных. Эмбриональное и личиночное развитие стрекающих, включая проблему дифференцировки клеток в ходе эмбриогенеза, также долгое время оставалось в тени. Учитывая это, в настоящей работе были изучены стадии жизненного цикла, в том числе стадии раннего развития, представителей классов Scyphozoa и Hydrozoa, включая представителя отряда Thecaphora.

В качестве объектов изучения были выбраны два представителя класса Hydrozoa (Gonothyraea loveni и Cladonema radiatum) и два представителя класса Scyphozoa (Aurelia aurita и Cassiopea andromeda). Эти виды были выбраны таким образом, чтобы особенности их биологии (строение, жизненный цикл, поведение) различались, и, в то же время, являлись типичными для своего отряда или семейства. Особое место в работе занимает сравнение личинок G. loveni и A. aurita как между собой, так и с личинкоподобными почками C. andromeda, являющимися результатом бесполого размножения. Гидроид C. radiatum стал объектом настоящего исследования вследствие особой стратегии активного захвата добычи, что требует хорошо развитых нервной и сократительной систем полипа.

Ранее в нервных клетках стрекающих был обнаружен широкий спектр нейромедиаторов, относящихся к различным классам (Kass-Simon, Pierobon, 2007). Наиболее изученным классом являются нейропептиды семейства RFамидов. Клетки с классическими нейротрансмиттерами выявлены лишь у нескольких видов стрекающих. В настоящей работе показано распределение RFамидов, как классических маркров нервных клеток стрекающих, и серотонина, функции которого изучены у стрекающих в меньшей степени.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в проведении сравнительного анализа развития нервной системы и роли нейромедиаторных веществ (серотонин и RF-амиды) в онтогенезе стрекающих на примере Gonothyraea loveni (Hydrozoa), Cladonema radiatum (Hydrozoa), Aurelia aurita (Scyphozoa) и Cassiopea andromeda (Scyphozoa).

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

Изучить распределение иммунореактивности к нейромедиаторным веществам на определенных стадиях онтогенеза представителей класса Hydrozoa (Cladonema radiatum и Gonothyraea loveni) и Scyphozoa (Aurelia aurita и Cassiopea andromeda).

Проследить динамику развития нервной системы на протяжении жизненного цикла исследуемых видов стрекающих.

Определить принадлежность серотонин- и (FM)RF-амидположительных клеток к тому или иному гистологическому типу.

Выявить функции серотонинэргической системы, е возможную связь с развитием и метаморфозом личинок.

Научная новизна. В работе впервые прослежено пространственновременное распределение серотонина в онтогенезе сцифоидных и гидроидных.

Высказано предположение, что серотонин играет роль в ходе метаморфоза личинки-планулы, а также личинкоподобной почки (при бесполом размножении). Серотонинэргическая нервная система, выявленная у гидрантов Cladonema radiatum, является первым доказательством наличия нейрональных сигналов серотонина у полипов гидроидных. Впервые показано наличие нервных клеток в ценосарке побега колониальных гидроидных на примере Gonothyraea loveni. Впервые описан процесс дифференцировки и усложнения нервной системы в ходе закладки новых элементов колонии (междоузлий) у G. loveni.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты исследования дают наглядное представление о разнообразии организаций нервных систем различных видов стрекающих. Полученные данные позволяют провести сравнительный анализ организации и трансформации нервной системы с другими представителями типа Стрекающие. В разделе материалов и методов подробно изложены методы, выработанные в ходе изучения выбранных объектов и представляющие собой тонкие модификации стандартных протоколов. Следовательно, данные методики могут быть использованы как пропись для дальнейших работ на аналогичных объектах. Исследование представляет собой основу для дальнейшего изучения роли нейромедиаторных веществ у стрекающих. Основные результаты работы будут включены в учебные курсы по эмбриологии и зоологии.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научных семинарах кафедр эмбриологии и зоологии беспозвоночных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; на международном симпозиуме «Эволюция многоклеточности: подходы к изучению со стороны гидры и других низших Metazoa» (Тютцинг, Германия, 2009); на IX ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН «Биохимическая Физика» (Москва, 2009); на ХХII зимней молоджной научной школе ИБХ РАН «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010); на I международных Беккеровских чтениях, (Волгоград, 2010); на III международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2010); на VII международном симпозиуме общества исследователей гидроидных (Порто Чезарио, Италия, 2010); на XI региональной конференции «Проблемы изучения, рационального использования и охраны природных ресурсов Белого моря»

(Санкт-Петербург, 2010); на VII международной конференции молодых учных «Молодость и прогресс биологии» (Львов, Украина, 2011); на международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов»

(Москва, 2011); на Х международной конференции общества нейробиологов беспозвоночных «Простые нервные системы» (Москва, 2012); на конференции, посвящнной 75-летию ББС МГУ «Морская биология, геология, океанология междисциплинарные исследования на морских стационарах» (Москва, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ (5 статей и тезисов), в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура работы. Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы», «Приложение». Список цитированной литературы включает 178 наименований, из которых 168 - на иностранных языках. Работа изложена на 162 страницах, приложение содержит 6 таблиц и 51 рисунок.

Благодарности. Автор выражает глубочайшую благодарность научным руководителям д.б.н. О.П. Мелеховой и к.б.н. И.А. Косевичу за помощь в освоении методик, а также за ценные замечания при выполнении работы и подготовке диссертации. Автор признателен сотрудникам Беломорской биологической станции им. Н.А. Перцова за возможность работы с живым материалом. Особую благодарность автор выражает Т.В. Неретиной и Н.С. Мюге. Автор благодарен Межкафедральной лаборатории электронной микроскопии МГУ; профессору Г. Пликерту (Университет Кльна) за антитела к RF-амиду; профессору Н. Дулину (Университет Чикаго) за техническую помощь; Группе Оптических Методов Исследования ИБР РАН и К.О. Муранову (ИБХФ РАН) за возможность использования конфокальной микроскопии;

сотрудникам ИБР РАН А.С. Микаеляну, Ю.Б. Шмуклеру и другим сотрудникам лаборатории эмбриофизиологии за критическое обсуждение работы;

родственникам и друзьям за всестороннюю поддержку на всех этапах проведения диссертационной работы.

Работа выполнена на оборудовании ЦКП Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ. Работа выполнена при частичной поддержке грантов Министерства образования и науки РФ и Совета по грантам Президента РФ, контрактов с Роснаукой № 02.740.11.0280 и Рособразованием № П1291, а также программы Ведущих научных школ НШ-4456.2010.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. В этом разделе приведены общие данные, касающиеся работы нейронов и нервной системы, с акцентом на организацию нервной системы у беспозвоночных. Дано описание морфологии и гистологии различных стадий жизненного цикла сцифоидных и гидроидных. В заключении приведн обзор имеющихся данных по нервным клеткам у стрекающих (с акцентом на сцифоидных и гидроидных).

Стрекающие являются одной из наиболее просто устроенных групп многоклеточных животных. Их тело состоит из двух однослойных эпителиев:

эпи- и гастродермы, которые являются производными экто- и эндодермы, соответственно. Сцифоидные и гидроидные характеризуются преимущественным развитием эпидермальной нервной системой. В ходе онтогенеза, первые нервные клетки дифференцируются еще в процессе формирования личинки планулы. Как правило, большая часть нервных клеток планул сосредоточена в эктодерме передней половины личинки. В течение метаморфоза личиночная система, как правило, дегенерирует, и по завершению метаморфоза, на полипоидной стадии развития, формируется нервная система полипа (гидранта), отличная от таковой у планулы. Медузоидная стадия развития также характеризуется хорошо развитой нервной системой. В целом, на всех стадиях развития нервную систему гидроидных и сцифоидных можно охарактеризовать как совокупность эпидермальных клеток, несущих длинные нервные отростки. Нервные отростки проходят в основании эпидермы, над мезоглеей, образуя нервное сплетение. Распределение нервных клеток и их отростков, как правило, неравномерно по телу животного.

К настоящему моменту известны общие характеристики нервной системы стрекающих на разных стадиях жизненного цикла. Однако для большинства групп стрекающих детальное строение нервной системы остатся неизученным.

Участие нейропептидов семейства RF-амидов в работе нервной системы было описано для многих стрекающих, в то время как роль серотонина практически не изучена.

Материалы и методы. Сбор и работа с живым материалом были проведены частично на Беломорской биологической станции им. Н.А. Перцова, частично – на основе лабораторных культур на Биологическом факультете МГУ.

Для изучения анатомии и ультраструктуры животных были использованы методы световой и электронной (ТЭМ и СЭМ) микроскопии; подготовку образцов проводили по стандартным методикам.

иммуноцитохимического окрашивания с последующей визуализацией при помощи конфокальной микроскопии. Для окрашивания были использованы флуорохромами TRITC или FITC. Для окрашивания актиновых филаментов использовали фаллоидин-FITC, для окрашивания ядер - DAPI.

Фармакологические эксперименты были проведены с использованием серотонина, его предшественников (триптофана и 5-гидрокситриптофана) и различных блокаторов серотонинэргической системы: имипрамина (блокатор трансмембранного переносчика серотонина, осуществляющего транспорт серотонина извне внутрь клетки), пара-хлорфенилаланина (пХФА, блокатор триптофангидроксилазы, фермента синтеза серотонина), ципрогептадина (блокатор 2 рецепторов серотонина).

Результаты. В данной главе последовательно изложены результаты по каждому исследованному виду. При описании каждого вида результаты упорядочены согласно хронологии онтогенеза. Перед изложением результатов по каждой стадии развития объекта исследования дано краткое описание анатомии этой стадии.

Gonothyraea loveni (Hydrozoa). Зрелые ооциты G. loveni не имели антителами. На ранних стадиях эмбрионального развития у зародышей G. loveni иммуноцитохимически выявлен серотонин. В бластомерах эмбрионов на стадии дробления окрашивание на серотонин носит гранулярный характер (Рис. 1, А). В ходе дробления, иммунореакция становится менее выраженной, и к началу гаструляции бластомеры становятся иммуноотрицательными. После гаструляции начинается процесс формирования личинки. На стадии ранней нейромедиаторные вещества, в то время как у зрелой, компетентной метаморфозу личинки, были обнаружены серотонин-положительные клетки и FMRF-амид-положительные клетки.

Рис 1. Иммуноцитохимическое окрашивание Gonothyraea loveni на стадии дробления (А) и зрелой планулы (Б-Е). А – эмбрион на стадии дробления, окрашивание на серотонин. Б – окрашивание на серотонин, прямоугольником обведн передний полюс планулы, стрелки указывают тела нервных клеток боковой эктодермы. В, Г – окрашивание на FMRF-амид, передняя половина планулы (передний полюс указан стрелкой) и задняя, соответственно. Д, Е – окрашивание на ТТ, передняя половина планулы и задняя, соответственно, стрелки указывают тела нервных клеток. кн – книдоциты.

Оба типа иммуноположительных клеток сконцентрированы в передней части эктодермы, однако отдельные клетки встречаются и в боковой эктодерме.

Тела серотонин-положительных клеток переднего полюса планулы имеют столбчатую форму, в то время как тела серотонин-положительных клеток боковой эктодермы округлой формы (Рис. 1, Б). Тела FMRF-амидположительных клеток, независимо от места локализации в теле личинки, имеют столбчатую форму (Рис. 1, В, Г). Кроме исследования распределения специфических нейральных маркров, были использованы антитела против тирозинированного тубулина (ТТ), при помощи которых у зрелых планул G. loveni были визуализированы тела нервных клеток и субэктодермальное нервное сплетение (Рис. 1, Д, Е). При этом паттерны иммунореактивности серотонина и ТТ частично перекрываются. Начиная с момента вступления в метаморфоз, иммуноположительные клетки перестают выявляться в теле планулы.

Рис 2. Влияние имипрамина, серотонина и ципрогептадина, нанеснных во время стимуляции метаморфоза (А) и после не (Б) на процент планул Gonothyraea loveni, вступивших в метаморфоз. * – P < 0,05.

При помощи фармакологических экспериментов было показано, что серотонин играет важную роль в процессе формирования компетентной к метаморфозу личинки. Так, планулы G. loveni, развивающиеся в присутствии пХФА (ингибитор синтеза серотонина), имели достоверно сниженную способность к вступлению в метаморфоз. Кроме того, было показано, что имипрамин и ципрогептадин, нанеснные во время стимуляции метаморфоза, оказывали различное влияние на поведение планул G. loveni: имипрамин снижал, а ципрогептадин увеличивал число осевших личинок (Рис. 2, А).

Результаты этого эксперимент свидетельствует о том, что сигналы, опосредуемые серотонином, тормозят вступление планул в метаморфоз. Те же вещества, нанеснные сразу после стимуляции планул к метаморфозу, не оказывали воздействия на скорость оседания планул (Рис. 2, Б).

Рис 3. Иммуноцитохимическое окрашивание колонии Gonothyraea loveni.

А – окрашивание на ТТ, ценосарк междоузлия, стрелка указывает на нервный отросток. Б-Г – окрашивание на FMRF-амид, на угловой вставке - вид в проходящем свете. Б – зрелый гидрант, стрелки указывают на тела нервных клеток в основании щупалец. В – растущее междоузлие. Г – зачаток гидранта.

б – бифуркация, вр – верхушка роста, гк – гастральный канал, го – гастральная область, гт – гидротека, зщ – зачатки щупалец, т – тела нервных клеток, щ – щупальца, эп – эпидерма.

В ходе исследования, нами была впервые выявлена нервная система в субэпидермальная нервная сеть, состоящая, в основном, из продольно ориентированных отростков ганглиозных нервных клеток, являющихся, повидимому, биполярными нейронами (Рис. 3, А). В тканях гидранта организация нервной системы заметно сложнее. Например, отчтливо видно ветвление нервных отростков. Кроме этого, некоторые отростки связывают соседние параллельно идущие отростки наподобие комиссур, что не было выявлено в тканях ценосарка (Рис. 3, Б). В тканях гидранта визуализированы би- и мультиполярные ганглиозные клетки. В основании каждого щупальца расположено тело нервной клетки, посылающей один нервный отросток в щупальце, а другой – в сторону гастральной области гидранта. Антитела против ТТ выявляют большее число нервных клеток и отростков, чем антитела против FMRF-амида, что может говорить о существовании компартментов нервной системы колонии G. loveni, осуществляющих иннервацию за счт отличных от FMRF-амидов нейромедиаторных веществ.

Колония растт за счт образования новых междоузлий. Процесс закладки нервной системы был прослежен в ходе морфогенетического цикла междоузлия.

Так, в междоузлии на ранних стадиях формирования нервные клетки выявлены не были. Первые иммуноположительные биполярные нервные клетки (иммуноположительные к антителам против и FMRF-амида, и ТТ) были обнаружены в проксимальной части ценосарка междоузлия, достигшего примерно половины длины зрелого междоузлия (Рис. 3, В).

Только к моменту образования зачатка гидранта нервные клетки достигают дистальной части растущего междоузлия, т.е. самого зачатка гидранта. При этом отростки нервных клеток, достигшие области зачатка, становятся более длинными, извилистыми и иногда разветвлнными (Рис. 3, Г), что является свидетельством дифференцировки и усложнения нервной системы будущего гидранта. Таким образом, морфогенез междоузлия опережает развитие нервной системы в нм, что отражает специфику дифференцировки клеток ценосарка.

Медузоидная стадия развития представлена у G. loveni прикреплнными медузоидами, исследуемые нейромедиаторные вещества, а также ТТположительные нервные клетки в которых обнаружены не были.

Cladonema radiatum (Hydrozoa). Окрашивание антителами против RFамида выявило у гидрантов C. radiatum субэпидермальную нервную сеть, состоящую, в основном, из продольно ориентированных нервных отростков и наиболее выраженную в оральных и аборальных щупальцах. В оральных щупальцах иммунореакция наиболее интенсивна в основании кластера книдоцитов (Рис. 4, А). Особое внимание привлекают RF-амид-положительные клетки эпидермы гипостома, окружающее ротовое отверстие. В гастральной области гидранта иммуноположительные клетки единичны.

Рис 4. Иммуноцитохимическое окрашивание гидрантов Cladonema radiatum антителами против RF-амида (А) и серотонина (Б-Д). А – оральная часть тела и оральное щупальце, стрелка указывает на колбовидные клетки в гипостоме. Б – фрагмент орального щупальца, стрелками указаны продольные нервные отростки. В – оральная часть тела, область отхождения оральных щупалец, стрелки указывают на нервные отростки, проходящие из щупалец в гастральную область. Г – гастральная область гидранта, стрелками указаны тела нервных клеток. Д – область отхождения аборального щупальца, стрелки указывают на нервные отростки, проходящие из щупальца в гастральную область. ащ – аборальное щупальце, го – гастральная область, гп – гипостом, к – скопление книдоцитов, ощ – оральное щупальце.

При помощи антител против серотонина также была визуализирована нервная сеть, которая, по-видимому, не идентична RF-амид-положительной нервной сети. Наиболее густая сеть серотонин-положительных отростков обнаружена в оральных щупальцах (Рис. 4, Б). Часть этих отростков переходит и сливается с нервной сетью гастральной области гидранта (Рис. 4, В). Серотонинположительные отростки распространяются вдоль гастральной области (Рис. 4, Г) и заходят в аборальные щупальца (Рис. 4, Д).

Рис 5. Ультраструктура нервных отростков оральных щупалец гидранта Cladonema radiatum (ТЭМ). Стрелками указаны везикулы с электронно-плотным (А) и электронно-прозрачным содержимым (Б). г – гастродерма, м – мезоглея, мо – мышечный отросток, мт – микротрубочки, н – нервный отросток, эп – эпидерма.

В ходе ультраструктурного изучения гидрантов C. radiatum были выявлены нервные отростки, характеризующиеся везикулами с различным содержимым.

Нейроны обоих типов были обнаружены в эпидерме гастральной области, оральных и аборальных щупалец гидранта. Первый тип нейронов содержит везикулы с электронно-плотным содержимым, достигающие в диаметре 170 нм (Рис. 5, А). Второй тип нейронов характеризуется везикулами с электронно менее плотным содержимым и диаметром около 90 нм (Рис. 5, Б). Везикулы расположены вблизи области контакта нервного отростка с мембраной мышечного отростка. В обоих типах нейронов видны микротрубочки.

Возможно, серотонин-положительные нервные клетки C. radiatum участвуют в мышечном сокращении, поскольку нанесение экзогенного серотонина вызывало сокращение отсечнных оральных щупалец гидрантов.

В щупальцах молодых неполовозрелых медуз C. radiatum была выявлена сеть RF-амид-положительных нервных отростков; серотонин на медузоидной стадии C. radiatum не обнаружен.

Aurelia aurita (Scyphozoa). Серотонин-положительная иммунореакция была выявлена уже на стадии дробления зародыша A. aurita во всех бластомерах (Рис. 6, А). Внутри клеток окрашивание имеет гранулярный характер, иммуноположительные гранулы равномерно распределены по цитоплазме, их диаметр составляет около 6 µm. На стадии гаструлы окрашивание сохраняется, но становится менее чтким, и к концу гаструляции постепенно исчезает.

Рис 6. Иммуноцитохимическое окрашивание Aurelia aurita антителами против серотонина (А-В, Д) и RF-амида (Г, Е). А – эмбрион на стадии дробления. Б – зрелая планула. В – зрелая планула, парасагиттальная область, стрелки указывают серотонин-положительные клетки боковой эктодермы. Г – зрелая планула, стрелки указывают тела RF-амид-положительных клеток. Д – щупальца сцифистомы. Е – область отхождения щупальца сцифистомы. г – гипостом, пп – передний полюс планулы, щ – щупальце.

После стадии гаструляции начинается развитие личинки: эмбрион удлиняется, передний конец становится шире заднего, формируется препланула, а затем и зрелая (компетентная к метаморфозу) планула. При помощи антител против серотонина в эктодерме переднего полюса препланулы A. aurita было выявлено скопление столбчатых клеток, в апикальной половине которых сосредоточена серотонин-положительная иммунореакция. На стадии зрелой планулы количество серотонин-положительных клеток в эктодерме переднего полюса заметно возрастает, а иммунореакция отмечается как в апикальной, так и в базальной частях клеток (Рис. 6, Б). Антитела против серотонина визуализируют и отдельные столбчатые клетки в боковой эктодерме планул A. aurita (Рис. 6, В). Колокализация окрашивания при нанесении антител против ТТ и серотонина не была показана.

В ходе онтогенеза A. aurita, первые RF-амид положительные клетки были выявлены на стадии зрелой планулы. Это единичные клетки, тела которых имеют столбчатую форму. Они расположены в передней половине боковой эктодермы и в эктодерме переднего полюса (Рис. 6, Г). От базальной части тела этих клеток отходят тонкие RF-амид положительные отростки. Они проходят под слоем эктодермы, вдоль мезоглеи, и образуют рыхлое субэктодермальное сплетение. Антитела против ТТ выявили большее количество нервных внутриклеточный серотонин может играть ключевую роль в ходе созревания планул. Так, эмбрионы A. aurita, инкубированные в пХФА, не формировали зрелых личинок за тот промежуток времени, который был достаточен для этого эмбрионам контрольной группы. Кроме этого, имипрамин и ципрогептадин, внеснные в среду с планулами в момент стимуляции метаморфоза, достоверно серотонинэргических сигналов в ходе запуска метаморфоза.

После запуска метаморфоза нервные клетки и их отростки не были выявлены всеми использованными антителами. Однако после завершения формирования первичного полипа при помощи антител против серотонина в эпидерме сцифополипа A. aurita были визуализированы крупные неотростчатые округлые клетки, наибольшее число которых было локализовано в щупальцах (Рис. 6, Д). Окрашивание сцифистом антителами против RF-амида выявило субэпидермальную нервную сеть, наиболее густую в области гипостома и щупалец (Рис. 6, Е).

RF-амид-положительная субэпидермальная нервная сеть была выявлена в тканях купола и гипостома, а также ропалиях эфир A. aurita. Серотонинположительных клеток у эфир A. aurita выявлено не было.

Cassiopea andromeda (Scyphozoa). Для сцифополипов C. andromeda характерно бесполое размножение путм отделения планулоподобных почек, способных к формированию вторичных сцифополипов. Распределение серотонина было прослежено от момента закладки почки C. andromeda до е вступления в метаморфоз. На ранних стадиях закладки, почка не имеет иммуноположительных элементов (Рис. 7, А). Позже, когда перетяжка между почкой и телом полипа сужается, и почка готовится к отделению, на е переднем конце (дистальном относительно полипа) появляется скопление серотонинположительных клеток (Рис. 7, Б).

Рис 7. Иммуноцитохимическое окрашивание планулоподобных почек Cassiopea andromeda на серотонин, стрелкой указан передний полюс. А – ранняя стадия закладки почки. Б – поздняя стадия формирования почки. В – отделившаяся почка. Г – начало метаморфоза. гп – гипостом, п – перетяжка между полипом и почкой.

Когда почка отделяется от сцифистомы, иммунореакция клеток переднего полюса с антителами против серотонина сохраняется (Рис. 7, В). На этой стадии иммуноположительные клетки расположены вокруг переднего полюса кольцом.

Эти же клетки являются иммунореактивными с антителами против ТТ. Как только почка C. andromeda прикрепляется к субстрату, иммунореактивность клеток переднего полюса (теперь – место контакта с субстратом) к антителам против серотонина пропадает (Рис. 7, Г). Также исчезает окрашивание клеток переднего полюса антителами против ТТ.

Участие серотонина в передаче сигналов, связанных с метаморфозом почек C. andromeda, было показано при помощи фармакологических экспериментов.

Так, почки, имеющие сниженный уровень внутриклеточного серотонина вследствие инкубации в пХФА, значительно позже почек контрольной группы завершали метаморфные преобразования.

RF-амид-положительных клеток у почек C. andromeda выявлено не было, однако у сцифополипов при помощи антител против RF-амида и ТТ была визуализирована субэпидермальная сеть нервных отростков, проходящих вдоль тела и щупалец.

Обсуждение. Обсуждение полученных результатов изложено разделами последовательно по стадиям развития согласно хронологии онтогенеза. Каждый раздел посвящн обсуждению и сравнению изученных видов Стрекающих на определнной стадии развития. Также приведены сравнения наших данных с результатами, полученными ранее другими авторами.

Эмбриогенез. У ранних эмбрионов A. aurita и G. loveni в цитоплазме бластомеров была выявлена серотонин-положительная иммунореакция, сходная у эмбрионов этих двух видов. Гранулярное окрашивание может быть связано с тем, что иммунореакция локализована в желточных гранулах зародышей, которые, возможно, являются местом синтеза серотонина. На основании иммуноцитохимического окрашивания, а также предыдущих исследований (Buznikov et al., 2001, 2003), можно предположить, что на эмбриональных стадиях A. aurita и G. loveni серотонин участвует в качестве донервного трансмиттера.

Планулы и планулоподобные почки. Иммуноцитохимическое окрашивание позволило выявить нервную систему у планул A. aurita и G. loveni и почек C. andromeda. Нервные клетки у всех трх видов сконцентрированы на переднем полюсе. У планулы A. aurita как представителя сцифоидных, это скопление клеток может входить в состав апикального органа, выполняющего сенсорную функцию (Nakanishi et al., 2008). У планулы G. loveni и почки C. andromeda иммуно-положительные клетки переднего полюса выполняют, скорее всего, функции, аналогичные функциям клеток апикального органа планул Anthozoa и Scyphozoa.

На основании формы, характера окрашивания и места локализации выявленные клетки могут быть классифицированы как сенсорные, ганглиозные или железистые (Martin et al., 1983). FMRF-амид-положительные клетки у изученных личинок являются сенсорными, в то время как серотонинположительные клетки принадлежали к различным типам (сенсорные, ганглиозные, железистые) в зависимости от места локализации в теле личинки и продемонстрировали значительное разнообразие в организации нервных систем у личинок изученных видов.

Метаморфоз планул и планулоподобной почки. У планул A. аurita и G. loveni, а также планулоподобной почки C. andromeda иммунореактивность к использованным антителам исчезает из тканей после вступления в метаморфоз.

Скорее всего, исчезновение окрашивания связано с деградацией нервных клеток в ходе метаморфоза, что типично для планул Стрекающих (Seipp et al., 2007;

Yuan et al., 2008). Исчезновение серотонин-положительных клеток у почек C. andromeda в момент вступления в метаморфоз можно рассматривать как доказательство функционального сходства нейросенсорного аппарата у планулоподобных почек и у планул. Скорее всего, деградация нервных клеток личинок спровоцирована необходимостью постметаморфной перестройки нервной системы и у сцифоидных, и у гидроидных.

Результаты фармакологических экспериментов позволили предположить, что у A. aurita серотонин участвует в процессе формировании планул, у планул G. loveni - в запуске метаморфоза, а у почек C. andromeda - в прохождении метаморфоза. Часть полученных в нашей работе результатов соответствует данным, полученным ранее на планулах гидроидных, в то время как другая часть результатов является противоположной по отношению к предыдущим исследованиям (Walther et al., 1996; McCauley, 1997; Zega et al., 2007).

Полипоидная стадия развития. Все изученные виды на полипоидной стадии характеризуются субэпидермальной RF-амид-положительной нервной сетью. Предположительно, роль нейропептидов семейства RF-амидов у полипов Стрекающих сводится к регуляции мышечного сокращения (Weber, 1989;

Grimmelikhuijzen et al., 2002; Mackie, 2004) или к регуляции выстреливания книдоцитов (Price, Anderson, 2006). Строение нервной системы в колонии текатных гидроидных на примере G. loveni было описано в настоящей работе впервые. Процесс нейрогенеза в междоузлии G. loveni является результатом дифференцировки и миграции нейробластов в растущих частях колонии. По мере развития междоузлия организация нервной системы постепенно усложняется.

Серотонин-положительные клетки на полипоидной стадии были выявлены только у C. radiatum и A. aurita. У гидрантов C. radiatum эти клетки имеют нейральную природу, что является первым доказательством наличия серотонинэргических нейронов у полипов гидроидных. Согласно данным иммунофлуоресцентного анализа серотонинэргическая нервная система гидрантов C. radiatum может быть вовлечена в регуляцию мышечного сокращения. У сцифистом A. aurita серотонин-положительные клетки являются, по-видимому, железистыми (Elofsson, Carlberg, 1989).

Медузоидная стадия развития. У двух изученных видов (A. aurita и C. radiatum) на медузоидной стадии выявлена субэпидермальная RF-амидположительная нервная сеть. Наши результаты согласуются с предыдущими данными, полученными на медузах этих видов (Plickert, Schneider, 2004; Jacobs et al., 2007). У прикреплнных медузоидов G. loveni нервные клетки не были выявлены. Это может косвенно подтверждать участие нервной системы в плавательных движениях и/или фоторецепции, необходимых свободноживущим медузам (Satterlie, 2008).

Выявлена динамика пространственно-временного распределения иммунореактивности к нейромедиаторным веществам (серотонин и (FM)RFамид) на протяжении онтогенеза двух представителей класса Scyphozoa (Aurelia aurita и Cassiopea andromeda) и двух представителей класса Hydrozoa (Gonothyraea loveni и Cladonema radiatum). Паттерн иммунореактивности к (FM)RF-амидам ограничен на всех стадиях нервными клетками, в то время как серотонин-положительная реакция присутствует и в других типах клеток в зависимости от стадии развития.

Распределение иммунореактивности к серотонину видоспецифично и меняется по мере развития организма. На стадии дробления серотонин выявлен в бластомерах, на стадии личинки и полипа – в отдельных эктодермальных нервных или железистых клетках. У планул и планулоподобных почек серотонин-положительные клетки преобладают на переднем полюсе. Впервые для представителей гидроидных у C. radiatum выявлена серотонинэргическая нервная система.

В онтогенезе исследованных видов эктодермальные (FM)RF-амидположительные сенсорные клетки впервые появляются на стадии планулы, их локализация в теле личинки и наличие отростков видоспецифичны.

С началом метаморфоза нервные клетки дегенерируют. Результаты показали, что серотонин участвует в метаморфозе планул и планулоподобных почек, однако влияние серотонинэргической системы на процесс метаморфоза различен у личинок изученных видов.

(FM)RF-амид-положительная нервная система полипоидной стадии представлена субэпидермальной сетью отростков ганглиозных клеток; у гидрантов организация нервной системы сложнее, чем у сцифополипов. У C. radiatum выявлены сенсорные RF-амид-положительные клетки. Впервые доказано наличие нервной системы в ценосарке побегов G. loveni (Thecaphora).

Развитие нервной системы в процессе роста побега включает процессы миграции и дифференцировки нейробластов.

У прикреплнных медузоидов G. loveni нервная система не выявлена, что может говорить о е вторичной редукции, связанной с потерей плавательной и сенсорной активности медузоида.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в журналах, включенных в перечень ВАК:

1. Майорова Т. Д, Косевич И. А., Мелехова О. П. Некоторые особенности эмбрионального развития и метаморфоза Aurelia aurita (Scyphozoa, Cnidaria) // Онтогенез. 2012. Т. 43, № 5. - С. 333-349.

2. Mayorova T., Kosevich I. FMRF-amide immunoreactivity pattern in the planula and colony of the hydroid Gonothyraea loveni // Zoology. 2013. V. 116, № 1.

- P. 9-19.

3. Mayorova T., Kach J., Kosevich I. Pattern of serotonin-like immunoreactive cells in scyphozoan and hydrozoan planulae and their relation to settlement // Acta Zoologica. 2013. doi: 10.1111/azo.12023.

4. Mayorova T., Kosevich I. Serotonin-immunoreactive neural system and contractile system in the hydroid Cladonema (Cnidaria, Hydrozoa) // Invertebrate Neuroscience. 2013. doi: 10.1007/s10158-013-0152-2.

Статьи в сборниках и др.:

1. Орлова (Майорова) Т.Д., Косевич И.А. Роль нейроактивных веществ в процессах развития стрекающих Aurelia aurita (Scyphozoa) и Gonothyraea loveni (Hydrozoa) и их распределение на стадиях раннего онтогенеза // Сб. науч. тр.

междунар. конф. «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов». Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2010. Т. 1. - С.

219-225.

Тезисы докладов на конференциях:

1. Orlova (Mayorova) T., Kosevich I. Neurotransmitters in early ontogenesis and asexual reproduction in Scyphozoa // Abstracts of International Workshop “The Evolution of Multicellularity: Insights from Hydra and other Basal Metazoans”, Tutzing, Germany, September 14th-17th, 2009. - P. 112.

2. Орлова (Майорова) Т. Д., Косевич И. А. Нейроактивные вещества у сцифоидных (Cnidaria, Scyphozoa) на стадиях раннего онтогенеза и при бесполом размножении // Тезисы докладов IX ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН "Биохимическая Физика», г. Москва, 9ноября 2009. М.: ООО «еПолиграф», 2009. - С. 194-198.

3. Орлова (Майорова) Т. Низкомолекулярные нейроактивные вещества на стадиях раннего онтогенеза и при бесполом размножении у Стрекающих // Тезисы докладов ХХII зимней молоджной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" ИБХ РАН, М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 2010. - С. 63.

4. Орлова (Майорова) Т. Д., Косевич И. А. Распределение серотонина и его сигнальная роль на ранних стадиях онтогенеза и бесполом размножении у Стрекающих (Cnidaria) // Тезисы докладов I Международных Беккеровских чтений, г. Волгоград, 27-29 мая 2010. Волгоград: ТриАС, 2010. Т. 1. - С. 483.

5. Орлова (Майорова) Т. Д., Косевич И. А. Роль нейроактивных веществ в процессах развития Стрекающих (Aurelia aurita (Scyphozoa) и Gonothyraea loveni (Hydrozoa)) и их распределение на стадиях раннего онтогенеза // Тезисы докладов III международной конференции с элементами школы для молодых ученых, аспирантов и студентов “Современные проблемы физиологии и Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2010. - С. 137.

6. Orlova (Mayorova) T. D., Kosevich I. A. Neuron-like cells appearance in the early ontogenesis of Gonothyraea loveni (Hydrozoa, Campanulariidae) // Abstracts of the 7th Workshop of the Hydrozoan Society, Porto Cesareo, Italy, September 10th-18th, 2010. - P. 64.

7. Орлова (Майорова) Т., Косевич И. Характеристика пространственновременного распределения серотонина и FMRF-амида на стадиях раннего онтогенеза стрекающих Aurelia aurita (Scyphozoa) и Gonothyraea loveni (Hydrozoa) // Тезисы докладов XI региональной конференции (с международным участием) «Проблемы изучения, рационального использования и охраны природных ресурсов белого моря», г. Санкт-Петербург, 9-11 ноября 2010. СПб:

ЗИН РАН, 2010. - С. 131.

8. Mayorova T., Kosevich I. Neuro-active substances in the early ontogenesis in Cnidarians Aurelia aurita and Gonothyraea loveni: distribution and impact // Abstracts of the VII International Scientific Conference for Students and PhD Students “Youth and progress of Biology”, Lviv, Ukraine, April 5th-8th, 2011. P. 216.

9. Майорова Т. Д. Ультраструктура и организация нервной системы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учных «Ломоносов-2011», г. Москва, 10-15 апреля 2011. М.: МАКС Пресс, 2011. - С. 117.

10. Mayorova T., Kosevich I. The neural net in Cladonema radiatum polyps (Hydrozoa, Cnidaria) // Abstracts of the X East European conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology “Simpler Nervous Systems”, Moscow, Russia, September 6th-10th, 2012. - P. 32.

11. Майорова Т., Косевич И. Распределение FMRF-амид-положительного окрашивания у планулы и в колонии гидроидного Gonothyraea loveni (Allman, 1859) // Тезисы докладов научной конференции «Морская биология, геология, океанология - междисциплинарные исследования на морских стационарах», посвященной 75-летию Беломорской биологической станции им. Н.А. Перцова, г. Москва, 27 февраля-1 марта 2013. М.: Т-во научных изданий КМК, 2013.

- С. 168.