МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. Ломоносова

Биологический факультет

на правах рукописи

ЛИНЬКОВА ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

ДЕСТРУКЦИЯ АМИНОАРОМАТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

АНАЭРОБНЫМИ МИКРОБНЫМИ СООБЩЕСТВАМИ

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2011 г.

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр Иванович кандидат биологических наук, доцент Котова Ирина Борисовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Ножевникова Алла Николаевна кандидат химических наук Емашова Наталия Александровна

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Защита состоится _ 2011 года в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 2011 г.

Учный секретарь диссертационного совета, к.б.н. Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. С развитием новых химических технологий в биосферу поступает большое количество токсичных и устойчивых соединений, уровень которых возрастает с каждым годом. Аминоароматические соединения, используемые в производстве лекарственных препаратов и лакокрасочных материалов, содержатся в сточных водах предприятий химической и фармацевтической промышленности (Carmona et al., 2009).

Аминоароматические вещества являются также продуктами восстановления азокрасителей в анаэробных условиях (Емашова и др., 2005), причм некоторые имеют природное происхождение. Например, 2-аминобензойная кислота (2-АБК) – предшественник синтеза алкалоидов в растениях, а 4-АБК (4-аминобензойная кислота, витамин Н1) используется кишечной микробиотой для синтеза фолиевой кислоты.

В настоящее время нагрузка на естественные процессы самоочищения биосферы является избыточной, и параллельно с незначительной деструкцией ксенобиотиков идт их постепенное накопление в окружающей среде. Значительная роль в деградации таких загрязнений принадлежит микроорганизмам (Остроумов, 1986; Щербакова, 2000; Diaz, 2004). Микроорганизмы являются важным звеном в круговороте веществ в биосфере, выполняя в основном роль редуцентов. Анаэробные микроорганизмы, обладающие способностью трансформировать большое количество органических и неорганических субстратов, принимают активное участие во всех биологических циклах (круговороте углерода, азота, серы и других элементов). В естественных условиях анаэробные микроорганизмы, входящие в состав микробных консорциумов, осуществляют функции деструкции сложных органических веществ, обеспечивая самоочищение экосистем.

Деструкция (амино)ароматических соединений зачастую происходит более эффективно в анаэробных условиях, т.к. в присутствии кислорода многие из них полимеризуются, что затрудняет дальнейшую минерализацию, либо образуют токсичные промежуточные продукты (Савельева, 2003). В связи с этим актуальны исследования, направленные на получение микробных сообществ, способных осуществлять процесс минерализации (амино)ароматических ксенобиотиков в отсутствие кислорода. В настоящее время результаты исследований по биодеградации загрязнений учитываются при разработке различных очистных сооружений. Для очистки почв, атмосферы, сточных вод используются биореакторы различных технологических типов: аэробный, анаэробный и гибридный, включающий анаэробную и аэробную стадии (Deriell et al., 1999). Как правило, в реакторах используются естественно сложившиеся консорциумы микроорганизмов. В таких консорциумах наблюдается комбинация катаболических возможностей, благодаря чему происходит полное разрушение вещества, недоступное чистым культурам микроорганизмов из-за термодинамических ограничений.

В настоящее время получены как микробные ассоциации, так и чистые культуры бактерий, разлагающие эти соединения в условиях сульфат- (Schnell, Schink, 1992) и нитратредукции (Tschech, Fuchs, 1987), изучены биохимические особенности расщепления ароматического кольца (Head, 1998; Harwood et al., 1999; Schink et al., 2000; Boll, 2005;

Heider, 2007; Fuchs, 2008; Хоменков и др., 2008; Carmona et al., 2009). Значительно меньше работ посвящено изучению деструкции аминоароматических соединений в условиях метаногенеза при отсутствии внешних акцепторов электронов.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было изучение способности микробных сообществ к деструкции аминоароматических кислот в анаэробных условиях.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Получение метаногенных микробных сообществ, способных расщеплять аминоароматические субстраты до СН4 и СО2;

2. Определение функциональных возможностей выделенных сообществ и влияния ряда факторов на процесс биодеградации;

3. Определение биохимического пути деструкции аминоароматических кислот и идентификация интермедиатов процесса;

4. Изучение микробного состава выделенных сообществ, разлагающих аминоароматику в анаэробных условиях;

5. Выделение чистых культур микроорганизмов, осуществляющих различные этапы деструкции аминоароматических веществ в изучаемых сообществах.

Научная новизна и практическая значимость работы. Была продемонстрирована способность анаэробных микробных сообществ различного происхождения к разложению как исходных аминоароматических субстратов, так и других ароматических веществ и азокрасителей. Показана возможность деструкции аминоароматических соединений сообществами, выделенными из донных отложений естественных водомов, которые ранее не подвергались массированному воздействию аминоароматических ксенобиотиков. Определены ароматические интермедиаты начальных стадий трансформации аминоароматики сообществами, полученными из различных источников биоматериала. Показано влияние ряда факторов на скорость и эффективность процесса биодеградации этих субстратов.

Проведено сравнение выделенных микробных консорциумов по таким параметрам, как видовое разнообразие (число морфотипов), активность биодеструкции аминоароматических субстратов, стабильность активности, течение самого процесса деградации. Был проанализирован состав микробных сообществ различного происхождения, определены функциональные возможности выделенных консорциумов и выявлены представители различных физиологических групп. Из двух метаногенных сообществ был выделен ряд чистых культур, участвующих в процессе деструкции ароматических аминов на стадии брожения.

Понимание сути процессов в биоремедиации природных сред и в очистке стоков позволяет предсказывать поведение микробных сообществ на разных этапах деструкции и управлять процессом очистки. Результаты исследований по микробной деградации загрязнений представляют собой научную основу для биотехнологического процесса обработки стоков, их необходимо учитывать при прогнозировании судьбы поллютантов в окружающей среде и разработке различных очистных сооружений.

Публикации и апробация работы. По результатам работы опубликовано печатных работ, из них 3 - статьи в рецензируемых журналах. Основные положения и результаты работы были представлены на Всероссийском симпозиуме Биотехнология микробов (Москва, 2004), Международной конференции Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды (Саратов, 2005), 12-й международной Пущинской школе-конференции молодых учных Биология-наука 21 века (Пущино, 2008), 4-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Экологические проблемы промышленных городов (Саратов, 2009), и Международных конференции студентов, аспирантов и молодых учных «Ломоносов»

(Москва, 2004 и 2009), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов»

(Москва, 2009), VI Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010).

Структура и объм работы: Материалы диссертации изложены на 170 страницах машинописного текста и включают 85 рисунков и 21 таблицу. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», который содержит отечественных и 178 иностранных наименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе были исследованы накопительные культуры, полученные из анаэробных илов двух очистных сооружений и донных отложений естественных водоемов. Базовым служил режим культивирования при рН 7, 30°С, в статических условиях в темноте в анаэробной минеральной среде, содержащей 100 мг/л дрожжевого экстракта, микроэлементы и резазурин (индикатор анаэробных условий).

Анаэробные условия создавали с помощью замены азотом газовой фазы в закрытых резиновыми пробками флаконах объмом 120 мл, а также внесения восстановителя – 0, г/л Na2S.9H2O. В качестве (амино)ароматических субстратов использовали 2-,3- и 4аминобензойные кислоты (2-,3-,4-АБК), 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК), бензойную кислоту (БК), 2-гидроксибензиловый спирт (2-ГБС), бензиловый спирт (БС), салициловую кислоту (СК).

Для определения деградации аминоароматики накопительными культурами спектрофотометрического сканирования (Shimadzu UV-1202, Япония) в диапазоне длин волн от 200 до 600 нм, а также высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) в обращенных фазах на колонках ChromSpher C18 2х10 см (Chrompack, Нидерланды) по поглощению при 230 нм. Концентрацию органических кислот и спиртов определяли с помощью ВЭЖХ на колонке Varian Metacarb 67H (300х6,5 мм; Merck,ФРГ). Содержание газов измеряли на газовом хроматографе Shimadzu GC-2014 (Япония) с двумя колонками.

Разделение водорода и метана проводили на колонке Molsieve 2 м х 3 мм, температура детектора -100С, газ-носитель – гелий. СО2 измеряли на том же хроматографе, температура детектора 33С, газ-носитель – гелий, колонка - Poraplot Q СЗ7554, 25 м х 0,53 мм (Chrompack, Varian Inc., CША).

Содержание белка в культуральной жидкости накопительных культур определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Аммоний-ион определяли по стандартному методу Несслера (Лурье, 1984). Анализ содержания лактата проводили электрохимически с использованием биосенсоров первого поколения на основе L-лактатоксидазы. API-тесты для лактобацилл (BioMerieux, Франция) проводили согласно рекомендациям.

Для выделения чистых культур применяли натуральные и минеральные жидкие или агаризованные среды общего назначения (МПА, голодный агар, базовую минеральную среду), селективные среды для разных групп микроорганизмов (сульфатредукторы, микроорганизмы-гидролитики, использующие целлюлозу, анаэробные азотфиксаторы из рода Clostridium, олиготрофные микроорганизмы, БГКП), а также базовую анаэробную агаризованную среду, содержащую различные добавки. Культивирование осуществляли как в анаэробных, так и в аэробных условиях. Для части посевов использовали предварительный прогрев биологического материала.

модифицированным фенол-хлороформным методом (Маниатис и др., 1984; Нетрусов и др., 2005). Полученные образцы ДНК дополнительно подвергали очистке с помощью миниколонок "Wizard DNA clean-up system" (Promega Corporation, Madison, США) по методике, приведенной в руководстве с поставляемым набором.

ПЦР-амплификацию генов 16S рРНК проводили с универсальными праймерами 8и 1492R согласно протоколу Lane (1991). Очистку ПЦР-продуктов выполняли с помощью производителя. ПЦР-продукты, полученные при амплификации с праймерами 8-27F и 1492R использованием набора реактивов BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя.

Сравнительный анализ последовательностей генов 16S рРНК осуществляли с помощью данных и программного обеспечения Ribosomal Database Project – RDP (http://rdp.cme.msu.edu). Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов микроорганизмов с помощью программы CLUSTALW v 1.75. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECONW (http://biocwww.uia.ac.be/u/yvdp/treeconw.html, Van de Peer, De Wachter, 1994). Автор выражает глубокую признательность и благодарность д.б.н. Туровой Т.П. за помощь в проведении филогенетического анализа.

ПЦР-продукты, полученные при амплификации с праймерами 338F (GC) (5CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3) и 518F(GC)

(5'-GCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGGTGBCAGCMGCCGCG

GТAA-3') (для сообществ), разделяли методом денатурирующего градиентного гельэлектрофореза (ДГГЭ) в 8% полиакриламидном геле, содержащем линейный градиент (30ДНК-денатурантов (мочевина и формамид). Электрофорез проводили при 60°С при напряжении 70 В 20 ч. После электрофореза гели окрашивали раствором красителя SYBR(R) Gold (разведение 1:10 000) в течение 40 мин. Наиболее чткие полосы, реамплификацию ДНК-фрагментов, используя праймеры 907R (5'CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3') и 515F (5'-GTGBCAGC MGCCGCGGTAA-3').

Морфологические особенности микроорганизмов в образцах исследовали методами фазово-контрастной и световой (микроскоп Биолам-2, ЛОМО, Россия) микроскопии соответственно, а также сканирующей электронной микроскопии. Микрофотографии с использованием фазового контраста получали с использованием микроскопа Leica DMR HC (Wetzlar, ФРГ), оборудованного цифровой камерой Leica DC 250. Подготовку препаратов для сканирующей электронной микроскопии проводили по стандартной методике (Нетрусов и др., 2005) и просматривали на электронном сканирующем микроскопе «Hitachi S - 405 A»

(Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

аминоароматические вещества. Анаэробные накопительные культуры, расщепляющие аминоароматические соединения, получали из активных метаногенных илов различного происхождения путм длительной адаптации к соответствующим аминоароматическим субстратам (более 3 лет на момент начала экспериментов). В работе использовали несколько источников биопроб: мезофильный флокулярный ил очистных сооружений Курьяновской станции аэрации (ил КСА), анаэробный ил очистных сооружений пивоваренного завода Efes Pilsener (ил ЕР), донные отложения реки Джамна (Индия), донные отложения содового озера Цайдам (Бурятия). В качестве субстратов использовали 2-, 3-, 4-АБК и 5-АСК. После практически полного исчезновения в культуральной жидкости внесенной порции начального субстрата в культивационные сосуды вносили шприцем новые порции того же аминоароматического вещества, после чего начинался следующий цикл потребления аминоароматики.

Мезофильный флокулярный ил очистных сооружений Курьяновской станции аэрации (ил КСА) представлял собой чрные мелкие частицы, состоящие из тонких палочек разной длины, мелких прямых палочек и скоплений кокков разного размера. Анаэробные культуры О4 и Р2 были получены из данного ила путм адаптации к 2-АБК (культура О4) и смеси 2АБК+4-АБК (культура Р2) в течение длительного периода (более 9 лет). Лаг-период активности перед первым циклом потребления составлял 50 и 70 сут соответственно.

Аминобензойные кислоты являлись единственным источником углерода и энергии в сообществе. Средняя скорость потребления 2-АБК культурой О4 составляла 0,03 мМ /сут, культура Р2 разрушала 2-АБК со скоростью 0,03 мМ/сут, 4-АБК – со скоростью 0,15 мМ/сут.

Микроскопическая картина обоих сообществ была представлена мелкими кокками, расположенными как в скоплениях, так и отдельно, короткими толстыми палочками, а также крупными фрагментированными палочками, появление которых было связано с концом цикла потребления ароматического субстрата и образованием биогаза. В сообществе Р2 встречались также крупные кокки и мелкие изогнутые палочки.

Активный метаногенный ил очистных сооружений пивоваренного завода Efes Pilsner состоял из тмных гранул, включающих 11 типов палочек и 3 типа кокков, с преобладанием крупных прямых палочек с обрубленными концами в виде коротких цепочек и коккобацилл, лежащих попарно. Анаэробная накопительная культура ЕР была получена путм адаптации ила к 2-АБК в течение долгого промежутка времени (более 5 лет). 2-АБК являлась единственным источником углерода и энергии в сообществе. Первый цикл потребления субстрата для данной культуры длился 38 сут, из них 14 сут продолжался лагпериод. Последующие циклы потребления начинались без адаптационного периода, культура потребляла 2-АБК со средней скоростью 0,06-0,08 мМ/сут. Микроскопический анализ сообщества ЕР показал наличие кокков, как в цепочках, так и отдельно, коротких толстых палочек; фрагментированных палочек с прямыми концами средней длины и в конце цикла потребления субстрата - длинных тонких изогнутых нитей.

Донные отложения реки Джамна (Индия) представляли собой чрные хлопья, состоящие из мелких кокков, коккобацилл и палочек разной формы и размера. Базовым служил режим культивирования при рН 7, 30°С, в статичных условиях в темноте. В ряде экспериментов варьировали значения различных параметров культивирования (рН, освещнности, температуры). При базовом режиме культивирования накопительные культуры наиболее активно разрушали 2-АБК, причем первый цикл ее потребления длительностью 135 сут начался с довольно длительного (54 сут) лаг-периода. Следующий цикл деградации 2-АБК проходил уже без лаг-периода и завершился за 25 сут.

Донные отложения содового озера Цайдам, для которого характерно высокое содержание минеральных солей (общая минерализация 14 г/л), представляли собой зеленовато-серые крупные рыхлые хлопья, состоящие из скоплений мелких и крупных кокков и палочек разной длины и формы. Из всех использованных нами субстратов наиболее активно в базовом режиме культивирования происходила деструкция накопительной культурой 2-АБК. Ее потребление началось спустя 35 сут, средняя скорость использования субстрата в цикле составила 0,22 мМ/сут. В варианте, культивируемом при базовых условиях и расщепляющем 2-АБК, в середине цикла преобладали мелкие палочки, были немногочисленные длинные прямые тонкие палочки.

Культуры, выделенные из илов очистных сооружений, являлись наиболее активными из всех использованных в работе. Они с высокой скоростью и в течение длительного времени потребляли аминоароматический субстрат и образовывали конечные продукты (биогаз), скорость потребления субстрата от цикла к циклу не изменялась. При пересевах и масштабировании эти анаэробные сообщества не теряли своей активности.

Для культур, полученных из естественных водомов, был характерен довольно продолжительный лаг-период, тогда как некоторые культуры, полученные из неадаптированных илов очистных сооружений, начинали потреблять субстрат практически без лаг-периода. Видовое разнообразие в культурах, выделенных из неадаптированного ила, вследствие непродолжительного воздействия аминоароматических веществ было богаче, чем в длительно адаптированных накопительных культурах О4 и Р2, однако активность деградации и е стабильность была выше у культур О4 и Р2.

В зависимости от обсуждаемых характеристик все использованные нами в работе культуры можно расположить в виде следующих рядов (в порядке возрастания) (табл.1).

Основные свойства анаэробных сообществ в сравнении.

Характеристика сообщества Сообщества (в порядке возрастания) Видовое разнообразие/Число О4, Р2 < Цайдам < Джамна бензиловый спирт > бензойная кислота > салициловая кислота.

адаптированными к аминобензойным кислотам.

Для культуры ЕР было изучено влияние пирувата на процесс деструкции и других ароматических субстратов (бензойной кислоты, бензилового спирта, салициловой кислоты, 2-гидроксибензилового флороглюцинола). Так, внесение 20 мМ пирувата в среду культивирования стимулировало процесс биодеградации как основного субстрата, так и других использованных ароматических веществ. Некоторые вещества (салициловую кислоту, пирогаллол, бензальдегид) накопительная культура ЕР оказалась способна разлагать только в присутствии пирувата как дополнительного источника углерода и энергии. Внесение пирувата ускоряло минерализацию как основного, так и других ароматических субстратов в 2-60 раз по сравнению с ростом на (амино)ароматическом веществе как единственном источнике углерода и энергии. Параллельно с деструкцией ароматического субстрата сообщество сбраживало пируват, образуя ацетат, пропионат, формиат, бутират и лактат в качестве промежуточных продуктов.

Анализ интермедиатов деструкции 2-АБК и 5-АСК с большой долей вероятности позволяет говорить о реализации бензоил-КоА-пути деструкции аминоароматических субстратов (Heider, Fuchs,1997) полученными микробными сообществами.

Как известно, существуют различные пути анаэробной конверсии ароматических веществ, где в качестве центрального интермедиата могут выступать не только бензоат, но и резорцинол или флороглюцинол (Heider, Fuchs,1997). Для проверки возможности реализации альтернативных путей деградации аминоароматических веществ было изучено потребление сообществом ЕР, изначально адаптированным к 2-АБК, флороглюцинола, резорцинола и его аналога пирогаллола. Отсутствие потребления флороглюцинола и резорцинола данным сообществом указывает на то, что в заданных условиях эти пути не реализуются.

С учтом всех идентифицированных нами интермедиатов можно предложить следующую последовательность реакций разложения 2-АБК:

Схема деструкции 5-АСК отличается от вышеприведнной схемы только на первых этапах (5-АСК трансформируется сначала в 2-ГБС, затем в бензоат, последующие стадии деградации совпадают с таковыми для процесса разложения 2-АБК).

4. Анализ компонентного состава сообщества. Анаэробные микробные сообщества, использованные в нашей работе, являются хорошо сбалансированными системами с облигатными связями между микроорганизмами-членами сообщества, что приводит к значительным трудностям при выделении чистых культур микроорганизмов прямым высевом на питательные среды. Высевы сообществ О4, Р2 и ЕР на селективные среды, проведнные с целью выявления различных функциональных групп микроорганизмов, входящих в состав сообщества, а также демонстрации потенциальных функциональных возможностей сообществ в реальных меняющихся условиях (например, в настоящих сточных водах), показали присутствие в сообществах сульфатредукторов, целлюлозолитических и олиготрофных микроорганизмов. Для определения общей численности гетеротрофных микроорганизмов, присутствующих в анаэробных сообществах, и количественных соотношений разных морфологических типов были проведены также высевы активных анаэробных культур на богатые и минеральные плотные питательные среды в анаэробных и аэробных условиях, выявившие присутствие в значительных количествах факультативных анаэробов.

При исследовании роли бесспоровых микроорганизмов в процессе деструкции и пространственной организации сообщества проводили кипячение образцов на водяной бане в течение 10 мин. Исключение метаногенных микроорганизмов и неспорообразующих синтрофов из анаэробных сообществ приводило к изменению как промежуточных продуктов, так и структуры микробного сообщества.

Для оценки филогенетического положения микроорганизмов, зависящих друг от друга в сложной пищевой цепи (сети) и зачастую некультивируемых, использовали DGGEметод анализа (Diaz et al., 2006) неадаптированного ила ЕР и активного сообщества ЕР, разрушающего 2-АБК. При разделении методом DGGE продуктов амплификации ДНК были реамплифицированных и очищенных ДНК-фрагментов, экстрагированных из DGGE-полос, и филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей генов 16S рДНК некультивируемых представителей филогенетической группы Bacteroidetes, а также присутствие представителей родов Bacillus, Moraxella, Lactobacillus, Methanosaeta и Methanosarcina.

культуре было меньше, чем для исходного неадаптированного ила, что свидетельствует о селективном воздействии аминоароматических веществ на микробное сообщество, приводящее к снижению количества видов в нм.

5. Чистые культуры. Из двух метаногенных сообществ, активно разрушающих аминоароматические субстраты, были выделены 5 чистых культур микроорганизмов, участвующих в процессе деструкции ароматических аминов.

Из микробного сообщества Tsaydam-5-ASA, разлагающего 5-АСК до биогаза, была выделена чистая культура Pseudomonas aeruginosa. Клетки изолята представляли собой грамотрицательные прямые или слегка изогнутые подвижные палочки, не образующие спор.

Данный штамм хотя и не принимает непосредственного участия в процессе деструкции аминоароматических соединений, однако при определнных условиях может происходить трансформация аминоароматики данным штаммом либо другим нитратредуцирующим микроорганизмом по схеме, предложенной ранее (Савельева, 2003). Помимо этого, по литературным данным, псевдомонады в составе сообщества могут как опосредованно стимулировать процесс деструкции аминобензойных кислот (синтез внеклеточных ПАВ, увеличивающих эффективность биодеструкции 5-АСК, Воробьв и др., 2007; Семнова и др., 2011), так и выполнять функции защиты других членов микробного сообщества от стрессорных воздействий (Николаев, 2011).

У исследуемого штамма бактерий была определена значительная часть ( нуклеотидов) последовательности гена 16S рРНК, что соответствует позициям с 52 по 1492 по номенклатуре E. coli. Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что микроорганизмам рода Pseudomonas. Более точное филогенетическое положение исследуемого штамма среди ближайших представителей данного рода представлено на рис. 4.

Выделенный штамм был идентифицирован и систематизирован как P. aeruginosa Tsaydam-5-ASA.

Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG 1225T (Z76666) Рис.4. Филогенетическое положение штамма Tsaydam-5-ASA среди видов рода Pseudomonas.

Из накопительной культуры ЕР-2-АБК был выделен штамм Bacillus subtilis EP-ABA.

Клетки штамма представляли собой грамположительные подвижные палочки среднего размера. В условиях нитратредукции ранее была описана возможность деструкции фталата микроорганизмами, относящимися к роду Bacillus (Ahring, Taylor, 1981), однако изменений концентраций внеснных ароматических субстратов в условиях нашего эксперимента обнаружено не было. Выделенный штамм обладает бродильным типом метаболизма, и внесение в сообщество дополнительных количеств его клеток приводило к увеличению количества образующихся летучих продуктов, в том числе ацетата, служащего субстратом метаногенеза.

По данным литературы для B.subtilis показана способность продуцировать защищающие клетки от стрессорных воздействий внеклеточные факторы - адаптогены, обладающие перекрстным действием (т.е. действием на клетки микроорганизмов других видов, Николаев, 2011). Одной из функций B.subtilis в выделенных нами ассоциациях может быть защита других микроорганизмов-членов сообщества от воздействия неблагоприятных факторов и поддержание его стабильного функционирования.

У исследуемого штамма была определена значительная часть (1495 нуклеотидов) последовательности гена 16S рРНК, что соответствует позициям с 15 по 1501 по номенклатуре E. coli. Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм относится к филуму Firmicutes и близок к бактериям рода Bacillus.

Более точное филогенетическое положение исследуемого штамма среди ближайших представителей данного рода отражено на рис.5.

Рис.5. Филогенетическое положение штамма EP-ABA среди видов рода Bacillus.

Штамм Moraxella osloensis EP-ABA2 был выделен из сообщества ЕР, расщепляющего 2-АБК. Клетки представляли собой мелкие грамотрицательные неподвижные палочки.

Согласно литературным данным, представители этого рода способны к деструкции бензоата (Berry et al., 1987) и п-крезола (Bossert, Young, 1986) в условиях нитратредукции, а также пнитрофенола (Spain, Gibson, 1991) и нафталинсульфокислот (Wittich et al., 1988) в аэробных условиях. В условиях нашего эксперимента изменений концентраций внеснных ароматических субстратов не наблюдали. Представители рода Moraxella способны осуществлять смешанное брожение (Asano et al., 1988). Внесение клеток штамма в сообщество приводило к увеличению количества образующихся кислот, в том числе ацетата, служащего субстратом метаногенеза.

У исследуемого штамма была определена значительная часть (1485 нуклеотидов) последовательности гена 16S рРНК, что соответствует позициям с 11 по 1505 по номенклатуре E. coli. Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм относится к филуму Gammaproteobacteria и близок к микроорганизмам рода Moraxella. Более точное филогенетическое положение исследуемого штамма среди Рис.6. Филогенетическое положение штамма EP-ABA2 среди видов рода Moraxella.

Штаммы Lactobacillus paracasei ssp. paracasei L-34 и L.rhamnosus L-43.1 были выделены из метаногенных сообществ Tsaydam-5-ASA и ЕР-2-АБК, соответственно и идентифицированы по результатам API-тестов. Нами была проведена проверка способности выделенных штаммов лактобацилл к деструкции аминоароматических субстратов, а также восстановлению двух пищевых азокрасителей. Ни одна из культур в условиях эксперимента не разлагала ароматические амины и азокрасители в качестве единственного источника углерода и энергии, однако обе осуществляли сбраживание линейных интермедиатов процесса до лактата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биодеградацию различных веществ, загрязняющих окружающую среду, изучают уже несколько десятилетий, однако имеющиеся литературные данные по деструкции аминоароматических соединений довольно немногочисленны и отрывочны.

Возможность разрушения ароматических веществ донными осадками природных водомов, не загрязннных соответствующими веществами, ранее была продемонстрирована различными авторами (Ye et al., 1992; Haggblom et al., 1993; Edwards, Grbic-Galic, 1994;

Becker et al., 2001). Однако биодеградация именно аминоароматических веществ сообществами, выделенными из подобных мест обитания, впервые была показана в нашей лаборатории. Начальная стадия потребления субстрата зачастую связана с действием небиологических факторов, заключающихся в адсорбции вещества на частицах ила (Wu et al., 1993; Fu, Viraragharan, 2001), причм вещества, отличающиеся по химическому строению, по-разному адсорбируются на поверхности клеток (Fu, Viraragharan, 2001), однако для аминоароматических соединений такие сведения отсутствовали. Нами было также показано, что в случае 2- и 4-АБК химическая природа субстрата не влияла на степень его адсорбции.

В данной работе впервые было показано влияние гидродинамических условий на процесс деградации аминоароматического субстрата и морфологические характеристики микробного сообщества, определены оптимальные начальные параметры культивирования для сообществ, разрушающих аминоароматический субстрат. Для ароматических интермедиатов (2-ГБС, СК, БС) была определена токсичность, сведения о которой по отношению к метаногенным консорциумам в литературе отсутствуют. Были также определены интермедиаты деструкции аминоароматики и предложена схема разложения 2АБК и 5-АСК выделенными консорциумами.

Результаты проверки возможности осуществления альтернативных путей деградации (Heider, Fuchs,1997) использованных в работе аминоароматических веществ, а также природа и последовательность появления промежуточных продуктов свидетельствовали о реализации бензоил-КоА-пути деструкции в микробных консорциумах.

Несмотря на преобладание некультивируемых микроорганизмов в изучаемых консорциумах, нами были выделены в чистые культуры и идентифицированы до вида несколько микроорганизмов. Штамм P.aeruginosa Tsaydam-5-ASA хотя и не принимает непосредственного участия в процессе деструкции аминоароматических соединений, однако при определнных условиях может опосредованно стимулировать процесс деструкции аминобензойных кислот (Савельева, 2003) и выполнять функции защиты от стрессорных воздействий других членов микробного сообщества (Николаев, 2011). Остальные выделенные штаммы - Lactobacillus rhamnosus и L. paracasei subsp. paracasei, Bacillus subtilis, Moraxella osloensis, выделенные из сообществ ЕР-2-АБК и Tsaydam-5-ASA, участвуют в процессе биоразрушения аминоароматических субстратов, входя в «бродильный» блок анаэробных микробных сообществ и осуществляя сбраживание линейных интермедиатов – продуктов деструкции аминобензойных кислот. Одной из функций, выполняемых выделенными штаммами, является также поддержание условий анаэробиоза в метаногенном сообществе, что способствует стабилизации процесса при метаногенной биодеградации субстратов.

Таким образом, представленные в работе данные позволяют лучше понять механизмы биоконверсии аминоароматических веществ до безвредных минеральных соединений, существенно расширяют знания о структурно-функциональной организации микробных сообществ, как из естественных мест обитания, так и из искусственно созданных человеком очистных сооружений.

ВЫВОДЫ

1. Выделены и изучены анаэробные микробные сообщества, стабильно и с высокой активностью расщепляющие изомеры аминобензойной кислоты и 5-аминосалициловую кислоту до СН4 и СО2.

2. Показано влияние на процесс биодеструкции ряда физико-химических факторов:

адсорбции, перемешивания, температуры и рН культивирования, освещнности, природы и токсичности аминоароматического субстрата, присутствия легкоусваиваемых источников углерода и энергии.

3. Идентифицированы продукты первичной трансформации: для 2-АБК и салициловой кислоты - бензиловый спирт, для 5-АСК - 2-гидроксибензиловый спирт.

4. Определены основные интермедиаты процесса и установлено их соответствие бензоилКоА-пути деструкции аминоароматических соединений в выделенных метаногенных сообществах.

5. Из метаногенных сообществ различного происхождения выделено и идентифицировано до вида 5 чистых культур микроорганизмов, участвующих в процессе деструкции аминоароматики.

6. Установлено селективное воздействие аминоароматических субстратов на микробное сообщество, выражающееся в снижении биоразнообразия и последовательной смене доминирующих морфотипов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах 1.Линькова Ю.В., Есакова А.А., Дьяконова А.Т., Намсараев Б.Б., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Проверка способности анаэробных микробных сообществ к разрушению аминоароматических ксенобиотиков // Экология и промышленность России. 2011. №1. С.29Линькова Ю.В., Куликова И.А., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Деградация азокрасителей и ароматических аминов метаногенными микробными сообществами из илов очистных сооружений // Вода: химия и экология. 2011. №7. С.51-58.

3. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Гладченко М.А., Калюжный С.В., Котова И.Б., Стамс А., Нетрусов А.И. Метаногенная деструкция (амино)ароматических веществ анаэробными микробными сообществами // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т.47. №5.

С.558-565.

Тезисы конференций 1. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Структура анаэробных микробных сообществ, потребляющих аминоароматические субстраты // Биотехнология микробов. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума. Москва, МГУ, 20-23 октября 2004 г. М: МАКС Пресс, 2004. С.54.

2. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Анаэробные сообщества микроорганизмов, разрушающие аминоароматические соединения // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды. Материалы международной конференции. Саратов, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 14-16 сентября 2005 г. Саратов: Изд-во Научная книга, 2005. С.32.

3. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Деструкция некоторых ароматических соединений анаэробными микробными сообществами // 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых учных Биология-наука века. Тезисы докладов. Пущино, 10-14 ноября 2008 г. С. 268-269.

Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т. Деструкция ароматических веществ метаногенными микробными сообществами // Международная конференция Ломоносов-2009. Тезисы докладов. Москва, МГУ, 13-18 апреля 2009 г.М.: МАКС Пресс, 2009. С.161.

Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Метаногенные микробные сообщества, разрушающие ароматические соединения // Экологические проблемы промышленных городов. Материалы 4-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Саратов, СГТУ, 7-8 апреля 2009 г. С. 38-39.

Куликова И.А., Дьяконова А.Т., Линькова Ю.В., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Разрушение двух пищевых азокрасителей анаэробными микробными сообществами различного происхождения // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов. Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием.

Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, биологический факультет, 24-27 декабря 2009 г.

М.: МАКС Пресс, 2009. С.99.

Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Деструкция аминоароматических кислот анаэробными микробными сообществами // Экосистемы.

Организмы. Инновации-11. Труды научной конференции. Москва, МГУ им.М.В.Ломоносова, биологический факультет, 24 июня 2009 г. М.: МАКС Пресс, 2010.

Линькова Ю.В., Котова И.Б., Куликова И.А., Дьяконова А.Т., Нетрусов А.И.

Особенности физиологии анаэробных микробных сообществ, использующих аминоароматические вещества // Актуальные аспекты современной микробиологии.

Материалы VI молоджной школы-конференции с международным участием. Москва, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, 25-27 октября 2010 г. М.: МАКС Пресс, 2010. С.41.

Линькова Ю.В., Куликова И.А., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Биодеструкция трх азокрасителей анаэробными микробными сообществами Автотрофные микроорганизмы (к 85-летию со дня рождения академика РАН Е.Н.Кондратьевой).

Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, биологический факультет, 23-26 декабря 2010. М.: МАКС Пресс, 2010.