Работа выполнена в Лаборатории эволюции геномов эукариот Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
Доктор биологических наук, профессор Д.А. Крамеров
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
Кандидат биологических наук, А.А. Буздин Доктор биологических наук, профессор В.С. Прасолов
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра молекулярной биологии.
Защита диссертации состоится «_» декабря 2008 г. в ч на заседании Диссертационного совета Д 002.37.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул.
Вавилова, д. 34/5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии РАН по адресу по адресу:
119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.
Автореферат разослан «_» ноября 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат фарм. наук Л.С. Грабовская Актуальность проблемы За последние два десятилетия описано большое количество малых РНК длиной от 70 до 600 нуклеотидов, выполняющих в клетке самые разнообразные функции.
Исследования строения и функций таких РНК и их генов открывают большой пласт процессов жизнедеятельности клетки, основная роль в которых не принадлежит белкам.
Малые РНК участвуют в процессинге и модификации рибосомных РНК (U3 RNA, C/D box and H/ACA box RNAs), в сплайсинге мРНК (U1, U2, U4, U5, U6 RNAs), в котрансляционном транспорте белков через мембраны эндоплазматического ретикулума (7SL RNA), в регуляции клеточного цикла (7SK RNA). Ряд малых РНК принимает участие в регуляции генной активности (small interference RNAs).
Большая роль, которую малые РНК играют в клетке, делает особенно актуальным поиск некодирующих РНК и определение их возможных функций. Одним из важнейших аспектов в изучении низкомолекулярных РНК является анализ структуры и эволюции их генов. Данная работа посвящена исследованию организации, эволюции и особенностям транскрипции генов одной из малых РНК грызунов – 4,5SH РНК.
Большинство малых РНК высоко консервативны и широко распространены среди млекопитающих. Однако несколько видов низкомолекулярных РНК, выделенных из грызунов, отсутствуют у млекопитающих других отрядов. Наиболее изучена ВС1 РНК, выделенная из клеток представителей таких различных семейств грызунов, как мышиные (мыши, крысы), с одной стороны, и свинковые (морские свинки), с другой. При этом она отсутствует у человека, быка, кролика. ВС1 встречается только в клетках нервной ткани, как и ее аналог, РНК ВС200, выделенная из клеток человека и других приматов. ВС1 и ВС200 обладают небольшой гомологией в 3`-концевых районах. В дендритах обе эти РНК локализуются в областях, где происходит трансляция мРНК, и, возможно, участвуют в регуляции этого процесса. Показано, что BC1 способна взаимодействовать своей Абогатой 3'-концевой половиной с поли(А)-связывающим белком и фактором инициации трансляции eIF4A. Именно этим, видимо, объясняется способность BC1 ингибировать трансляцию (Wang et al, 2005).
Другие РНК, обнаруженные в клетках крыс и мышей, но отсутствующие у человека и кролика, были описаны еще в 1970-х годах и названы 4,5SI РНК и 4,5S РНК (последнюю позднее Harada et al, 1986, обозначили как 4,5S РНКН, далее в наших работах – 4,5SH РНК). 4,5SI РНК встречается у грызунов только четырех родственных семейств (мышиные, хомячьи, слепышовые и бамбуковые крысы) и демонстрирует значительную консервативность нуклеотидной последовательности, что свидетельствует о ее вероятной функциональности (Gogolevskaya and Kramerov, 2002). 4,5SI РНК и 4,5SН РНК широко распространены в различных видах клеток и тканей. 4,5SН РНК обнаруживают ассоциированной с поли(А)-содержащими РНК, но ее функция остается неясной.
Все рассмотренные РНК объединяют следующие свойства: они синтезируются РНК-полимеразой III, имеют узкий круг распространения и обладают явным родством с тем или иным коротким ретропозоном (или коротким диспергированным элементом SINE, Short Interspersed Element). 5`-концевые участки ВС1 и ВС200 РНК гомологичны ID- и Alu- элементам соответственно. 4,5SI РНК обладает некоторым сходством с элементом В2. Наконец, 4,5SН РНК на большей части своей длины высокогомологична элементу В1. Специально для обозначения РНК с узким кругом распространения был введен термин стеноРНК (Gogolevskaya and Kramerov, 2002). Группу стеноРНК составляют все рассмотренные малые РНК и ряд других. Узкое распространение свидетельствует о недавнем возникновении этих РНК в эволюции. Поэтому они могут быть очень удобными и ценными объектами для изучения процессов (механизмов) образования новых функциональных РНК и их генов.
4,5SI РНК закодирована в нескольких десятках генов, рассеянных по геному (Takeuchi and Harada, 1986). В отличие от этого, гены 4,5SН РНК в геномах мыши и крысы входят в состав длинных (4.2 и 5.3 т.п.н. соответственно), тандемно повторяющихся последовательностей (700 – 850 копий) (Schoeniger and Jelinek, 1986). Нуклеотидная последовательность такого повтора из генома мыши была секвенирована; это позволило показать, что каждый повтор содержит лишь один ген 4,5SН РНК (Schoeniger and Jelinek, 1986). Таким образом, 4,5SН представляет интерес как пример эволюционно молодой РНК, а также с точки зрения необычной организации ее генов в геноме.
В нашей лаборатории И.К. Гоголевской был исследован круг распространения 4,5SН РНК. Используя Нозерн-гибридизацию и ПЦР, она показала, что распространение 4,5SН РНК ограничено шестью родственными между собой семействами грызунов. Далее, клонируя и секвенируя кДНК, Гоголевская строго доказала наличие 4,5SН РНК в тканях грызунов, принадлежащих этим семействам. Анализ последовательностей кДНК (рис. 1) выявил, с одной стороны, явную консервативность этой РНК, а с другой стороны – определенный уровень ее гетерогенности внутри каждого организма. Такая гетерогенность скорее всего связана с небольшими различиями между генами 4.5SН РНК внутри одного генома.
Исследования характера организации генов 4.5SН РНК в различных семействах грызунов, а также определение роли прилегающих к ее гену последовательностей до сих пор не проводилось.
Rno кДНК вариант 1 был представлен двумя клонами, Ama кДНК варианты 1 и 2 были представлены соответственно тремя и двумя клонами. Все остальные варианты кДНК были представлены по одному клону. Различия в числе остатков Т на 3'-конце может быть объяснено стохастическим характером терминации РНК-полимеразы III. GenBank АС крыса AY228147-AY228151, золотистый хомячок AY228157-AY228159, слепыш AY228152-228156, большой тушканчик AY228144-AY228146.
Целью данной работы было исследовать характер организации последовательностей, содержащих ген 4,5SН РНК, у представителей различных семейств грызунов, а также определить роль последовательностей, прилегающих к гену данной РНК, в его транскрипции.
В связи с этими целями нами были поставлены следующие задачи:
Установить, включен ли ген 4,5SН РНК в геномах представителей последовательностей ДНК.
Показать тандемное расположение таких повторов, определить и проанализировать нуклеотидные последовательности некоторых из них.
последовательности, прилегающие к гену 4,5SН РНК, могут быть важны для ее эффективности.
Проверить, используя трансфекцию в клетки HeLa, насколько важны 5'прилегающие последовательности для транскрипции гена 4,5SН РНК в живой Было определено, что в геномах представителей различных семейств грызунов (мышиные, хомячьи, слепышовые и тушканчиковые) ген 4,5SН РНК включен в состав длинных повторяющихся последовательностей (4,5SН-повторов). Длина таких повторов варьирует от 4,0 т.п.н. у большого тушканчика до 5,3 т.п.н. у крысы. Показано, что в геноме большого тушканчика 4,5SН-повторы организованы тандемно. Полностью определены нуклеотидные последовательности 4,5SН-повторов из геномов большого тушканчика и крысы, частично - из генома слепыша. Показано, что нуклеотидные последовательности 4,5SН-повтора у филогенетически отдаленных видов (мышь, слепыш, тушканчик), не содержат протяженных участков гомологии, за исключением собственно гена 4,5SH РНК. У близкородственных видов (мышь и крыса) длинные области гомологии чередуются c протяженными, видоспецифическими вставками и делециями. Для всех последовательностей. В экспериментах по транскрипции in vitro с помощью экстрактов клеток асцитной карциномы Эрлиха и клеток HeLa установлено, что высокая эффективность транскрипции может сильно изменяться при замене последовательностей 4,5SН-повтора, прилегающих к началу гена. Были выявлены: (а) последовательности ДНК, которые могут поддерживать транскрипцию гена 4,5SH РНК на высоком уровне, (б) последовательности, умеренно благоприятные для транскрипции, (в) последовательность, снижающая транскрипцию гена 4,5SH РНК на 2-3 порядка. Показано, что существует не одна уникальная последовательность, которая, будучи расположена перед геном, способствует его активной транскрипции, но нередко встречаются и другие (причем случайные) последовательности, также позволяющие этому гену эффективно транскрибироваться in vitro. Исследования по транскрипции гена 4,5SН РНК в клетках HeLa показали высокую значимость нативных последовательностей 4,5SН-повтора для эффективной транскрипции изучаемого гена.
В данной работе впервые исследована структура необычной генетической системы - длинной тандемно повторяющейся последовательности, включающей ген малой РНК - с точки зрения ее эволюции и особенностей транскрипции. Разработанные подходы могут быть использованы для изучения как эволюции и транскрипции генов других малых РНК, так и различных повторяющихся последовательностей.
Результаты работы были представлены на Международной Конференции «Advances in Molecular Cell Biology» (Москва, 17 - 18 июня 2004 г.) и на ежегодных научных конференциях аспирантов ИМБ РАН (2004 г. и 2005 г.).
По материалам диссертации опубликованы 2 печатные работы, из них 2 статьи.
Диссертация изложена на 115 страницах, содержит 18 рисунков и 3 таблицы.
Работа включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список цитированной литературы, включающий 243 источника, и приложение.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Консервативность тандемной организации генов 4,5SН РНК.
Для мыши и крысы был показан особый характер организации генов 4,5SН РНК (Schoeniger and Jelinek, 1986). В их геномах длинная (4,2 и 5,3 т.п.н. соответственно) последовательность, содержащая ген 4,5SH РНК, образует кластер из нескольких сотен тандемно организованных повторов. Чтобы проанализировать, консервативна ли такая организация повторяющейся последовательности для представителей других семейств грызунов, геномную ДНК малого слепыша, большого тушканчика, золотистого хомячка, крысы и домовой мыши (взятой в качестве контроля), обрабатанную рестриктазами Eco RI, Bam HI, Hind III, гибридизовали по Саузерну с радиоактивным зондом, специфичным для гена 4,5SН РНК. Для всех исследуемых видов было показано наличие по крайней мере одной гибридизационной полосы, яркость которой сопоставима с полосой, наблюдаемой в случае мыши (рис 2).
Это указывает на то, что у анализируемых нами видов ген 4,5SН РНК входит в состав повторяющейся последовательности. Такую последовательность мы назвали 4,5SH-повтором.
Чтобы проверить, сохраняется ли тандемная организации 4,5SH-повтора в эволюции, мы провели исследование этой последовательности у большого тушканчика, представителя семейства Dipodidae, наиболее отдаленного от Muridae среди семейств, обладающих геном 4,5SН РНК. Геномную ДНК тушканчика, переваренную в различной степени рестриктазой Bgl II, гибридизовали со специфическим зондом (рис.
3).
Рис. 3. Тандемная организация 4,5SH-повтора из генома большого тушканчика.
А. Блот-гибридизация по Саузерну частично переваренной рестриктазой Bgl II геномной ДНК тушканчика. Время реакции составляло 60 минут для частичного переваривания и 180 минут – для полного. 4.0 т.п.н. и 8.0 т.п.н. фрагменты (указаны стрелками) соответствуют мономеру и димеру 4,5SH-повтора. Б. ПЦР-анализ 4,5SH-повтора из генома большого тушканчика. I – схема ПЦР. Праймеры (обозначены маленькими стрелками) напралены к концам 3.1т.п.н. Eco RI-фрагмента (светло-серый бокс). 1 т.п.н.
Eco RI-фрагмент обозначен темно-серым. Показаны три тандемные единицы. II.
Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле. Количество геномной ДНК большого тушканчика, использованной в реакции, обозначено внизу.
При полном переваре наблюдалась полоса 4 т.п.н., а при ограниченном переваре появлялась также полоса 8 т.п.н. Эти полосы мы интерпретировали как мономер и димер тандемно повторяющейся единицы.
Полученные данные согласуются с гипотезой о тандемной организации изучаемой последовательности в ДНК тушканчика. Но, поскольку повторяющаяся единица достаточно велика, трудно получить “лесенку” из большего числа олигомеров. Поэтому мы сочли необходимым подтвердить полученные данные с помощью другого эксперимента. В ходе дальнейшей работы был клонирован и секвенирован фрагмент 4,5SH-повтора тушканчика размером 3,1 т.п.н., ограниченный сайтами рестриктазы Eco RI. Это дало возможность провести ПЦР с использованием праймеров, комплементарных концам известной последовательности и направленных наружу (рис. 3). При такой направленности праймеров продукт может быть получен, только если повторы расположены тандемно. Как и ожидалось, в ходе ПЦР с различным количеством ДНКматрицы были получены фрагменты ДНК размером около 1 т.п.н. (рис. 3), что полностью подтверждает тандемное расположение последовательностей, содержащих ген 4,5SН РНК.
Таким образом, можно утверждать, что тандемная организация последовательности, содержащей ген 4,5SН РНК, характерна не только для мыши и крысы (Schoeniger, Jelinek, 1986), но и для филогенетически отдаленного от них большого тушканчика. Поэтому высока вероятность того, что в геномах представителей других семейств, более близких к мышиным, нежели тушканчиковые, эта последовательность также организована как тандемный повтор.
Анализ нуклеотидных последовательностей 4,5SН-повтора.
Нуклеотидная последовательность 4,5SН-повтора была нами определена полностью (большой тушканчик и крыса) или частично (малый слепыш).
Нуклеотидная последовательность собственно гена 4,5SН РНК тушканчика очень сходна с таковой у мыши, в то время как вся остальная часть 4,5SН-повтора большого тушканчика практически не обладала сходством с 4,5SН-повтором мыши. Однако по крайней мере перед геном можно наблюдать небольшие участки гомологии с последовательностями мыши (рис. 4). Как и у мыши, повторяющаяся единица тушканчика богата простыми последовательностями (рис. 5).
Eco RI фрагмент 4,5SН-повтора слепыша размером 2.0 т.п.н. был клонирован и один из клонов был частично секвенирован. Нуклеотидная последовательность гена 4,5SН РНК, содержащегося в этом клоне, несколько отличалась от установленных нами последовательностей кДНК слепыша (однонуклеотидные замены на протяжении всей последовательности и 10нуклеотидная вставка в 3`-области гена) (рис. 4). Однако внутренний промотор и терминатор РНК-полимеразы III остались неизмененными.
Возможно, этот ген является представителем особого подсемейства генов 4,5SН РНК.
Последовательности, фланкирующие ген, обнаруживают короткие участки гомологии с последовательностями мыши (рис. 4). Видимо, у слепыша повторяющаяся единица также богата простыми последовательностями, поскольку на секвенированном участке длиной 960 пн представлены две простые последовательности - (TG)16 и (GA)17.
Рис. 4. Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена 4.5SH РНК и его фланкирующих последовательностей длиной 100 н.п. Точка старта транскрипции обозначена «1». Обозначены боксы А и В и терминатор РНК-полимеразы III (Т7). Номера доступа GenBank X60026, AY228160, AY828231 и AY828230 для мыши, крысы, слепыша и большого тушканчика соответственно.
Schoeniger & Jelinek (1986) оценили величину повторяющейся единицы, включающей ген 4,5SН РНК, в геноме крысы в 5,3 т.п.н., но не определили ее нуклеотидную последовательность. Нами было обнаружено, что рестриктаза Bam HI вырезает фрагмент 2,2 т.п.н., содержащий ген 4,5SН РНК. Было получено несколько клонов, содержащих этот фрагмент, и один из них был секвенирован (номер доступа в GenBank AY228160).
последовательностями мыши, как и ожидалось, была заметно выше, чем у тушканчика и слепыша (рис. 4). Поиск в Rat Genome DataBase базе данных геноме крысы участков, сходных с этим 2,2 т.п.н. фрагментом ДНК выявил не аннотированный длинный фрагмент генома крысы (номер доступа в GenBank AC109432.2), содержащий три полноразмерные повторяющиеся единицы, включающие ген 4,5SН РНК. Таким образом, мы получили возможность сравнить полноразмерные 4,5SН-повторы не только у отдаленных видов (мышь и большой тушканчик), но и у близкородственных (мышь и крыса).
Рис. 5. Расположение простых последовательностей в 4,5SH-повторе крысы, мыши и большого тушканчика. Ген 4,5SН РНК обозначен черным цветом, простые последовательности – серым. Указаны нуклеотидные последовательности повторяющихся единиц.
При выравнивании нуклеотидных последовательностей повторяющихся единиц, включающих ген 4,5SН РНК, мыши и крысы мы обнаружили, что участки гомологии прерываются последовательностями, имеющимися только у одного из этих видов.
Видимо, видоспецифические последовательности появились в результате делеций и вставок, произошедших после дивергенции этих двух видов грызунов. Сами последовательности гена практически идентичны у крысы и мыши. Уровень сходства между другими гомологичными последовательностями 4,5SН-повтора крысы и мыши составляет около что характерно для нейтрально эволюционирующих последовательностей этих двух видов (O'HUigin and Li, 1992). В 4,5SН-повторе крысы, как и у мыши, тушканчика и слепыша, часто встречаются простые последовательности.
Некоторые из них сходны по локализации и образующим их мотивам с простыми последовательностями 4,5SН-повтора мыши, хотя и могут иметь иную протяженность (рис. 5). Видимо, в эволюции повторяющейся последовательности, содержащей ген 4,5SН РНК, большую роль играют не только замены нуклеотидов, но и особенно протяженные вставки и делеции, а также амплификация простых последовательностей.
Транскрипция гена 4,5SН РНК мыши в системе in vitro Значение 5'-фланкирующих последовательностей 4,5SH-повтора для транскрипции Первоначально нашей целью было выяснить, значимы ли 5'-фланкирующие последовательности гена 4,5SH РНК для его транскрипции, или для обеспечения ее необходимого уровня достаточно наличия внутреннего промотора. Для этого на основе последовательностей 4,5SH-повтора мыши нами были созданы конструкции, включающие ген 4,5SH РНК мыши с расположенными перед ним участками длиной 700 п.н.
«