на правах рукописи

КАЗАКОВА Лейли Хыдыркулыевна

ОБМЕН МАКРОЭЛЕМЕНТОВ

У КЛАРИЕВОГО СОМА Clarias gariepinus (Burchell, 1822)

ПРИ РАЗНЫХ ИСТОЧНИКАХ ЭКЗОГЕННОГО КАЛЬЦИЯ

03.00.13 – физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2009 1

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии животных Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Иванов Алексей Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Панов Валерий Петрович доктор сельскохозяйственных наук, профессор Раденко Вера Николаевна

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ирригационного рыбоводства»

Защита диссертации состоится «09» ноября 2009 г. в 16-30 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.09 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 49, ученый совет РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ им. Железнова ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан «07» октября 2009 г и размещен на сайте университета www.timacad.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.А. Ксенофонтова

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БГКП – бактерии группы кишечной палочки ЖКТ– желудочно-кишечный тракт КМАФАнМ – количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов КОЕ – колониеобразующая единица мг% – миллиграммов в 100 г ПСР – полусинтетический рацион ПЧ – пищевые частицы ПЭФ – плотная эндогенная фракция РФ – растворимая фракция СОЭ – скорость оседания эритроцитов СВ – сухое вещество ЦХ – цельный химус

I.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важным условием полноценного кормления является обеспечение организма животных минеральными веществами в необходимых количествах и соотношениях.

В настоящее время подробно описаны внешние проявления недостатка и избытка макроэлементов в организме животных, пути поступления и выведения из организма, особенности минерального обмена у разных видов (Георгиевский В.И., 1979, Кальницкий Б.Д., 1985, Хеннинг А., 1976). Показано, что макроэлементы, присутствующие в химусе, имеют четко выраженную локализацию у животных, принадлежащих к разным таксономическим группам (Полякова Е. П., 1996, 2003, 2005; Полякова Е.П., Ксенофонтов Д.А., Ксенофонтова А.А., 2000; Кибеб Л. Г., Каширина Н.А., 2001; Полякова Е.П., Иванов А.А., Ревякин А.О. и др. 2003; Ксенофонтов Д. А., 2008).

Преобладающим макроэлементом в животном организме является кальций (1,2 – 1,5% в сыром веществе). Он является основным структурным компонентом скелета, участвует в процессах генерации нервных импульсов, работы мышц, свертываемости крови. В последнее время обнаружено его присутствие в большом количестве в полостной слизи и высказано предположение о важности кальция для слизистых образований желудочнокишечного тракта птиц и млекопитающих, участвующих в процессе полостного гидролиза (Полякова Е. П., 1996; Полякова Е.П., Иванов А.А., Ревякин А.О. и др., 2003; Ксенофонтова А.А., 2004).

Процессы пищеварения у рыб изучены в меньшей степени. Однако исследования последних лет показали, что для этих животных характерны основные закономерности образования химуса, содержания и распределения в нем минеральных элементов, обнаруженные у птиц и млекопитающих (Полякова Е. П., 2003). Однако особенности пищеварения и минерального обмена у рыб изучены недостаточно. Это в равной мере касается и такого перспективного объекта рыборазведения, как клариевый сом.

Цель и задачи исследования. Целью нашей диссертационной работы являлось изучение влияния экзогенного кальция на обмен макроэлементов и особенностей формирования химуса у рыб.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. изучить влияние кальция рациона и кальция воды на рост и физиолого-биохимические показатели рыб;

2. выяснить особенности структурирования химуса рыб и 3. изучить роль экзогенного кальция в структурировании химуса рыб;

4. выяснить влияние кальция на метаболизм фосфора, магния, натрия 5. изучить участие кожной слизи рыб в минеральном обмене.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые на фоне разного уровня Ca в воде и в рационе изучена взаимосвязь энтерального метаболизма макроэлементов с их гомеостазированием во внутренней среде на примере клариевого сома. Изучен метаболизм кальция у клариевого сома при ограничении его поступления в организм через экзогенные источники. Изучена структура химуса рыб. Показана локализация макроэлементов в энтеральной среде рыб. Выявлена адсорбирующая способность слизей ЖКТ рыб по отношению к минеральным элементам. Обнаружены идентичные свойства полостной и наружной слизи накапливать макроэлементы, а также бактериостатические свойства кожной слизи рыб.

Результаты исследований позволяют скорректировать сложившийся в современном научном сообществе взгляд на процессы пищеварения и роль в них катионов. Полученные данные могут быть использованы в учебных целях, для планирования дальнейших исследований процессов пищеварения, при уточнении минерального состава рационов кормления рыб, для разработки концепций питательного гомеостаза, диетического питания и пищеварения.

Апробация результатов исследований. Основные положения диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на Международной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 140-летию РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2005), Международной научной конференции молодых ученых «Приоритетный национальный проект «Развитие АПК» - новые возможности для молодых ученых» (Москва, 2006), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной выдающимся педагогам Петровской академии (Москва, 2008), XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2009», Международной научной конференции молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в развитие инноваций аграрной науки» (Москва, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

На защиту выносятся положения 1. клариевый сом (возраст 1 год) устойчив к длительной депривации 2. уровень кальция в химусе рыб относится к жестким константам 3. кальций участвует в структурировании содержимого желудочнокишечного тракта рыб;

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах компьютерного текста, включает в себя следующие разделы:

введение, обзор литературы, материалы и методика исследований, результаты собственных исследований, выводы, заключение, список литературы, включающий 211 наименований, из них 64 на иностранном языке, приложения.

Работа иллюстрирована 2 рисунками и 39 таблицами.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования были разделены на 2 этапа.

1. Изучение формирования энтеральной среды у пресноводных рыб.

2. Изучение влияния экзогенного кальция на обмен макроэлементов у клариевого сома. Этот этап состоял из двух частей:

• изучение влияния алиментарного кальция (опыт 1);

• изучение влияния степени минерализации воды (опыт 2).

Схема исследований представлена на рисунке 1.

Объектом первого этапа исследований были рыбы следующих видов – ленский осетр (Acipenser baeri), форель (Parasalmo mykiss), клариевый сом (Clarias gariepinus).

Рыб брали из промышленных условий, где они содержались согласно технологиям, рекомендованным для каждого вида. Изучали структуру химуса и локализацию катионов во фракциях химуса.

Объектом второго этапа исследований служили самцы и самки клариевого сома (Clarias gariepinus Burchell, 1822) в возрасте 1 года, со средней живой массой 1161 г, в количестве 29 голов.

Опыты проводились в условиях кафедры физиологии и биохимии животных РГАУ-МСХА им. К.А.Тимирязева в период с марта 2005 по март 2007 года, лабораторные анализы и обсчет результатов проводили с марта по март 2008 года.

Рыб содержали в аквариумах объемом 400 л, при температуре 27С.

Ежедневно производили подмену воды на 1/3 объема водой соответствующего состава.

На клариевых сомах провели два опыта. В первом опыте исследовали влияние поступления кальция из корма на состав энтеральной среды. Для этого в качестве корма рыбам предлагался полусинтетический рацион (ПСР) с фиксированным содержанием кальция. Для группы 1 использовался вариант рациона c очень низким содержанием кальция, для группы 2 – с добавлением элемента. Состав рационов представлен в таблицах 1 и 2. Рацион сходной рецептуры использовал Гусев Е.Е. (1970; 1970а) на карпах. Поэтому мы посчитали его пригодным для кормления всеядных рыб, к которым относится и клариевый сом.

Во втором опыте изучали влияние кальция в составе воды на минеральный обмен. Для этого группу 3 содержали в дистиллированной воде, а группу 4 – в водопроводной, дехлорированной путем отстаивания. Обе группы получали промышленный комбикорм «AQUAVALENT» FM 44/18 EX (Табл. 2).

Таблица 1. Состав полусинтетических рационов бумага, г Рыб в начале первого опыта в течение двух недель адаптировали к дистиллированной воде, используя дистиллят вместо водопроводной воды при ежедневной подмене. Затем в течение недели рыб приучали к новым кормам.

Аналогично во втором опыте рыб из группы 3 адаптировали к дистиллированной воде. Тридцать дней рыб в обоих опытах содержали в экспериментальных условиях, затем проводили взятие образцов органов, тканей и химуса.

ОБМЕН МАКРОЭЛЕМЕНТОВ

У КЛАРИЕВОГО СОМА ПРИ РАЗНЫХ ИСТОЧНИКАХ

ЭКЗОГЕННОГО КАЛЬЦИЯ

+дистиллированная дистиллированная +дистиллированная водопроводная (минерализация (минерализация (минерализация Рис. 1. Схема исследований Часть химуса фракционировали по методике, разработанной на кафедре физиологии и биохимии животных с выделением пищевых частиц (ПЧ), плотной эндогенной фракции (ПЭФ) и растворимой фракции (РФ) (Георгиевский В. И., Полякова Е. П.,1998).

Все образцы высушивали до абсолютно сухого вещества, определяли массу и процентное содержание сухого вещества в сыром, озоляли и определяли массу и процентное содержание золы в сухом веществе по общепринятым методикам. Далее определяли содержание кальция, магния, калия и натрия методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии, фосфора – колориметрическим методом (Георгиевский В.И., Полякова Е.П., 1977).

В образцах цельной крови определяли следующие показатели: СОЭ, содержание гемоглобина, осмотическую резистентость эритроцитов по традиционным методикам. В сыворотке крови и кожной слизи изучали содержание альбуминов, глюкозы и мочевины с использованием тест-наборов «Агат» и «Ольвекс Диагностикум».

Таблица 2. Химический состав полусинтетического рациона и комбикорма Микробиологические исследования кожной слизи проводили в лаборатории кафедры микробиологии. Исследовали рыб, содержавшихся в водопроводной воде. Брали образцы кожной слизи и воды из аквариума.

Определяли количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) чашечным методом Коха, Clostridium perfringens и бактерий группы кишечной палочки (БГКП) методом предельных разведений. Определяли состав доминирующих форм бактерий в воде и слизи и способность кожной слизи подавлять рост представителей таких родов бактерий как Bacillus sp., Sarcina sp., Erwinia sp., а также микромицетов родов Mucor, Penicillium, Aspergillus. Изучение антибиотической активности проводилось методом диффузии с применением бумажных дисков.

использованием программы MS Excel.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Структура химуса рыб и локализация катионов в его фракциях Данные, полученные при изучении химуса разных видов рыб, показали, что содержание сухого вещества в ЦХ этой группы животных подчиняется общим закономерностям.

Максимальное содержание СВ у всех рыб наблюдалось в химусе желудка (18-34%). После эвакуации химуса в проксимальный отдел кишечника, концентрация сухого вещества снижалась до 11-15%. В химусе дистального отдела кишечника содержание сухого вещества в среднем по трем видам рыб составило 13-15%.

Повышение влажности химуса в кишечнике объясняется разбавлением химуса секретами пищеварительных желез и пилорических придатков (у форели) в проксимальном отделе кишечника и выведением лишней воды из организма в дистальном. Последнее характерно для ЖКТ пресноводных рыб и не свойственно наземным животным.

Структура химуса у рыб не зависела от видовой принадлежности (Рис. 2).

В желудке на долю ПЧ приходилось 13-39% сухого химуса, на долю ПЭФ – 32на долю РФ – 26-54%. В проксимальном отделе кишечника межвидовые различия были еще менее выражены. На долю ПЧ приходилось 2-10%, на долю ПЭФ – 19-23%, РФ – 65 – 81% сухого вещества химуса. В химусе дистального отдела кишечника содержалось 14-19% ПЧ, 19-27% ПЭФ, 59-64% РФ.

Рис. 2. Структура химуса рыб.

Высокое содержание растворимой фракции в дистальном отделе кишечника характерно только для пресноводных рыб. У наземных животных наблюдается снижение концентрации этой фракции в химусе толстого кишечника из-за всасывания воды. Вместе с тем, ПЭФ + РФ в нативном химусе рыб образуют единое целое и составляют его основной объем, как и у наземных животных.

Изучение локализации катионов во фракциях химуса рыб показало следующее. Кальций накапливался в ПЭФ по мере продвижения по желудочно-кишечному тракту от 979 мг% в СВ у форели, 317 мг% в СВ у осетра и 823 мг% в СВ у сома в желудке до 7422 мг% в СВ, 3146 мг% в СВ и 2501 мг% в СВ соответственно в дистальном отделе кишечника. В ПЧ концентрация элемента снижалась с 7101 мг% в СВ в желудке форели, мг% в СВ в желудке осетра и 1860 мг% в СВ у сома до 6258 мг% в СВ, мг% в СВ и 595 мг% в СВ соответственно в дистальном отделе кишечника. В РФ содержание кальция было минимальным и составляло в среднем у форели 1791 мг% в СВ, у осетра – 1664 мг% в СВ, у сома – 3416 мг% в СВ.

Натрий у всех видов рыб, как и у птицы и млекопитающих (Полякова Е.

П., Сунатро К., Георгиевский В. И., 1990; Полякова Е.П., Ксенофонтов Д.А., Ксенофонтова А.А., 2000), концентрировался преимущественно в РФ. У форели содержание элемента в растворимой фракции было на уровне 4772 мг% в СВ, тогда как в ПЧ и ПЭФ кальция содержалось в среднем 1036 мг% и мг% в расчете на СВ. В химусе осетра в РФ содержание натрия было на уровне 2849 мг% в СВ, в ПЧ и ПЭФ – 452 и 652 мг% в СВ соответственно. У клариевого сома в сухом веществе РФ обнаруживалось 3526 мг% натрия, ПЧ и ПЭФ – 315 и 1298 мг% соответственно.

Полученные данные позволяют сделать выводы о важности ПЭФ для энтерального обмена кальция у рыб. Помимо того, что в ее составе элемент выводится из организма, вероятно, кальций необходим для нормального функционирования этой фракции и ее участия в полостном гидролизе. Мы предполагаем, что химус, и в первую очередь ПЭФ, гомеостазируются по содержанию кальция, с использованием эндогенных ресурсов рыбы.

3.2. Влияние экзогенного кальция на обмен макроэлементов у Для подтверждения тезиса о влиянии экзогенного кальция на обмен макроэлементов мы ограничивали поступление кальция в организм клариевых сомов из корма (опыт 1) и из воды (опыт 2). После 30-дневной выдержки в экспериментальных условиях определяли физиологическое состояние сомов, параметры энтерального обмена макроэлементов, распределение минеральных элементов в их организме. Результаты этих опытов представлены ниже.

3.2.1. Минеральный состав воды и кормов Анализ воды, используемой для содержания рыбы, показал, что зольность дистиллята была более чем в 44 раза ниже, чем водопроводной воды.

При этом в дистиллированной воде концентрация кальция оказалась в 50 раз, магния – в 80 раз, натрия – в 58 раз, калия – в 46 раз ниже, чем в водопроводной.

Также мы изучали минеральный состав ПСР и комбикорма (табл. 3).

Основные различия были обнаружены в содержании сухого вещества (50 % в ПСР и 90% в комбикорме), золы (1,2% в ПСР без кальция, 2,7% в ПСР с кальцием и 6,6 % в комбикорме (в сухом веществе)) и кальция (220 мг% в СВ в ПСР без кальция, 906 мг% в СВ в ПСР с кальцием, 1008 мг% в СВ в комбикорме). Концентрация остальных макроэлементов в кормах находилась на одном уровне. Содержание фосфора во всех видах кормов было 1391 мг%, магния – 234 мг%, натрия – 383 мг%, калия – 96 мг% в расчете на сухое вещество.

Таблица 3. Содержание сухого вещества, золы и минеральных элементов в вещество, % Зола, % в СВ Анализ макроминерального состава воды из первого опыта (группы 1 и 2) показал, что содержание кальция было на уровне 0,5 мг/л в группе 1 и 1,5 мг/л в группе 2. Концентрация магния в воде составляла 0,5 мг/л. Фосфор, калий и натрий не были обнаружены в дистиллированной воде.

Был проведен мониторинг суточного накопления макроэлементов в воде из бассейнов в опыте 2 (группы 3 и 4). Отбирали пробы воды объемом 500 мл непосредственно перед ее подменой и после подмены.

Наши исследования показали, что в воде концентрация всех макроэлементов, кроме фосфора, увеличивалась на протяжении суток. Так, за сутки содержание кальция в аквариуме с использованием дистиллята изменялось с 2,1 до 3,7 мг/л, в случае с водопроводной водой - с 18 до 33 мг/л.

Концентрация магния в аквариуме с использованием дистиллированной воде изменялась в пределах с 0,51 до 0,71 мг/л. В аквариуме с водопроводной водой содержание магния не изменялось в течение суток (9,1 мг/л). Содержание натрия при использовании дистиллята увеличивалось с 1,2 до 2,7 мг/л, в воде из аквариума с водопроводной водой - с 4,1 до 6,8 мг/л. Калий возрастал – с 0, до 0,3 мг/л, и с 0,7 до 1,6 мг/л соответственно. Концентрация фосфора в течение суток снижалась как при использовании дистиллированной воды (с 3, до 3,3 мг/л), так и водопроводной (8 – 4,8 мг/л).

Полученные данные подтверждают, что для рыб, содержавшихся в дистиллированной воде, основным источником кальция являлся корм.

3.2.2. Общее состояние, рост и развитие рыбы Наблюдение за рыбой показало, что ограничения потребления кальция и тип рациона не повлияли на поведение и общее состояние рыб. Рыбы во всех вариантах опытов активно питались, вели придонный образ жизни, демонстрировали типичное для своего вида поведение – всплывали для заглатывания воздуха, проявляли агрессию при выяснении иерархических отношений в группе.

Определение степени развития половой системы самцов и самок показало, что гонады у рыб находились на IV – V стадии по шкале зрелости (Анисимова И.М., Лавровский В.В., 1983).

За время опыта изменялась живая масса рыб. В группах 3 и 4 – отмечалось ее увеличение (с 1229±196 г до 1289±286 г и с 1304±105г до 1435±86 г соответственно). В первом опыте наблюдалось недостоверное снижение живой массы рыбы на в каждой группе.

В результате измерения гематологических показателей установлено, что скорость оседания эритроцитов (СОЭ) (1,9 мм/ч) и содержание гемоглобина (12,1 г%) у рыб разных групп не различались. Осмотическая резистентность