САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ГРАДОБОЕВА
Анастасия Евгеньевна
На правах рукописи
ЭКСПРЕССИЯ НАТИВНОГО И МОДИФИЦИРОВАННОГО ГЕНОВ
ИММУННОГО ИНТЕРФЕРОНА БЫКА В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ
SACCHAROMYCES CEREVISIAE И PICHIA PASTORIS
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистологияАВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2010
Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете в лаборатории биохимической генетики кафедры генетики и селекции
Научный руководитель: доктор биологических наук Падкина Марина Владимировна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, академик РАСХН, профессор, директор Всероссийского НИИ сельхозмикробиологии Тихонович Игорь Анатольевич;
доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник отдела молекулярной генетики НИИЭМ СЗО РАМН Мандельштам Михаил Юрьевич Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН
Защита состоится « » _ 2010 г. в часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб 7/9, СПбГУ, биологопочвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета
Автореферат разослан « »_ 20 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Л.А. Мамон
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. За последнее десятилетие иммунология претерпела глубокие изменения в связи с доказательством того, что иммунная система регулируется пептидными гормонами – цитокинами, действия которых подчиняются тем же закономерностям, что и процессы с участием классических гормонов и их рецепторов (Завьялов, 1993). На данный момент известна первичная структура нескольких десятков цитокинов, обеспечивающих дистанционное взаимодействие иммунокомпетентных клеток между собой. Изучение цитокинов имеет не только теоретическое, но и прикладное значение (Кетлинский, 1992).
Наиболее широкое применение в клинической практике получили интерфероны (ИНФ), представляющие собой естественную систему противовирусной защиты организма, а также оказывающие иммуностимулирующее, противовоспалительное, противоопухолевое и антимитотическое действие (Ершов и др., 1996). ИФН-, иммунный, синтезируется Т-лимфоцитами после стимуляции их митогенами, антителами, интерлейкином-2.
Иммунные интерфероны млекопитающих повышают бактерицидную и фунгицидную активность макрофагов и являются эффективными препаратами для лечения и профилактики различных заболеваний животных. Использование интерферонов в качестве лекарственного средства имеет существенные преимущества по сравнению с антибиотиками и химиотерапевтическими препаратами за счет широкого спектра действия, обусловленного активацией иммунной системы, и из-за отсутствия побочных эффектов.
С разработкой методов работы с ДНК in vitro появилась возможность клонировать и экспрессировать чужеродные гены в различных прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах и получать рекомбинантные белки в значительных количествах. Впервые препараты рекомбинантных цитокинов были получены из бактерий Escherichia coli (Дебабов, 1985). Однако E.coli являются условно патогенными микроорганизмами, и получаемый белок не удается полностью очистить от продуктов жизнедеятельности бактерий, поэтому препарат в той или иной степени является токсичным, что ограничивает применение его в медицине (Primrose, 1986). Использование непатогенных микроорганизмов (дрожжей), не содержащих токсических и пирогенных факторов, в качестве продуцентов рекомбинантных цитокинов млекопитающих позволяет использовать эти белки в ветеринарии.
Используя системы экспрессии различных видов дрожжей, а также подбирая условия культивирования, можно добиться достаточно высокого уровня выхода рекомбинантного белка. Однако следует отметить, что целью подобных экспериментов является, в основном, повышение продукции гетерологичных белков. При этом мало внимания уделяется самим продуцентам и процессам, происходящим в клетках микроорганизмов во время синтеза чужеродных белков. Очевидно, что такие исследования необходимы для успешного решения основной задачи биотехнологии – увеличения выхода целевого продукта.
Целью данной работы являлось получение штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris – продуцентов биологически активного ИФН- быка и изучение особенностей продукции гетерологичного белка клетками двух видов дрожжей.
В задачи исследования входило:
- получение вектора экспрессии, обеспечивающего синтез нативного и модифицированного -интерферона быка в клетках дрожжей P.
- получение штаммов-продуцентов биологически активного ИФНбыка на основе дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris;
- изучение протеолитической стабильности нативного и модифицированного белков;
- сравнение эффективности дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris в качестве систем экспрессии гетерологичных генов;
- изучение влияния экспрессии гетерологичного гена bIFNG на Научная новизна исследования. Впервые получен штамм дрожжей P.
pastoris – продуцент модифицированного ИФН- быка, обладающего повышенной протеолитической стабильностью. Впервые показано, что продукция рекомбинантного ИФН- быка приводит к повышению количества карбонилированных белков в клетках дрожжей и вызывает изменения, подобные оксидативному стрессу. Установлено, что дрожжи P.
pastoris являются более устойчивыми к различным стрессорным факторам.
Показано, что в клетках дрожжей P. pastoris синтезированный белок находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в случае S. cerevisiae он образует так называемые «тельца включения». Впервые показано, что сигнал ядерной локализации ИФН- млекопитающих обеспечивает транспорт гетерологичного белка в ядро дрожжевой клетки, что свидетельствует об эволюционной консервативности этого процесса.
Практическая значимость. Штаммы дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris, синтезирующие и аккумулирующие рекомбинантный ИФН- быка внутри клеток, могут быть использованы в качестве иммунопробиотической кормовой добавки для профилактики различных заболеваний животных.
Штамм – продуцент модифицированного ИФН- может быть использован для получения рекомбинантного белка и создания на его основе лекарственного препарата, аналоги которого в настоящее время в России отсутствуют.
Положения, выносимые на защиту:
1. Продукция рекомбинантного ИФН- быка оказывает на клетки дрожжей негативное влияние, подобное оксидативному стрессу. Различная устойчивость дрожжей S. cerevisiae и P.
pastoris к негативному воздействию продукции чужеродного белка обусловлена особенностями метаболизма.
2. Делеция десяти аминокислот на С-конце молекулы ИФНбыка повышает устойчивость белка к протеолитической деградации, не оказывая влияния на его биологическую 3. В молекуле ИФН- быка имеется сигнал ядерной локализации, который выполняет свою функцию в клетках дрожжей.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Московском международном конгрессе «Биотехнология – состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), на XXII международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Словакия, Братислава, 2005), в работе Школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, Пущино, 2006), на Седьмой международной научно-практической конференции «Исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 1 статья, патента и 4 тезисных сообщения.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на машинописной странице, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 194 наименования, и приложения.
Работа содержит 3 таблицы и 29 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы. В работе использованы следующие штаммы дрожжей S. cerevisiae: 1-GRF18 (MAT his3-11,15 leu2-31,11 pho3-1); 2P4-GRF (MAT his3-11,15 leu2-31,11 pep4); D576 (85-D600X62-D563: MAT leu2 arg4 HIS3 pho3Х MATа leu2 ARG4 his3 pho3) из коллекции лаборатории биохимической генетики, а также штамм дрожжей P.pastoris GS115 (his4) (Invitrogen).
Плазмиду pYGIB, содержащую ген bIFNG под контролем промотора и терминатора гена РНО5 дрожжей S. cerevisiae (Мясников и др., 1989), использовали для создания штаммов дрожжейсахаромицетов - продуцентов ИФН- быка.. В данной работе были получены плазмиды pBIG, pPIC9/BIGd10, pBIG/GFP и pBIGd10/GFP которые содержали нативный (bIFNG) или модифицированный (bIFNG30) структурные гены ИФН- быка, или эти гены, сшитые с геном GFP, под контролем промотора и терминатора гена АОХ дрожжей P. pastoris. (рис.1).
Рис.1. Схема плазмид pYGIB, pBIG, pBIGd10, pBIG(pBIGd10)/GFP.
Плазмиды pBIG, pBIGd10 были использованы для получения штаммов метилотрофных дрожжей – продуцентов рекомбинантных белков. Плазмиды pBIG/GFP и pBIGd10/GFP использовали при изучении локализации рекомбинантного белка в дрожжевой клетке.
Методы. Выделение плазмидной ДНК из бактерий и хромосомной ДНК из дрожжей, рестрикционный анализ, электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из геля, лигирование, ПЦР, трансформацию бактерий и дрожжей проводили в соответствии со стандартными методиками (Birnboim a Doli, 1979; Маниатис и др., 1984; Fujimura, 1997).
Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1992).
Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Иммунобллотинг проводили по стандартному методу (Bidwai, 1992).
Биологическую активность рекомбинантного ИФН определяли по подавлению цитопатической активности вируса везикулярного стоматита в культуре фибробластов трахеи эмбрионов коров (FBT) в соответствии с фармакологической статьей ФС 42-3433-97.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Создание штамма дрожжей S. cerevisiae – продуцента ИФН- быка Для создания штамма дрожжей S. cerevisiae – продуцента рекомбинантного ИФН- быка плазмидой pYGIB (Мясников и др., 1989) трансформировали гаплоидные штаммы 1-GRF18, 2P4-GRF18 и диплоидный штамм D576, в которых экспрессия генов, клонированных под контролем промотора гена РНО5, регулируется неорганическим фосфатом. На необходимость такой регуляции указывали ранее полученные данные о том, что продукция чужеродных белков негативно влияет на клетки дрожжей, снижая выход биомассы и, следовательно, значительно снижает количество полученного белка. Использование регулируемой экспрессии позволило уменьшить отрицательное воздействие ИФН- на рост дрожжей продуцентов, но не повлияло на митотическую стабильность рекомбинантной плазмиды.Штамм-продуцент на основе диплоидного штамма накапливал больше биомассы, но сравнение профилей элюции внутриклеточных белков диплоидного и гаплоидного штаммов при хроматографии на сефакриле S- показало наличие у диплоида большого количества примесных белков в области предполагаемого выхода ИФН-, что существенно осложнило бы очистку рекомбинантного белка.
Уровень продукции ИФН- быка был низким и не превышал 10 мг/л клеточной культуры даже у штамма 2P4-GRF18/pYGIB, у которого отсутствовала вакуолярная аспартилпротеаза А, принимающая участие в расщеплении гетерологичных белков (Woolford et al., 1986). Эти результаты позволили предполагать, что ИФН- является токсичным для дрожжей S.
cerevisiae.
Одним из путей снижения отрицательного воздействия чужеродного белка на жизнедеятельность клетки-хозяина является его секреция. Однако, ИФН- является гликопротеином, а структура углеводных компонентов секретируемых белков дрожжей S. cerevisiae и млекопитающих различна (Schultz et al., 1987), что не позволяет использовать данный вид дрожжей для создания секреторного продуцента ИФН-.
Особенности метаболизма дрожжей S. cerevisiae также создают неудобства использования их в качестве продуцентов рекомбинантных белков. В качестве конечного продукта усвоения углеводов образуется этанол, который ингибирует рост культуры, что также приводит к снижению продукции гетерологичного белка.
Как альтернативный организм-продуцент ИФН- быка нами были выбраны дрожжи P. pastoris, которые успешно используются для гетерологичного синтеза различных белков. Дрожжи P. pastoris способны использовать метанол в качестве единственного источника углерода.
Сильный промотор гена АОХ1, кодирующего структуру алкогольоксидазы – первого фермента утилизации метанола, регулируется источником углерода.
(Cereghino а. Cregg, 2000).
2. Создание штамма дрожжей P. pastoris – продуцента рекомбинантного ИФН- быка. Возможность получения штамма дрожжей P.
pastoris, обеспечивающего продукцию рекомбинантного ИФН- быка и секрецию синтезированного белка в культуральную жидкость была продемонстрирована ранее (Николаев и др., 2002). Было показано, что скорость роста штамма–продуцента не отличалась от исходного штамма, что говорило об отсутствии негативного влияния продукции рекомбинантного белка. Такие результаты могли быть связаны со снижением токсичности белка за счет секреции, или могли быть обусловлены особенностями самого штамма-продуцента.
Для выяснения этого вопроса получили штамм дрожжей P. pastoris, обеспечивающий внутриклеточное накопление ИФН- быка. Ген bIFNG клонировали в векторе экспрессии pPIC9, предварительно удалив из него сигнальную область альфа-фактора дрожжей S. cerevisiae ( MF ), отвечающую за секрецию рекомбинантного белка в культуральную среду.
Полученной плазмидой pBIG трансформировали штамм дрожжей P. pastoris GS115. При сравнении скорости роста исходного штамма и штаммапродуцента в условиях индукции обнаружили, что синтез чужеродного белка не подавляет рост дрожжей P. pastoris, в отличие от S. cerevisiae. При этом уровень продукции составлял около 20 мг/л.
Полученные данные позволяют говорить о том, что гетерологичный ИФН- оказывает негативное влияние на жизнедеятельность дрожжей S.
cerevisiae, но не влияет на P. pastoris, даже при внутриклеточном накоплении. Кроме того выяснилось, что в клетках дрожжей P. pastoris значительная часть ИФН- находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в клетках дрожжей S. cerevisiae рекомбинантный белок накапливается в виде так называемых «телец включения» и экстрагируется только с помощью детергентов (рис.2 ).
Рис. 2. Иммуноблот внутриклеточных белков штаммов 2Р4-GRF18/pYGIB (A) и GS115/pBIG (B).
М – маркеры молекулярной массы;
1 – водорастворимые белки;
2, 3, 4 – экстракция 1%, 2,5% и 5% ДСН, соответственно.
Эти данные, свидетельствующие о том, что форма нахождения гетерологичного белка и степень его влияния на жизнедеятельность организма-продуцента зависят от вида используемых дрожжей, стали основанием для изучения влияния экспрессии гетерологичного гена на клетки дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris. Подобные исследования проводили для бактериальных клеток и обнаружили, что синтез гетерологичных белков вызывает в клетках бактерий E. coli изменения, подобные оксидативному стрессу (Remaut et al., 1986). Однако, до настоящего времени отсутствовали данные о том, как изменяется физиологическое состояние дрожжей – продуцентов чужеродных белков.
3. Исследование адаптивной способности дрожжей S. cerevisiae и P.
pastoris к стрессорным воздействиям.
Одним из показателей оксидативного стресса является увеличение числа карбонилированных белков. Измерение содержания карбонильных групп в белках штаммов-продуцентов обоих видов дрожжей продемонстрировало их увеличение относительно исходных штаммов, выращенных в тех же условиях, приблизительно в 1,5 раза (рис.3).
D366/D280 0, Рис. 3. Содержание карбонильных групп в клеточных белках исходных штаммов и штаммов-продуцентов.
(Относительное содержание карбонильных групп определяли как соотношение поглощения при длине волны 366 нм к поглощению при длине волны 280 нм).
Полученные данные свидетельствуют о том, что продукция ИФНявляется стрессорным фактором для обоих видов дрожжей и вызывает изменения, подобные оксидативному стрессу. Однако у P. pastoris не наблюдается негативного влияния рекомбинантного белка и не происходит подавления роста дрожжей-продуцентов.
Таким образом, дрожжи P. pastoris являются более устойчивыми к продукции гетерологичных белков, чем S. cerevisiae. Возможным объяснением этого явления может служить то, что метилотрофные дрожжи являются аэробными организмами, а дрожжи-сахаромицеты относятся к факультативным анаэробам, что обусловливает определенные особенности метаболизма, в частности, утилизация источников углерода у дрожжей P.
pastoris происходит за счет аэробного окисления, а у дрожжей S. cerevisiae, в основном, за счет брожения. Известно, что в клетках аэробных организмов в качестве побочных продуктов дыхания образуются активные формы кислорода (АФК), которые могут вызывать повреждения нуклеиновых кислот, белков, липидов и снижать жизнеспособность клеток (Cadenas, 1989).
Штаммы-продуценты дрожжей P. pastoris растут на несбраживаемых источниках углерода, поэтому в течение всего периода культивирования у них активно функционируют митохондрии, вырабатываются АФК и увеличивается количество шаперонов и других белков, обеспечивающих защиту клеток от оксидативного стресса. В связи с этим, к началу синтеза гетерологичного белка в клетке дрожжей P. pastoris уже будет содержаться достаточно большое количество шаперонов, и, следовательно, они изначально оказываются более устойчивыми к стрессовым воздействиям, с которыми сталкивается клетка в процессе продукции чужеродного белка. Об этом свидетельствуют и наши данные о том, что уровень карбонилирования белков у исходного штамма P. pastoris превышает таковой у S. cerevisiae.
В работах по изучению влияния оксидативного стресса на клетки дрожжей было показано, что воздействие стрессорного фактора в небольшой дозе приводит к тому, что в дальнейшем клетка становится более устойчивой как к тому же виду стресса, так и к воздействиям других негативных факторов (Estruch, 2000). Если рассматривать продукцию рекомбинантных белков у штаммов-продуцентов рекомбинантного ИФН- как процесс, являющийся стрессом для клетки хозяина, можно было ожидать, что будет наблюдаться устойчивость к другим видам стрессорных факторов.
Действительно, клетки дрожжей-продуцентов рекомбинантного ИФН- быка демонстрировали большую устойчивость к перекиси водорода, чем клетки исходных штаммов (рис. 4, 5). При этом рост дрожжей S. cerevisiae прекращался при меньших концентрациях Н2О2, чем рост дрожжей P.
pastoris, то есть дрожжи-сахаромицеты оказались менее приспособленными к воздействию оксидативного стресса, что, очевидно, объясняется особенностями метаболизма обоих видов дрожжей (Градобоева, Падкина, 2008).
Рис. 4. Зависимость роста штаммов дрожжей S. cerevisiae 2P4-GRF18/pYGIB (A) и 2P4-GRF18 (B) от концентрации H2O2.
1 – 0,5 мМ Н2О 2 – 1 мМ Н2О 3 – 1,5 мМ Н2О Рис. 5. Зависимость роста штаммов дрожжей P. pastoris GS115/pBIG (A) и GS115 (B) от концентрации H2O2.
1 – 1 мМ Н2О 2 – 1,5 мМ Н2О 3 – 3 мМ Н2О Полученные результаты позволяют сделать вывод, что, помимо уже известных преимуществ использования дрожжей P. pastoris для экспрессии гетерологичных генов, мы наблюдаем более выраженную адаптацию самих клеток этого вида дрожжей к различным видам стрессорных факторов, в том числе к продукции гетерологичных белков, что обусловлено особенностями метаболизма данного вида дрожжей. Этим, вероятно, и объясняется тот факт, что накапливаемый в клетках дрожжей P. pastoris гетерологичный белок в основном находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как дрожжи S.
cerevisiae аккумулируют чужеродный белок в виде «телец включения».
4. Получение модифицированного ИФН- быка Полученные нами штаммы дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris – продуценты ИФН- быка можно использовать как кормовую иммунопробиотическую добавку. Однако, широкий спектр действия интерферонов, возможность лечения и профилактики различных заболеваний делает необходимым получение очищенного препарата ИФН- быка.
Выделение рекомбинантного белка из клеток дрожжей P. pastoris является трудоемкой процедурой, поэтому для этой цели лучше использовать секреторных продуцентов.
Ранее было показано, что секретируемый ИФН- подвержен протеолитической деградации. Анализ аминокислотной последовательности ИФН- человека выявил несколько потенциальных сайтов узнавания трипсиноподобными протеазами, два из которых расположены на С-конце молекулы (Татьков и др., 1995). Известно, что замена аминокислот в этой области приводит к потере биологической активности белка, тогда как удаление 10 аминокислот с С-конца молекулы ИФН- человека не влияет на биологическую активность белка, а напротив, ведет к повышению его стабильности, поскольку повышает устойчивость к действию протеаз (Мирошников и др., 2005).
«