Рис. 2. Влажная камера с Са- вокруг гранул с иммобилизоальгинатными гранулами. ванными клетками гриба Tolypocladium cylyndrosporum На рисунке 4 представлены кривые изменения площади мицелия T. cylindrosporum вокруг гранул с различным содержанием альгината: 0,5;1,0; 1,5; 2,0%.

Концентрацию крахмала внутри гранул составляла 1%.

Рис.4. Динамика изменения площади колонии мицелия Tolypocladium cylindrosporum вокруг гранул с различным содержанием альгината.

Минимальная концентрация альгината натрия, применяемого для иммобилизации, ограничивалась механическими свойствами получаемых гранул: гранулы с содержанием альгината кальция менее 0,5% очень неустойчивы и быстро механически разрушаются. Максимальная концентрация альгината ограничивалась вязкостью раствора: раствор с содержанием альгината натрия более 4% вязкий и его сложно применять в технологии иммобилизации.

Как видно из рисунка 4, площадь мицелия гриба вокруг гранулы уменьшалась пропорционально увеличению концентрации альгината в них. Максимальная площадь колонии на 12-е сутки достигается при росте из гранул с содержанием альгината 1% и равна 7,5 мм. Формы кривых роста практически не отличались друг от друга и имели S-образную форму. Можно предположить, что на прорастание и скорость роста мицелия из гранулы накладываются диффузионные ограничения, которые возрастают с увеличением концентрации альгината.

Характер роста и развития мицелия T.cylindrosporum из гранулы аналогичен росту гриба в свободном состоянии: после прорастания мицелия из гранулы происходит его рост, с последующим ветвлением и образованием конидиеносцев и спор гриба.

В дальнейшей работе для иммобилизации использовали альгинат натрия с конечной концентрацией 1%.

Для изучения влияния природы субстрата были выбраны крахмал, с концентрациями в грануле 0,5%; 1%; 1,5%, подсолнечное, соевое и льняное масла, с концентрациями 10%. Данные вещества являются высокомолекулярными или образуют эмульсию внутри гранул, что сводит к минимуму возможность их диффузии из гранулы после иммобилизации. Эксперименты по изучению роста гриба из гранул проводили в аналогичных условиях во влажной камере.

Рис. 5. Динамика изменения площади колонии мицелия Tolypocladium cylindrosporum вокруг гранул с различным содержанием крахмала.

Рис. 6. Динамика изменения площади колонии мицелия гриба Tolypocladium cylidrosporum вокруг гранул, содержащих различные масла (концентрация 10%).

На рисунках 5 и 6 представлены кривые изменения площади колоний гриба во времени при росте мицелия из гранул, содержащих различные субстраты. Видно, что наибольшая площадь мицелия к концу 12-х суток, равная 22 мм, достигалась при росте гриба из гранул, содержащих подсолнечное масло в концентрации 10% от объема (таблица 3) и выражается в сут -1.

При микроскопировании гранул отмечено, что в течение всего эксперимента гриб развивался аналогично росту в свободном состоянии: проросшие гифы начинали увеличиваться и ветвиться, далее образовывались конидиеносцы, и начиналось спорование. При росте T. cylindrosporum из гранул, содержащих масла, диаметр мицелия был заметно больше, чем при росте из гранул, содержащих крахмал.

Для сравнительной оценки роста гриба вокруг гранул был использован новый показатель – удельная скорость образования колонии. При этом были сделаны следующие допущения: поверхность колонии, растущей на стекле, достаточно однородна, а мицелий находится в одинаковом физиологическом состоянии в любой момент времени. Расчет данного параметра проводили по тангенсу угла наклона прямой, полученной при обработке S-образной кривой зависимости площади от времени в полулогарифмических координатах (таблица 3).

Из таблицы 3 видно, что расчетные значения удельной скорости роста колоний, выросших вокруг гранул с различными параметрами, имеют практически одинаковые значения для одних субстратов с различными концентрациями. Это свидетельствует, в первую очередь, о том, что диффузионные ограничения, возникающие как внутри гранулы при диффузии компонентов питания к клетке гриба, так и при диффузии компонентов питания из гранулы в окружающую среду и межклеточное пространство, не оказывают существенного влияния на скорость роста мицелия гриба из гранулы.

Характеристики роста Tolypocladium cylindrosporum из гранул с различными параметрами.

Альги- Альги- Крахмал нат 1% нат 1% Следует отметить, что оптимальными характеристиками гранулы для получения максимальной площади колонии вокруг гранулы T. cylindrosporum являются 1% альгината и 10% подсолнечного масла. При этом масло выполняет в грануле одновременно две функции: агента, придающего гранулам свойство положительной плавучести и субстрата для роста и развития гриба из иммобилизованного состояния в свободное.

6. Исследование ларвицидной активности бактерий Bacillus thuringiensis var.

israelensis в свободном и иммобилизованном состоянии Как было показано ранее, гибель первых личинок под воздействием иммобилизованных клеток гриба T. cylindrosporum начинается на 3-4-е сутки. Для бактериальных препаратов на основе Bti данная характеристика составляет несколько часов. Таким образом, очевидна целесообразность разработки новой препаративной формы по созданной нами технологии с использованием бактерий Bti.

Из нескольких штаммов Bti, полученных из коллекций Центра прикладной микробиологии (г. Оболенск), Института систематики и экологии животных Сибирского отделения РАН (г. Новосибирск) и ВКПМ (г. Москва), отобрали один, обладающий максимальной ларвицидной активностью.

Для этого провели глубинное культивирование 5 штаммов бактерий на Lбульоне при естественном значении рН 6,5-7,0, температуре 25°С и постоянном перемешивании на ротационной качалке при скорости 200 об/мин. Засев культур осуществляли с косяка из пробирки. Культивирование проводили в течение 48 часов. К этому моменту все клетки бактерий начинали спороваться и параллельно образовывали кристалл -эндотоксина, что контролировали при микроскопировании фиксированных препаратов.

Оценку ларвицидной активности штаммов Bti проводили на личинках комаров рода A.aegypty I – II возраста в лабораторных условиях по описанной выше методике. В сосуды с личинками вносили по 106КОЕ/мл глубинной культуры. В качестве контроля использовали сосуды с личинками без внесения микроорганизмов. Эксперименты с каждым штаммом проводили в 3-х повторностях. Через 24 часа проводили подсчет живых и мертвых личинок и далее рассчитывали процент их гибели. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Гибель личинок комаров Aedes aegypty под воздействием бактерий B.thuringiensis var. israelensis Штаммы Bti (коллекционный номер) % гибели личинок Aedes aegypti B.thuringiensis var. israelensis (1223) Из таблицы 4 видно, что все исследуемые штаммы Bti обладают достаточно высокой ларвицидной активностью. Для дальнейшей работы был выбран штамм Bti 1223 как один из наиболее активных.

Выбранный штамм иммобилизовали в 1% альгинате натрия с добавлением 10% подсолнечного масла для придания гранулам положительной плавучести.

Оценку ларвицидной активности полученных гранул проводили аналогично оценке активности гранул гриба. Доза гранул подбиралась из расчета 1 гранула на 1 см поверхности емкости, что соответствовало концентрации 10 6 КОЕ/мл.

Через 24 часа проводили подсчет живых и мертвых личинок и рассчитывали процент их гибели. После этого удаляли все личинки из емкости и добавляли аналогичное количество живых личинок того же возраста. Аналогичные операции повторяли в течение всего эксперимента, пока происходила гибель личинок комаров. Результаты представлены в таблице 5.

Изменение ларвицидной активности иммобилизованных клеток B.thuringiensis var. israelensis 1223 во времени.

Время Количество мертвых лиГибель личинок Aedes aegypti, % Полученные результаты свидетельствовали о том, что бактерии Bti, иммобилизованные в Са-альгинатном геле сохраняли ларвицидную активность. Ларвицидная активность препаративной формы сохранялась в течение 2-3 дней после внесения.

7. Создание препаративной формы Конечной целью данной работы было создание комплексного препарата, содержащего две культуры микроорганизмов. Важно было исследовать возможность иммобилизации микроорганизмов в одну гранулу и изучить взаимное влияние микроорганизмов.

Для этого были проведены серии экспериментов по изучению:

1. влияния свободных клеток бактерий на рост гриба из гранул. Для этого в чашку Петри с агаризованной средой Чапека засевали 0,1мл выращенной глубинно культуры бактерий Bti и в центр чашки помещали гранулу с иммобилизованным T. cylindrosporum. Контролем служил рост гриба на среде Чапека без добавления бактерий.

2. влияния на рост гриба клеток бактерий, иммобилизованных в одной грануле.

Для этого готовили гранулы с одновременно иммобилизованными клетками бактерий и гриба, помещали их на предметное стекло во влажную камеру и анализировали рост гриба из гранулы. Контролем служили гранулы, с иммобилизованными клетками T.cylindrosporum без добавления бактерий.

В варианте 1 роста гриба из гранулы не наблюдалось, а бактерии покрыли поверхность агара ровным газоном. В варианте 2 при иммобилизации бактерий и гриба в одной грануле отмечено, что рост T. cylindrosporum из гранулы происходит, при этом мицелий более тонкий и слабый, чем в контроле. Максимальная площадь колонии гриба на 8 сутки при росте из гранул с бактериями почти в два раза меньше, чем при росте из гранул без добавления Bti.

Из проведенных экспериментов можно сделать вывод, что бактерии угнетают рост грибов, поэтому иммобилизацию микроорганизмов T. cylindrosporum и Bti проводить в одной грануле не целесообразно.

Следующим этапом работы был подбор оптимального соотношения гранул, содержащих только бактерии или только грибы, в препаративной форме. Критериями для оценки эффективности препаративной формы были минимизациия времени начала гибели личинок и продолжительность действия препаративной формы. Для этого готовили смеси с различным процентным содержанием гранул с бактериями или грибами (таблица 6) и проверяли ларвицидную активность полученных препаративных форм. Эксперимент проводили с подсаживанием личинок.

Препаративные формы проверяли на ларвицидную активность по следующей методике. В емкость с водой помещали по 20 личинок комара Aedes aegypty I-II возраста. Далее вносили один из вариантов препаративной формы в концентрации 1 гранула на 1 см2 поверхности емкости.

Варианты исследуемых препаративных форм с различным содержанием гранул с T. cylindrosporum и Bti.

Первые 8 суток эксперимента через каждые 24 часа производили подсчет живых и мертвых личинок комаров. Мертвые личинки не удаляли из емкости. На 8-е сутки в емкость были подсажены по 20 личинок комара I-II возраста. В течение последующих 4-х суток эксперимента через каждые 24 часа проводили подсчет живых и мертвых личинок. На 12, 16 и 20-е сутки эксперимента в емкость проводили подсадку по 20 личинок I-II. Подсчет живых и мертвых личинок проводили каждые сутки в течение всего эксперимента. Дополнительное количество препарата в ходе всего эксперимента не вносили. Каждую неделю объем воды в емкостях доводили до первоначального отстоянной водопроводной водой. Личинки подкармливали сухим дейтритом в течение всего эксперимента. Эксперименты с каждой препаративной формой проводили в трех повторностях. В качестве контроля был проведен эксперимент по аналогичной схеме без внесения какой-либо препаративной формы.

Развитие личинок в контрольном эксперименте проходило по стандартным законам: к 8-м суткам в емкости была обнаружена одна мертвая и две окуклившихся личинки. На дне стакана были обнаружены хитиновые оболочки личинок, что свидетельствовало об их переходе в более старшую фазу. Все это свидетельствовало о нормальном развитии популяции личинок. Внесение дополнительного количества личинок на 8-е сутки не изменило общей тенденции развития популяции. К концу 12-х суток было обнаружено 3 мертвых личинок, 2 взрослых особи и 5 куколок. После внесения личинок на 12-е, 16-е и 20 сутки общая тенденция развития личинок сохранилась. После 12-х суток подсчет живых и мертвых личинок был крайне затруднен из-за высокой плотности популяции. Из описанных результатов можно предположить, что процент гибели в контрольном эксперименте не превышал 10% от общего количества личинок на каждой стадии внесения новых.

К концу эксперимента окуклилось и образовалось имаго не менее 20 (не менее 25%).

Таким образом, можно сделать вывод, что условия, созданные в контрольном эксперименте, позволяют нормально развиваться личинкам на протяжении дней, проходя характерные для них стадии развития: достижение 4 возраста, стадии окукливания и стадии имаго.

После внесения в емкость с личинками препаративной формы на основе клеток Bti первые мертвые личинки были обнаружены через несколько часов после внесения препарата. К концу первых суток 18-19 личинок (90-95%), не проявляли признаков жизни. В течение последующих 8 суток в одной из экспериментальных повторностей наблюдали 100% гибель личинок, в двух других повторностях После дополнительного внесения новых личинок в течение первых суток наблюдали незначительную гибель личинок, к 12-м суткам общее количество погибших личинок достигало 24-25 штук, что составляло 25% от вновь внесенных личинок. Большинство мертвых личинок было локализовано на дне сосуда, среди них наблюдались частично разложившиеся личинки. Единичные мертвые личинки плавали на поверхности воды в емкости. Образование имаго на данной стадии эксперимента не наблюдалось. Внесение новых личинок на 12, 16 и 20-е сутки не изменило общей картины гибели личинок: на каждом этапе наблюдали гибель 2- личинок на следующзие сутки после внесения. Начиная с 16-х, суток во всех повторностях наблюдали образование куколок и имаго, к концу эксперимента их количество было 7 и 3, соответственно.

Таким образом, препаративная форма на основе иммобилизованных клеток Bti воздействовало на личинок комаров в первые моменты времени после внесения. Начиная с 8-х суток эксперимента воздействие клеток Bti ослабевает и к 12-м суткам снижалось практически до нулевых значений. Личинки комаров, погибшие под воздействие прапаративной формы на основе клеток бактерий Bti не являлись источником поражения вновь внесенных личинок, о чем свидетельствовало образование куколок и имаго.

После внесения в емкость с личинками препаративной формы на основе клеток гриба T. cylindrosporum первые мертвые личинки были обнаружены на 4-е сутки. К 8-м суткам 18-20 личинок, что составляет 90-100%, было поражено грибом T.cylindrosporum. Характерным отличием личинок, пораженных грибом, является их локализация на поверхности раздела фаз, обездвижение и образование характерной «шапки» гриба на поверхности личинки. После внесения на 8-сутки дополнительного количества новых личинок к 12-м суткам практически вся популяция была обездвижена. Визуальный анализ показал, что более 80% процентов всей популяции поражены грибом. Последующее снесение новых личинок на 12, 16 и 20-е сутки не изменило общей тенденции в поражении личинок грибом T.

cylindrosporum. К концу эксперимента не было выявлено ни одной куколки и имаго. Мертвые личинки, в большинстве своем, были локализованы на поверхности с визуальными признаками поражения грибом.

Эксперимент по применению препаративной формы на основе иммобилизованных клеток гриба T. cylindrosporum показал практически 100% эффективность препарата. К недостаткам данной препаративной формы можно отнести то, что начало гибели личинок начиналось на 4-5-е сутки после начала эксперимента, достигая максимальных значений на 8-е сутки.

После внесения в емкость с личинками препаративной формы на основе смеси равных количеств иммобилизованных клеток гриба T. cylindrosporum и бактерий Bti первые мертвые личинки были обнаружены через несколько часов после внесения, а к концу первых суток наблюдали 90-95% гибель личинок. Данное количество оставалось постоянным в течение последующих 8 дней. Большинство мертвых личинок было локализовано на дне емкости. После внесения на 8-е сутки дополнительного количества личинок в течение первых суток наблюдали 30-50% гибель личинок. К концу 12-х суток количество мертвых личинок достигало 70личинки окуклились. Большинство мертвых личинок было локализовано на поверхности и на них визуально были видны поражения грибом. Дополнительное внесение личинок на 12, 16 и 20-е сутки не привело к изменению обшей картины гибели личинок. К концу эксперимента было выявлено 5 куколок и 2 имаго.

Мертвые личинки были локализованы как на дне емкости, так и на поверхности.

Причем, на личинках, плавающих на поверхности, было отмечено развитие гриба T. cylindrosporum.

После внесения препаративной формы на основе смеси гранул гриба T. cylindrosporum и бактерий Bti в процентном соотношении 25:75, соответственно, гибель первых личинок была обнаружена через несколько часов. К концу первых суток общее количество мертвых личинок составило 95-100%. Большинство мертвых личинок было локализовано на дне емкости, только 2 из них плавали на поверхности. После дополнительного внесения личинок на 8-е сутки количество живых личинок к концу 12-х суток составило около 10 штук. 8 мертвых личинок были локализованы на поверхности, и на них были видны поражения грибом. Дополнительное внесение новых личинок на 12, 16 и 20-е сутки эксперимента сохранили общую картину гибели. К концу эксперимента количество окуклившихся личинок достигло 10, а количество имаго было равно 3.

При внесении препаративной формы на основе смеси гранул гриба T. cylindrosporum и бактерий Bti в процентном соотношении 75:25, соответственно, первые мертвые личинки были обнаружены через несколько часов после внесения, к концу первых суток их количество составило около 90%, и локализованы они были на дне сосуда. После внесения на 8-е сутки дополнительного количества живых личинок через несколько дней практически вся популяция была обездвижена.

Половина из них была локализована на поверхности жидкости и поражена грибом. К концу 12-х суток не было выявлено ни одной живой личинки. Данная тенденция сохранилась и после внесения дополнительного количества живых личинок на 12, 16 и 20-е сутки. К концу эксперимента не было обнаружено ни одной куколки и имаго.

Таким образом, эксперименты по определению ларвицидной активности различных препаративных форм показали, что все исследуемые препаративные формы обладают ларвицидной активностью. Эффективность и длительность сохранения ларвицидной активности зависит от микроорганизмов, используемых для иммобилизации. Препаративная форма на основе иммобилизованных клеток Bti имеет очень высокую эффективность применения в первые сутки после внесении и практически теряет ларвицидную активность после 8-12 суток.

Препаративная форма на основе клеток гриба T. cylindrosporum начинает действовать начиная с 4-х суток, проявляя максимальную эффективность к 8-м суткам. Сохранение ларвицидной активности в течение не менее месяца может быть обусловлено либо действием самой препаративной формы, либо за счет гриба, развившегося на пораженных личинках, которые также локализованы на поверхности жидкости.

Препаративные формы с разным соотношением гранул гриба T. cylindrosporum и бактерий Bti так же проявили свою ларвицидную активность на высоком уровне. Снижение в препаративной форме гранул с клетками бактерий Bti в 4 раза не привело к снижению ларвицидной активности в первые сутки, но в то же время позволило достичь оптимальных параметров ларвицидной активности на 8-е и последующие сутки эксперимента, когда гибель личинок происходит под воздействием гриба T. cylindrosporum.

Таким образов, в качестве базового варианта препаративной формы для борьбы с личинками комаров была принята препаративная форма, состоящая из 25% гранул с иммобилизованными гранулами Bti и 75% гранул гриба T. cylindrosporum. Всем гранулам были приданы свойства положительной плавучести за счет иммобилизации растительного масла.

8. Определение эффективной дозы препарата.

Определение нормы расхода препарата проводили на базе Испытательного лабораторного центра (ИЛЦ) ГУП «Московский городской центр дезинфекции»

(МГЦД).

Испытания проводили согласно требованиям документа «Нормативные показатели безопасности и эффективности дезинфекционных средств, подлежащих контролю при проведении обязательной сертификации» (пункт 3.11: «Средства для борьбы с личинками комаров (микробиологические, на основе уротропина и др.»). В качестве показателя эффективности использовли показатель «Гибель личинок через 24 часа, %» для различных концентраций. Эксперименты проводили в 6 повторностях.

Результаты проведенных экспериментов показали, что внесение препарата в дозировке не менее 0,10 мл/м2 (что составляло 1 гранула на 1см2 поверхности) обеспечивает во всех опытах полную гибель личинок комаров при отсутствии гибели в контроле в течение первых 24 часов.

Существующие нормативные документы не предусматривают определения длительности эффективности действия препаратов. Тем не менее длительность действия препарата определяли исходя из натурных испытаний в реальных условиях по обработке затопленных подвалов и водоемов не рыбохозяйственного назначения.

9. Хранение препарата.

В экспериментах по изучению срока хранения препарата в качестве консервирующих агентов исследовали растворы глицерина и лактозы. Глицерин используют как консервирующий агент для препаративных форм на основе иммобилизованных клеток гриба T. viride и бактерий P. fluoriscens. Лактоза была выбрана, исходя из того, что гриб T. cylindrosporum, как было показано ранее, практически не метаболизирует ее.

Изучали следующие варианты стабильности препаративной формы (ПФ) при длительном хранении:

• ПФ в физиологическом растворе;

• ПФ в 15 растворе глицерина в физиологическом растворе;

• ПФ в 30% раствором глицерина в физиологическом растворе;

• ПФ в 15% растворе лактозы в физиологическом растворе;

• ПФ в 30% растворе лактозы в физиологическом растворе.

Исследование всех вариантов на стабильность в процессе хранения проводили в двух вариантах. Первый заключался в том, что ПФ помещали в перечисленные растворы и закладывали на хранение на один год. В течение года через определенные промежутки времени производили отбор проб и определяли концентрацию микроорганизмов. В конце года проводили оценку ларвицидной активности ПФ.

Другой вариант заключался в исследовании хранения ПФ по методу «ускоренного старения» при повышенной температуре. Суть метода заключается в том, что препарат, помещенный в растворы исследуемых консервирующих агентов, подвергали цикличному воздействию пониженных (t=0°C) и повышенных (t=30°С) температур в течение суток. Всего было проведено 30 циклов. Через определенное количество циклов проводили отбор проб гранул и анализировали концентрации клеток бактерий и грибов в них. После последнего цикла проводили изучение ларвицидной активности препарата.

Результаты экспериментов по хранению представлены в таблицах 7 и 8.

Как видно из таблицы 7, при изучении сохранности ПФ методом «ускоренного старения» в варианте хранения иммобилизованных клеток в физиологическом растворе без консерванта, через 10 циклов концентрация клеток упала практически на порядок, далее падение продолжалось и к концу испытаний их концентрация упала практически на 4 порядка.

При хранении иммобилизованных клеток в 15 и 30% растворах глицерина и лактозы в физиологическом растворе концентрация клеток через 10 циклов практически не изменилась, а к концу 30-го цикла снизилась не более, чем на порядок.

Исследования ларвицидной активности, проверенной для образцов препаратов в растворах консервирующих агентов, показали, что иммобилизованные клетки даже после 30-ти циклов сохраняли свою эффективность на том же уровне, что и свежеприготовленные.

Результаты сохранности препарата по методу «ускоренного старения».

ИК в физ. р-ре ИК в 15% р-ре глицерина в физ. р-ре ИК в 30% р-ре глицерина в физ. р-ре ИК в 15% р-ре лактозы в физ. р-ре ИК в 30% р-ре лак- тозы в физ. р-ре Результаты экспериментов по хранению образцов препаратов при комнатной температуре в течение года показали, что в отсутствие консервирующих агентов концентрация клеток через полгода снижается на порядок, а через год почти на пять порядков, что соответствует полученным по методу «ускоренного старения».

Концентрации клеток при хранении препарата при комнатной температуре.

ИК в физ. р-ре ИК в 15% р-ре глицерина в физ. р-ре ИК в 30% р-ре глицерина в физ. р-ре ИК в 15% р-ре лактозы в физ. р-ре ИК в 30% р-ре лак- тозы в физ. р-ре При хранении иммобилизованных клеток в растворах глицерина или лактозы в течение года снижение концентрации клеток было незначительным и не превышало одного порядка. Различие между консервантами заключалось в том, что при хранении в растворах глицерина даже в 30% растворе наблюдался рост гриба из гранул, что приводило к слипанию гранул и потере товарного вида. При хранении в 15 и 30% растворах лактозы роста гриба из гранул отмечено не было и эффекта слипания не наблюдалось.

Исследования ларвицидной активности, проверенной для образцов препаративных форм в растворах консервирующих агентов, показали, что препарат даже после года хранения сохранял свою эффективность на том же уровне, что и свежеприготовленный.

Таким образом, из полученных результатов эксперимента можно сделать вывод, что оптимальным консервирующим агентом для хранения препарата в течение не менее года является лактоза в концентрации 15%.

10. Результаты производственных испытаний Для проведения производственных испытаний препарата была наработана опытная партия. Испытания проводили в период с 15.05.2006 по 15.09.2006 г. путем обработки затопленных подвальных помещений в г.Москве общей площадью 500 м2.

Препарат вносили по следующей схеме. Непосредственно перед обработкой готовили рабочий раствор путем перемешивания необходимого количества препарата в водопроводной воде при температуре 22С. Дозу препарата рассчитывали, исходя из площади обрабатываемой водной поверхности и нормы расхода препарата 0,1 мл/м2. Объем воды для приготовления рабочего раствора рассчитывали, исходя из нормы расхода рабочего раствора 10 мл/м2 обрабатываемой поверхности.

Обработки проводили путем нанесения рабочего раствора на водную поверхность с помощью ранцевого опрыскивателя с постоянным перемешиванием, диаметр форсунок был не менее 0,3 мм.

Перед обработкой проводили подсчет численности личинок и окрыленных комаров сачком диаметром 20 см по методике, описанной в МУ 3.5.2.705- «Борьба с комарами, выплаживающимися в подвальных помещениях». Первоначальная численность личинок в подвале составляла 50 ± 5 экз./м2, имаго – 33 ± экз./м2.

Учет эффективности обработок проводили через каждые 7 дней после обработки в течение 4 месяцев. Снижение численности комаров после обработки определяли в процентах по количеству комаров (личинок, имаго) в сравнении с их числом до проведения обработки.

Испытания показали, что после обработки затопленных подвалов препаратом через неделю не было зарегистрировано ни одной личинки или куколки. Количество окрыленных комаров на стенах подвалов и лестничных клетках в среднем было менее 1 экз./м2. Количество личинок и имаго остались на том же уровне в течение 4 месяцев после обработки.

Таким образом, из проведенных испытаний можно сделать вывод, что разработанный препарат на основе смеси иммобилизованных клеток гриба T.cylindrosporum и бактерий Bti является высокоэффективным препаратом длительного действия для уничтожения личинок комаров.

1. Отобран гриб T. cylindrosporum, обладающий наибольшей энтомопатогенной активностью в отношении личинок комаров. При изучении кинетики роста T. cylindrosporum, иммобилизованных в Са-альгинатных гранулах с субстратами различной природы (крахмал, растительные масла), показано, что рост мицелия гриба на поверхности гранул не отличается по морфо-физиологическим характеристикам от роста при их поверхностном культивировании. Установлено, что на рост мицелия из гранул оказывает влияние природа и концентрация субстрата, иммобилизованного в грануле, а также концентрация альгината. Оптимальными для T. cylindrosporum являются концентрация альгината 1% и концентрация подсолнечного масла внутри гранулы 10%.

2. Показано, что клетки T. cylindrosporum, иммобилизованные в Са-альгинатные гранулы, а также в гранулы с одновременно иммобилизованными субстратами различной природы, сохраняют свою ларвицидную активность, стабильность при хранении в течение не менее 1 года.

3. При изучении кинетики гибели личинок комаров A. aegypty под действием гриба T. cylindrosporum, показано, что введение в гранулу таких веществ как налканы и растительные масла обеспечивает положительную плавучесть гранул, что повышает эффективность их использования за счет пролонгированного действия и локализации на поверхности воды. Показано, что клетки T.

cylindrosporum, иммобилизованные в гранулы с субстратом, вызывают возникновение эпизоотии личинок комаров A. Aegypty.

4. При изучении кинетики гибели личинок A. aegypty под воздействием клеток бактерий B. thuringiensis var. israelensisis свободных и иммобилизованных в Саальгинатные гранулы, обладающие положительной плавучестью, показано, что при иммобилизации бактерии сохраняют свою ларвицидную активность.

5. При изучении взаимного влияния клеток T.cylindrosporum и B. thuringiensis var.

israelensis было показано, что бактерии угнетают рост гриба как в свободном так и в иммобилизованном состоянии. Однако, при одновременном применении иммобилизованных клеток T.cylindrosporum и B. thuringiensis var. israelensis повышается эффективность и длительность ларвицидной активности препаративной формы. Это легло в основу создания комбинированного препарата на основе смеси гранул иммобилизованных клеток бактерий и грибов.

6. Разработано, испытано и внедрено в производство инсектицидное средство Батолим на основе смеси Са-альгинатных гранул с иммобилизованными клетками T.

cylindrosporum с субстратом и B. thuringiensis var. israelensis в процентном соотношении 75:25. Показана высокая эффективность средства при его применении в коммунальном хозяйстве для борьбы с личинками комаров.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

3. Мельников Е.А., Алексеева (Горюнова) О.Б., Терешкина Н.Н., Марквичев Н.С., Борисов Б.А. Изучение хранения и прорастания спор нематофильного микромицета Paecilomyces lilacinus, иммобилизованного в кальцийальгинатном геле // Материалы IV Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2007. – С.

298-299.

4. Горюнова О.Б., Марквичев Н.С. Биологический препарат для борьбы с дичинками кровососущих комаров на основе ассоциации энтомопатогенных микроорганизмов // Материалы V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2009. – С.

205-206.

5. Горюнова О.Б., Марквичев Н.С. Рост гриба Tolypocladium cylindrosporum из гранул кальций-альгинатного геля // Биотехнология. - 2009. - №3. – С. 34Горюнова О.Б., Марквичев Н.С. Комары – вне закона// Экология и жизнь. – 2009. - №6. - С. 89-