Министерство образования и науки

Государственное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

Башкирский государственный педагогический университет

им. М.Акмуллы

Н.И.Латыпова Э.Н.Хисамов

Биохимические и морфологические

изменения в крови животных и человека

при действии бисамина

Уфа

2011

УДК 5765.591.111

ББК 28.707+28.080.1 Л 51 Печатается по решению учебно-методического совета Башкирского государственного педагогического университета им. М.Акмуллы Латыпова Н.И., Хисамов Э.Н.

Биохимические и морфологические изменения в крови животных и человека при действии бисамина: монография [Текст]. – Уфа: Вагант, 2011.– 188 с.

Изучено влияние бисамина на биохимические и гематологические показатели в эксперименте и в условиях производства. Анализ и интерпретация полученных результатов проведены в условиях сопоставления с данными в литературе. Выявлены достоверные негативные сдвиги в организме при хроническом действии данного соединения.

Монография адресуется специалистам в области экологии и физиологии.

Рецензенты:

С.А. Лобанов, д-р мед.н., проф., БГПУ С.М. Мочалов, д-р фил.н., проф., БГУ ISBN 978-5-9635-0311- © Вагант, ivagant.ru Оглавление ВВЕДЕНИЕ

Глава I. Биохимические оновы адаптации в условиях негативного влияния химических факторов

1.2. Биологическая активность алифатических аминов и молекулярные механизмы их биотрансформации в организме 1.3.Химические и токсикологические свойства тетраметилметилендиамина (бисамина)

ГЛАВА II. ХАРАКТЕР БИОХИМИЧЕСКИХ

ИЗМЕНЕНИЙ В ОРГАНИЗМЕ ПРИ ДЕЙСТВИИ

БИСАМИНА НА ПРОИЗВОДСТВЕ И В УСЛОВИЯХ

ЭКСПЕРИМЕНТА

2.1. Биохимические и морфологические показатели крови крыс при хроническом действии бисамина

2.1.1. Влияние бисамина на гематологические показатели у крыс

2.1.2. Влияние бисамина на гемолитическую резистентность эритроцитов

2.1.3. Влияние бисамина на АТФазную активность эритроцитов

2.1.4. Состояние метгемоглобинредуцирующей функции эритроцитов

ivagant.ru 2.1.5. Влияние бисамина на холинэстеразную активность сыворотки крови крыс.

2.2. Биохимические и морфологические показатели крови у рабочих нефтехимического производства ионола

2.2.1. Гематологические показатели у рабочих нефтехимического производства ионола

2.2.2. Кислотная резистентность эритроцитов у рабочих нефтехимического производства ионола

2.2.3. АТФазная активность эритроцитов

2.2.4. Активность НАДН-метгемоглобинредуктазы и содержание метгемоглобина в эритроцитах

2.2.5. Активность холинэстеразы сыворотки крови.................. 2.2.6. Содержание гаптоглобина в сыворотке крови и фенотипы гаптоглобина у рабочих

2.3. Гематологическая индикация ионола

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

Приложения

ivagant.ru

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АХХ – ацетилхолинхлорид АТФ – аденозинтрифосфат АТФаза – аденозинтрифосфатаза -6-ФДГ – глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа ПК) – глутатионпероксидаза Нв – гемоглобин Нр – гаптоглобин НАД – никотинамидадениндинухслеотид НАДФ – шкотинамидадениндинуклеотидфосфат ДЦГ – лактатдегидрогеназа МАО – моноаминоксидаза МГР – метгемоглобинредуктаза МтНв – метгемоглобин ivagant.ru

ВВЕДЕНИЕ

Высокие темпы химизации народного хозяйства расширяют контакты человека с химическими веществами.

Внедрение современных технологий и значительное улучшение условий труда на промышленных предприятиях позволили значительно снизить концентрацию токсических веществ в рабочей зоне. Однако при воздействии низких концентраций токсических веществ специфика действия яда во многих случаях оказывается стертой, отсутствуют клинические проявления интоксикации, поддерживаются в пределах физиологической нормы количественные показатели клеток крови. В связи с чем возникают затруднения в распознавании и дифференциальной диагностике "малых" форм профессиональной патологии [102,152,153]. Воздействие относительно небольших концентраций ядов приводит к снижению реактивности организма и развитию функциональных изменений со стороны наиболее ранимых систем в организме, которые при продолжении работы во вредных условиях могут переходить в органические [76,82].

На современном этапе задача диагностики заключается в том, чтобы с помощью современных методов исследования (биохимических, биофизических и др.) уловить наиболее ранние стадии патологических процессов, выявить изменения на молекулярном (биохимическом) уровне, на котором патологический процесс завязывается и где он проходит действительно ранние, ничем симптоivagant.ru матически не проявляющиеся стадии развития [145]. В данном случае все внимание должно быть обращено на выявление тех первичных изменений, которые намного предшествуют появлению соответствующей клинической симптоматики, т.е. при отсутствии объективных и субъективных признаков текущего патологического процесса у еще практически здорового человека, обладающего нормальной способностью к развертыванию компенсаторноприспособительных реакций.

Особую актуальность в настоящее время приобретает разработка чувствительных и информативных биохимических критериев оценки и прогнозирования неблагоприятного действия химических веществ, позволяющих выявить наиболее ранние предпатологические изменения состояния здоровья населения в зависимости от загрязнения окружающей среды [21,149], способствующих целенаправленному профотбору и диагностике хронических интоксикаций химической этиологии [11,69,181].

К химическим соединениям, биологическая активность которых недостаточно изучена, относится и тетраметилметилендиамин (бис-амин.). Бисамин широко используется при синтезе бесцветных стабилизаторов, в частности ионола, и других нефтепродуктов [142]. Кроме того бисамин рекомендован как средство для борьбы с воз-возбудителем рака картофеля и как стимулятор роста растений [15].

Бисамин, как и большинство алифатических аминов с низкой молекулярной массой, – летучее соединение и в процессе промышленного производства легко проникает в воздух рабочих помещений. Это обусловливает контакт с ним значительного контингента работающих. Между тем последствия воздействия низких концентраций бисамина на организм человека и животных до настоящего времени не ivagant.ru изучены, хотя его острая токсичность не вызывает сомнений [172]. Остаются открытыми вопросы о механизмах повреждающего действия бисамина на клеточном, ультраструктурном и молекулярном уровнях, биотрансформации и детоксикации его в организме. Несомненно, что биохимические исследования начальных метаболических сдвигов способны продвинуть решение этих сложных вопросов и оказать реальную помощь в разработке проблем, касающихся ранней диагностики, профилактики и патогенетически обоснованных способов коррекции нарушений, выявленных у людей, имеющих контакт с бисамином.

В данной работе проанализированы биохимические сдвиги со стороны некоторых метаболических систем эритроцитов и сыворотки крови и были определены наиболее информативные биохимические параметры использования их как ранних критериев дезадаптации при длительно» действии низких концентраций бисамина. В частности были изучены следующие аспекты:

– функциональное состояние мембран эритроцитов в экспериментальных исследованиях на крысах и у людей, имеющих длительный контакт с бисамином.

– процессы метгемоглобинобразования и метгемоглобин редуцирующую активность, а также функционирование пентозофосфатного шунта эритроцитов при хроническом воздействии бисамина.

– влияние бисамина на холинэстеразную активность сыворотки крови в экспериментальных исследованиях на крысах и у людей, имеющих контакт с бисамином в процессе производства, – количественные изменения гаптоглоби на в сыворотке крови в зависимости от его фенотипа у рабочих, имеющих контакт с бисамином.

ivagant.ru – сравнительная оценка информативности определения таких показателей крови как количество эритроцитов, ретикулоцитов, уровень гемоглобина и метгемоглобина в крови, кислотная резистент-ность эритроцитов, активность НАДНметгемоглобинредуктазы, аденозинтрифосфатаз, глюкоеофосфатдегидрогеназы эритроцитов, активность холинэстеразы и количество гаптоглобина в сыворотке крови как ранних показателей дезаптации при длительном контакте с бисамином в условиях производства.

– характер адаптивных возможностей человека в зависимости от генетически детерминированеого признака – фенотипа гаптоглобина, при длительном контакте с бисамином и рассмотреть возможности использования данного показателя в качестве критерия при профотборе.

Впервые исследовано функциональное состояние эритроцитарных мембран в условиях хронического воздействия бисамина. Показано, что бисамин нарушает устойчивость эритроцитов к действию гемолизирующих агентов, снижает активность мембра-носвязанных ферментов Са,Мё~ и Ма,К-АТФаз эритроцитов крыс и человека.Следствием хронического действия бисамина является нарушение внутриклеточных метаболических процессов. Наблюдается снижение активности метгемоглобинредуцируюздих систем и торможение пентозофосфатного пути расщепления глюкозы в эритроцитах. Ускоренное метгемоглобинобразование выявлено в эритроцитах людей, работающих в условиях, где бисамин является одним из факторов малой интенсивности.

В экспериментальных исследованиях при хроническом воздействии бисамина на крыс и при обследовании людей, имеющих контакт с бисамином в процессе производственной деятельности, обнаружено снижение активности холинэстеразы в сыворотке крови.

ivagant.ru У людей выявлено повышение концентрации гаптоглобииа в сыворотке крови независимо от его фенотипа. В то же время адаптационные возможности людей, имеющих длительный контакт с низкими концентрациями бисамина, в какой-то степени зависели от наследуемого типа гаптоглобина.

Длительное действие незначительных концентраций бисамина не вызывает существенных отклонений от нормы таких гематологических показателей, как концентрация гемоглобина и количество эритроцитов в крови, однако при этом наблюдается значительный ретикулоцитоз как в экспериментальных исследованиях, так и у людей.

Результаты исследований расширяют представление о повреждающем действии бисамина на метаболические процессы в клетке. Ряд исследованных показателей – содержание метгемоглобина, кислотная резистентность эритроцитов, активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, активность аденозинтрифосфатаз эритроцитов, активность холинэстеразы сыворотки крови, количество ретикулоцитов, предложено использовать как ранние диагностические тесты в качестве критериев дезадаптации при проведении профилактического обследования лиц, имеющих длительный контакт с бисамином.

Показана целесообразность определения фенотипов гаптоглобина при проведении профотбора на предприятиях, где возможен контакт с бисамином. Материалы исследования вошли в инструктивное письмо "Пути снижения неврологической заболеваемости у рабочих нефтехимических предприятий БАССР", которое рекомендовано к внедрению в практическую деятельность врачейневропатологов, участковых и цеховых врачей поликлиник и МСЧ заводов согласно приказа МЗ БАССР Р283-Д от 10.06.88 года.

ivagant.ru Глава I. Биохимические оновы адаптации в условиях негативного влияния химических факторов 1.1. Основные принципы и биохимические механизмы адаптации при действии на организм химических Одной из наиболее важных черт биологических систем является способность приспосабливаться к изменениям среды – адаптация. В свете современных представлений адаптация трактуется как изменение скоростей биологических реакций [161], направленных на сохранение внутренней среда организма, несмотря на изменения окружающей среда. Таким образом, стратегия адаптации заключается в поддержании гомеостаза [178], в сохранении таких фундаментальных характеристик биосистемы, как энергия, масса, информация [127 ].

Адаптивные возможности организма реализуются через приспособительные реакции, среди которых выделяют компенсаторные реакции. Если под первыми подразумевают любые проявления адаптации, то под вторыми – только те из них, которые обусловливают восстановление гомеостаза после гибели части того или иного органа. Изза сложности дифференцировки этих двух понятий, чаще всего пользуются термином компенсаторноприспособительные реакции [161. Компенсаторноприспособительные реакции не являются какими-то особыми реакциями организма, а развертываются на той же материальной основе, что и нормальные физиологические функции, но, как правило, с большей, чем обычно, интенсивностью [145]. С позиций биохимии это означает, что скорости и направление биохимических реакций подвержены адаптивному регулированию. Так, например, для ivagant.ru поддержания уровня глюкозы в крови необходима регуляция глюконеогенеза и гликолиза – противоположно направленного процесса [178]. Компенсаторноприспособительные реакций организма, таким образом, формируются на основе усиления и ослабления одновременно, при интенсификации одних функций всегда наблюдается торможение других [161].

Различают срочный и долговременный этапы адаптации [108]. Судя по смыслу, который П.Хочачка и Дк.Сомеро вкладывают в понятие –"немедленная адаптация" оно соответствует понятию "срочной этап адаптации". Срочный этап адаптации развивается непосредственно после действия раздражителя [155]. Особенностью немедленной адаптации является то, что она происходит настолько быстро, что не может быть связана с изменениями в экспрессии генов или со значительной перестройкой клеточных структур в результате биосинтетических процессов. Она осуществляется путем модуляции уже имеющихся ферментов [178]. При переходе срочной адаптации в долговременную происходит увеличение мощности функциональной системы, увеличивается синтез различных белков, в том числе ферментов, и нуклеиновых кислот [155]. Отличие этих адаптивных реакций от генетичесой адаптации, которая идет на протяжении многих поколений, состоит в том, что она протекает исключительно на фенотипическом уровне [178].

С.Н.Голиков, И.В.Саноцкий, Л.А.Тиунов [150]. учение о гомеостазе использовали в качестве общей концепции химической патологии. По их мнению, всякий ответ, направленный на восстановление нарушенного равновесия, расценивается как гомеостатическая реакция. Химические агенты, вмешиваясь в молекулярные механизмы функционирования биохимических систем (рецепторов, ivagant.ru ферментов,биологических мембран), изменяют нормальные процессы клеточного и тканевого гомеостаза, что приводит к функциональным нарушениям на соответствующем уровне, которые считаются первичными сдвигами гомеостаза.

Основу биохимических механизмов адаптации и компенсации при действии на организм химических веществ составляет система детоксикации ксенобиотиков, обеспечивающая сохранение и поддержание гомеостаза в условиях возрастающего загрязнения окружающей среды [161,165,166]. Согласно основным принципам формирования компенсаторно-приспособительных реакций, сформулированных Д.С.Саркисовым [145,146,161], наиболее универсальным является принцип структурного обеспечения гомеостаза. Так, уже при поступлении в кровяное русло ксенобиотик связывается с сывороточным альбумином. Эта реакция рассматривается как один из механизмов защиты организма от экзогенных низкомолекулярных соединений [48,99].

Детоксикацию ксенобиотиков обеспечивают четыре взаимосвязанных звена : микросомальные монооксигеназы, включая фосфолипиды мембран эндоплазматической сети; коньюгирующие агенты и энзимы реакций коньюгации; макроэргические соединения, необходимые для синтеза белков-ферментов и реакций коньюгации; ферменты и ферментные механизмы антирадикальной и антиперекисной защиты [165,166].

Центральным звеном детоксикации липофильных ксенобиотиков являются монооксигеназы гладкой эндоплазматической сети, катализирующие биотрансформацию до полярных метаболитов, вступающих в реакции коньюгации с образованием малотоксичных соединений, которые выделяются из организма. Водорастворимые ксенобиотики подivagant.ru вергаются биотрансформации с помощью внемикросомальных ферментных систем, локализованных на митохондриях, лизосомах, пероксисомах и в цитозоле [166].

При воздействии на организм экстремальных факторов происходит активизация биохимических процессов, дополнительных источников энергии, например, глюконеогенеза и особенно, B-окисления жирных кислот [127].

Помимо прямых токсических эффектов наблюдаются и побочные эффекты действия ядов. В процессе биотрансформации генерируются супероксидные радикалы, активизируется супероксидцисмутаза и усиливается продукция перекиси водорода, которая инициирует перекисное окисление липидов, нарушает проницаемость биологических мемб-ран. Эти токсические эффекты перекиси водорода предупреждаются ферментными системами каталазы и глутатиошероксидазы, разлагающие перекись водорода или использующими ее для окисления глутатиона и других эндогенных субстратов [166]. Таким образом, участие глутатиона в реакциях детоксикации не сводится только к реакциям конъюгации с химическими агентами.

Система глутатиона и связанные с ним ферменты занимают центральное место в антирадикальной антиперекисной защите организма. Это является еще одним свидет ельством в пользу развиваемых В.В.Соколовским [155,156] представший о роли тиолдисульфидной системы в биохимических механизмах адаптации.

По концепции В.В.Соколовского содержание $Нгрупп в организме может рассматриваться как показатель, отражающий уровень неспецифической резистентности организма [155], где основная роль тиолдисульфидной системы сводится к поддержанию окислительно– восиановительного гомеостаза [154]. Окислению подвергаются различные биосубстраты: тиоловые соединения неivagant.ru белковой и белковой природы, в том числе и ферменты, аскорбиновая кислота, липиды и другие соединения. Среди ферментов наиболее чувствительными к окислению являются сульфгидрильные ферменты [160], активность которых подавляется при блокировании содержащихся в них сульфгидрильных групп [156]. Тиоловые ферменты участвуют в регуляции углеводного, белкового и липидного обменов, с тиолами связан биосинтез белка и специфическая активность коферментов (SН-глутатион, кофермент А, липоевая кислота) [156]..Другая окислительновосстановительная система, чутко реагируя на внешнее воздействие, состоит из аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислоты. Аскорбиновая кислота, наряду с тиолами, относится к водорастворимым антиоксидантам [155].

В стабилизации окислительно-восстановительного гомеостаза исключительное значение имеют ферментные механизмы редукции окисленных форм и группа антиперекисных ферментов.

Окисленный глутатион восстанавливается глутатионпероксидазой с использованием НАДФН, образующегося в пентозофосфатном цикле, и, таким образом, состояние окислительно-восстановительной системы зависит и от функционирования водородпоставляющих процессов, в частности, от активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и ферментов гликолиза, основного поставщика НАДН. Связь антиоксидантной системы с основными метаболическими процессами в клетке убедительно свидетельствует о том, что антиоксидантная система имеет прямое отношение к молекулярным механизмам неспецифической резистентности организма к стрессорным воздействиям [155].

Для биохимической системы детоксикации характерен "принцип дублирования", наличие альтернативных, множественных путей превращения ксенобиотиков в орivagant.ru ганизме. В зависимости от условий воздействия токсических веществ (время, ритм, режим и концентрация) включаются те или иные механизмы их биотрансформации.

Так, при детоксикации липофильных ксенобиотиков "принцип дублирования" проявляется во взаимозаменяемости коньюгирующих агентов, в особенностях внутриклеточного распределения реакций конъюгации. При детоксикадии водорастворимых ксенобиотиков, не вступающих в реакции коньюгации, он проявляется в наличии нескольких путей биотрансформации. Обычно существует основной путь и дополнительные. В экстремальных условиях могут функционировать все пути биотрансформации химического агента [161].

Различают специфическое и неспецифическое в действии химических соединений на организм. Проявление специфических и неспецифичевских признаков очень часто зависят от силы и продолжительности действия раздражителя, а также ряда других условий [161]. В хронической химической патологии исключительное значение имеют общие адаптивные и компенсаторные механизмы, стирающие грань между специфическим и неспецифическим [48,50,102]. Различные толкования этих понятий зависят от того, на каком уровне рассматриваются эти понятия, т. к. механизмы адаптации включают разные уровни структурной организации живого и соответственно должны учитываться с использованием биохимических, физиологических и других методов исследования. То, что в биохимическом плане расценивается как специфическое, в патофизиологичёском может являться универсальным [50,155]. В условиях, нe превышающих регламентированные уровни химических веществ, биохимические системы детоксикации функционируют в рамках физиологических параметров. Интенсификация экстремального химическоivagant.ru го воздействия на организм резко усиливает приспособительные реакции, которые оцениваются уже как компенсаторные [166]. Многообразие реакций детоксикации, общие неспецифические черты, характерные для компенсаторно-приспособительных процессов, указывают на то, что проблема адаптации – проблема работы организма как единого целого [161]. Примером тому является действие на организм алифатических аминов 1.2. Биологическая активность алифатических аминов и молекулярные механизмы их биотрансформации Биологическая активность алифатических аминов в значительной степени определяется химической структурой и физико-химическими свойствами соединений. В специальной литературе широко представлены публикации, касающиеся характеристики алифатических аминов [56,85,86,159,258]. Сведения по этому вопросу обобщены и достаточно подробно изложены в работах Н.К. Кулагиной и соавт. [85,87].

С повышением молекулярного веса и увеличением алкильного радикала повышается Т. кип., снижается летучесть, понижается растворимость в воде и увеличивается растворимость в жирах. Аналогичные параметры отмечены при переходе от первичных алифатических аминов к третичным. Отмечено, что действие алифатических аминов характеризуется однотипными проявлениями. Различия заключаются лишь в степени выраженности нарушений, длительности течения патологического процесса и наличия у некоторых аминов специфических эффектов.

Так, например, некоторые алифатические амины вызывают аллергизацию [20,59,184 ].

ivagant.ru Характерным в проявлении токсического действия алифатических аминов является политропность. Показано, что для большинства алифатических аминов свойственно резко выраженное раздражающее действие на слизистую оболочку глаз, кожные покровы и верхние дыхательные пути [52,83,92,96,205,259]. С повышением жирорастворимости этот эффект снижается и возрастает способность к резорбции. После контакта алифатических аминов с неповрежденной кожей большинство авторов наблюдали гиперемию, отек с последующими изъязвлениями или некротические изменения [26,120], вплоть до некроза костной ткани. Отмечены аллергические дерматозы и экземы у рабочих, контактирующих с этилендиамином [20,59,184]и высшими алифатическими аминами [5,57,120,125,162].

Довольно часто встречаются заболевания органов дыхания среди рабочих, контактирующих с веществами этой группы [165,205]. Однако ведущим признаком токсического действия алифатических аминов, по мнению большинства исследователей, является поражение центральной нервной системы. Действие ряда алкиламинов (гептиламин, дипро-пиламин, дибутиламин, триэтиламин, диизобутиламин) сопровождается дрожанием всего тела, повышением тактильной чувствительности, развитием клонико-тонических судорог, появлением судорожного дыхания, вплоть до остановки дыхания [26]. В хроническом эксперименте с триметиламином страдает безусловно рефлекторная деятельность [175], отмечается затруднение, при выработке условных рефлексов, страдает координация движений. При действии этилендиамина отмечены отклонения в состоянии терморегуляции, что свидетельствует о влиянии продукта на вегетативные функции центральной нервной системы [59]. Изменения в центральной нервной системе вызывали как низшие, так и ivagant.ru высшие алифатические амины, хроническое поступление которых приводит к снижению нервно-мышечного возбуждения. Клиническая картина отравления животных аминами полиметиленового ряда также указывает на преимущественное поражение центральной нервной системы, кратковременное возбуждение обычно сменяется угнетением нервной системы [129,174].

Функциональные нарушения центральной нервной системы сопровождаются морфологическими изменениями. При действии диметиламина /, триметиламина и высших алифатических аминов обнаружены дистрофические изменения в клетках коры и подкорковых областях головного мозга [6,256].У людей поражение центральной нервной системы проявляется в виде астеновегетативного или невростенического синдромов, которые возникают уже через 2-3 года и нарастают по мере увеличения стажа работы [19,20,125].

Нарушение деятельности центрального регулирующего аппарата организма ведет к нарушению функционирования различных других органов и систем. Так, довольно часто токсические поражения нервной системы сопровождаются кардиотоксическим действием алифатических аминов. В эксперименте кардиотоксическое действие алифатических аминов чаще всего обнаруживается в хроническом эксперименте и подострых опытах и более характерно для непредельных и изомерных аминов. [27]. Так, аллиламин вызывает повьпиение проницаемости стенок сосудов, развитие воспалительных и дистрофических изменений в миокарде с последующей сердечно-сосудистой недостаточностью. Изменения в миокарде вызывают и другие амины: триэтиламин, бутиламин, диизопропиламин [56,86,92,]. У людей, работающих с высшими алифатическими аминами выявлены изменения в сердечно-сосудисой системе в виде нейроцирivagant.ru куляторной дистонии, нарушений микроциркуляции, обнаружены повышение артериального давления, умеренная тахикардия, лабильность пульса и нарушение сократительой функции миокарда [121,85].Предположение о том, что кардиотоксическое действие алифатических аминов связано с функционированием моноаминооксидаз [26], подтвердилось в исследованиях с аллиламином, который значительно активизировал моноаминооксидазы миокарда [202]. Опасность большинства алифатических аминов для организма объясняется выраженным гепатотоксическим действием. Токсическое влияние на печень оказывают триэтиламин [86], метиламин [52], трибутиламин, триметиламин [175], высшие алифатические амины [120]. При гистологическом исследовании обнаружены мелкоочаговые некрозы, жировая и белковая дистрофия, клеточный и ядерный полиморфизм, гипертрофия и гиперплазия купферовских клеток [175]. Нарушения со стороны функционального состояния печени выявлены у 55% работающих с высшими аливатическими аминами. Это сопровождается изменениями со стороны белкового, углеводного и липидного обменов [90,125,163,258]. При этом страдает протромбиневая активность и повышается активность аминотрансфераз крови.

При интоксикации алифатическими аминами очень часто выявляется патология почек. Концентрация алифатических аминов в воздухе прямо пропорцинально коррелирует с концентрацией их в моче, из этого следует, что амины и их метаболиты выводятся из организма в основном через почки [265]. При этом все низкомолекулярные амины относительно быстро преобразовываются в диметиламин [201].

При поражении почек наблюдаются как функциональные изменения: нарушение суточного диуреза, протеинурия [4,182],так и морфологические: жировая и белivagant.ru ковая дистрофия, некрозы, вакуолизация эпителия мочевых канальцев [175].

Имеются сведения об эмбриотоксическом действии аминов [174],о влиянии аминов на иммунную и репродуктивную [104,173] системы..

Противоречивые данные, встречающиеся в литературе относительно влияния аминов на кроветворную систему, видимо, можно объяс –нить как индивидуальными свойствами аминов и спецификой их действия на организм, так и фазовостыо интоксикации [101,144]. Так, хроническое отравление анилином на ранних стадиях интоксикации характеризуется увеличением гемоглобина и эритроцитов, затем –анемией и ретикулоцитозом [41].

Многие амины действуют как гемолитические яды, вызывая снижение стойкости эритроцитов и ускоренное разрушение их в кровя ном русле; одновременно регистрируется компенсаторная реакция, сопровождающаяся появлением в крови эритроцитов с повышенной стойкостью [129,171] и увеличением количества ретикулоцитов.

Изменения со строны красной крови вызывают и высшие алифатические амины [120], некоторое снижение количества ретикулоцитов при действии полиэтиленполиамина отмечают Иванова Е.В. и Сулейманова С.М. [61].

Многие амины обладают метгемоглобинобразующим действием. Образование метгемоглобина в какой-то степени играет защитную роль в организме, предохраняя тканевые дыхательные ферменты от окисления, однако, чрезмерное накопление его в эритроцитах ведет к раннему старению клеток и ускоренному гемолизу эритроцитов.

Это, возможно, является одной из причин снижения кислотной резистентности эритроцитов при действии токсических веществ [28,36,4389,129].

ivagant.ru Накопление МтНв может происходить в результате повышенного образования перекисей при действии ряда алифатических аминов. Наличие активной аминогруппы может быть причиной непосредственного окисления железа гема или вызывать нарушение третичной структуры глобина, обеспечивающего устойчивость железа в геме к окислению, так как амины, попадая в организм, могут ковалентно связываться с эритроцитами, альбумином и гемоглобином. Не исключено, что амины взаимодействуют и с другими белками, в частности, с ферментами гликолиза и пентозофосфатного пути, в процессе функционирования которых образуются восстановленные НАД и НАДФ, используемые в метгемоглобинредуктазных системах [25,49,79,121,196,213,236].

Влияние амина отражается и на других биохимических показателях крови. В некоторых случаях нарушается порфириновый обмен /171/, повышается количество нуклеиновых кислот, в особенности РНК /244/. Под действием триэтилендиамина обнаруживается повышение уровня гаптоглобина, понижение количества серо-мукоида и активности лейцилнафтиламидазы [17,244,261 ].

Гепатотроное действие аминов проявлялось значительной активацией аминотрансфераз в сыворотке крови и угнетением их в печени [122,175 ]. Эти же авторы указывают на отклонения в углеводном обмене. Ослабление интенсивности тканевого дыхания сопровождается некоторым усилением гликолиза в печени подопытных животных, свидетельством чего является повышение активности лактатдегидрогеназы и уменьшение содержания гликогена в этом органе.С этих позиций представляют интерес данные о том, что 4-диметиламинофенол-НС1 необратимо снижает глюконеогенез из молочной, пировиноградной кислот и диоксиацетона в канальцах изолированной ivagant.ru почки крысы, а также ингибирует активность ферментов гликолиза, уменьшается суммарное содержание адениловых и пиридиновых нуклеотидов. Предполагается, что ингибирование глюконеогенеза является результатом быстрого необратимого связывания исследуемого соединения с белками [130,262 ].

Способность аминов угнетать активность холинэстеразы установлена достаточно давно. Механизм ингибирующего действия четвертичных аммониевых соединений на холинэстеразу основан на том, что содержащийся в этих соединениях положительно заряженный атом азота электростатически взаимодействует с анионным центром холинэстеразы и тем самым обеспечивает образование комплекса фермент-ингибитор. Помимо заряда, важную роль играют пространственные, стерические отношения, которые определяют расположение молекулы ингибитора на поверхности фермента и обеспечивают возможность упрочения комплекса за счет ван-дер-валь-совых сил, действующих на коротком расстоянии. Во многих случаях введение в молекулу вещества второй четвертичной группы, т.е. создание бис-четвертичных соединений, приводило к значительному усилению антихолинэстеразной активности [49 ]. С увеличением числа метильных групп способность угнетать холинэстеразу возрастает /218/.

Многие исследователи при действии ряда аминов наблюдали сдвиг тиолдисульфидного равновесия в сторону повышения окисленных форм (7,100 ) и накопление малонового диальдегида, что свидетельствует об активации перекисного окисления липидов. Об этом же свидетельствует и выявленное нарушение тиолдисульфидного соотношения низкомолекулярных тиолов /100/, которые выполняют в клетке функцию антиоксидантов [7,100,34,156 ].

ivagant.ru Не исключается и другой механизм выявленного нарушения тиолдисульфидного обмена, связанный с дезаминированием аминов. Как известно, образующаяся перекись водорода обезвреживается в системе глутатионпероксидазы – глутатионредуктаза. Повышенное же образование перекиси водорода нарушает равновесие окисленных и восстановленных форм низкомолекулярных тиолов [167,156].

В основе их мембраноповреждающего действия, по мнению ряда исследователей, также лежит повышенное образование перекиси водорода при дезаминировании экзогенных алифатических аминов и нарушение взаимосвязи липоперекисного и микросомального окисления [12,34,121,159.

Хотя в литературе и накапливаются сведения о непосредственном воздействии аминов на активность отдельных ферментов как возможный механизм их токсического эффекта, все же Г.И.Сидоренко и Р.В.Меркурьева [107,111].

мембраноповреждающий эффект определяют как универсальный и наиболее ранний при воздействии факторов внешней среды, выраженность которого зависит от интенсивности и длительности контакта с загрязнителями.

Воздействие ксенобиотиков приводит к компартментализации ферментных систем и последующей гибели клетки [107,111,134,149, 150,158].

Все это свидетельствует о том, что в механизмах повреждающего действия аминов существенную роль играет их биотраксформация.

Несмотря на значительный объем сведений о токсичности алифатических аминов, вопросы их метаболизма пока недостаточно изучены. В определенной степени этим объясняется отсутствие биохимических критериев ранней диагностики профессиональных интоксикаций, что несоivagant.ru мненно затрудняет разработку стратегии профилактических мероприятий.

Биотрансформацию алифатических аминов трудно предсказать, особенно в случае превращений амина с несколькими азотными цент рами [51]. Это, вероятно, связано как с особенностями физико-химических свойств, так и с многообразием возможных метаболичес ких путей при биодеградации алифатических аминов в организме.

Как правило, выделяют две основные группы ферментов, прини мающих участие в метаболизме ксенобиотиков, в том числе и алифа тических аминов – это микросомальные и немикросомальные фермент ные системы [128]. К немикросомальным ферментам, в частности, относятея мито-хондриальные аминоксидазы (моноаминооксидаза и диаминооксидаза), которые являются ключевыми ферментами обмена биогенных аминов. Аминооксидазы катализируют реакцию окислительного дезаминирования [45]. Образующийся в этой реакции аммиак преимущественно выводится из организма в виде мочевины, а перекись водорода разлагается каталазой.

Моноаминооксидаза (моноамин: О2 оксидоредуктаза, дезаминирующая, К.Ф. 1.4.3.4.) может принимать участие в дезаминировании первичных, вторичных и третичных алифатических аминов [126,271]. Наиболее быстро дезаминируются первичные моноамины, начиная с члена ряда, содержащего 3 углеродных атома. С увеличением углеродной цепочки скорость метаболизма сначала увеличивается, а затем уменьшается. Вторичные и третичные амины более устойчивы к дезаминированию. Они преимущественно подвергаются дезалкилированию, образуя первичные амины или, в случае простых аминов, выделяются неизменными и очень часто при этом оказывают торможение на моноаминооксидазы [248]. Так вторичные ivagant.ru амины (диэтиламин, дипропиламин, дибутиламин) снижают активность митохондриальной моноаминооксидазы (МАО) печени и головного мозга на 14-20%, триэтиламин – на 14-43%. Эти изменения наблюдались в остром эксперименте, при действии же низких доз моноаминооксидазная система справлялась с нагрузкой, и изменений в активности МАО не обнаружено. Третичный амин (триэтиламин) угнетает МАО сыворотки крови кроликов и в хроническом эксперименте [175 ].

Необходимо отметить, что аминооксидазы встречаются во многих органах и тканях, в том числе и в тканях мозга, и хотя активность МАО в мозге меньше, чем в печени и почках, однако имеется в количествах превосходящих, как полагают, необходимые для обеспечения метаболизма тех аминов, которые являются нейромедиаторами. Активность МАО обнаружена и в митохондриальной фракции ретикулоцитов, но обнаруживают ее активность в эритроцитах только при наличии в циркулирующей крови большого количества ретикулоцитов [247 ].

Эффект действия алифатических аминов на МАО может быть в разных органах прямо противоположным.

Так, аллиламин, ингибируя активность МАО тканей головного мозга и печени у крыс, значительно активизировал МАО тканей миокарда [202 ].

Некоторые авторы связывают развитие патологического процесса, с нарушением обмена биогенных аминов. В результате угнетения МАО блокируется процесс окислительного дезаминирования что ведет к накоплению биогенных аминов в головном мозге и других органах [26,179,204,245]. При этом наблюдается повышенное вьщеление их с мочой. Биогенные амины, как известно, играют важную роль в процессах медиации в нервной системе и ivagant.ru нарушение их обмена через нервную систему будет отражаться на деятельности других органов и тканей.

Моноаминооксидазы являются мембраносвязанными ферментами, локализация их в мембране может быть различной: на внешней, внутренней или на обеих поверхностях биомембран. Обычно молекулы МАО в значительной мере погружены в липиды биомембран и лишь небольшая часть их каталитической поверхности доступна для взаимодействия с аминами [194].

Кроме митохондриальной моноаминооксидазы, дезаминирование чужеродных аминов может катализироваться микросомальной аминооксидазой. Довольно высокая активность этого фермента обнаружена в печени кролика, но в печени крыс, морских свинок активность ее очень низка [128].

Первичные и вторичные амины могут подвергаться в организме N –метилированию неспецифическими метилтрансферазами. Эти ферменты обнаружены в цитозоле печени, легких, селезенке, надпочечниках, мозге. Метилтрансферазы катализируют N-метилирование норадреналина до адреналина и, как отмечалось выше, могут метаболизировать экзогенные амины /50/.

Один из возможных путей биодеградации аминов – это ацетилирование при участии коэнзима А. Перенос ацетила при этом, катализируется соответствующими трансферазами, локализованными в цитозоле клеток различных органов и тканей, в том числе и в эритроцитах [240]. Через N –ацетилирование метаболизирует 5-аминонафтол, у которого 98% радиоактивности метаболитов мочи было связано с N –ацетилированными производными этого соединения.

Среди людей обнаружены особи способные к быстрому ацетилиро-ванию чужеродных соединений – "быстivagant.ru рые ацетиляторы" и особи, у которых процессы ацетилирования протекают медленно – "медленные ацетиляторы".

Принадлежность к той или другой группе определяется одной из форм ацетилтрансфераз, локализованной в печени и кишечнике, активность которой генетически детерминирована и подчиняется менделевскому расщеплению у потомства, причем за "быстрые ацетиляторы" отвечает доминантный аллель, а за "медленные" –рецессивный.

"Медленные ацетиляторы" менее устойчивы к токсическому действию ксенобиотиков, которые подвергаются детоксикации путем N –ацетилирования [267].

Из числа микросомальных ферментов ведущая роль в детоксикации ксенобиотиков большинством авторов отводится оксидазам со смешанными функциями (монооксигеназам) и ферментам, обеспечивающим процессы конъюгации.

Оксидазы со смешанными функциями (ОСФ) представляют собой полиферментный комплекс, локализованный на гладком эндоплазматическом ретикулуме и связанный с двумя внемитохондриальными цепями переноса электронов [150]. Оксидазы со смешанными функциями принимают участие в метаболизме эндогенных стероидов, ненасыщенных жирных кислот и простагландинов. Кроме того, монооксигеназные системы могут участвовать в метаболизме липотропных ядов, катализируя реакции Сгидроксилирования в алифатической цепи, N – гидроксилирования, N –дезалкилирования, окислительного дезаминирования, эпоксидирования и ряда других каталитических реакций.

Важнейшим компонентом микросомальной монооксигеназной системы является цитохром– Р-450, ответственный за активацию молекулярного кислорода и связывание субстрата. Помимо цитохрома-Р-450, в состав этой ivagant.ru системы входят НАДФН-цитохром-Р-450-редуктаза, цитохром в5 и НАДН-цитохром.в5-редуктаза.Чужеродные амины могут также подвергаться N –дезалкилированию системой микросомальных ферментов. Механизм N – дезалкилирования заключаются в ферментном образовании и –оксида, который затем ферментативно или самопроизвольно претерпевает внутримолекулярную перегруппировку, образуя амини альдегид [128].

В метаболизме алифатических аминов могут принимать участие одновременно несколько ферментных систем с преобладанием одного из путей биотрансформации.

Первичные амины под влиянием различных ферментных систем (включая и ферменты, участвующие в N окислении третичных аминов) могут превращаться в N – окисленные продукты – оксимы, гидроксиламины и Снитрозосоединения, а также в дезаминированные соединения – кетоны и альдегиды. Вторичные алифатические амины в процессе метаболизма превращаются в гидроксиламины и нитроны, а также в дезалкилированные и дезами-нированные производные [164].

По мнению Сидорина Г.И. с соавт. [121] и Луковниковой А.В., [159] исследуемые ими алифатические амины (дибутиламин, трибу-тиламин, диметилдипропилентриамин и тетраметилдипропилентриа-мин) метаболизируются системой неспецифических оксидаз микросом при одновременном участии микросомальной моноаминооксидазы. В основе наблюдаемого при этом нарушения тиолдисульфидного обмена, как полагают авторы, кроме микросомального окисления и переоксидации лшшдов, лежит также повышенное образование перекиси в результате процессов дезаминирования экзогенных аминов.

Включение той или иной системы в процесс детоксикации аминов'в определенной мере зависит и от дозы ксеivagant.ru нобиотика, поступающего в организм. Так, N – ацетилирование 5-амино-1-нафтола протекает преимущественно при введении низких доз, а 0-суль-фатирование наблюдается в экспериментах с высокими дозами. Образование N –гидроксилированных метаболитов при этом не происходит [214]. При увеличении нагрузки часть продукта может выделяться и в неизменном виде, как это наблюдалось в случае с триметиламином, когда при приеме 100 мг вещества соединение почти полностью подвергалось N –окислению, а при увеличении количества до мг и 600 мг 50% ксенобиотика выводилось с мочой в неизменном виде [263].

1.3.Химические и токсикологические свойства тетраметилметилендиамина (бисамина) Бисамин находит широкое применение в качестве промежуточного сырья при проведении органических синтезов при производстве ионола – бесцветного стабилизатора синтетического каучука. В процессе промышленного производства он проникает в воздух рабочих помещений и может оказывать вредное воздействие на организм рабочих.

Тетраметилметилендиамин (бисамин) относится к классу алифатических аминов, к подклассу 1,1-диаминов, называемых также гем-диаминами или аминалями [257].

Бисамин, представляет собой прозрачную жидкость с резким запахом, которая в нормальных условиях очень быстро испаряется. Молекулярная масса бисамина – 102,18;

Т.кип. –83°С, плотность при 20°С – 0,744 г/см3 [172], хорошо растворим в воде и устойчив в водных растворах.

Бисамин имеет сильно выраженные основные свойства, обусловленные наличием свободных электронных пар у ivagant.ru атомов азота, что и способствует образованию протонированной формы амина – четвертичного аммониевого соединения [118].

В основе физиологической активности аминов» лежит их способность образовывать водородные, ковалентные и ионные связи, которые определяют способность аминов приближаться к рецепторному сайту в организме.

В том случае, когда соли четвертичных аммониевых оснований полностью ионизированы, проницаемость клеточной мембраны для этих соединений понижается, однако при наличии в равновесной смеси даже небольшого количества амина проникновение через мембрану может иметь место [118].

В литературе освещены некоторые стороны токсичности бисамина по данным острых опытов [172]. Клиническая картина отравления при этом у мышей и крыс была сходной и характеризовалась заторможенностью, неустойчивой походкой, боковым положением. Величина LD5Q для крыс составила – 224 мг/кг, для мышей – мг/кг. Таким образом, бисамин относится к веществам, обладающим сильной токсичностью.

При однократном внесении чистого продукта в конъюнктивальный мешок глаза кролика отмечались раздражение, слезотечение и блефароспазм, через 5 часов появлялась сильная гиперемия слизистой оболочки, в последующие дни – гнойный конъюнктивит, сужение зрачка, помутнение роговицы и деформация века.

Контакт с бисамином вызывал сухость и шелушение кожи, уменьшение эластичности кожной складки, выраженный сосудистый рисунок; на 5-7 день обнаруживался некроз.

При изучении кожно-резорбтивного действия установлено, что даже при однократной аппликации наблюivagant.ru даются изменения общего состояния: адинамия, снижение мышечной силы, потеря болевой чувствительности. Однократное воздействие продукта у подопытных животных вызывало гиперемию хвоста, а в последующие сроки некроз. Кожные тесты на фоне предшествующих повторных аппликаций не выявили сенсибилизирующего действия продукта. Бисамин обладает высоким кумулятивным действием, коэффициент кумуляции для него составил 0,4.

При гистологических исследованиях отмечено выраженное полнокровие сосудов внутренних органов, головного мозга, отек легких микроскопически обнаружены фрагментации мышечных волокон миокарда, дистрофические изменения в печени и почках. Рекомендованная В.А.Мышкиным в соавт. [172] расчетная ПДК в воздухе рабочей зоны составляет 0,2 мг/м.

Учитывая перечисленные выше свойства, а также чрезвычайную летучесть соединения, авторы пришли к выводу о потенциальной опасности бисамина в смысле возможности острых интоксикаций в условиях производства, а выраженные кумулятивные свойства к тому же обусловливают возможность развития хронических интоксикаций. Отсутствуют экспериментальные исследования при ингаляционном поступлении и хроническом действии. Открытым остается вопрос о развитии компенсаторно-приспособительных и защитных биохимических реакций, как в эксперименте на животных, так и у человека в условиях промышленного производства.

Необходимо отметить, что в производственных условиях, наряду с бисамином, на различных этапах технологического цикла возможен контакт работающих и с другими промежуточными продуктами производства ионола.

Сюда следует отнести сам ионол, основание Манниха, 2,6дитретбутилфенол, триметиламин, диметиламш, метанол.

ivagant.ru Бикбулатовым Н.Т. с соавторами [190] был проведен анализ токсичности двух реальных смесей, в которых процентное соотношение компонентов было приближено к производственным условиям; параллельно исследовалась токсичность составляющих компонентов смеси. Основным компонентом одной из них был бисамин (32%), из других соединений в состав смеси вошли: основание Манниха (26,7%), метанол (23%), триметиламин и диметиламин (по 5-6%). Остальные 10% составили: 2,6-дитретбутил фенол, 2,4,6-тритрет-бутилфенол, ионол, ортопаратретбутилфенол и вода. В состав второй смеси бисамина не входил, основным компонентом ее было основание Манниха (85%) и ионол' (15%). Учитывая клиническую картину отравления, количественное соотношение отдельных компонентов смеси и их токсичность, а также физико-химические свойства, авторы делают вывод, что наиболее характерным токсичным компонентом смеси является бисамин, по которому и следует проводить гигиеническое нормирование.

При клиническом обследовании рабочих нефтехимического произодства ионола в ряде случаев выявлены признаки астенизации и вегето-сосудистой дисфункции [72,123]. Выявленные реографическими методами отклонения в гемоциркуляции проявляются в более высокой частоте сердечных сокращений и повышенном пульсовом кровенаполне нии сосудов головного мозга,– снижение тонуса мозговых артерий [132, 177], у значительной части рабочих того же производства отмечены изменения микроциркуляторного гомеостаза с направленностью в сторону гиперкоагуляции [39, 132]. В функциональных изменениях нервной системы превалируют парасимпатическая направленность вегетативных нарушений [72,74,123]. Поражение вегетативной нервной системы у 13% осмотренivagant.ru ных сочеталось с изменениями стволового отдела головного мозга: нистагмоидные подергивания глазных яблок, понижение глубоких, рефлексов, акроцианоз, акрогипергидроз, дрожание пальцев рук. Гематологические нарушения выражаются в ретиколоцитозе (42% обследованных), эозинофилии (33%), увеличение числа палочкоядерных нейтрофилов (25%), моноцитозе (30%). Отмечается также диспротеинемия за счет гипоальбуминемии и гиперглобулинемии [74].

Суммируя представленные литературные данные, можно сказать следующее: биотрансформация и биохимические основы отравления алифатичезкими аминами, бисамина в частности, изучены недостаточно. Еще менее изучены компенсаторно-приспособительные и защитные реакции организма, вырабатываемые в производственных условиях в ответ на хроническое воздействие бисамина.

Все это в значительной степени затрудняет выбор биохимических тестов, позволяющих в наиболее ранние сроки выявлять лиц с признаками дезадаптации и проводить научно-обоснованные оздоровительные и профилактические мероприятия на предприятиях по производству ионола.

Поэтому, одной из основных задач нашей работы было изучение некоторых биохимических показателей крови в эксперименте и у рабочих производства ионола, контактирующих с бисамином. Учитывая универсальность домбраноповреждающего действия ксенобиотиков, мы сочли необходимым исследовать также функциональное состояние мембран эритроцитов и эритроцитарных ферментов.

ivagant.ru

ГЛАВА II. ХАРАКТЕР БИОХИМИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ

В ОРГАНИЗМЕ ПРИ ДЕЙСТВИИ БИСАМИНА

НА ПРОИЗВОДСТВЕ И В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТА

Влияние бисамина на биохимические показатели крови изучались в экспериментальных исследованиях на белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 140-160 грамм. Всего в эксперименте было задействовано 200 животных. Определение хронического действия бисамина осуществляли при ингаляционных затравках, поскольку в производственных условиях поступление бисамина в организм идет в основном через органы дыхания.

Для этого использовали 200-литровые заправочные камеры Б.А.Курляндского. В затравочных камерах на протяжении 4-х часов поддерживалась концентрация бисамина на уровне 10,185 мг/м (I группа животных), что примерно соответствует расчетному ПДК [172] или 0,925 мг/м (2-я группа животных).

Периодичность затравки составляла 5 дней в неделю.

Исследуемые биохимические показатели определяли в динамике через 1,2,4,8 и 16 недель после начала воздействия раздражителя.

Кровь, полученную путем декапитации животных или нанесения насечек на хвост, а в случае рабочих – из локтевой вены или при проколе пальца, собирали в пробирки с добавлением гепарина (120 ед/мл крови), при исследовании эритроцитарных энзимов, и без него, для получения сыворотки крови при изучении активности сывороточной холинэстеразы и гаптоглобина.

При исследовании биохимических показателей крови в общей сложности охвачено 378 рабочих производства ионола, имеющих контакт с биоамином, среди которых мужчин и 97 женщин. Возраст обследуемых составлял 19ivagant.ru 45 лет, стаж работы на данном предприятии – от 2-х месяцев до 15 лет. В качестве контрольной.группы представлены 30 человек из вспомогательных подразделений (энергоцех, управление и работники здравпункта), а при исследо;вании типов гаптоглобина 243 донора из городской и сельской местности, которые не имели контакта с бисамином и другими химическими соединениями, входящими в состав воздуха рабочих помещений производства ионола.

По возрастному составу контрольная группа была аналогична опытной группе. Изучение биохимических показателей у работающих проводилось в зависимости от возраста, пола и по стажу (до I года, 1-5 лет, 6-10 лет, более 10 лет).

Кроме того, рабочие контактирующие с бисамином, были подразделены на две подгруппы с учетом интенсивности воздействия исследуемого соединения:

1а группа – рабочие, имеющие постоянный контакт с бисамином в процессе производства;

16 группа – не имеющие постоянного контакта с бисамином (периодичность воздействия составляла 2-3 раза в неделю), тогда как остальные компоненты воздуха рабочих помещений были одинаковыми.

Исследования биохимических показателей крови входили в комплекс углубленного одномоментного клинико-физиологического обследования, что позволило проследить за изменениями биохимических показателей в зависимости от степени компенсации функций. При неврологическом, обследовании рабочих, которое проводилось сотрудниками кафедры нервных болезней Башкирского государственного медицинского института под руководством зав.кафедры профессора, д.м.н. Н.А.Борисовой, особое внимание уделялось выявлению признаков вегетативной дисфункции. Оценка тонуса вегетативной нервной системы проводилась с помощью схемы-вопросника, опivagant.ru ределения индекса Кердо и рефлекторного дермографизма. Исследовалась вегетативная реактивность с помощью пробы Ашнера-Даньина и вегетативное обеспечение по данным ортоклиносатической пробы. Состояние сердечно-сосудистой системы изучалось общепринятыми методами с. использованием ЭКГ и РЭГ.

В зависимости от степени компенсации функции все обследованные рабочие производства ионола были подразделены на три группы:

группа А – лица, не предъявляющие жалоб на состояние здоровья и при клинико-физиологическом обследовании у которых не выявлены отклонения (удовлетворительная адаптация);

группа Б – лица, не имеющие жалоб, но при клиникофизиологическом обследовании у которых отмечены отдельные признаки вегето-сосудистой дистопии (лица с признаками дезадаптации);

группа В – рабочие с синдромом вегето-сосудистой дистонии (неудовлетворительная адаптация).

Для решения вопроса информативности тестов, которые отразили бы проявление дезаптационных признаков у рабочих производства ионола в наиболее ранние сроки, изучен ряд биохимических показателей. В хроническом эксперименте на крысах и у рабочих исследованы: содержание Нв, МтНв, эритроциты, ретикулоциты, кислотная резистентность эритроцитов, активность АТФаз, НАДНметгемоглобинредуктазы, холинэстеразы сыворотки. У экспериментальных животных дополнительно определяли активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, у рабочих – фенотип и концентрацию гаптоглобина в сыворотке крови.

При выборе методов исследования учитывали доступность биологического материала, информативность и ivagant.ru возможность внедрения в практику профилактических осмотров.

Уровень гемоглобина в крови определяли общепринятым гемиглобинцианидным методом [71] с применением стандартного набора реактивов. Определение количества эритроцитов вели фотометрическим; методом [77], подсчет количества ретикулоцитов проводили, в мазке крови, окрашенном бриллианткрезилблау, и выражали в процентах по отношению к количеству эритроцитов [109].

Для оценки функционального состояния эритроцитов в динамике токсического действия бисамина использовались следующие методы:

I. Метод кислотных эритрограмм по И.И.Гительзону и И.А. Терскову [45], позволяющий дифференцировать эритроциты по кислотной стойкости.

Этот показатель, определяемый проницаемостью мембран эритроцитов и состоянием защитных мембранных "барьеров", реагирует закономерными изменениями на выход всей системы крови из равновесия [144,164] и позволяет характеризовать состояние эритроцитов в целом при воздействии различных повреждающих факторов. [18,29,135,188].

Для регистрации кинетики гемолиза использовался компенсационный фотоэлектроколориметр; все реактивы перед началом опыта выдерживали при температуре 24°С.

Рабочая смесь состояла из 2 мл взвеси эритроцитов (готовилась разведением 0,02 мл крови физиологическим раствором до экстинкции Е=0,7) и 2 мл 0,002 н раствора НС на 0,85% раствора NaС1. Оптическая плотность смеси регистрировалась через каждые 30 секунд при длине волны 600 нм. Процент гемолизированных эритроцитов за каждые 30 секунд расчитывался по разности показателей оптической плотности между соседними точками. За 100% ivagant.ru гемолиза принимали разность оптической. плотности между началом и концом гемолиза (без учета сферулярных изменений). Оценивались и такие показатели как форма эритрограммы, время начала и окончания гемолиза, положение пика кривой.

2.Определение относительного количества метгемоглобина в эритроцитах проводили по методу Эвелин и Мэйлой в модификации,рекомендуемой А.А.Покровским [133].

По сравнению с другими методами он более точен и требует незначительного количества крови. В метгемоглобине железо окислено до трехвалентного состояния и кислород присоединен необратимо, таким образом метгемоглобин теряет способность переносить кислород. Принцип метода заключается в том, что гемиглобин в кислом растворе дает характерную полосу поглощения света при нм. Гемиглобинцианид, в который гемиглобин легко превращается, не имеет полосы поглощения в означенном месте спектра. Поэтому уменьшение оптической плотности, наступающее после обработки гемолизата крови цианидами, пропорционально количеству метгемоглобина в растворе. Для вычисления относительного количества метгемоглобина используется контрольный раствор исследуемой крови со 100% содержанием гемиглобина в нем, что достигается при добавлении раствора К3Fe (CN)6. Экстинкция опытной и контрольной пробы рамеряется дважды – до и после прибавления раствора цианида калия на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 630 нм. Относительное количество метгемоглобина в крови в % по отношению ко всему гемоглобину рассчитывали по формуле.

'В норме в крови содержатся лишь следы МтНв (менее 1%, имеющегося в крови гемоглобина).

3. Метод определения активности НАДН-зависимой метгемоглобинредуктазы в крови.

ivagant.ru Определение НАДН-метгемоглобинредуктазы (НАДН-МГР) в крови вели по методу Hegеsch Е. [122] в модификации, предложенной Г.В.Дервиз [58]. Принцип метода основан на том, что образованный под.влиянием К3Fe(CN)6 метгемоглобин при воздействии. НАДН-МГР, находящейся в исследуемом образце крови, восстанавливается в гемоглобин при обязательном присутствии в растворе НАДН2. Гемоглобин, соединяясь с кислородом, образует О2-Нв. При этом появляется пик оптической плотности в области 575-578 нм, интенсивность которого со временем увеличивается. Эта реакция регистрировалась на спектрофотометре СФ-26 (в экспериментальных исследованиях) или на спектрофотометре марки " SрекоRD " производства ФРГ (при обследовании рабочих). Замеры делались через каждую минуту в течение 5 минут после добавления НАДН., За первые три минуты скорость реакции была наибольшей и из этих трех значений высчитывали оптическую плотность за одну минуту. Активность НАДН-МГР выражали в микромолях гемоглобина, восстановленного за I минуту отнесенного к I г Нв крови, испытуемого. В качестве субстрата использовался специальным образом приготовленный гемолизат, в котором активность НАДН-МГР отсутствовала. С этой целью гемолизат несколько раз очищался ДЭАЕ-циллюлозой.

4. Определение АТФазной активности эритроцитов.

АТФазную активность эритроцитов исследовали по методу Whitam et al [269] в гемолизате эритроцитов. Для определения активности Са, Mg-АТФазы в инкубационную среду добавляли уабаин в концентрации 10 ст. для ингибирования N а, К-АТФазы. Активность К, NаАТФазы расчитывали по разности между суммарной активностыо и активностью Са, Mg-АТФазы. Об активности АТФаз судили по приросту неорганического фосфора и ivagant.ru выражали в мк моль/ сек х л эритроцитов. Неорганический фосфор определяли методом Фиске-Суббароу [78].

5. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитах.

Исследование к глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности эритроцитов проводили по методу G. Е.

GЛоск и D.Мс.Lеап [220 в гемолизате эритроцитов, отмытых дважды холодным физиологическим раствором в десятикратном разведении. Для определения брали 0,1 мл гемолизата эритроцитов. Активность рассчитывали на г.

Нв, содержащегося в исследуемом гемолизате и выражали в мкмоль НДДФН/сек х г. Нв.

6. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови.

Принцип метода определения холинэстеразной активности в.сыворотке крови по Неstrin [133] заключается в том, что при реакции ацетилхолина с щелочным раствором гидроксиламинхлорида образуется гидроксамовая кислота, которая в кислом растворе дает с хлористым железом цветную реакцию. Интенсивность окраски зависит от концентрации ацетилхолина. Об активности холинэстеразы судили по количеству разложившегося ацетилхолина путем вычитания количества ацетилхолина в опытной пробе из количества ацетилхолина, определяемого в контрольной пробе. Количество ацетилхолина определяли по калибровочному графику, построенному по серии стандартных растворов ацетилхолинхлорида. Активность фермента выражали в мкмоль АХХ/сек х г белка. Концентрацию белка в сыворотке крови определяли биуретовым методом [81].

7. Определение концентрации гаптоглобина в сыворотке крови.

ivagant.ru У рабочих, кроме перечисленных выше показателей, были изучены дополнительно концентрация гаптоглобина в сыворотке крови и фенотипы гаптоглобина.

Концентрацию гаптоглобина (Нр) в сыворотке крови определяли по методу Когiпек J. в модификации, предложенной Прохуровской З.Я. и Б.Л.Мовшович [136]. Метод основан на свойстве Нр связываться с гемоглобином (Нв) и при определенных условиях осаждаться раствором риванола. При этом раствор Нв, добавленный в избытке, риванолом не осаждается и остается в растворе. К исследуемой сыворотке добавляли известной концентрации Нв (0,5%). После осаждения риванолом определяется остаточное количество Нв фотометрическим методом при нм. Разность между взятым Нв и оставшимся в растворе указывает на количество Нв, связанного с Нр.

В норме у человека содержание Нр в сыворотке крови может колебаться от 0,5 до 1,4 г/л. Отмечается несколько меньшее содержание Нр у женщин по сравнению с мужчинами. Полагают, что в норме уровень Нр в определенной степени зависит от его фенотипа. Так, показатель более 1,0 г/л характерен для типа Нр 1-1, показатель ниже 1,0 г/л характерен для лиц с типом 2-2. Лица с типом Нр 2-1 чаще имели показатель концентрации Нр средний между ними /I/.

8. Определение типов гаптоглобина методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ).

Тип Нр генетически детерминирован и встречается в популяции человека в виде трех основных фенотипов: Нр 1-1, Нр 2-1 и Нр 2-2 [170]. Для определения типов Нр предложено несколько методов. Почти все из них имеют в основе электрофорез и отличаются либо носителем, используемым при электрофорезе, либо методом окраски фореграмм. Исключением является иммунологический ivagant.ru метод определения фенотипа Нр с применением специфической антисыворотки [226]. Электрофорез проводят на различных несущих средах: бумага, агар, крахмальный блок. Наиболее современным и удобным в применении является метод диск-электрофореза с использованием в качестве носителя полиакриламидного геля. Являясь синтетическим репаратом, ПААГ имеет ряд преимуществ:

постоянный химический состав, прозрачность, большую фракционную способность. Этот метод был использован при определении фенотипов Нр у рабочих. Электрофорез проводили по методу B.G. Davis [106].

Для электрофореза использовали 7% полиакриламидный гель, которым заливали стеклянные трубочки диаметром 5 мм на высоту 60 мм. Пробу, в количестве 0,01 мл (300-400 мкг белка) наслаивали на гель после предварительной 1-2 часовой инкубации исследуемой сыворотки с 0,5% раствором гемолизата, приготовленного из отмытых эритроцитов. Длительность электрофореза примерно 1,5 часа при 2-3 ма на трубку. Идентификацию Нр в геле проводили бензидиновым методом в модификации Н.Н.Старостина [160]и частично методом, предложенным Х.С.Рафиковым с со авт. [140] с ортодианизидовой окраской геля.

Все данные экспериментальных и производственных исследований были статистически обработаны с вычислением средней арифметической М, средней ошибки среднеарифметической и критерия достоверности t (по Стьюденту) [70].

2.1. Биохимические и морфологические показатели крови крыс при хроническом действии бисамина Бисамин является соединением с сильно выраженным разражающим действием на слизистые оболочки и кожivagant.ru ные покровы животных. Гистологические исследования внутренних органов животных указывают на значительные дистрофические изменения в сердце, печени, почках.

Действие бисамина вызывает и функциональные изменения: адинамию, потерю чувствительности, снижение мышечной силы [139].

Однако в литературе не описаны общепринятые показатели (вес животных, весовые коэффициенты органов, гемоглобин, эритроциты, ретикулоциты), характеризующие состояние животных; отсутствуют также сведения о биохимических показателях при хроническом влиянии бисамина, таких как метгемоглобин, активность ряда ферментов (холинэстераза, АТФаза эритроцитов,глюкозофосфатдегидрогеназа, НАДН-метгемоглобинредуктаза), кислотная резистентноеть эритроцитов.

С этой целью нами были проведены экспериментальные исследования хронического влияния бисамина на крыс. Так как у рабочих в основном поступление бисамина в производственных условиях идет через верхние дыхательные пути, нами проведен эксперимент с ингаляционной затравкой двумя концентрациями бисамина – 0,185 и 0,925 мг/м куб. Концентрация бисамина 0,185 мг/м приблизительно соответствует расчетному ПДК [139]. Предварительными исследованиями было показано, что взятые для исследования концентрации бисамина вызывают характерные изменения в общем состоянии животных, наблюдается отставание в приросте массы тела и динамике весовых коэффициентов внутренних органов опытных животных при действии этих же концентраций, что подтверждает действенность взятых для исследования доз.

ivagant.ru 2.1.1. Влияние бисамина на гематологические Исследования уровня гемоглобина (Нв), количества эритроцитов и ретикулоцитов в крови животных при длительном поступлении бисамина выявили фазовый характер их колебаний в зависимости от концентрации исследуемого соединения и длительности опыта. Действие низких концентраций бисамина (1-я группа) не вызывает каких-либо значимых изменений в уровне Нв на протяжении почти всего эксперимента – наблюдается лишь тенденция к повышению. Искючением является 8-я неделя эксперимента, когда отмечается повышение уровня Нв, достоверно отличающееся от контроля.

Количественные колебания эритроцитов под влиянием низких концентраций также изменяются незначительно, и только к последнему сроку исследования наблюдается некоторая анемизация животных.

Наиболее чувствительными к действию бисамина оказались ретикулоциты, количество которых начинает снижаться с первых дней эксперимента и достигает минимальных значений (60% от исходного уровня) через 4 недели от начала хронической затравки. На следующем этапе исследования (8 недель) наблюдается стимуляция эритропоэза. Значимое повышение количества ретикулоцитов не сопровождается с увеличением количества эритроцитов. К концу эксперимента (16 недель) содержание ретикулоцитов снижается до исходных величин, и это позволяет предположить, что к 4-й неделе эксперимента сказывается кумулятивный эффект бисамина, вызывающий гемолиз эритроцитов, убыль которых компенсируется ускоренным созреванием ретикулоцитов, а в следующие сроки количество эритроцитов поддерживается на том же уровне благодаря стимуляции эриivagant.ru тропоэза. В отличие от животных 1-й группы, при поступлении высоких концентраций бисамина (0,925 мг/м3) у животных 2-й группы наблюдается достоверное повышение уровня Нв на всех этапах эксперимента относительно исходных данных, а в некоторые сроки исследования (2-я, 4-я,