МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего

профессионального образования

КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ

А.А. ШЕВЧЕНКО, О. Ю. ЧЕРНЫХ,

Л.В. ШЕВЧЕНКО, Г.А. ДЖАИЛИДИ,

Д.Ю. ЗЕРКАЛЕВ. Е.А. ГОРПИНЧЕНКО

ДИАГНОСТИКА АКТИНОМИКОЗА

Учебное пособие г. Краснодар, 2013 1

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

А. А. ШЕВЧЕНКО, О. Ю. ЧЕРНЫХ, Л.В. ШЕВЧЕНКО, Г.А. ДЖАИЛИДИ, Д.Ю. ЗЕРКАЛЕВ, Е.А. ГОРПИНЧЕНКО

ДИАГНОСТИКА АКТИНОМИКОЗА

Учебное пособие Для студентов высших учебных заведений факультета ветеринарной медицины по направлению подготовки «Ветеринария»

КРАСНОДАР, УДК 619:616.992.28А-07(075) ББК 48. Д Авторы: А. А. Шевченко, О. Ю. Черных, Л.В. Шевченко, Г.А. Джаилиди, Д.Ю. Зеркалев, Е.А. Горпинченко Учебное пособие «Диагностика актиномикоза».

Краснодар: КубГАУ, 2013. 12 с.

В учебном пособии изложены основные свойства возбудителей актиномикоза; описаны бактериоскопические, бактериологические, биохимические, биологические и серологические методы диагностики и дифференциальной диагностики заболевания.

РЕЦЕНЗЕНТЫ:

Лысенко А.А. – доктор ветеринарных наук, профессор, декан факультета ветеринарной медицины КубГАУ.

Куриннов В.В. – доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии.

Рекомендовано методической комиссией факультета ветеринарной медицины КубГАУ протокол №3 от 19 ноября года.

© Кубанский государственный аграрный университет 350044, Краснодар, ул. Калинина, Цель занятия: изучить правила отбора патологического материала и отправки в ветеринарную лабораторию, основные свойства возбудителей актиномикоза, методы лабораторной диагностики.

Диагностика актиномикоза животных проводится комплексно, учитывают эпизоотологические данные, клинические признаки, патологоанатомические изменения и лабораторные исследования.

Большинство видов бактерий рода Actinomyces патогенны для животных и человека. Основные патогенные виды следующие:

A.bovis — возбудитель актиномикоза крупного рогатого скота, естественной средой обитания предположительно являются слизистые ротовой полости или кишечник; A.suis вызывает у свиней актиномикоз молочной железы; A.israelii — основной возбудитель актиномикоза человека, может быть причиной эндометритов, цервицитов и конъюнктивитов, ассоциируется с актиномикозом крупного рогатого скота и свиней, естественное место обитания — ротовая полость, слизистые кишечника людей; A.pyogenes — вызывает гнойные процессы у животных, в том числе маститы коров, перитониты у свиней, естественной средой обитания являются слизистые оболочки; A.viscosus — возбудитель актиномикоза собак; A.hordeovulneris — вызывает у собак абсцессы, плевриты, перитониты, артриты.

Лабораторная диагностика болезней, вызываемых перечисленными видами бактерий, основана на результатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование Объектом исследования является гной, экссудат, содержимое абсцессов, пораженные лимфатические узлы. Тканевый материал в случае необходимости консервируют в 30%-ном водном растворе глицерина.

Микроскопическое исследование исходного материала При диагностике болезней, вызываемых A.bovis и A.viscosus, существенное диагностическое значение имеет микроскопия зернистых гранул «друз», обнаруживаемых в гное или экссудате. С указанной целью гной (экссудат) помещают в чашку Петри, разводят небольшим количеством дистиллированной воды, находят зеленовато-желтые (A.bovis) или серо-белые (A.viscosus) зернышки, т.н. «друзы». Зернышки промывают в дистиллированной воде, помещают на предметное стекло в каплю 10-20%-ного раствора NaOH или КОН и выдерживают 15 минут или немного подогревают над пламенем горелки. Далее на препарат наносят водный раствор глицерина (50%-ный), накрывают его покровным стеклом и изучают под малым и большим увеличением микроскопа. Скопления клеток возбудителя имеют гомогенный центр из переплетенных палочковидных клеток, к периферии булавовидно утолщающихся. При окраске по Граму центр «друзы» окрашивается грамположительно, периферия — грамотрицателыю.

В препаратах, содержащих в материале A.pyogenes, находят маленькие, очень полиморфные грамположительные палочковидные бактерии размером 0,5-2,0 х 0,2-0,3 мкм, располагающиеся беспорядочно. Клетки A.hordieovulneris имеют морфологию, типичную для рода, — нитевидные ветвящиеся, реже короткие дифтероидные формы.

Выделение и идентификация патогенных видов Культивирование. Посев исследуемого материала производят на кровяной агар (кровь овец, крупного рогатого скота). Посевы материала, предположительно содержащего A.bovis, культивируют в аэробных условиях в атмосфере 10%) СО2; A.hordeovulneris растет в аэробных и анаэробных условиях с содержанием в атмосфере 10%> CO2 A.pyogenes и A. viscosus растут в аэробных условиях с 10%) СО2. Контаминированный материал высевают на селективные среды. Для выделения A.israelii из контаминированного материала на неселективных средах следующую его предварительную обработку. Материал суспендируют в транспортной среде Syed: раствор 1-0,6% раствор К2НРО4, раствор 2-1,2% раствор NaCl, 1,2% раствор (NH4) 2S04, 0,6% раствор КН2РО4, 0,25% раствор MgSО4. Готовая среда содержит 75 мл раствора №1, 75 мл раствора № 2,10 мл 1М раствора этилендиаминотетраацетата, 20 мл свежего 1%-ного раствора дитиотреитола, 5 мл 8%-ного раствора Na2CО3, 1 мл 1%>ного раствора резазурина, 814 мл дистиллированной воды, рН 8,0.

Среду стерилизуют фильтрацией. Исследуемый материал суспендируют в транспортной среде. 1 мл суспензии смешивают с 1 мл толуола и встряхивают 20 минут. Водную фазу отсасывают пипеткой, добавляют к ней 10 мл транспортной среды, центрифугируют и осадок высевают на неселективные питательные среды.

Эффект обработки основан на ингибирующем действии толуола на грамотрицательные бактерии. Посевы культивируют при 36С от 2-4 до 14 дней.

Особенности роста актииомицетов на питательных средах.

A.bovis на плотных питательных средах образует нитевидные микроколонии через 24 часа; позднее — макроколонии диаметром около 2 мм, непрозрачные, белые, серо-белые, кремово-белые, шероховатые или гладкие, без зоны гемолиза, мягкой консистенции.

Рост медленный, типичные колонии формируются к 14-15 дню культивирования. Возбудитель хорошо растет (диффузно) в тиогликолатном бульоне к 7-10 дню инкубирования.

A.pyogenes. Нитевидных микроколоний не образует, через 48 часов инкубирования формирует колонии размером около 1 мм с узкой зоной -гемолиза, выпуклые, с ровными краями, непрозрачные, белые или серо-белые, гладкие, мягкой консистенции.

A. viscosus формирует колонии двух типов: 1-й тип — крупные, гладкие, блестящие, выпуклые; 2-й тип — маленькие, шероховатые, неправильной формы.

A.hordeovulneris. Первоначально образует нитевидные микроколонии, позднее (14 дней культивирования) формируются колонии размером около 2 мм, приподнятые, с волнистым краем, с нитевидными отростками, непрозрачные, белые, серо-белые, кремово-белые, шероховатые, сухие или мягкой консистенции, обычно без зоны гемолиза.

A.suis. Образует колонии размером до 2 мм, гладкие, непрозрачные, выпуклые, центр может иметь углубление, края волнистые с отростками, белого или серо-белого цвета. Колонии могут быть шероховатыми или гладкими, сухими или мягкими.

A.israelii. Образует нитевидные микроколонии на плотных средах, к 14 дню - макроколонии R- формы, диаметром около мм, выпуклые, центр может иметь углубление, края волнообразные и нитевидные, непрозрачные, белого, серо-белого, кремовобелого цвета, по консистенции сухие, крошкообразные или мягкие.

Морфология клеток актиномицетов в культуре. Морфология клеток в культуре у ряда актиномицетов отличается от таковой в исследуемом материале.

A bovis. В препаратах, окрашенных по Граму, клетки имеют форму грамположительных палочек, коккобактерий, палочек с утолщенными или разветвляющимися концами, могут присутствовать нити различной длины.

A.pyogenes. В препаратах находят типичные для рода полиморфные грамположительные палочки.

A. viscosus. В мазках из крупных колоний обнаруживают грамположительные дифтероидные палочковидные клетки, в мелких колониях — короткие ветвящиеся нити.

A hordeovulneris. Морфология клеток в препаратах типична для рода. A.suis. В препаратах находят типичные грамположительные палочки дифтероидной формы, иногда кокковидной, а также V, Y или Т-формы, короткие или длинные нити, ветвящиеся формы.

Идентификация представителей рода Actinomyces на уровне рода. Начальные этапы идентификации предполагают в первую очередь дифференциацию видов рода Actinomyces от родов Nocardia, Streptomyces, Dermatophilus. При этом у выделенных культур определяют: потребность в О каталазную активность, подвижность, кислотоустойчивость клеток, рост на грибных средах, наличие воздушных гиф, образование спор, фрагментацию гиф наличие запаха у колоний, тип утилизации углеводов (оксидация, ферментация в тесте Хью - Ляйфсона).

На основании перечисленных признаков для дальнейшего изучения отбирают культуры бактерий, типичные по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам для Actinomyces, растущие в анаэробных или капнофильных (СО2) условиях атмосферы, не имеющие запаха, дающие отрицательную (чаще) или положительную (реже) реакцию на каталазу, не проявляющие при окраске по модифицированному методу Циля — Нильсена кислотоустойчивое™, не растущие на средах для культивирования гри бов, не образующие воздушных гиф, спор, не проявляющие склонности к фрагментации нитей (гиф), расщепляющие углеводы (глюкоза) в тесте Хью — Ляйфсона путем ферментации.

Таблица 1 - Родовые признаки Actinomyces Отношение к кисло- Анаэробы или Строгие Аэробы Аэробы/ капноces при окраске по модифицированному методу Циль-Нильсена (нитей) Метаболизм Ферментация Оксидация Оксидация Слабая ферментация Ветеринарное значе- Локальные и системные бо- Не патоген- Вызывают поние лезни, характеризующиеся ны ражение кожи + положительная реакция; - отрицательная реакция; - (+) преимущественно негативные реакции.

Идентификация представителей рода Actinomyces на видовом уровне. У выделенных культур, отвечающих родовым признакам Actinomyces, изучают с целью определения их видовой принадлежности более широкий круг ферментативных свойств.

Таблица 2 - Свойства основных патогенных для животных риала лазы - тест с S. aureus Леффлера Биопроба. Заражение лабораторных животных в диагностике болезней этой группы обычно не применяют. A.pyogenes, например, проявляет слабую и вариабельную патогенность. При подкожном заражении A.pyogenes у животных развиваются подкожные абсцессы, внутрибрюшинном или внутривенном — возможен летальный исход.

Питательные среды Питательные среды и условия культивирования актиномицетов подбирают с учетом отношения конкретного вида к молекулярному кислороду, потребности в сыворотке крови и некоторых ростовых факторах.

Сердечно-мозговой бульон (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют мозгового отвара (сухой) — 12,5 г, сердечного отвара — 5,0 г, протеозопептона — 10, г, декстрозы — 2,0 г, натрия хлорида — 5,0 г, двунатриевого фосфата — 2,5 г. Устанавливают рН 7,4, стерилизуют при 121° С минут.

Сердечно-мозговой агар. Готовят на основе сердечномозгового бульона, добавляя 2% агара. Среды пригодны для культивирования A.Israeli и A.bovis.

Czapek Dox-arap (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют натрия нитрата — 2,0 г, калия хлорида — 0,5 г, железа сульфата — 0,35 г, калия сульфата — 0, г, сахарозы-30 г, агара — 12 г. Стерилизуют при 115° С 20 минут, рН 6,8. Данная синтетическая среда рекомендуется для культивирования актиномицетов.

Мальтозный (глюкозный) агар Сабуро. В 1000 мл дистиллированной воды растворяют мальтозы (или глюкозы) — 4 г, пептона —1 г, агар-агара — 1,8 г. Среду фильтруют, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют при 110° С 15 минут. Для культивирования актиномицетов можно применять кровяной агар, среду Леффлера, тиогликолевые среды и среды, предназначенные для культивирования анаэробов, не содержащие специальных селективных добавок. Например, агар и бульон Шадлера (см. «Питательные среды для культивирования клостридий»). Во всех случаях надо учитывать, что A.pyogenes лучше растет на средах с кровью (сывороткой крови) и утилизируемыми углеводами, A.hordeovulneris — на средах с 15-20% фетальной сыворотки. Для изоляции ряда актиномицентов применяют питательные среды с селективными добавками.

Среда Бейгтона и Колмана. Состав питательной среды: сердечно-мозговой бульон — 3,7 г, дрожжевой экстракт (порошок) — 0,5 г, поливинилпироллидон — 1,0 г, цистеин солянокислый —0, г, агар — 1,5 г, вода дистиллированная — 100 мл. Компоненты растворяют, стерилизуют при 115° С 30 минут, охлаждают до 45° С и вносят 5 мл стерильной сыворотки крови кролика. Затем к мл готовой питательной среды добавляют 1 мл раствора NaF ( мг/мл), 0,5 мл стерильного раствора колистина сульфата (1 мг/мл).

Эти растворы предварительно стерилизуют. Среду используют для культивирования оральных актиномицетов.

Среда Колмана и Лоше. В качестве основы используют обогащенную плотную среду. К основной среде добавляют метронидазола — 10 мкг/мл и кадмия сульфата — 20 мкг/мл. Кадмия сульфат стерилизуют автоклавированием вместе с основной средой, метронидазол фильтруют и вносят в среду на последнем этапе. Среда рекомендована для культивирования A.viscosus и A.naeslundii.

Контрольные вопросы. 1. Правила взятия, оформления и отправки в лабораторию патматериала для исследования? 2. Как ставят диагноз на брадзот? 3. Дифференциальная диагностика брадзота. 4. Методы лабораторной диагностики брадзота. 5. На чем основана лабораторная диагностика на брадзот?

Список использованной литературы 1. Бакулов И.А., Вишняков И.Ф., Власов Н.А. и др. Особо опасные болезни животных. Покров.: ВНИИВВиМ, 1998.

2. Ветеринарная микробиология иммунология: Учебник /Под ред.

проф. Н. А. Радчука. - М. Агропромиздат 1991.

3. Костенко Т.С., Скаршевская Е.И., Гительсон С.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. М. Агропромиздат 1989.

4. Колычев Н. И. Ветеринарная микробиология и иммунология.

Омск 1996г.

5. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.

Костенко Т.С., Родионова В.Б, Скородумов Д.И. М.: Колос, 2001.

6. Сидоров М.А, Скородумов Д.И, Федотов В.Б. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. – М.: Колос, 1995.

7. Скородумов Д.И, В.В. Субботин, Сидоров М.А, Костенко Т.С.

Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных. – М.: ИзографЪ, 2005.

8. Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Черных О.Ю., Шевкопляс В.Н.

Лабораторная диагностика инфекционных болезней животных. – Краснодар. - 2009, 575 с.

9. Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Литвинова А.Р., Брилев Р.О., Злищева М.А. Совершенствование специфической профилактики крупного рогатого скота//Труды Кубанского государственного аграрного университета. Серия: Ветеринарные науки, 2009. – № (ч.1). - С. 127-129.

Авторы: А. А. Шевченко, О. Ю. Черных, Л.В. Шевченко, Г.А. Джаилиди, Зеркалев Д.Ю., Е.А. Горпинченко Учебное пособие «Диагностика актиномикоза».

© Кубанский государственный аграрный университет 350044, Краснодар, ул. Калинина,