«ТЕХНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Республика Казахстан 1 Алматы 2014 УДК 663.18 ББК 30.16 я 7 Б 59 Бияшев К.Б., Тулемисова Ж.К., Орынтаев К.Б. Б59 Техническая микробиология – Алматы, 2014г. ISBN 978-601-241-184-4 Техническая ...»

КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ АГРАРНЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ

ТЕХНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Республика Казахстан 1

Алматы

2014

УДК 663.18

ББК 30.16 я 7

Б 59

Бияшев К.Б., Тулемисова Ж.К., Орынтаев К.Б.

Б59 Техническая микробиология – Алматы, 2014г.

ISBN 978-601-241-184-4

Техническая микробиология составляет в настоящее время основную часть биотехнологии и приобретает все большее значение в народном хозяйстве. В учебном пособии приведены характеристики микроорганизмов, методы их культивирования, селекции, и хранения, перспективы развития производств, основанных на применении микроорганизмов в биотехнологических процессах (получение белка, витаминов, ферментов, продуктов метаболита, антибиотиков, вакцин, сывороток, биоэнергетике, биоконверсии органических отходов и др.).

Предназначено в качествае учебного пособия для бакалавриатов, магистрантов и Ph-докторантов специальности «Биотехнология» и практических работников.

ББК 30.16 я Учебное пособие рассмотрено на УМО Казахского национального аграрного университета (протокол № 12 от 14.02.2012 г.) и рекомендовано к изданию.

Рецензенты:

Абуталип А. – доктор ветеринарных наук, профессор Утянов А.М. - доктор ветеринарных наук, профессор Б 00(05)- ISBN 978-601-241-184-

ВВЕДЕНИЕ

Последние два десятилетия характеризуются выдающимися достижениями биотехнологии, являющейся междисциплинарной областью знаний, базирующейся на микробиологии, биохимии, молекулярной биологии, биоорганической химии, биофизике, вирусологии, иммунологии, генетике, инженерных науках и электронике.

Современная техническая микробиология — основа биотехнологии — решает многие вопросы, связанные с биосинтезом, трансформацией и другими направлениями индустриальной деятельности, где главными «технологами» служат клетки микроорганизмов или их ферментные системы, иммобилизованные на определенном нейтральном носителе.

В связи с широким использованием микроорганизмов — продуцентов разнообразных продуктов их жизнедеятельности — первоочередными следует назвать задачи получения их высокопродуктивных штаммов, обладающих ценными биосинтетическими свойствами. Эти задачи в тесном контакте с микробиологами решают генетики, а также специалисты, владеющие методами генетической инженерии.

Развитие микробиологической биотехнологии позволяет существенно интенсифицировать производство, повышать эффективность использования природных ресурсов, решать экологические проблемы, создавать новые источники энергии. Возможности биотехнологии при международном сотрудничестве специалистов могут быть направлены на решение мировых кризисных проблем, связанных с восполнением дефицита белка и энергии, предотвращением опасных заболеваний, охраной окружающей среды.

Одна из особенностей микробиологической биотехнологии состоит в том, что она использует технологии производства продуктов на ранних этапах развития микробиологического синтеза. Выявлены существенные потенциальные возможности для усовершенствования традиционных технологий и расширения сфер приложения получаемых продуктов.

В настоящее время достижения микробиологической биотехнологии перспективны в следующих отраслях:

- в промышленности (пищевая, фармацевтическая, химическая, нефтегазовая) - использование биосинтеза и биотрансформации новых веществ на основе сконструированных методами генной инженерии штаммов бактерий и дрожжей с заданными свойствами на основе микробиологического синтеза;

- в экологии - повышение эффективности экологизированной защиты растений, разработка экологически безопасных технологий очистки сточных вод, утилизация отходов агропромышленного комплекса, конструирование экосистем;

- в энергетике - применение новых источников биоэнергии, полученных на основе микробиологического синтеза и моделированных фотосинтетических процессов, биоконверсии биомассы в биогаз;

- в сельском хозяйстве - разработка в области растениеводства трансгенных агрокультур, биологических средств защиты растений, бактериальных удобрений, микробиологических методов рекультивации почв; в области животноводства - создание эффективных кормовых препаратов из растительной, микробной биомассы и отходов сельского хозяйства, репродукция животных на основе эмбриогенетических методов;

-в медицине и ветеринарии - разработка медицинских и ветеринарных биопрепаратов, моноклональных антител, диагностикумов, вакцин, развитие иммунобиотехнологии в направлении повышения чувствительности и специфичности иммуноанализа заболеваний инфекционной и неинфекционной природы.

Разработка и совершенствование методов сохранения высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, используемых на практике, представляет одну из задач современной технической микробиологии.

Все вышесказанное — свидетельство того, что техническая микробиология объединяет большой перечень проблем, решение которых требует широкого использования современных методов исследования и участия в этом не только микробиологов, но и специалистов других Глава 1. Общая характеристика микроорганизмов Живой покров нашей планеты составляют растения, животные и микроорганизмы. Хотя микроорганизмы являются самыми древними существами в эволюции органического мира, человечество узнало о них только в конце XVII в. Микроорганизмы не составляют однородной в систематическом отношении группы. Название это имеет собирательное дифференцировку. Термин «микробиология» происходит от греческих слов: Micros — малый, bios — жизнь, 1оgos - наука, т. е. наука о жизни малых.

Биологической единицей всего живого является клетка. Они построены по единому принципу. Важнейшими компонентами являются три типа макромолекул: ДНК, РНК и белок. Биосинтез органических веществ осуществляется сходным образом на любых ступенях организации. Все эти свойства объединяют разные организмы в единый мир живых существ. Однако наряду с чертами сходства существуют и черты различий, позволяющие дифференцировать организмы на отдельные систематические группы. Изучение тонкого строения клеток с помощью электронного микроскопа выявило существенные различия в структуре клеток разных организмов.

Особенно большие различия установлены между бактериями и сине-зелеными водорослями, с одной стороны, и всеми остальными организмами (низшими и высшими) с другой. Это дало основание разделить живые существа на две противоположные группы: прокариоты (доядерные) и эукариоты (истинно ядерные).

К эукариотам отнесены высшие растения, животные и протисты (простейшие, водоросли и грибы), к прокариотам - бактерии и синезеленые водоросли.

Клетка эукариотов характеризуется сложным строением. Она имеет настоящее ядро с ядрышком, отделенное от цитоплазмы ядерной мембраной. В ядре содержится набор хромосом постоянный для каждого вида организмов. В цитоплазме клетки расположены вде важнейшие органеллы – митохондрии и хлоропласты, которые отделены от цитоплазмы мембраной (двойные). В митохондрии содержатся десятки ферментов, осуществляющих окислительно-восстановительные процессы. Хлоропласты содержат хлорофилл, участвующий в процессе фотосинтеза.

В клетках прокариотов отсутствует истинное ядро и ядерная мембрана, нет ядрышка. Ядерный аппарат представлен одной хромосомой, расположенной непосредственно в цитоплазме. Прокариоты лишены также митохондрий, хлоропластов и других-органоидов, характерных для эукариотов. Они содержат функциональные аналоги этих органоидов, которые не всегда морфологически четко дифференцированы. Так, фотосинтетический аппарат сине-зеленых водорослей и фотосинтезирующих бактерий обнаруживается в форме относительно простых пластинчатых образований (хроматофор или тилакоидов).

Имеется существенная разница между этими двумя группами и в химическом составе клеточных стенок. Основным веществом клеточных стенок прокариотов является гликопептид или пептидогликан, не встречающийся в клетках эукариотов.

Несмотря на простоту организации клетки, прокариоты в процессе развития приобрели разносторонние физиолого-биохимические функции, которые обеспечивают многообразие метаболических путей и, как следствие, широкое распространение в природе.

Развитие эукариотов (из прокариотов) произошло значительно позже с появлением кислорода в атмосфере и рассматривается как гигантский скачок в эволюции организмов, проявившийся в усложнении структурной организации и морфологической дифференцировке.

1.1 Систематика как наука занимается проблемами классификации, номенклатуры и идентификации организмов. Задачей классификации определенные группы. Номенклатура дает названия отдельным группам устанавливает принадлежность микроорганизмов к определенному таксону на основании конкретных признаков.

В настоящее время в микробиологии существуют два различных подхода к систематике, обусловливающие два вида классификации. Одни исследователи считают, что классификация должна отражать историю развития организмов и строиться на филогенетической основе. Это голландской школы Клюйвер, ван Ниль и Стениер разрабатывали сторонником этого направления был Н. А. Красильников.

Второй подход к систематике основан на учете признаков, традиционная, классификация. Она чаще всего заранее подчинена таксономической единице, часто выбираются произвольно. Иногда.микроорганизмы объединяются в группы на основании одного классифицированные по данной систематике, могут иметь большое классификации. Искусственная классификация предназначена для определения той группы организмов, которая интересует исследователя.

Искусственная классификация положена в основу Определителя Берджи (1974, 1984, 1992).

Одной из причин, затрудняющей классификацию микроорганизмов, является отсутствие точно установленных критериев, служащих для определения вида. По аналогии с систематикой высших организмов в микробиологии принято считать основной систематической единицей вид исходя из того, что под этим названием объединяется группа микроорганизмов, наделенная общими признаками и происходящая oт общего предка.

Близкородственные виды (species) объединяются в роды (genus), роды — в семейства (familia), семейства — в порядки (ordo), порядки — в классы (classis), классы – в отдел (divisio), отделы – в царство (regnum). Высшей систематической единицей является царство. Бактерии относятся к царству Procaryotae.

В микробиологии, также как и в ботанике и зоологии, принята бинарная номенклатура (К. Линней). Первое слово – название рода. Оно пишется с прописной буквы и характеризует какой-либо морфологический или физиологический признак микроорганизма, либо фамилию ученого, открывшего этот микроорганизм, либо особый отличительный признак, например местообитание. Второе слово пишется со строчной буквы. Оно обозначает видовое название микроорганизма, характеризующее некоторые отличительные признаки. Например, Bacillus anthracis, родовое название Bacillus, видовое - anthracis.

Название микроорганизмам присваиваются в соответствии с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий, введенного с 1 января года, они едины во всех странах мира.

В микробиологии часто пользуются термином «штамм» и «клон».

Штамм – это более узкое понятие, чем вид. Обычно штаммами называют различные культуры микроорганизмов одного и того же вида. Штаммы одного вида могут быть достаточно близкими по своим свойствам или различаются по отдельным признакам. В то же время свойства разных штаммов не выходят за пределы вида.

Клон – это культура, полученная из одной клетки. Совокупность (популяция) микроорганизмов, состоящая из особей одного вида, называется чистой культурой.

Группа прокариотов, клетки которых обладают ригидной клеточной стенкой, имеющих форму прямой или изогнутой палочки, а также форму шара, делящихся бинарным путем, выделена как собственно группа бактерий. Многие их них имеют жгутики и способны образовывать споры, причем эта способность не является формой размножения клеток.

Термин «бактерии» происходит от слова bacterion - палочка. Размеры бактерий выражаются в микрометрах (1 мкм – 10-6м).

шаровидные, или кокковые, палочковидные и извитые.

Бактериальная клетка, несмотря на внешнюю простоту, представляет собой весьма сложный организм, для которого характерны процессы, свойственные всем живым существам.

Разные методы исследования позволили выявить различные поверхностные и внутренние структуры у бактерий. К поверхностным структурам относят капсулы, жгутики, фимбрии и пили, а также клеточная стенка, под которой расположена цитоплазматическая мембрана. К внутренним структурам относят цитоплазму, в которой находятся нуклеоид, рибосомы и мембранные образования, а также разнообразные включения. Бациллы и некоторые бактерии образуют споры.

Бактериальная клетка по своему химическому составу в общих чертах сходна с клетками всех живых организмов. Она содержит одинаковые с ними минеральные и органические вещества.

В бактериальной клетке содержатся такие же биокомпоненты, как и у всех живых клеток. Это вода, минеральные вещества, органические вещества - белки, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы.

1.2 Питание микроорганизмов. Питание является неотъемлемой функцией каждого живого организма. В процессе питания организм получает вещества, идущие на синтез клеточных структур, а также служащие источником энергии для всех процессов жизнедеятельности.

Для питания микроорганизмов необходимы те же элементы, что для растений и животных. В первую очередь это углерод, азот, кислород и водород. Они являются основой всех органических веществ, которые входят в состав живой клетки.

Для характеристики типов питания растений и животных введены термины «аутотрофный» и «гетеротрофный». Аутотрофный (от греческого auto – сам, trophic – питающийся) тип питания который присущ растениям; гетеротрофный (от греческого hetero – другой) тип присущ животным.

Микроорганизмы в отличие от растений и животных характеризуются многообразием типов питания. Для них предложена новая классификация и новые термины для обозначения типов питания. В основу этой классификации положены источник углерода, источник энергии и донор электронов (восстановитель). Источником углерода для одних микроорганизмов могут служить неорганические соединения, в частности углекислота, для других органические вещества. Те микроорганизмы, которые получают углерод только из углекислоты и синтезируют из него органическое вещество, называются автотрофами - «самостоятельно питающимися». Они характеризуются наибольшей автономностью и независимостью своего питания от жизнедеятельности других организмов, могут развиваться в чисто минеральных средах. Другие микроорганизмы могут использовать углерод из готовых органических соединений, они называются гетеротрофами и paзвиваются на органических средах.

Восстановление углерода до органических соединений требует.затрат энергии. Источником энергии может быть солнечный свет и химические связи органических и минеральных веществ. Организмы, которые фотосинтезирующими, а те, которые используют энергию химических хемосинтезирующими.

В качестве доноров водорода (электронов) для восстановления углерода могут служить органические и минеральные вещества. По отношению к ним микроорганизмы разделяются на органотрофы используют органические вещества и литотрофы используют Соответствующие названия имеют и микроорганизмы, обладающие этими типами питания.

Изучение химического состава бактериальной клетки показали, что нуклеиновые кислоты и др.) характерны для микроорганизмов всех типов.

Они синтезируются клетками из веществ той среды, где развивается микроорганизм. Такие вещества, в которых нуждается микроорганизм и которые он потребляет из окружающей среды для удовлетворения своих пищевых потребностей, получили название питательных, а среды, определяется пищевыми потребностями микроорганизмов. Последние весьма разнообразны, поэтому и разнообразен набор питательных сред, применяемых для культивирования микроорганизмов. Универсальных сред нет. Для каждого вида или группы близких видов необходима своя микроорганизмов, называются элективными, или избирательными. По происхождению среды бывают естественными, или натуральными, и синтетическими (лабораторными). Естественные среды состоят из веществ растительного и животного происхождения. Это могут быть клетки и ткани (культура тканей) или экстракты из них. На таких средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в них содержатся в основном все необходимые компоненты. Синтетические среды готовятся из химически чистых элементов, которые берутся в строго определенных концентрациях. Состав этих сред в отличие от естественных всегда известен.

Микроорганизмы отличаются от всех других организмов огромной скоростью потребления питательных веществ. Экспериментальным путем установлено, что бактериальная клетка за сутки потребляет «пищи» в раз больше веса своего тела. Это свидетельствует о повышенном обмене веществ у микроорганизмов. Специальных органов питания микроорганизмы не имеют. Питательные вещества поступают в клетку через всю ее поверхность. Это способствует быстрому обмену веществ между клеткой и средой. Известны два способа питания живых существ голозойный и голофитный.

При голозойном способе питания плотные частицы пищи захватывает или заглатывает живой организм, в пищеварительном тракте которого пища подвергается перевариванию. Этот способ питания характерен для животных (от высших до простейших).

При голофитном способе питания живые существа, не имеющие специальных органов для заглатывания и пищеварения, используют питательные вещества путем их всасывания в виде относительно небольших молекул из водного раствора.

Как известно, большинство органических соединений представляют собой полимеры (например, полисахариды и белки) и не могут быть поглощены и использованы непосредственно в обмене веществ клетки.

Такие вещества вначале должны быть расщеплены на простые соединения, для которых клеточная мембрана проницаема. Крупные молекулы расщепляются экзоферментами, которые экскретируются клетками внеклеточное переваривание, свойственное только микроорганизмам.

Поступление питательных веществ в клетку микроорганизма.

Поступление воды и растворенных в ней питательных веществ из окружающей среды внутрь микробной клетки, а также выход продуктов обмена из клетки происходит через клеточную стенку, капсулу и слизистые слои. Капсула и слизистые слои представляют собой достаточно рыхлые образования, и они, возможно, не оказывают значительного влияния на транспорт веществ, тогда как клеточная стенка может служить существенным барьером для поступления питательных соединений в клетку.

Активная роль в процессе поступления в клетку питательных веществ принадлежит также цитоплазматической мембране.

цитоплазматическую мембрану лишь тогда, когда на нее действует какаялибо сила или же с помощью механизмов, которые обусловливают перенос этого вещества через мембрану. В первом случае мы имеем дело с пассивной диффузией, когда транспорт вещества осуществляется через электролитов) или электрических потенциалов (в случае ионов) по обе стороны цитоплазматической мембраны. Экспериментами показано, что за цитоплазматическую мембрану путем пассивной диффузии. Скорость такого переноса веществ весьма незначительна.

Транспорт большинства растворенных веществ осуществляется через мембрану с помощью специальных механизмов переноса. Это молекулыпереносчики, циркулирующие между внешним и внутренним пограничными слоями цитоплазматической мембраны. Считают, что эти растворенных веществ на ее внешней стороне и транспортируют их к внутренней, откуда они высвобождаются в цитоплазму без изменения. Эти связанные с цитоплазматической мембраной переносчики, представляющие собой белки, называются пермеазами.

Известны два типа процессов переноса растворенных веществ, осуществляемых пермеазами. Первый тип — облегченная диффузия.

Движущей силой этого процесса является разница в концентрации какоголибо вещества по обе стороны мембраны. При этом молекула вещества соединяется с молекулой-переносчиком у наружной поверхности мембраны и образовавшийся комплекс диффундирует через мембрану к ее внутренней стороне. Там он диссоциирует, и освобожденное вещество оказывается внутри клетки. Затем переносчик диффундирует обратно к наружной поверхности и сразу же может присоединить к себе другую молекулу вещества. Облегченная диффузия не требует расхода энергии, если наружная концентрация вещества выше внутренней, и вещество, таким образом, перемещается «вниз» по химическому градиенту. Скорость ее зависит от концентрации вещества в наружном растворе. Предполагают, что выход продуктов обмена веществ из микробной клетки осуществляется по типу облегченной диффузии и проходит при участии переносчиков.

Второй тип процесса транспорта веществ пермеазами называется активным переносом. В этом случае растворенные вещества переносятся в клетки микроорганизмов «вверх» по химическому градиенту (или, как говорят, против градиента концентрации). Считают, что большинство веществ проникает в клетку микроорганизма в результате активного переноса. Подобный транспорт веществ нуждается в энергии (АТФ), получаемой в результате дыхания или брожения. При отсутствии источников энергии накопления веществ внутри цитоплазмы не происходит.

В норме у бактериальных клеток всегда наблюдается определенное напряжение цитоплазмы, объясняющееся осмотическим давлением клетки, при котором цитоплазма плотно прижата к оболочке. Такое постоянное напряжение клеточного содержимого называется тургором и является одним из необходимых условий роста клетки. Величина осмотического давления у бактерий колеблется в пределах 6105 Па.

При увеличении концентрации питательного раствора (поваренной соли или сахара) бактериальная клетка обезвоживается, цитоплазма ее сокращается и отходит от оболочки, клетка переходит в состояние расслабления и вялости. Такое явление называется плазмолизом.

Если концентрация раствора значительно ниже концентрации содержимого клетки (дистиллированная вода), наступает процесс, обратный плазмолизу – плазмоптиз. Вода проникает в бактериальную клетку, ее содержимое разбухает, форма меняется. Плазмоптиз, так же как и плазмолиз, приводит к гибели бактериальной клетки.

Как и во всех живых организмах, основную часть микробной клетки составляет вода (80-90% общей массы клетки). Элементарный состав клеток микроорганизмов характеризуется следующими данными (в % от массы сухого вещества): углерод - 50, кислород - 20, азот - 14, водород - 8, фосфор - 3, сера - 1, калий - 1, натрий - 1, кальций - 0,5, магний - 0,5, хлор - 0,5, железо - 0,2, другие элементы - 0,3.

Некоторые микроорганизмы для развития требуют дополнительные вещества называемыми ростовыми, или факторами роста. В эту группу веществ входят витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, органические кислоты.

Микроорганизмы, нуждающиеся в факторах роста, называются ауксотрофными, а не нуждающиеся - прототрофными. Ауксотрофными чаще всего являются мутанты прототрофов, которые можно получить из прототрофов путем искусственного мутагенеза. Ауксотрофы отличаются от исходных прототрофов потребностью в определенных факторах роста.

Они растут на сложных естественных средах, в состав которых вводится дрожжевой экстракт или (для определенных ауксотрофов) кукурузный экстракт. Если микроорганизм неспособен синтезировать то или иное соединение, оно становится для него незаменимым фактором роста.

количествах (мкг/л). Они чаще всего входят в состав ферментов и поэтому играют незаменимую роль в физиологии микробной клетки.

микроорганизма, питательное вещество участвует во множестве разнообразных химических реакций; эти реакции, а также все остальные химические проявления жизнедеятельности микроорганизмов носят общее название обмена веществ или метаболизма. Обмен веществ состоит из двух групп жизненно важных процессов - катаболизма и анаболизма.

Катаболизм (диссимиляция, энергетический обмен) - это процессы распада пищевых веществ - углеводов, жиров и белков, которые микроорганизмов различают две основные формы катаболизма - дыхание и брожение. При дыхании происходит полное разрушение органических веществ с выходом большого количества энергии и образованием бедных энергией конечных продуктов (СО2 и Н2О). При брожении осуществляется незначительного количества энергии и накоплением богатых энергией конечных продуктов (этилового спирта, молочной, масляной и других кислот). Высвобождающаяся при катаболизме органических веществ свободная энергия аккумулируется в форме энергии фосфатных связей аденозинтрифосфата (АТФ).

При аэробном дыхании акцептором водорода является кислород, при анаэробном - неорганические окисленные соединения типа нитратов, сульфатов, при брожении - органические соединения.

Анаболизм (ассимиляция, конструктивный обмен) объединяет процессы синтеза макромолекул (нуклеиновых кислот, белков, полисахаридов и т. д.) из более простых соединений. Процессы синтеза связаны с потреблением свободной энергии, которая вырабатывается в результате дыхания или брожения и поставляется в форме АТФ.

Катаболизм и анаболизм протекают одновременно, многие реакции и промежуточные продукты являются для них общими и осуществляются с помощью ферментов. Ферменты - биологические катализаторы. Они катализируют тысячи химических реакций, из которых слагается обмен веществ микроорганизма. В настоящее время известно около тысячи ферментов. Согласно разработанной Международной комиссией по ферментам новой классификации и номенклатуре ферментов, они подразделяются на шесть главных классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы.

Вопросы для самопроверки Понятие о прокариотах Классификация микроорганизмов Основные группы микроорганизмов Питание микроорганизмов Дыхание микроорганизмов Метаболизм микроорганизмов Глава 2. Культивирование микроорганизмов 2.1Виды питательных сред. Под культивированием понимают выращивание определенного вида, типа или клона микроорганизма, или смеси разных микроорганизмов на питательных средах.

Для выращивания бактерий применяют различные питательные среды. Они могут быть жидкими, твердыми (лучше называть их плотными) или полужидкими. Жидкие среды готовят на основе водных растворов каких-либо веществ, чаще всего мясной воды, различных гидролизатов, иногда жидких естественных продуктов (молока, крови и др.). Для получения плотных сред к ним добавляют или агар, или желатин, или силикагель в соответствующих концентрациях. Агар представляет собой полисахарид сложного состава, получаемый из морских водорослей.

Он имеет плотную волокнистую структуру. Агар плавится при 100 °С, но при охлаждении сохраняет жидкую консистенцию до 45 °С. Для получения плотных сред его добавляют в концентрации 1,5-3,0%.

Полужидкие среды имеют вязкую консистенцию благодаря добавлению к ним небольшого количества агара (0,3-0,7%). По происхождению среды делят на естественные (кровяные, молочные, картофельные, яичные) и искусственные, получившие особенно широкое распространение. Они представляют собой искусственные сбалансированные смеси питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, необходимых для роста и размножения микроорганизмов. В них в качестве универсального источника азота и углерода для патогенных бактерий применяют пептоны - продукты неполного расщепления белков с помощью ферментов (пепсина), различные гидролизаты (рыбный, казеиновый, дрожжевой и т.

п.). Питательные среды должны обязательно отвечать трем основным требованиям:

1) они должны содержать в достаточном количестве все необходимые питательные вещества (источники энергии, углерода, азота), соли и ростовые факторы;

2) должны иметь оптимальную для роста данного вида бактерий рН;

повышается концентрация питательных веществ, особенно солей, до уровней, тормозящих рост бактерий).

прозрачными. Наконец, они должны быть стерильными, не содержать подразделяют на следующие основные категории.

Универсальные - среды, на которых хорошо растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий. К ним относятся: мясо-пептонный бульон (МПБ = мясная вода + 1% пептона + 0,5% NaCl), мясо-пептонный агар (МПА = МПБ + 2-3% агара).

Дифференциально-диагностические - среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям. К ним относятся среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса и многие другие.

обогатительные) — среды, содержащие вещества, используемые микроорганизмами определенных видов и не благоприятствующие или даже препятствующие росту других микроорганизмов. Селективные среды определенные виды бактерий. Сюда относятся среды Мюллера, Кауфмана, селенитовая, Рапопорт, 1%-ная пептонная вода, Китт-Тароцци и др.

Синтетические - среды строго определенного химического состава, представляющие собой растворы неорганических солей с добавлением химических соединений, которые служат источником углерода или азота.

Примером такой синтетической среды является минимальная среда М-9, в которой источником энергии и углерода является глюкоза, а азота - NH4C1.

Синтетические среды могут быть и более сложного состава с включением различных аминокислот, оснований и витаминов.

Полусинтетические - синтетические среды, к которым добавляют какой-либо продукт природного происхождения, например сыворотку крови. Существует много различных вариантов питательных сред, сконструированных с учетом потребностей соответствующих видов бактерий и диагностических целей.

2.2 Способы культивирования микроорганизмов.

В зависимости от способа культивирования различают периодические (стационарные и при глубинном культивировании) и непрерывные (при проточном) культуры бактерий.

Стационарный способ: питательные среды сохраняются постоянными, с ними никаких дополнительных манипуляций не производят. Однако при таком способе культивирования в жидких питательных средах, где преобладают анаэробные энергетические процессы, выход биомассы незначителен. Поэтому в связи с развитием микробиологической промышленности были разработаны принципиально новые способы культивирования, позволяющие получать гораздо больший выход биомассы или биологически активных соединений. К их числу относятся метод глубинного культивирования с аэрацией и метод использования проточных сред.

Поверхностный метод культивирования. Культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Клетки получают питание за счет содержащихся в этих средах веществ и используют для дыхания кислород воздуха, поэтому для их нормального обеспечения кислородом приходится применять рыхлые по своей структуре среды с небольшой высотой слоя.

Недостатком метода является необходимость больших площадей для выращивания. Выращивание производственной культуры происходит обычно в не асептических условиях. Однако среда и кюветы должны быть надежно стерилизованы..

Главное преимущество поверхностного метода - низкая потребность электроэнергии по сравнению с глубинным методом.

Метод глубинного культивирования с аэрацией. Для выращивания с помощью этого способа применяют специальные устройства - реакторы.

Они представляют собой герметические котлы (приспособленные автоклавы), в которые заливается жидкая питательная среда. Реакторы снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальные рН, дозированное поступление необходимых дополнительных питательных веществ. Однако главная особенность таких реакторов в том, что они постоянно продуваются стерильным воздухом и в них установлены мешалки, с помощью которых среда постоянно перемешивается. Поэтому во всей питательной среде создается такая концентрация свободного кислорода, при которой энергетические процессы происходят в аэробных условиях, т.

е. достигается максимальное использование энергии, заключенной в глюкозе, а следовательно, и максимальный выход биомассы.

Глубинное культивирование проводят в реакторах в герметичных котлах с жидкой питательной средой, оборудованных автоматическими приспособлениями для контроля рН, О2, температуры, поступления стерильного воздуха и т.д. В аэробных условиях достигается максимальное использование энергии и максимальный выход биомассы. Выход биомассы бакьерий при культивировании в стационарных условиях через 18 20 ч КОЕ, а при глубинном способе через 12 14 ч 50- 60 109 КОЕ.

Весь процесс должен проводиться в строго асептических условиях, что с одной стороны, является преимуществом метода, а с другой составляет наибольшую техническую трудность, т.к. нарушение асептики часто приводит к прекращению роста культур.

Проточный способ культивирования позволяет создать условия, при которых клетки имеют возможность длительное время находиться в определенной фазе роста (экспоненциальной) при постоянной концентрации питательных веществ и в одних и тех же условиях, обеспечивающих непрерывный рост культуры. Методы получения непрерывных культур основаны на том, что в аппарат, где растут клетки, непрерывно добавляют свежую питательную среду и одновременно из него удаляют соответствующее количество бактерий.

микроорганизмов включают периодические или непрерывные процессы.

Биореактор, ферментер или ферментатор - это закрытая или открыта емкость, в которой при определенных условиях (давление, температура, концентрация сухих веществ, рН среды и т.д.) протекает на клеточном или молекулярном уровне контролируемая реакция, осуществляемая с помощью микроорганизмов.

биореакторов и вспомогательного оборудования; б) загрузку аппарата питательной средой; в) внесение посевного материала (клеток, спор); г) рост культуры, который может совпадать во времени со следующим этапом или предшествовать ему; д) синтез целевого продукта; е) отделение и очистку готового продукта. Речь идет о временной последовательности этапов, по окончании последнего этапа проводится мойка биореактора и его подготовка к новому циклу.

Этап роста культуры включает несколько фаз: а) лаг-фазу сравнительно медленный рост внесенной культуры, осваивающей новую среду обитания в объеме биореактора; б) экспоненциальную фазу бурное деление клеток, сбалансированный рост культуры; в) фазу замедленного роста, связанного с исчерпанием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболизма; г) стационарную фазу - прирост клеток равен их убыли; д) фазу отмирания - постепенное снижение числа жизнеспособных клеток.

Биотехнологически ценные продукты синтезируются в экспоненциальную фазу (нуклеотиды, многие ферменты, витамины - так называемые первичные метаболиты) или в стационарную фазу роста (антибиотики, красящие вещества и т.д. — так называемые вторичные метаболиты или идиолиты).

Широко применяют периодическое культивирование с подпиткой:

помимо внесения питательного субстрата в реактор до введения в него биообъекта, в процессе культивирования в аппарат добавляют питательные вещества через определенные промежутки времени порциями или непрерывно «по каплям». Иногда дополнительно вносят биообъект.

Существует также отьемнодоливочное культивирование, когда часть объема из биореактора время от времени изымается при добавлении эквивалентною объема среды. Это приводит к регулярному омолаживанию культуры и к задержке ее перехода к фазе отмирания. Такой режим культивирования в значительной мере уподобляется непрерывному процессу, поэтому называется также полунепрерывным культивированием.

В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Обеспечивается непрерывный приток свежей питательной среды в биореактор и отток из него культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности.

Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой.

Вопросы для самопроверки 1.Понятие о культивировании микроорганизмов 2.Виды питательных сред 3.Способы культивирования микроорганизмов 4.Виды биотехнологических процессов 3. Глава Хранение микроорганизмов Несмотря на постоянное углубление наших знаний в области генетики, биохимии, физиологии и экологии микроорганизмов, мы все еще далеки от понимания полной картины о процессах, ответственных за обратимый переход клеток микроорганизмов в анабиотическое состояние. Примерно за 60-летнюю историю активного изучения мира микроорганизмов и создания их коллекций накопились достаточно общие, но все еще не вполне четкие, по нашему мнению, представления по управлению процессами консервации и восстановления жизнеспособности каждого конкретного организма. Сопоставляя количество вновь открываемых или общебиологических представлениях о строении и физиологии микробных клеток, становится понятным явное отставание знаний в области конкретных подходов. Богатый опыт работы с коллекциями микроорганизмов свидетельствует о том, что ряд современных методов консервации оказывается относительно эффективным при поддержании лабораторных культур микроорганизмов. Однако эффективная консервация с полным сохранением популяций и геномов представляет собой проблему, особенно если учесть необычайное физиологическое разнообразие микроорганизмов, а также то, что способность сохранять жизнеспособность в определенных условиях оказывается связана не только с родом и видом микроорганизма, но нередко с его расой. Поэтому, как бы ни был ценен эмпирический опыт по поддержанию культур, актуальной остается и попытка анализа природных процессов, в ходе которых многие микроорганизмы успешно сохраняются в природе, несмотря на весьма жесткие там условия, отнюдь не способствующие активной их жизнедеятельности. Механизмы этих процессов в отдельных более хорошо изученных случаях столь эффективны, что обеспечивают сохранение микроорганизмами жизнеспособности и генетической стабильности в течение весьма длительных сроков. В целом практика консервации, развивавшаяся на протяжении многих десятилетий, соответствующих тем механизмам погружения клеток в анабиотическое состояние, которые были выявлены (и продолжают выявляться) при изучении образования, свойств и прорастания специализированных покоящихся клеток микроорганизмов.

Существующая практика консервации ориентируется обычно на специализированных приемов, позволяющих перевести в анабиотическое состояние вегетативные клетки разнообразных микроорганизмов.

обитающих в окружающей среде, плохо культивируются в искусственных условиях. Это так называемые некультивируемые микроорганизмы, исследование которых сопряжено с необходимостью их сохранения, что предполагает соответствующие работы по выбору условий консервацииреактивации.

Поддержание штаммов в рабочем состоянии, сохранение их ценных свойств являются важными условиями практически любой работы с микроорганизмами - от первичного изучения до использования их в производстве различных биопрепаратов.

3.1 Методы хранения микроорганизмов Методы непродолжительного хранения микроорганизмов Методы непродолжительного хранения являются одними из самых простых, не требующих дорогостоящего оборудования и в то же время незаменимых в повседневной работе с микроорганизмами.

- Субкультивирование, или метод перевиваемых культур Субкультивирование, или периодический пересев на свежие агаризованные среды, относится к старейшим и давно уже ставшим традиционными методам поддержания и сохранения бактериальных культур как в лабораторных, так и промышленных условиях. Интервал между пересевами зависит от микроорганизма, используемой среды, температурных условий хранения.

микроорганизмах идут с пониженными скоростями и поэтому промежутки между пересевами удлиняются. Однако для роста некоторых бактерий требуются комплексные среды. Или же для сохранения их специфических физиологических свойств необходимо присутствие в среде сложных соединений. При использовании комплексной среды могут потребоваться более частые пересевы, связанные с ускоренным ростом бактерий или накоплением конечного продукта метаболизма.

микроорганизмов при комнатной температуре в закрытом контейнере. Для завинчивающимися крышками или резиновые пробки либо обычные ватно-марлевые пробки, которые обертывают парафильмом и помещают в полиэтиленовый пакет. Чтобы уменьшить скорости метаболизма микроорганизмов, культуры лучше хранить в бытовом холодильнике при температуре 5-8 °С. Используя эти меры предосторожности, можно сохранять большинство бактерий в течение 3-5 месяцев без пересева.

экспериментальным путем, стараясь проводить их как можно реже во избежание селекции вариантов. На случай потери культуры желательно сохранять ее дубликаты. После каждого пересева культуру проверяют на чистоту и периодически проводят сокращенную проверку для выявления каких-либо изменений в фенотипических свойствах бактерий. В пересеваемых культурах не следует выделять единичные колонии, поскольку при этом повышается вероятность селекции мутантов.

Преимущества и недостатки метода. Метод периодических пересевов прост в исполнении и используется для многих микроорганизмов. Он общедоступен и позволяет легко контролировать чистоту штаммов.

Недостатками же метода являются необходимость соблюдения регламентов пересевов, потребность в большом количестве посуды, питательных сред, значительные затраты времени, риск загрязнения культуры, ошибки при обозначении штаммов или наклеивании неправильной этикетки, случаи селекции, риски потерь культур и т.д..

Известны случаи изменения биологических свойств микробных культур и даже их гибель. При частых пересевах штаммы-продуценты из-за спонтанной диссоциации нередко могут терять или снижать способность к выработке целевых продуктов.

- Хранение под минеральным маслом С помощью этого сравнительно простого и дешевого метода удается весьма успешно сохранять месяцами или даже годами многие виды бактерий. Для этого метода обычно используют стерильное минеральное масло медицинского назначения (например, вазелиновое масло с удельной плотностью 0,865-0,890 г/см3).

Техника проведения. Масло стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 170 °С в течение 1-2 ч, поскольку автоклавирование для этой цели применять не рекомендуется [23-25]. Культуры выращивают в пробирках -на скошенном питательном агаре (косячках), в толще агаризованной среды (столбиках) или в жидкой питательной среде соответствующего состава. В пробирки с выросшими микроорганизмами стерильно наливают слой минерального масла высотой не менее 2 см (косячки должны быть покрыты полностью). Слой масла служит защитой культур от высыхания, одновременно понижая их метаболизм. Покрытые маслом культуры хранят в вертикальном положении в холодильнике. Для проверки сохранности культур периодически определяют их жизнеспособность. Обычно культуры пересевают 1-2 раза в год на свежую среду. Для этого используют инокуляционные иглы или петли. При обжиге иглы (петли) следует позаботиться о том, чтобы брызги масла не попали на окружающие предметы и персонал. Пересеянные культуры снова покрывают стерильным маслом, а исходные материалы хранят до тех пор, пока не станет ясно, что заложенный на хранение штамм не загрязнен и не изменен.

Недостатки метода. Этому методу присущи такие же недостатки, как и обычному периодическому пересеву. Кроме того, всегда велика вероятность загрязнения и потери штамма вследствие использования нестерильного масла.

- Хранение в воде и водно-солевых растворах Метод хранения в физиологическом растворе и дистиллированной воде применим для большинства микроорганизмов, если их требуется сохранить в течение, например, месяца. Микробные клетки при использовании этого метода переходят в покоящееся состояние - гипобиоз.

Техника проведения. Клетки с плотностью не более 109 КОЕ/мл вносят в пробирку с индифферентной жидкостью с физиологическим ионным составом и подходящим рН. Пробирки с инокулятом хранят в холодильнике при температуре 4-8 °C.

Недостатки метода. По нашим наблюдениям, велика вероятность загрязнения штаммов вследствие благоприятных условий (влажность и температура) для роста грибной флоры во внутреннем объеме пробирки.

- Хранение высушиванием на твердых носителях Большинство бактериальных культур гибнет при высыхании в лабораторных условиях. Однако некоторые культуры, особенно спорообразующие, если были высушены в подходящих для них носителях, сорбирующих влагу, сохраняются годами.

В практике хранения микроорганизмов используются самые разнообразные носители - почва, песок, бумага, смолы, желатин, активный уголь, зерна злаков и многие другие.

- Хранение замораживанием при температурах ниже точки кристаллизации воды Обычное замораживание. От хранения в воде и водно-солевых растворах данный метод отличается тем, что емкости с образцами помещают в морозильную камеру холодильника при температуре от минус 10 до минус 20 °С. Такой простой прием замораживания проб в отличие от обычного нахождения микроорганизмов в водной среде позволяет заметно продлить сохранность штаммов и уменьшить вероятность их загрязнений, что бывает удобно при исследовании большого количества изолятов. При таком способе консервации изоляты остаются живыми от 6 месяцев до лет хранения. Недостатки метода. Такой способ хранения не рекомендуется применять для криочувствительных бактерий из-за их повреждений в эвтектических смесях концентрированных растворов электролитов и высокой вероятности генетического обмена между клетками, что может способствовать неконтролируемой селекции культуры.

Методы длительного хранения микроорганизмов Длительное хранение клеток без утраты ценных свойств проводится методами, обеспечивающими существенное торможение протекающих у них жизненных процессов. Это достигается путем глубокого замораживания микроорганизмов или их высушивания из замороженного (лиофилизация) либо непосредственно из жидкого состояния. Высокий эффект консервации этими методами достигается тем, что клетки, лишаясь свободной воды в условиях субнулевых и (или) криогенных температур, переходят в состояние анабиоза.

- Консервация замораживанием при низких температурах Практически все известные группы бактерий способны длительно храниться в замороженном состоянии при низких (криогенных) температурах (температуры ниже 120 К, т.е. менее минус 153 °С). Такую температурную область хранения обеспечивают сжиженные газы - воздух (80 К или минус 193 °С); азот (77,4 К или минус 196 °С); неон (27,1 К или минус 246 °С); водород (20,4 К или минус 256 °С); гелий (4,2 К или минус 269 °С) [41]. Исполняя роль хладоагентов, они могут относительно долго оставаться в сосудах Дьюара или сделанных по их принципу специальных хранилищах с хорошей теплоизоляцией. Испаряясь под атмосферным давлением, эти газы в сжиженном состоянии достаточно хорошо поддерживают постоянную температуру нормального кипения каждого из них.

криоконсервации (от греч. кгувъ - холод, мороз, лед) из-за доступности и безопасности получил жидкий азот. Поэтому криоконсервация в жидком азоте или его паре является основным для большинства коллекций культур. Этим методом консервируют самые различные биоматериалы актиномицеты, бактерии, дрожжи, грибы, вирусы растений и животных, культуры клеток и т.д. В ряде музеев многие бактериальные культуры достаточно успешно хранятся при температурах, которые обеспечивают современные морозильники или кель-винаторы (обычно до минус 86 °С). При этих температурах хранения скорость отмирания может быть в 1000 раз меньше, чем при минус 10 °С.

О востребованности метода криоконсервации биоматериалов свидетельствует достаточно хорошо развитая инфраструктура производства и маркетинга криогенного оборудования, включающего программные замораживатели, хранилища и транспортные резервуары, морозильники, а также различные расходные материалы.

Криогенное оборудование Замораживатели. Для криоконсервации микроорганизмов, как правило, не требуется специальных программных замораживателей, как для клеток эукариотов, клеточных линий и органов.

Хранилища. Это специализированное оборудование, выпускаемое различными фирмами, обеспечивает возможности транспортировки и хранения материалов в жидком азоте.

Морозильники. Выпускается множество типов низкотемпературных холодильников, которые успешно применяются для хранения клеточных материалов. Это, например, низкотемпературные морозильники типа Vestfrost VT, MDF-U6086S SANYO HVU 586, МТТТ МЛ, быстрозамораживатель NZKP-48/80 Frigera и др. Современные морозильники обычно оборудованы аварийной сигнальной системой, работающей на аккумуляторе, а некоторые из них и устройствами аварийной подачи паров жидкого азота или углекислого газа (LN2 или CO2).

Используемые материалы Емкости и принадлежности. Выпускаются различные виды емкостей для хранения бактерий в жидком азоте. Для этих целей используются толстостенные боросиликатные ампулы с готовыми насечками, полипропиленовые пробирки 38^12,5 мм с завинчивающимися крышками и силиконовыми прокладками производства Greiner bio-one. Из-за увеличивающегося количества консервируемых проб возникла необходимость в уменьшении размеров емкостей для хранения.

Компанией Cryo Bio System's (CBS™) предложены соломины с хлопковой и гидрофобной пробкой, специально созданные для хранения биологических образцов в жидком азоте и парах азота, а также в низкотемпературных морозильниках. По безопасности они отвечают стандартам ISO 9002 и FDA. В этой же компании можно приобрести оборудование для автоматического заполнения, запайки, наклейки, маркировки и обрезки соломин (CBS™ PACE, CBS™ SYMS).

Криопротекторы. При хранении бактерий в жидком азоте применяют криопротекторы двух типов. К первому относятся глицерин и диметилсульфоксид (ДМСО), которые легко проходят через клеточную мембрану и обеспечивают как внутриклеточную, так и внеклеточную защиту от замораживания. Ко второму виду криопротекторов относятся такие вещества, как сахароза, лактоза, глюкоза, маннит, сорбит, декстран, поливинилпирролидон и полигликоль, которые обеспечивают защитное действие на наружной поверхности клеточной мембраны. Протекторы первого типа, т.е. глицерин и ДМСО, оказались более эффективными и пригодными для широкого круга бактерий. Выбор криопротектора зависит от вида бактерий. При замораживании новых штаммов следует предварительно проверить действие на них криопротектора. Глицерин и ДМСО обычно добавляют в ростовую среду в концентрации 5-10 %.

Глицерин стерилизуют автоклавированием 15 мин при давлении 104 Па.

Стерилизацию ДМСО осуществляют фильтрованием, используя пористые свечи «Села» или установку стерилизующей фильтрации. ДМСО собирают порциями по 10-15 мл в стерильные пробирки и хранят в замороженном состоянии при температуре минус 5 °С (ДМСО замерзает при температуре минус 18 °С).

3.2 Консервирование микроорганизмов Консервирование высушиванием из замороженного состояния сублимационное высушивание, замораживание-высушивание) - широко распространенный способ высушивания биоматериалов из замороженного состояния, при котором вода испаряется в условиях вакуума без оттаивания льда, что позволяет полностью сохранять первичную структуру объекта сушки. При его использовании многие физиологически разнородные виды бактерий и бактериофаги удается сохранять в жизнеспособном состоянии 30 лет и более. Для этого высушенные клетки должны быть защищены от действия кислорода, влаги и света. По многочисленные разработки.

Оборудование. В зависимости от предназначения высушиваемого биоматериала сублимационные установки делят на два больших класса:

- оборудование для сушки биомедицинских, фармацевтических препаратов;

- для сушки пищевых продуктов.

высушивании различают сублимационные установки коллекторного и камерного типа. В коллекторных установках ампулу, флакон, колбу с биопрепаратом (каждый элемент в отдельности) во время сушки связывают с устройством для улавливания водяных паров (конденсатором) индивидуальным трубопроводом. В камерных установках сосуды с осуществляется, как правило, весь цикл высушивания препарата. По периодические, поточно-циклические и установки с непрерывным действием.

Крупнейшие производители сублимационного оборудования - Niro Atlas-Stord Denmark A/S (Дания), Leybold (Германия), Stokes, Virtis (США), Edwards (Великобритания), Kyowa Vacuun Engineering (Япония), Shanghai Tofflon Science and Technology Co., Ltd (Китай). В России сублимационные установки производят НПО «Вакууммаш» (Казань), фирмы «Шабетник и Компания», «Биохиммаш».

Подготовка культур к сушке. Успех лиофилизации зависит от качества используемых клеток, от того, насколько они жизнеспособны и в экспоненциальной или ранней стационарной фазах роста.

Защитные среды. Для подготовки клеток к лиофилизации их суспендируют в среде, содержащей растворы защитных сред. В качестве криопротекторов применяют 20 % снятое молоко, либо 12 % раствор сахарозы. Готовят 20 % снятое молоко и стерилизуют его порциями (по мл) в течение 20 мин при температуре 116 °С. Следует избегать перегрева, так как при этом может произойти карамелизация молока. В стерильных условиях собирают клетки, выросшие на поверхности агара, смывая их % обезжиренным молоком. Клетки, выращенные в жидкой культуре, отделяют в стерильных условиях центрифугированием, затем суспендируют осадок в стерильном молоке, чтобы получилась суспензия, содержащая по меньшей мере 110 клеток/мл. Эту же процедуру применяют и в том случае, когда в качестве криопротектора используется сахароза. В качестве криопротекторов также используют декстран (10 %), лошадиную сыворотку, инозит и другие вещества. В каждую ампулу в зависимости от ее объема наливают от 0,1 до 1 мл суспензии клеток, затем закрывают ватной пробкой и подравнивают ее ножницами. После приготовления суспензии ее следует разлить по ампулам как можно быстрее. Интервал между разливом и процессом лиофилизации должен быть сведен до минимума, чтобы избежать осаждения клеток и других приблизительно 1,3 см ниже края ампулы и обжигают их верхнюю часть, чтобы убрать лишние волокна ваты.

Лиофилизация. Техника лиофилизации включает следующие процессы и стадии:

эвтектических значений (при которых растворы защитных сред полностью замерзают);

- первичное высушивание, когда вся вымороженная в лед свободная влага сублимируются под воздействием движущих сил - вакуума и подводимой тепловой энергии;

- вторичное высушивание (досушивание), когда удаляется связанная влага под воздействием тех же движущих сил, но с более интенсивным подводом тепла.

Считается, что из всех групп микроорганизмов переносят лиофилизацию лучше бактериальные формы. По устойчивости к сушке подразделяют бактерии на три группы:

- очень стойкие, такие как представители родов Streptococcus, Staphylococcus, Brevibacterium, Corynebacterium, Lactobacillus, Salmonella, Bacillus и т.д. Их жизнеспособность после сушки обычно составляет 70средне резистентные, например представители родов Brucella, Salmonella, Seratia, Pseudomonas. Их выживание достигает 70 %;

- чувствительные к высушиванию - некоторые представители родов Spirochete, Methylobacter, Methylococcus.

Хранение. Лиофилизованные культуры хранят при температуре ниже 5 °С. С понижением температуры растет и сохраняемость клеток. При комнатной температуре лиофилизованные культуры хранить не рекомендуется.

Восстановление (реактивация) культур. Лиофилизованную культуру переводят в суспензию сразу после вскрытия ампул, добавляя в каждую от 0,3-1,0 мл соответствующей стерильной жидкой среды. Суспензию в ампулах хорошо перемешивают и переносят в пробирки с 5 мл жидкой среды. После тщательного перемешивания отбирают 0,2 мл суспензии и наносят на твердую или полужидкую среду того же состава. Необходимо проверять чистоту культуры до лиофилизации и после нее. Для этого суспензию клеток стерильно разводят и делают посев штрихом на твердые среды. Пробирки и чашки со средой инкубируют при оптимальной для бактерий температуре и, как только начинается их рост, делают пересев на свежую среду, чтобы убедиться в чистоте культуры. Рост бактерий, подвергавшихся лиофилизации, часто начинается после длительной лагфазы. Поэтому нельзя делать заключение о гибели культуры, если инкубация была недостаточно длительной.

Проверка жизнеспособности бактерий. Чтобы определить, насколько эффективен процесс высушивания бактерий из замороженного состояния, проверяют их жизнеспособность как до, так и после лиофилизации.

Консервирование высушиванием из жидкого состояния В отличие от сушки на носителях высушивание из жидкого состояния (L-высушивание) находящихся в жидкой фазе (Liquid). Это один из сложных методов, используемых для долгосрочного сохранения микроорганизмов.

Некоторые микроорганизмы, чувствительные к замораживанию или лиофилизации, могут успешно быть сохранены L-высушиванием.

Подготовка клеток для L-высушивания. Для высушивания используют клеточную суспензию с плотностью не менее 110 клеток/мл в подходящей защитной среде. В случае жидких культур клетки собирают стерильным суспендированием осадка при помощи стеклянных шариков в защитной среде.

Подготовка стабилизатора-носителя. В ампулы из нейтрального стекла (45^10 мм) наливают по 0,1 мл 20 % (вес/объем) обезжиренного молока, содержащего 10 % (вес/объем) нейтрального активизированного древесного угля и один из эффективных защитных агентов, таких как 5 % инозит, 5 % глутамат, 5 % раффиноза или 10 % мед. Используемый активизированный уголь должен иметь статус для применения в активизированного древесного угля сопоставимого качества. Ампулы неплотно закрывают негигроскопической ватой и стерилизуют при температуре 115 °С около 13 мин.

(содержащие тонкий диск стабилизатора-носителя) выдерживают несколько минут при температуре 20-25 °С. В каждую ампулу стерильно вносят около 0,025 мл (одна капля с пипетки Пастера) клеточной суспензии, осторожно капая на тонкий диск, чтобы не коснуться стенок ампулы.

Высушивание. Заполненные ампулы быстро ставят на металлический поддон, который переносят в металлическую камеру на водяной бане при температуре 20 °С. После 20-30 мин эквилибрации образцов включают вакуумный насос, который отсасывает влагу из сушильной камеры. При этом влага конденсируется на холодной ловушке (приблизительно минус 35 °С). В технологии сушки из жидкого состояния различают две стадии первичное и вторичное высушивание.

Достоинства и недостатки метода. По мнению некоторых авторов, этот способ высушивания имеет несколько преимуществ перед лиофильным высушиванием и успешно использовался для консервации большой коллекции лабильных микроорганизмов в различных музеях.

Защитные средства, используемые при консервации Чтобы снизить воздействие множества повреждающих факторов в процессе замораживания биологических структур экспериментальным путем, криопротекторы. Этот раздел криобиологии возник на основе изучения естественных моделей защиты клеток, пребывающих в состоянии гипо- и анабиоза. Защитные среды должны отвечать следующим критериям:

-сохранять жизнеспособность, морфологические, биохимические, таксономические и генетические свойства микроорганизмов в процессе консервации и хранения;

- быть нетоксичными;

- иметь низкую температуру эвтектики;

- предотвращать гиперконцентрирование солей в суспензии;

- стабилизировать водородные связи в кристаллической решетке и иметь хорошую растворимость в воде;

- легко соединяясь с водой, выполнять колигативные функции;

предотвращать формирование больших кристаллов льда;

-хорошо проникать в клетки (только внутриклеточный механизм криопротекции).

разделены на две группы:

1. Внутриклеточные криопротекторы - среды, проникающие в клетки.

Однако в силу огромного разнообразия встречающихся в природе микроорганизмов одним криопротектором в практической работе не обходятся. Поэтому при криоконсервации новых бактериальных штаммов следует предварительно проверить действие на них различных типов микроорганизмов, так и для условий их последующего хранения.

Приводим краткое описание наиболее часто используемых защитных веществ.

Внутриклеточные протектанты. Основными защитными средами внутриклеточного действия являются глицерин и диметилсульфоксид.

микроорганизмы (например, S. rouxii, E. coli, Ps. Putida) в природной среде или после введения им дополнительного количества глицерина к питательным средам увеличивают свои синтетические процессы перед переходом в анабиоз. Увеличение концентрации глицерина играет важную роль в стабильности микроорганизмов к обезвоживанию, увеличивает устойчивость клеток при снижении активной воды (aw) и обеспечивает выживаемость в процессе замораживания. Глицерин успешно применен к замораживанию различных микроорганизмов (Serratia marcescens, Erwinia aroideae, T4 фаг, Claviceps sp., Acremo-rium chrysogenum, S. cerevisiae, C.

utilis и многих других) с высоким процентом выживаемости и сохранением свойств.

Криопротек-тивные свойства этого вещества зависят от концентрации.

Большинство мировых коллекций культур микроорганизмов рекомендует 10 % концентрацию. Все же оптимальные концентрации ДМСО, как и глицерина, различаются в зависимости от специфики клеточного материала и могут варьировать в диапазоне от 5 до 20 %.

Внеклеточные защитные средства. Защитные среды внеклеточного действия пригодны для сохранения биологических объектов как при криоконсервации, так и при сублимационном высушивании.

Поливинилпирролидон (Polyvinylpyrrolidone, PVP, (-C6H9NO-)n).

Есть несколько гипотез о механизмах криопротекции PVP. Согласно одной из них защитный эффект связан с его способностью проникать в клетки по механизму пиноцитоза. Другая гипотеза соотносит механизм защиты со способностью связывать молекулы полимера с клеточной мембраной и формированием внешней оболочки вокруг клетки.

Гидроксиэтилкрахмал (Hydroxyethyl starch, HES). Это нетоксичное, биологически инертное защитное средство. Эти свойства делают HES полезным в качестве плазмозаменяющего и защитного средства для некоторых клеток крови.

Декстран. Это вещество хорошо известно в медицине в качестве криопротектант для сохранения микроорганизмов и вирусов. Декстран химически инертен и поэтому может быть использован в смеси с другими криопротекторами в составе многокомпонентных защитных сред. Для криоконсервации и лио-филизации микроорганизмов применяются, например, различные сахариды (сахароза, глюкоза, трегалоза), коллоиды (желатин, агар, пептон, молоко и сыворотки), соли (глутамат натрия) и т.д.

Так, использование композитных защитных сред, как показывают экспериментальные исследования и практический опыт, обеспечивает более высокую жизнеспособность микробных клеток в процессе консервации и последующего хранения по сравнению с простыми защитными средами. В практической работе более 60 лет используется сахарозожелатиновая защитная среда (сахароза 10 % + желатин 1 %), которая подходит как для бактерий, так и для актиномицетов. Другие защитные среды, включающие, например, пептон (0,1-10 %), сахарозу ( %), лактозу (10 %), трегалозу (10 %), обезжиренное молоко (10-20 %), натрия глутамат (5 %), гидролизат казеина и многие другие вещества, успешно применяются для консервации родов Bacillus, Pantoea, Seratia, Erwinia, Lactobacillus, Acetobac-ter, Streptococcus и др.

микроорганизмов К основным факторам, влияющим на результаты консервации микробных культур перед сохранением, относят метод культивирования (поверхностный или глубинный), температурный режим, состав и pH питательной среды, аэрацию. Также большое значение имеют возраст, физиологическое состояние и концентрация клеток культуры.

Питательная среда. Состав питательной среды отражается на резистентности микробных клеток к воздействию экстремальных факторов. Нет единого мнения относительно того, какую среду использовать для размножения объекта консервации - богатую или бедную. Культивирование на богатых питательных средах рекомендуется в некоторых предписаниях по консервации, так как в данном случае процент жизнеспособных клеток выше. Согласно другим авторам, бедные и со временем истощающиеся питательные компоненты среды являются сигналом для реорганизации метаболизма клеток, что ведет к сохранению их энергии. Клетки, вероятно, готовят себя к гипобиозу, от которого далее переходят в анабиотическое состояние более легко. Правильный выбор питательной среды ведут по белку, углеводу и накоплению липида, что может увеличивать резистентность клеток к лиофилизации.

Кислотность (pH). На устойчивость клеток при их консервации оказывает влияние величина кислотности среды культивирования. Хорошо известно, что pH среды культивирования влияет на размножение клеток:

есть оптимальный диапазон pH для каждой культуры и рост клеток вне оптимальных значений рН замедлен или вообще отсутствует. Наблюдается корреляция между криорезистентностью пивных и пекарских дрожжей Б.

cerevisiae и кислотностью среды культивирования. При pH 4,2 эти дрожжи растут быстрее, но их выживаемость после лиофилизации минимальная.

Пути совершенствования методов консервации Совершенствование методов хранения идет по путям оптимизации существующих методов, применения комбинированных методов, а также поиска новых подходов к переводу клеток в состояние покоя. Эти разработки открывают новые перспективы консервации биоматериалов как для научных исследований, так и для практического использования.

Оптимизация существующих методов консервации. Даже при консервации весьма хорошо исследованных и достаточно устойчивых к экстремальным факторам окружающей среды микроорганизмов могут периодически возникать проблемы полного сохранения их свойств.

Например, при изучении свойств тест-штамма возбудителя сибирской язвы после хранения в растворе глицерина в условиях холодильника наблюдалась гетерогенность популяции по морфологии колоний, снижение терморезистентности спор, возрастание величины LD50 для белых мышей. Пассаж через организм животного, так называемая «анимализация», позволяет восстановить исходные свойства штамма.

Одна из причин гибели микроорганизмов при криоконсервации и замораживании/высушивании связана с формированием ледяных кристаллов, которые разрывают клеточные стенки Применение комбинированных методов. С обнаружением новых видов микроорганизмов или совершенствованием техники выделения ранее не культивируемых в лабораториях возникла необходимость и в совершенствовании техники консервации этих микроорганизмов.

Актуальной остается проблема по разработке комплексного подхода к консервации микроорганизмов, учитывающего как известные сведения о процессах, выработанных естественным отбором и способствующих сохранению микроорганизмов в природе, так и эмпирические достижения лабораторного хранения. В близком будущем речь может пойти и об искусственном создании культур микроорганизмов, повышенно приспособленных к сохранению жизнедеятельности в неблагоприятных для вегетативного размножения условиях среды. Успешность лабораторных программ консервации, несомненно, может быть повышена, если будут использоваться популяции клеток, реализующие свойственные им процессы так называемой «самоконсервации» либо индуцированные к этому соответствующими экспериментальными воздействиями.

Вопросы для самопроверки 1. Методы непродолжительного хранения микроорганизмов 2. Методы длительного хранения микроорганизмов 3. Лиофилизация 4. Понятие о криопротекторах Микробиологический синтез различных веществ играет ключевую роль в биотехнологическом производстве. Начало современной промышленной микробиологии было положено в 40-х годах, когда наладили производство пенпциллинов методами ферментации. В настоящее время микроорганизмы продуцируют десятки видов соединений - аминокислот, антибиотиков, белков, витаминов, липидов, нуклеиновых кислот, полисахаридов, пигментов, сахаров, ферментов и т. д.

К многообразному миру микроорганизмов относятся прокариоты (одноклеточные организмы, не содержащие оформленных ядер) бактерии, актиномицеты, риккетсии и низшие эукариоты (одноклеточные и многоклеточные организмы, имеющие сформированные ядра, в которых хромосомы окружены специальной пористой мембраной (липопротеидной природы), - дрожжи, нитчатые грибы, простейшие и водоросли. Из более биотехнологических процессах используют всего несколько сотен.

Микробиологическая промышленность предъявляет к продуцентам жесткие требования, которые важны для технологии производства:

высокая скорость роста, использование для жизнедеятельности дешевых субстратов и устойчивость к заражению посторонней микрофлорой.

4.1 Биотехнологические объекты и их функции организации:

а) субклеточные структуры (вирусы, плазмиды, ДНК митохондрий и хлоропластов, ядерная ДНК);

б) бактерии и цианобактерии;

в) грибы;

г) водоросли;

д) простейшие;

е) культуры клеток растений и животных;

ж) растения – низшие (анабена-азолла) и высшие – рясковые.

Бактерии и цианобактерии. Микроорганизмов, синтезирующих продукты или осуществляющих реакции, полезные для человека, несколько сотен видов. Биотехнологические функции бактерий разнообразны. Бактерии используются при производстве:- пищевых продуктов, например, уксуса (Gluconobacter suboxidans), молочнокислых напитков (Lactobacillus, Leuconostoc) и др.;- микробных инсектицидов (Bacillus thuringiensis);- белка (Methylomonas);- витаминов (Clostridium рибофлавин);- растворителей и органических кислот;- биогаза и фотоводорода.

Полезные бактерии относятся к эубактериям. Уксуснокислые бактерии, представленные родами Gluconobacter и Acetobacter, - это грамотрицательные бактерии, превращающие этанол в уксусную кислоту, а уксусную кислоту в углекислый газ и воду. Род Bacillus относится к грамположительным бактериям, которые способны образовывать эндоспоры и имеют перитрихиальное жгутикование. B.subtilis - строгий аэроб, а B.thuringiensis может жить и в анаэробных условиях. Анаэробные, образующие споры бактерии представлены родом Clostridium.

C.acetobutylicum сбраживает сахара в ацетон, этанол, изопропанол и nбутанол (ацетобутаноловое брожение), другие виды могут также сбраживать крахмал, пектин и различные азотсодержащие соединения.

Lactobacillus, Leuconostoc и Streptococcus, которые не образуют спор, Гетероферментативные молочнокислые бактерии рода Leuconostoc превращают углеводы в молочную кислоту, этанол и углекислый газ.

Гомоферментативные молочнокислые бактерии рода Streptococcus продуцируют только молочную кислоту, а брожение, осуществляемое представителями рода Lactobacillus, позволяет получить наряду с молочной кислотой ряд разнообразных продуктов.

К бактериям рода Corynebacterium, неподвижные грамположительные (C.diphtheriae, C.tuberculosis) и непатогенные почвенные виды, имеющие промышленное значение. С.glutamicum служит источником лизина и улучшающих вкус нуклеотидов. Коринебактерии хотя и считаются горнорудных отходов.

Широко используется такое свойство некоторых бактерий, как диазотрофность, то есть способность к фиксации атмосферного азота.

Выделяют 2 большие группы диазотрофов:

- симбионты: без корневых клубеньков (азотобактер - лишайники, азоспириллум - лишайники, анабена – лишайники, азолла), с корневым клубеньками (бобовые – ризобии, ольха, лох, облепиха – актиномицеты);

метилобактер), автотрофы (хлоробиум, родоспириллум и амебобактер).

Микробные клетки используют для трансформации веществ.

манипуляциях при создании геномных клонотек, введении генов в растительные клетки (агробактерии).

Все цианобактерии обладают способностью к азотфиксации, что (Anabaena) - нитчатая сине-зеленая водоросль. Нити из более или менее округлых клеток, содержат гетероцисты и иногда крупные споры, по всей длине нить одинаковой толщины. В цитоплазме клеток откладывается близкий к гликогену запасной продукт - анабенин. Такие представители цианобактерий, как носток, спирулина, триходесмиум съедобны и непосредственно употребляются в пищу. Носток образует на бесплодных землях корочки, которые разбухают при увлажнении. В Японии местное население использует в пищу пласты ностока, образующиеся на склонах вулкана и называет их ячменным хлебом Тенгу (Тенгу - добрый горный дух).

Преимущества спирулины по сравнению с другими съедобными водорослями не только в простоте культивирования, но и в несложности сбора биомассы, высушивания ее, например, под солнцем. В ряде стран выращивают спирулину вида Spirulina platensis. В клетках спирулины, помимо ценного белка, углеводов, липидов, витаминов, в значительных количествах запасается, например, такое ценное вещество, как поли-bоксибутират. Российская фармацевтическая промышленность выпускает препарат «Сплат» на основе цианобактерии Spirulina platensis. Он содержит комплекс витаминов и микроэлементов и применяется как общеукрепляющее и иммуностимулирующе средство.

Грибы. Биотехнологические функции грибов разнообразны. Их используют для получения таких продуктов, как:

антибиотики (пенициллы, цефалоспорины);

гиббереллины и цитокинины (фузариум и ботритис);

каротиноиды (н-р, астаксантин, придающий мякоти лососевых рыб красно-оранжевый оттенок вырабатывают Rhaffia rhodozima, которых добавляют в корм на рыбозаводах);

белок (Candida, Saccharomyces lipolitica);

сыры типа рокфор и камамбер (пенициллы);

соевый соус (Aspergillus oryzae).

К грибам относятся дрожжи и плесени.

Из 500 известных видов дрожжей первым люди научились использовать Saccharomyces cerevisiae, этот вид наиболее интенсивно культивируется. К дрожжам, сбраживающим лактозу, относится Kluyveromyces fragilis, который используют для получения спирта из сыворотки. Saccharomycopsis lipolytica деградирует углеводороды и употребляется для получения белковой массы. Все три вида принадлежат к классу аскомицетов. Другие полезные виды относятся к классу дейтеромицетов (несовершенных грибов), так как они размножаются не половым путем, а почкованием. Candida utilis растет в сульфитных сточных водах (отходы бумажной промышленности). Trichosporon cutaneum, окисляющий многочисленные органические соединения, включая некоторые токсичные (например, фенол), играет важную роль в системах аэробной переработки стоков. Phaffia rhodozyma синтезирует астаксантин - каротиноид, который придает мякоти форели и лосося, выращиваемых на фермах, характерный оранжевый или розоватый цвет.

Промышленные дрожжи обычно не размножаются половым путем, не образуют спор и полиплоидны. Последним объясняется их сила и способность адаптироваться к изменениям среды культивирования (в норме ядро клетки либо гаплоидны, либо диплоидны).

Плесени вызывают многочисленные превращения в твердых средах, которые происходят перед брожением. Пищевые продукты на основе сброженных плесневыми грибами Rhizopus oligosporus соевых бобов или пшеницы содержат в 5 - 7 раз больше таких витаминов, как рибофлавин, никотиновая кислота) и отличаются повышенным в несколько раз содержанием белка. Плесени также продуцируют ферменты, используемые в промышленности (амилазы, пектиназы и т.д.), органические кислоты и антибиотики. Их применяют и в производстве сыров.

Искусственное выращивание грибов способно внести и иной, не менее важный вклад в дело обеспечения продовольствием возрастающего населения земного шара. Люди употребляют грибы в пищу с глубокой сельскохозяйственной культурой, как зерновые злаки, овощи, фрукты, давно уже стало актуальной задачей. Наиболее легко поддаются искусственному выращиванию древоразрушающие грибы. Это связано с особенностями их биологии, которые стали нам известны и понятны только сейчас. Их способность легко расти и плодоносить использовали с древнейших времен.

Искусственное разведение древоразрушающих грибов получило довольно широкое распространение. Исследования в этом направлении продолжаются.

Простейшие. Простейшие относятся к числу нетрадиционных объектов биотехнологии. До недавнего времени они использовались лишь как компонент активного ила при при биологической очистке сточных вод.

В настоящее время они привлекли внимание исследователей как продуценты биологически активных веществ.

В этом качестве рациональнее использовать свободноживущих простейших, обладающих разнообразными биосинтетическими возможностями и потому широко распространенными в природе.

Особую экологическую нишу занимают простейшие, обитающие в рубце жвачных животных. Они обладают ферментом целлюлазой, способствующей разложению клетчатки в желудке жвачных. Простейшие рубца могут быть источником этого ценного фермента.

синтезируются, а многоклеточные животные или растения представляют собой более ограниченную сырьевую базу, чем простейшие, культуры которых можно получать методами биотехнологии независимо от времени года или климатических условий.

В настоящее время в мире придается большое значение производству глюканов не только для медицинских целей, но и для пищевой и текстильной промышленности. До сих пор глюканы получали из культур бактерий или морских водорослей.

Биомасса простейших содержит до 50% белка. Его высокая биологическая ценность заключается в том, что он содержит все незаменимые аминокислоты, причем содержание свободных аминокислот на порядок выше, чем в биомассе микроводорослей, бактерий и в мясе. Это свидетельствует о широких возможностях применения свободноживущих простейших в качестве источника кормового белка.

Водоросли. Водоросли используются, в основном, для получения белка. Весьма перспективны в этом отношении и культуры одноклеточных водорослей, в частности высокопродуктивных штаммов рода Chlorella и Scenedesmus. Их биомасса после соответствующей обработки используется в качестве добавки в рационы скота, а также в пищевых целях.

Хлорелла содержит около 50 % белка, а люцерна — лишь 18 %. В целом в пересчете на 1 га хлорелла образует 20—30 т чистого белка, а люцерна — 2—3,5 т. Кроме того, хлорелла содержит 40 % углеводов, 7—10 % жиров, витамины А (в 20 раз больше), B2, К, РР и многие микроэлементы.

Варьируя состав питательной среды, можно процессы биосинтеза в клетках хлореллы сдвинуть в сторону накопления либо белков, либо углеводов, а также активировать образование тех или иных витаминов.

В пищу употребляют не менее 100 видов макрофитных водорослей как в странах Европы и Америки, так и особенно на Востоке. Из них готовят много разнообразных блюд, в том числе диетических, салатов, приправ. Их подают в виде засахаренных кусочков, своеобразных конфет, из них варят варенье, делают желе, добавки к тесту и многое другое.

Гидролизаты белка зеленой водоросли Scenedesmus используются в медицине и косметической промышленности.

Наряду с кормами водоросли давно применяют в сельском хозяйстве в качестве удобрений. Биомасса обогащает почву фосфором, калием, йодом и значительным количеством микроэлементов, пополняет также ее бактериальную, в том числе азотфиксирующую, микрофлору. При этом в почве водоросли разлагаются быстрее, чем навозные удобрения, и не засоряют ее семенами сорняков, личинками вредных насекомых, Одним из самых ценных продуктов, получаемых из красных водорослей, является агар — полисахарид, присутствующий в их оболочках и состоящий из агарозы и агаропектина. Количество его доходит до 30— % от веса водорослей (водоросли лауренция и грацилярия, гелидиум).

Водоросли — единственный источник получения агара, агароидов, каррагинина, альгинатов. В России основным источником агара служит красная водоросль анфельция. Бурые водоросли являются единственным источником получения одних из самых ценных веществ водорослей — солей альгиновой кислоты, альгинатов. Альгинаты исключительно широко применяются в народном хозяйстве. Это изготовление высококачественных смазок для трущихся деталей машин, медицинские и парфюмерные мази и кремы, синтетические волокна и пластики, стойкие к любой погоде лакокрасочные покрытия, не выцветающие со временем ткани, производство шелка, клеящих веществ исключительно сильного действия, строительных материалов, пищевые продукты отличного качества — фруктовые соки, консервы, мороженое, стабилизаторы растворов, брикетирование топлива, литейное производство и многое другое. Альгинат натрия — наиболее используемое соединение — способен поглощать до 300 весовых единиц воды, образуя при этом вязкие растворы.

Бурые водоросли богаты также весьма полезным соединением — шестиатомным спиртом маннитом, который с успехом применяют в пищевой промышленности, фармацевтике, при производстве бумаги, красок, взрывчатки и др. Бурые водоросли в ближайшее время планируется использовать для получения биогаза. Каллусные культуры макрофитных водорослей могут быть использованы далее в различных направлениях.

Каллусные культуры пищевых макрофитных водорослей, например ламинариевых, могут в перспективе использоваться для получения белка, непосредственно идущего в пищу и в пищевые добавки, а также в корма сельскохозяйственным животным. Суспензионные культуры макрофитных водорослей открывают в перспективе возможности использования их в качестве трофического звена в марикультуре. Они могли бы также выступать в качестве партнера в искусственно создаваемых растительных ассоциациях, участники которых обладают полезными свойствами.

Выделяемые клетками культуры экзометаболиты, характерные для исходного вида водоросли, будут составлять основу трофического обмена при удачном подборе партнеров в растительной ассоциации или комплексе марикультуры. Необходимо отметить, что при отсутствии токсического и антагонистического действия выделяемых соединений в естественных условиях существуют разнообразные и многочисленные природные ассоциации, например повсеместно встречающиеся комплексы водорослей и бактерий.

соответствовать определенным требованиям: способность к росту на дешевых питательных средах, высокая скорость роста и образования целевого продукта, минимальное образование побочных продуктов, стабильность продуцента в отношении производственных свойств, безвредность продуцента и целевого продукта для человека и окружающей среды. В связи с этим все микроорганизмы, используемые в микробиологической промышленности проходят длительные испытания на безвредность для людей, животных и окружающей среды. Важным свойством продуцента является устойчивость к инфекции, что важно для поддержания стерильности и фагоустойчивость.

4.3 Стадии биотехнологического производства.

Большое разнообразие биотехнологических процессов, нашедших промышленное применение, приводит к необходимости рассмотреть общие, наиболее важные проблемы, возникающие при создании любого биотехнологического производства. Процессы промышленной биотехнологии разделяют на 2 большие группы: производство биомассы и получение продуктов метаболизма. Однако такая классификация не отражает наиболее существенных с технологической точки зрения аспектов промышленных биотехнологических процессов. В этом плане необходимо рассматривать стадии биотехнологического производства, их сходство и различие в зависимости от конечной цели биотехнологического процесса.

Существует 5 стадий биотехнологического производства.

Две начальные стадии включают подготовку сырья и биологически действующего начала. В процессах инженерной энзимологии они обычно состоят из приготовления раствора субстрата с заданными свойствами (рН, температура, концентрация) и подготовки партии ферментного препарата данного типа, ферментного или иммобилизованного. При осуществлении микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе.

Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - главная задача любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами.

Третья стадия - стадия ферментации - центральная среди этапов промышленного производства, на которой происходит образование целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит. Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную среду инокулята до завершения процессов роста, биосинтеза или биотрансформации.

ферментерами или биореакторами. Основными элементами ферментера являются двойные стенки, промежуток между которыми заполняется охлаждающей или нагревающей жидкостью, входные отверстия для газовых и жидких потоков, система контроля за составом питательной среды и условиями внутри реактора.

Поскольку в промышленной биотехнологии выделяют 2 типа процессов - накопление биомассы и накопление ценных веществ, возникающих в ходе роста и последующего развития культуры, то меняется и характер построения производства во времени. Биомасса одноклеточных выращивается непрерывным способом в аппаратах хемостатного типа, а все процессы второй группы осуществляются периодически, когда в одном и том же аппарате в производственном цикле протекают все необходимые фазы развития клеток и биосинтеза. Процессы двух рассматриваемых типов отличаются по требованиям к степени асептики, что связано с их объёмами - белок одноклеточных выпускается миллионами тонн сухого вещества, а выпуск продуктов второго типа составляет, как максимум, тысячи или десятки тысяч тонн.

На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ концентрациях, весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции.

Заключительная стадия биотехнологического производства приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии.

Кроме того, препараты для медицинских целей требуют специальных стерильными. Далее приводится характеристики каждой из стадий промышленного микробиологического синтеза.

Все товарные формы биопрепаратов с точки зрения технологии их получения можно разделить на три основные группы.

- Биопрепараты, имеющие в товарном продукте в качестве основного компонента жизнеспособные микроорганизмы. К этой группе относятся средства защиты растений, бактериальные удобрения, закваски для силосования кормов, биодеграданты, другие активные средства биотрансформации.

- Биопрепараты, в состав которых входит инактивированная биомасса клеток и продукты ее переработки. Это кормовые дрожжи, грибной мицелий и т.д.

- Биопрепараты на основе очищенных продуктов метаболизма микроорганизмов. К ним относятся витамины, аминокислоты, ферменты, антибиотики, биолипиды, полисахариды, продукты комплексной переработки микробных масс и метаболитов.

В зависимости от принятых на предыдущей стадии решения товарные формы представляют собой либо сложную смесь, содержащую некоторое количество основного вещества, либо высокоочищенный препарат, отвечающий ряду специальных требований.

Продукт может выпускаться в жидком или сухом виде. Стадия помещении их в тару (мешки, барабаны, флаконы и т.п.), размеры и тип которой определяются потребностями заказчика и свойствами продукта (его слеживаемостью, гигроскопичностью, стойкостью к загниванию и т.д.). Другие требования предъявляются к медицинским препаратам и биохимическим реактивам.

Вопросы для самопроверки 1.Биотенологические обьекты 2. Биотенологические функции бактерий 3. Биотенологические функции грибов 4. Биотенологические функции плесни 5 Биотенологические функции простейших 6 Биотенологические функции водоросли 7.Стадии биотехнологических производств Глава 5. Продукты жизнедеятельности необычайно широк и разнообразен. Продуктами биотехнологических производств являются природные макромолекулы - белки, ферменты, полисахариды, полиэфиры, выделенные из клеток микроорганизмов, тканей и органов растений и животных.

По отношению к процессу роста низкомолекулярные продукты метаболиты. Первичные метаболиты необходимы для роста клеток. К ним относятся структурные единицы биополимеров аминокислоты, кислоты и другие соединения. Вторичные метаболиты (антибиотики, пигменты, токсины) - низкомолекулярные соединения, не требующиеся для выживания клеток и образующиеся по завершении фазы их роста.

5.1 Аминокислоты.

Аминокислоты – органические вещества, сочетающие свойства кислот и оснований (являются основным элементом построения всех белков животных и растительных организмов). Аминокислоты класс органических соединений, содержащих карбоксильные (—СООН) и аминогруппы (—NH2); обладают свойствами и кислот, и оснований.

Участвуют в обмене азотистых веществ всех организмов (исходное соединение при биосинтезе гормонов, витаминов, медиаторов, пигментов, пуриновых и пиримидиновых оснований, алкалоидов и др.). Природных аминокислот свыше 150. Около 20 важнейших аминокислот служат мономерными звеньями, из которых построены все белки (порядок включения аминокислот в них определяется генетическим кодом).

Большинство микроорганизмов и растения синтезируют необходимые им аминокислоты; животные и человек не способны к образованию так называемых незаменимых аминокислот, получаемых с пищей. Освоен аминокислот, используемых для обогащения пищи, кормов, как исходные продукты для производства полиамидов, красителей и лекарственных препаратов.

В современной мировой практике с помощью микробиологического синтеза получают около 60% производимых аминокислот. В результате химического синтеза всегда образуются рацематы - равновесные смеси Lи D-форм аминокислот, требующие в дальнейшем дорогостоящей очистки.

Присутствие D -формы в продукте представляет собой балласт, поскольку не усваиваются организмом человека и животного, а у некоторых аминокислот обладает токсическими свойствами. Очевидное преимущество микробиологического синтеза получения аминокислот состоит в том, что биологически активной L- форме.

Из 20 аминокислот, составляющих белки, восемь не могут синтезироваться в организме человека и животных; эти незаменимые аминокислоты (изолицин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, валин, фенилаланин) должны содержаться в пище или кормах. Особенно важны лизин и метионин. Метионин производится синтетически, тогда как 80% лизина - биосинтетически. Микроорганизмы обычно синтезируют каждую из аминокислот в определенных количествах, обеспечивая тем самым синтез специфических белков. Это объясняется тем, что контроль за скоростью биосинтеза каждой аминокислоты осуществляется на уровне генов. Такой контроль исключает перепроизводство аминокислот. При жизнедеятельности осуществляют сверх синтез аминокислот, т.е.

производят их в количествах, намного превышающих потребности самих клеток. Пути биосинтеза отдельных аминокислот были изучены с применением метода изотопных меток. Метод изотопной метки основан на том, что к растущей культуре микроорганизма добавляют меченную аминокислоту, которая включается в синтез белка. Затем, выделяя белок на разных этапах, обнаруживают метку.

Основной путь селекции продуцентов аминокислот - получение ауксотрофных мутантов, которых отбирают на селективных средах. После воздействия на суспензии бактериальных культур физическими (УФЛ или ренгеновские лучи) и химическими (этиленамин, диэтилсулфат) детерминирующий фермент, без которого не может осуществляться биосинтез определенной аминокислоты (нарушение процесса регуляции синтеза фермента).

Лизин - конечный продукт разветвленного метаболического пути Brevibacterium flavum, который также ведет к синтезу метионина и треонина. Лизин и треонин регулируют этот путь, взаимодействуя с его первым ферментом - аспартаткиназой; накопление обеих аминокислот ингибирует активность этого фермента. Посредством мутации в гене, кодирующем гомосериндегидрогеназу, нарушают активность этого фермента и блокируют синтез треонина и метионина; в результате удаляется один из ингибиторов фермента аспартаткиназы (треонин). Затем такой ауксотрофный мутант выращивают в среде, содержащей достаточно треонина и метионина для поддержания роста, однако имеющегося треонина мало для прекращения биосинтеза лизина, который продолжается с нормальной скоростью, что приводит к его накоплению. У ауксотрофных мутантов избыток одной аминокислоты при дефиците другой не приводит к подавлению активности фермента.

Глютаминовая кислота - первая аминокислота, полученная на основе промышленного микробиологического - синтеза, синтезируется Corynebacterium glutamicum. В условиях, обеспечивающих нормальный рост культур, сверхсинтеза этой аминокислоты не происходит.

«Перепроизводство» этого продукта штаммами коринебактерии наблюдается в среде, с меньшей, чем оптимальная, концентрацией биотина (1-5мкг/л), в результате которого нарушается синтез мембранных фосфолипидов и глутамат натрия проходит через клеточную мембрану и накапливается в среде.