МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО

ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И. ПИРОГОВА» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

(ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России)

УТВЕРЖДАЮ

Декан медико-биологического факультета, профессор _ Ю.В.Балякин «» 2013г.

ПРОГРАММА ЭЛЕКТИВНОГО КУРСА

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННОЙ

ТЕРАПИИ ЛЕЙКОЗОВ – ПУТЬ К ИЗЛЕЧЕНИЮ

Уpoвень oснoвнoй oбpaзoвaтельнoй прoгpaммыподготовка специалистов (бaкaлaвpиaт, магистратура, пoдгoтoвкa специaлистoв) Haпpaвление(я) пoдгoтoвки (специaльнoсть)_ “Лечебное дело”, “Педиатрия” Фopмa oбyчeния_очная (oчнaя, oчнo-зaoчная (вечеpняя), зaoчнaя) Cpoк oсвoeния ООП_6 лет (нopмaтивный сpoк oбучения) Фaкvльтет_Медико-биологический Кaфедpa_ Молекулярной и клеточной генетики_ Декaн фaкyльтетa Балякин Ю.В.

пoдпись (Ф.И.О.) Зaвeдyющий кaфедpoй _ Куцев С.И..

пoдпись (Ф.И.О.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. Цели и задачи элективного курса……………………………………………..……………….. 2. Требования к уровню освоения содержания элективного курса………………………….. 3. Объем курса и виды учебной работы……………………………………………………….…. 4. Содержание курса…………………………………………………………………………….….. 4.1.Содержание разделов курса…………………………………………………………………….. 4.2.Разделы учебного курса, виды учебной деятельности и формы контроля………………..…. 5. Методические рекомендации по организации элективного курса……………………… Примерное содержание лекции…………………………………………………….……………..

1.ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ЭЛЕКТИВНОГО КУРСА

ЦЕЛЬЮ ЭЛЕКТИВНОГО КУРСА является подготовка выпускника по специальности “Педиатрия” и “Лечебное дело”, владеющего базисными знаниями и умениями, необходимыми для понимания роли цитогенетических и молекулярно-генетических исследований в изучении патогенеза лейкозов и солидных опухолей, поиске мишеней для таргетного воздействия на опухолевые клетки, разработке тарегтной терапии, изучение значения анализа опухолевого кариотипа, мутационного статуса и профиля экспрессии генов опухолевых клеток в диагностике, выборе тактики терапии и оценке ее эффективности в практической деятельности врача.

ЗАДАЧИ КУРСА

Изучение роли цитогенетических и молекулярно-генетических исследований в выявлении мишеней для целенаправленной терапии опухолей.

Изучение принципов разработки препаратов таргетного действия на основе исследования молекулярных свойств молекул-мишеней.

Изучение возможностей цитогенетического и молекулярно-генетических исследований для диагностики лейкозов и других онкологических заболеваний.

Изучение молекулярно-генетических механизмов резистентности к таргетной терапии лейкозов и онкологических заболеваний и пути ее Изучение цитогенетических и молекулярно-генетических подходов к мониторингу эффективности таргетной терапии лейкозов (минимальная

2. ТРЕБОВАНИЯ К РЕЗУЛЬТАТАМ ОСВОЕНИЯ ЭЛЕКТИВНОГО КУРСА

В результате изучения элективного курса обучающиеся должны:

Знать: Основы цитогенетических и молекулярно-генетических технологий, использующихся для изучения лейкозов и солидных опухолей, для диагностики и мониторинга эффективности таргетной терапии; хромосомные аберрации и мутации генов, ответственных за развитие лейкозов и некоторых солидных опухолей, для которых разработана таргетная терапия;

основные препараты целенаправленного действия, применяемые в зависимости от результатов цитогенетических и молекулярно-генетических исследований; основные механизмы развития резистентности к препаратам целенаправленного действия, генетические методы их идентификации и пути ее преодоления; алгоритм генетического мониторинга терапии некоторых лейкозов и солидных опухолей.

Уметь: интерпретировать результаты анализа кариотипа опухолевых клеток; оценить результаты молекулярно-генетических исследований мутаций; анализировать результаты исследования экспрессии некоторых генов; осуществлять дифференцированный подход к терапии лейкозов в зависимости от результатов цитогенетических и молекулярных исследований.

Владеть: принципами методов, используемых для диагностики и оценки целенаправленной терапии лейкозов и солидных опухолей: цитогенетический метод, FISH, ПЦР в режиме реального времени, секвенирование ДНК по Сэнгеру; основными принципами цитогенетической номенклатуры и номенклатурой мутаций.

3. ОБЪЕМ КУРСА И ВИДЫ УЧЕБНОЙ РАБОТЫ

Аудиторные занятия, из них:

Контингент обучающихся: студенты лечебного и педиатрического факультетов.

Продолжительность обучения: 72 учебных часов, из них 48 у.ч. - аудиторные занятия, у.ч. - самостоятельная работа 4.1 Содержание разделов элективного курса Хронический Клинико-генетическая характеристика ХМЛ;

миелоидный лейкоз цитогенетические и молекулярно-генетические (ХМЛ): геномные исследования патогенеза ХМЛ; реципрокная транслокация основы патогенеза и t(9;22), химерный ген BCR-ABL; аномальная тирозинкиназа таргетной терапии BCR-ABL и ее ингибиторы: иматиниб, нилотиниб, Таргетная терапия Минимальная остаточная болезнь (MRD) при ХМЛ;

ХМЛ ингибиторами цитогенетический ответ на терапию ИТК; большой и тирозинкиназ (ИТК): полный молекулярный ответ на терапию ИТК;

цитогенетический и молекулярные основы прекращения терапии ИТК и молекулярный сохранения ремиссии; резистентность к терапии ИТК:

мониторинг; мутации и амплификация гена BCR-ABL, клональная резистентность и цитогенетическая эволюция, экспрессия OCT1, пути ее преодоления фармакогенетика ИТК, мутация T315I и терапия 3 Ph-негативные хронические полицитемии, эссенциальной тромбоцитемии, миелопролифератив идипатического миелофиброза. Наследственные ХМПЗ.

ные заболевания Наиболее частые мутации при ХМПЗ: мутация V617F гена (ХМПЗ) – геномные JAK2, мутации в экзоне 12 гена JAK2, мутация W515K/L основы патогенеза и гена MPL. Активация сигнальных путей при ХМПЗ.

таргетной терапии 4 Ph-негативные хронические гена JAK2 в ХМПЗ. Один ген – три заболевания:

миелопролифератив современная теория. Ингибитор янус-киназы – ные заболевания – руксолитниб. Аллельная нагрузка в оценке эффективности терапия терапии ХМПЗ. Полногеномные исследования и ингибиторами янус- перспективы изучения патогенеза и терапии ХМПЗ Хронический Клинико-генетическая характеристика В-клеточного ХЛЛ.

лифолейкоз (ХЛЛ): Делеции 11q23, 13q14, 17р13, трисомия хромосомы 12, цитогенетические и комплексные нарушения кариотипа и прогноз терапии молекулярные ХЛЛ до появления таргетных препаратов. Алемтузумаб и маркеры. Таргетная терапия ХЛЛ при делеции 17р13, мутациях гена p53.

моноклональные CD52 – алемтузумаб Острый ОЛЛ: транслокация t(9;22)(q34;q11.2) c образованием лимфобластный химерного гена BCR-ABL1 и ингибиторы тирозинкиназ лейкоз (ОЛЛ): иматиниб, дазатиниб и нилотиниб. Транслокация генетическая t(12;21)(p13;q22) с образованием слитного гена ETV6характеристика и RUNX1 (TEL-AML1), t(1;19)(q23;p13) – с образованием возможности химерного гена E2A-PBX1 (TCF3-PBX1) и другие таргетной терапии аномалии. Прогноз эффективности терапии в зависимости Рак молочной Гиперэкспрессия HER2 или амплификация гена HER2 при железы (РМЖ): РМЖ. Гуманизированное МКА, блокирующее гиперэкспрессия или внеклеточный домен рецептора HER2 эпидермального амплификация HER2 фактора роста – трастузумаб. Ингибитора трансаминаз и трастузумаб рецепторов HER1 (EGFR1) и HER2 (EGFR2) лапатиниб в Немелкоклеточный Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) и ингибиторы ТК рак легкого (НМРЛ) EGFR — гефитиниб и эрлотиниб, ингибитор и тарегтная терапия VEGF- бевацизумаб. Мутации гена EGFR и прогнзоз ингибиторами EGFR. терапии ингибиторами ТК EGFR.

Острый миелоидный Молекулярные маркеры ОМЛ как мишени для таргетной лейкоз (ОМЛ): терапии: FLT3, RAS/RAF/MEK/ERK и янус-киназы (JAKклассификация, 2). Молекулярная биология ОМЛ и сигнальные пути.

генетическая Преклинические и клинические исследования AC-220, характеристика, сорафениба и мидостаурина у пациентов ОМЛ с мутациями таргетная терапия в гене FLT3, GSK1120212 и MSC1936369B у пациентов Лейкозы, Цитогенетические аномалии при МДС. Метилирование миелодиспластическ ДНК и модификация гистонов при лейкозах и МДС.

ий синдром (МДС): Ингибитор ДНК-метилтрансферазой - азацитидин.

изменения Гипометилирование ДНК и реактивация генов при терапии эпигенетической азацитидином.

регуляции экспрессии генов – основа нового подхода к таргетной Полногеномные Технологии секвенирования следующего поколения (ССП).

исследования в Подготовка библиотеки ДНК; амплификация ДНКпоиске мишеней для библиотеки; параллельное секвенирование клонов целенаправленной амплифицированной ДНК-библиотеки. Исследования Таргетные Препараты целенаправленного действия: блокада препараты: циркулирующих лигандов; блокада связывания лигандов с классификация, экстрацеллюлярным доменом рецептора; ингибирование особенности ТК внутриклеточного домена рецептора; ингибирование механизма действия внутриклеточных белков; эпигенетическая регуляция 4.2 Разделы учебного курса, виды учебной деятельности и формы контроля п/п электива включая самостоятельную контроля лейкоз (ХМЛ):

ингибиторами тирозинкиназ цитогенетически молекулярный мониторинг;

резистентность и преодоления заболевания миелопролифера заболевания – ингибиторами янус-киназы.

цитогенетически молекулярные маркеры.

Таргетная терапия ХЛЛ:

моноклональные антитела к CD алемтузумаб лейкоз (ОЛЛ):

генетическая характеристика и возможности таргетной гиперэкспрессия амплификация трастузумаб тарегтная ингибиторами классификация, генетическая характеристика, таргетная ческий синдром изменения эпигенетической регуляции экспрессии генов – основа нового подхода к таргетной поиске мишеней целенаправленн особенности механизма действия

5. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОРГАНИЗАЦИИ

ЭЛЕКТИВНОГО КУРСА

Настоящая программа создана в развитие представлений и навыков полученных студентами лечебного и педиатрического факультетов в изучении генетики, онкологии и гематологии. Основными формами обучения студентов на элективном курсе являются лекции, семинары.

Лекционная форма обучения предусматривает получение новых знаний и формирование теоретической основы необходимой для понимания роли цитогенетических и молекулярногенетических исследований в изучении патогенеза лейкозов и солидных опухолей, поиске мишеней для таргетного воздействия на опухолевые клетки, разработке тарегтной терапии, изучение значения анализа опухолевого кариотипа, мутационного статуса и профиля экспрессии генов опухолевых клеток в диагностике.

На семинарских занятиях под руководством высококвалифицированных преподавателей обсуждаются ключевые вопросы генетических исследований при лейкозах и некоторых солидных опухолях, выборе тактики терапии и оценке ее эффективности в зависимости от результатов генетических исследований, интерпретация результатов этих исследований в практической деятельности врача. Обязательным полагается выполнение слушателями реферативных работ с последующим обсуждением сообщений на семинарах.

Завершается элективный курс сдачей зачета.

“Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ): геномные основы патогенеза и таргетной Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) – клональное миелопролиферативное заболевание, составляющее около 20% вновь диагностированных случаев лейкозов у взрослых. Ежегодная заболеваемость ХМЛ – не более 1-2 случаев на 100 000 взрослого населения. ХМЛ развивается в результате появления в стволовой кроветворной клетке реципрокной транслокации t(9;22)(q34;q11.2). Образующуюся при этом дериватную хромосому der(22)t(9;22) с укороченным длинным плечом называют филадельфийской (Ph-хромосома) (рис.1) по названию города, в котором она была впервые описана. В результате реципрокной der(22)t(9;22) Рис. 1. Кариотип клетки костного мозга с с Ph-хромосомой (der(22)t(9;22)).

транслокации t(9;22)(q34;q11.2) происходит слияние гена ABL (Abelson gene), расположенного на длинном плече хромосомы 9, с геном BCR (the breakpoint cluster region gene), расположенном на длинном плече хромосомы 22, с образованием слитного гена BCR-ABL (рис.2 ). При реципрокной транслокации t(9;22)(q34;q11.2) возможно формирование нескольких вариантов слитного гена BCR-ABL. Наиболее часто (95%) при этой транслокации сливаются 5’-область гена BCR и 3’-область гена ABL. Точка разрыва на 9-й хромосоме находится в 5 интроне между экзонами 1 и 2 гена ABL. Точка разрыва на 22-й хромосоме, как правило, локализуется в главной зоне М-BCR (major breakpoint cluster region) гена BCR. В этом случае возможно образования вариантов слитного гена BCR-ABL по типу b3a2 (слияние экзона 3 гена BCR и экзона 2 гена ABL) и по типу b2a2 (слияние экзона 2 гена BCR и экзона 2 гена ABL).

Значительно реже (3-4% случаев) разрыв гена BCR наблюдается в минорной зоне (m-BCR) и тогда имеет место слияние экзона 1 гена BCR и экзона 2 гена ABL, что соответствует варианту транслокации е1а2. Менее чем в 1% случаев наблюдаются такие молекулярные варианты транслокации t(9;22)(q34;q11), как b2a3, b3a3, е6а2, е19а2.

Белок BCR-ABL является тирозинкиназой с повышенной активностью и играет ключевую роль в патогенезе ХМЛ. Механизмы, контролирующие в норме активность ABL тирозинкиназы, не способны регулировать активность химерной BCR-ABL тирозинкиназы, что приводит к злокачественной трансформации стволовой кроветворной клетки. Активность BCR-ABL тирозинкиназы обусловливает увеличение пролиферативной активности клеток и ингибирование апоптоза, уменьшает зависимость кроветворных клеток от цитокинов и снижает клеточную адгезию. При установлении диагноза ХМЛ 90-100% клеток костного мозга характеризуются наличием Ph-хромосомы, выявляемой цитогенетическим или FISH методами.

Рис.2. Варианты химерного гена BCR/ABL (Deininger M, Goldman J, Melo J. Blood. 2000;

96, 3343-56) В течение всего XIX века для лечения ХМЛ использовался раствор Fowler, основным ингредиентом которого был мышьяк. В XX веке на смену мышьяку последовательно пришли рентгеновское излучение, бусульфан, гидроксимочевина, трансплантация костного мозга и интерферон. Наконец, в начале XXI в практику гематологов вошел новый препарат ингибитор тирозинкиназ иматиниб. Внедрение иматиниба значительно увеличило бессобытийную и общую выживаемость больных ХМЛ (рис.3). Этот препарат, по часто используемому в посвященной ХМЛ литературе выражению, совершил революцию в терапии ХМЛ.

фазе ХМЛ (M.D.Anderson Cancer Research Centere database (2011), The University of Texas) Исторически так сложилось, что подходы к лечению многих солидных злокачественных опухолей впервые были предложены и апробированы в терапии онкогематологических заболеваний. Многие лекарственные препараты впервые были использованы для лечения онкогематологических заболеваний, а уже затем была обнаружена их противоопухолевая активность при солидных опухолях. Первый представитель ингибиторов тирозинкиназ иматиниб был создан для лечения ХМЛ, однако показал свою активность и при лечении миелопролиферативных заболеваний. Более того, благодаря успехам лечения ХМЛ иматинибом появилась новая парадигма таргетной (целенаправленной) терапии онкологических заболеваний.

Появление иматиниба и других ингибиторов тирозинкиназ (дазатиниб, нилотиниб) – это результат движения от эмпирической терапии к терапии с рациональным дизайном, основанным на понимании клеточных и молекулярных механизмов патогенеза заболевания.

Иматиниб селективно ингибирует BCR-ABL тирозинкиназу, встраиваясь в АТФсвязывающий карман киназного домена белка BCR-ABL и удерживая его таким образом в неактивном состоянии(рис.4).

Рис.4 Механизм действия первого ингибитора тирозинкиназ - STI571 (иматиниба) Иматиниб является специфическим ингибитором тирозинкиназы, подавляющим киназную активность белков, кодируемых BCR-ABL, ABL и ABL-связанными (Arg) генами, ингибирующим функциональную активность рецепторов тромбоцитарного фактора роста (PDGF-R) и kit-рецепторов. Первоначально предполагалось, что иматиниб действует как прямой конкурирующий ингибитор связывания АТФ. Однако структурный анализ показал, что иматиниб занимает только часть пространства АТФ-связывающего кармана тирозинкиназы.

Более того, иматиниб эффективен только против BCR-ABL активационной петли, находящейся в неактивном конформационном состоянии, благодаря чему достигается высокая специфичность препарата. Он контактирует с 21 аминокислотами внутри сайта связывания АТФ и активационной петли. Белок BCR-ABL эффективно удерживается в неактивном состоянии, что препятствует связыванию АТФ и фосфорилированию BCR-ABL. Вследствие этого не фосфорилируется каскад эффекторных молекул и не активируется пути трансдукции сигналов. В результате экспериментов in vitro с перевиваемой клеточной линией LAMA 84, полученной от пациента с ХМЛ в бластном кризе, и клетками, полученными от пациента в хронической фазе ХМЛ, было выявлено, что иматиниб специфично ингибирует пролиферативную активность и клоногенный потенциал лекозных клеток и стимулирует их апоптоз.

G-метод дифференциальной окраски хромосом клеток костного мозга (G-banding) позволяет выявить классическую Ph-хромосому в 90-95% клинически диагностированных случаев ХМЛ. В 5% случаев ХМЛ может быть обнаружена вариантная форма Ph-хромосомы, в которой помимо участков хромосом 9 и 22 вовлечены и другие дополнительные хромосомы. По современным представлениям, наличие вариантной Ph- хромосомы в клетках костного мозга на момент диагностики хронической фазы ХМЛ не влияет на прогноз заболевания. В редких случаях ХМЛ могут быть идентифицированы криптические транслокации, которые не обнаруживаются методом СЦИ. В этих случаях транслокация t(9;22)(q34;q11), а точнее – образующийся при этой транслокации слитный ген BCR-ABL, цитогенетически выявляется только с помощью метода флуоресцентной in situ гибридизации хромосом (FISH).

Также на момент диагностики ХМЛ помимо Ph-хромосомы в клетках костного мозга могут выявляться дополнительные хромососомные аберрации. Появление дополнительных хромосомных аберраций на фоне терапии иматинибом рассматривается как клональная эволюция, обусловливает плохой прогноз и может быть предвестником трансформации хронической фазы в фазу акселерации. Однако, прогностическое значение тех же самых дополнительных хромосомных аномалий, выявленных на этапе диагностики ХМЛ, не вполне понятно. С одной стороны, эти дополнительные хромосомные аберрации могут быть уже проявлением клональной эволюции на начальном этапе развития заболевания и, следовательно, представлять угрозу прогрессии ХМЛ. С другой стороны, существующие данные свидетельствуют об отсутствии влияния таких хромосомных аномалий на эффективность проводимой терапии и выживаемость пациентов с ХМЛ. Так, в клиническом исследовании эффективности терапии ХМЛ -интерфероном дополнительные хромосомные аномалии были обнаружены у включенных в исследование впервые выявленных больных ХМЛ в 10% случаев.

Исследователи не обнаружили различий по частоте достижения цитогенетического ответа и общей выживаемости между группами пациентов с дополнительными хромосомными аберрациями и без них. Однако, при лечении иматинибом данные о прогностическом значении дополнительных хромосомных аномалий, выявляемых до начала лечения, противоречивы. В одних исследованиях выявлено негативное влияние этих аномалий на достижение цитогенетического и молекулярного ответов. В других исследованиях дополнительные хромосомные аберрации, выявленные в Ph-положительных клетках до начала терапии иматинибом, достоверно не влияли на достижение цитогенетического ответа.

После внедрения в клиническую практику гематологов таких методов лечения ХМЛ, как трансплантация костного мозга, препаратов - интерферона и, особенно, ингибиторов тирозинкиназ стандартное цитогенетическое исследование клеток костного мозга является общепризнанным “золотым стандартом” для оценки ответа на терапию ХМЛ. Оптимальный ответ на терапию иматинибом при цитогенетическом исследовании заключается в достижении через 3 месяца лечения частичного цитогенетического ответа (Ph-положительных клеток в костном мозге не более 35%) и после 6 месяцев – полного цитогенетического ответа (Phположительные клетки в костном мозге не обнаруживаются). Достижение частичного или полного ответа на терапию иматинибом в указанные сроки ассоциировано со значительным снижением риска прогрессии заболевания и увеличением выживаемости пациентов с ХМЛ.

Поэтому достижение цитогенетического ответа можно рассматривать как предиктивный фактор благоприятного исхода терапии ХМЛ.

Незаменимость СЦИ в мониторинге лечения ХМЛ объясняется не только тем, что результаты СЦИ являются эффективно работающими критериями ответа на проводимое лечение и достоверным фактором прогноза. Более важно, что СЦИ является единственным методом в цитогенетической практике, позволяющим анализировать весь хромосомный набор одновременно. Следовательно, СЦИ является единственным методом, позволяющим выявить дополнительные хромосомные аномалии (клональную эволюцию) в Ph-положительных клетках, которые могут появляться на фоне терапии ХМЛ. Цитогенетическая эволюция в Phположительных клетках ассоциирована с плохим прогнозом и высоким риском прогрессии заболевания в фазу акселерации и бластный криз. Обнаружение клональной эволюции в Phположительных клетках в процессе лечения свидетельствует о недостаточном подавлении генетически нестабильного опухолевого клона клеток и развитии рецидива. В исследованиях эффективности терапии ХМЛ иматинибом обнаружено, что появление дополнительных хромосомных аномалий в Ph-положительных клетках достоверно уменьшает частоту достижения цитогенетического ответа на терапию иматинибом. Более того, прогноз развития хронической фазы ХМЛ при появлении клональной эволюции на фоне терапии иматинибом сравним с прогнозом при развитии фазы акселерации ХМЛ.

Выявление на фоне терапии иматинибом в Ph-положительных клетках таких аномалий, как дополнительная Ph хромосома (+der (22)t(9;22)), дополнительная хромосома 8 (+8), изохромосома 17 (i(17q10)) и других аномалий является “предостережением” и требует изменения тактики терапии ХМЛ – повышение дозы иматиниба, переход на терапию ингибиторами тирозинкиназ второго поколения (нилотиниб, дазатиниб).

Примерно у 5% пациентов с ХМЛ, получающих терапию иматинибом, дополнительные хромосомные аномалии появляются в Ph-негативных клетках. По современным представлениям появление дополнительных хромосомных аберраций в Ph-негативных клетках не отражается на прогнозе заболевания и не требует изменения тактики ведения больных ХМЛ. Однако зачастую в Ph-негативных клетках обнаруживаются хромосомные аберрации, характерные для миелодиспластического синдрома или острых лейкозов, что предполагает развитие вторичных гематологических неопластических процессов. Однако такие случаи единичны и не играют существенной роли в определении прогноза ХМЛ.

Развитие молекулярно-генетических технологий, в частности метода трансфекции ретровирусов, в 70-80-х годах XX века позволило показать, что мутации некоторых генов могут приводить к развитию злокачественных опухолей. Так, была доказана канцерогенная роль такого онкогена, как с-ABL. В исследованиях A. De Klein с соавт. ( 1982) ген с-ABL был картирован в геноме человека на длинном плече хромосомы 9 в регионе 9q34 и было показано, что при ХМЛ он транслоцируется на хромосому 22. Затем Groffen J с соавт. (1984) впервые описали ген BCR хромосомы 22, а уже через год Shtivelman E. с соавт (1985) доказали факт слияния генов BCR и ABL, в результате которого образуется химерный транскрипт. Далее в 1990 году была установлена очень важная связь между этими молекулярно-генетическими данными и уже известным к тому времени фактом протеинкиназной активности белка ABL.

Таким образом, была доказана повышенная тирозинкиназная активность белка BCR-ABL. И, наконец, в этом же году в лаборатории J. Groffen была произведена трансфекция гена BCR-ABL экспериментальным животным, что вызвало развитие лейкоза (Daley G.Q., Van Etten R.A., Baltimore D., 1990). Результаты этих молекулярно-биологических исследований и появление в 1989 году метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) заложили основу использования молекулярных технологий в диагностике и мониторинге терапии ХМЛ.

Методология идентификации BCR-ABL эволюционировала на протяжении последних лет. Качественный ПЦР-анализ, показывающий только наличие или отсутствие транскрипта, недостаточно информативен. Поэтому для диагностики ХМЛ с последующей возможностью оценки динамики терапии на первый план вышли количественные ПЦР-исследования и поиск прогностически важных уровней транскрипта BCR-ABL. Для определения минимальной остаточной болезни используют методику количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (real-time PCR, RQ-PCR). В основе метода лежит регистрация накопления продуктов реакции в реальном времени и построение калибровочных кривых по реальным процессам, происходящим в каждой конкретной пробирке. Для детекции ПЦР-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флюоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта – так называемая репортерная флюоресценция.

Результат исследования методом real-time ПЦР выражают отношением уровня экспрессии гена BCR-ABL к уровню экспрессии контрольного (housekeeping) гена. В качестве контрольного гена наиболее часто используют гены ABL, BCR, 2M. Альтернативный метод выражения результатов real-time ПЦР был введен Т. Hughes и коллегами в 2003 году в ходе новаторского международного рандомизированного исследования STI571 (IRIS Study), доказавшего высокую эффективность лечения хронического миелоидного лейкоза иматинибом.

В этом исследовании среднее значение экспрессии гена BCR-ABL в тридцати образцах крови, полученных от пациентов с хроническим миелоидным лейкозом до терапии, считалось показателем среднего базового значения. Авторы предложили концепцию диагностики с возможностью последующего мониторирования ответа на терапию иматинибом с использованием десятичного логарифма (log10): редукция экспрессии гена BCR-ABL по сравнению со стандартной базовой линией не леченых иматинибом пациентов оценивалась в log10. Другой вариант выражения результатов - это отношение числа копий гена BCR-ABL к числу копий контрольного гена, или представление данного соотношения в процентном выражении, где число копий контрольного гена принято за 100% (Hughes T., Deininger M., Hochhaus A. et al., 2006).

Уровень экспрессии транскрипта коррелирует с числом лейкозных клеток, присутствующих в крови (рис. ). Лейкозоспецифичный BCR-ABL транскрипт является удобным маркером как для диагностики ХМЛ, так и молекулярного мониторинга терапии ХМЛ методом количественной ПЦР, так как почти у всех пациентов с хроническим миелоидным лейкозом обнаруживается один или два типа транскрипта, которые различаются только по одному BCR экзону.

Рис. Соспоставление количества лейкозных клеток с результатами цитогенетического и молекулярного мониторинга терапии ХМЛ В течение последних 12 лет несколько групп исследователей развивали метод ПЦР в режиме реального времени для измерения уровня транскрипта в крови и костном мозге, который позволил мониторировать динамику минимальной остаточной болезни и оказался приемлемой альтернативой для мониторинга терапии ХМЛ. Уровень транскрипта коррелирует с количеством лейкемических клеток в крови и костном мозге, что может быть использовано для точной оценки ответа на терапию.

Введение в практику научных и клинических исследований метода ПЦР в режиме реального времени (rt-PCR) в конце 1990-х годов значительно упростило количественный ПЦР анализ. Клиническая значимость количественной оценки BCR-ABL методом ПЦР в режиме реального времени показана в ряде исследований. Исследование пациентов с ХМЛ, получающих иматиниба, показало выраженную корреляционную связь между процентом Phпозитивных метафаз в костном мозге и определяемым методом ПЦР в режиме реального времени уровнем BCR-ABL транскрипта в крови. Раннее снижение уровня BCR-ABL транскрипта предшествует цитогенетическому ответу на лечение иматинибом пациентов в хронической фазе ХМЛ и находится в корреляционной связи с благоприятным прогнозом.

Существуют различные модификации метода ПЦР в режиме реального времени в зависимости от типа используемого прибора, дизайна праймеров, анализируемых локусов гена BCR-ABL,типа используемых флуорохромов и контрольных генов. Эти различия приводят к вариациям чувствительности и точности разных модификаций метода. В настоящее время несколько групп исследователей работает над проблемой стандартизации различных модификаций метода ПЦР в режиме реального времени.

Для дальнейшей оценки уровня редукции клона лейкозных клеток у пациентов с ХМЛ в полной цитогенетической ремиссии необходимо измерение уровня BCR-ABL транскрипта методом ПЦР в режиме реального времени. T.Hughes, S.Branford (2006) измеряли количество BCR-ABL транскриптов и BCR транскриптов. Для стандартизации результатов исследования уровня экспрессии BCR-ABL полученное значение выражалось в процентах количества BCRABL транскрипта по отношению к количеству BCR траснкрипта (BCR-ABL/ BCR). Эти исследования проводились в трех лабораториях, расположенных в Аделаиде, Сиэтле и Лондоне. Вследствие методологических особенностей, имеющихся в каждой из этих лабораторий, обнаруживались постоянные различия значений показателя BCR-ABL/ BCR. Для стандартизации результатов все три лаборатории анализировали 30 идентичных образцов, полученных от пациентов с ХМЛ до начала терапии. По 30 образцам было подсчитана медиана базового значения для каждой лаборатории.

Термины “ПЦР негативный” и “полный молекулярный ответ” необходимо использовать с большой долей осторожности, так как они обозначают абсолютное исчезновение лейкемии, что может быть ошибкой.

Несмотря на успешность терапии ингибиторами тирозинкиназ, к 7 годам наблюдения в исследовании IRIS оказалось очевидным, что из всей группы пациентов, рандомизированных на терапию иматинибом, только 57% сохраняют полный цитогенетический ответ на терапию, проводимую в соответствии с первоначальным протоколом. В недавно опубликованных de Lavallade c соавт. результатах небольшого, одноцентрового исследования также показано, что среди пациентов, получающих иматиниб 5 лет после установления диагноза ХМЛ, полный цитогенетический ответ достигли и удерживают 63% пациентов.

Таким образом, клиническая резистентность к терапии иматинибом развиваются у меньшинства пациентов с ХМЛ, однако в достаточно высоком проценте случаев.

Исследователи довольно быстро выявили ряд механизмов, приводящих к “неудаче” терапии иматинибом или к рецидиву ХМЛ.

Механизмы резистентности, связанные с BCR-ABL тирозинкиназой.

Наиболее изученными являются так называемые “BCR-ABL связанные” механизмы развития первичной и вторичной резистентности к терапии иматинибом. К ним относятся дупликация или амплификация гена BCR-ABL, выявляемые цитогенетически в виде дупликации Ph-хромосомы или молекулярно-цитогенетически (FISH-анализ) в виде амплификации гена BCR-ABL.

Амплификация гена BCR-ABL как одного из клинически значимых механизмов резистентности к иматинибу у пациентов с ХМЛ является общепризнанной. Однако, работы по исследованию амплификации гена BCR-ABL в основном были проведены на клеточных культурах, а описания амплификация гена BCR-ABL in vivo у пациентов с ХМЛ единичны.

M.E.Gorre с соавт. [2001] методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) показали геномную амплификацию гена BCR-ABL у трех из девяти пациентов с резистентной к иматинибу формой ХМЛ. По данным A. Hochhaus [2003], множественные копии гена BCR-ABL методом FISH обнаружены у 2-х из 7-и обследованных пациентов с ХМЛ с первичной резистентностью и не обнаружены ни у одного из 25 пациентов с ХМЛ на фоне рецидива. У пациентов с амплификацией гена BCR-ABL вероятность достижения полного цитогенетического ответа после 36 месяцев терапии иматинибом не превышала 20%, тогда как у пациентов без амплификации гена BCR-ABL достигала 70%.

Рис. Амплификация гена BCR-ABL в клетке костного мозга. ДНК зонд 22q11.2 LSI BCR SpectruGreen / 9q34 LSI ABL SpectrumOrange dual fusion (Vysis, Abbott) (Куцев С.И., Морданов С.В.. Онкогематология. 2009; 3:57-60).

Мутации киназного домена гена BCR-ABL. Хотя к настоящему времени описано много “точечных” мутаций киназного домена гена BCR-ABL и их количество продолжает увеличиваться, клиническое значение каждой из них в индивидуальном прогнозе эффективности терапии иматинибом и другими ингибиторами тирозинкиназ может различаться. Branford S. с соавт.[ 2003] и, особенно, Nicolini [2006] показали снижение Рис. Мутации киназного домена гена BCR-ABL.

выживаемости без прогрессии и общей выживаемости только у тех пациентов с ХМЛ, которые имели мутацию T315I или различные мутации в участке гена BCR-ABL, кодирующего P-петлю киназного домена ABL-тирозинкиназы. Использование теста in vitro для определения IC (50% inhibitor concentration), позволило охарактеризовать чувствительность различных мутантных форм ABL-тирозинкиназы к иматинибу и другим ингибиторам тирозинкиназ. Так, например такие мутации, как Q252H, V299L, M351Т, L384M в тестах in vitro приводят лишь к незначительному снижению чувствительности ABL-тирозинкиназы к иматинибу и, вероятно, играют роль в развитии клинической резистентности только в сочетании с другими механизмами. Напротив, мутации G250E, E255K/V, T315I и другие могут приводить к высокому уровню резистентности к иматинибу. Различия в чувствительности ABLтирозинкиназы к различным ингибиторам тирозинкиназ (иматинибу, дазатинибу, нилотинибу, босутинибу) в зависимости от вида мутации гена BCR-ABL могут использоваться для выбора второй линии терапии у резистентных к иматинибу пациентов. В данной статье мы не будем подробно останавливаться на рассмотрении клинического значения исследования мутационного статуса больных ХМЛ поскольку этой теме была посвящена одна из недавних наших обзорных статей, опубликованных в данном журнале в 2008 году.

Механизмы резистентности, несвязанные с BCR-ABL тирозинкиназой.

Не связанные с BCR-ABL тирозинкиназой механизмы включают появление дополнительных хромосомных аберраций, которые выявляются с помощью цитогенетического мониторинга, активацию альтернативных сигнальных путей, а также группу механизмов формирования резистентности, для которой характерны изменения фармакокинетики ингибиторов тирозинкиназ: повышенная экспрессия белка множественной лекарственной резистентности PgP и других белков-транспортеров, избыточное связывание иматиниба с сывороточным альфа-1-кислым гликопротеином, избыточная метаболизация лекарственного препарата ферментами цитохрома Р450.

Клональная цитогенетическая эволюция. Одним из основных “BCR-ABL несвязанных” механизмов резистентности и, одновременно, прогрессии ХМЛ является “клональная эволюция” – появление дополнительных хромосомных аберраций в Ph-позитивных лейкозных клетках. Клональная эволюция в полном объеме может быть выявлена только при исследовании костного мозга стандартным цитогенетическим исследованием, позволяющим оценить весь хромосомный набор опухолевой клетки.

Пациенты в хронической фазе ХМЛ, имеющие дополнительные хромосомные аберрации в Ph-позитивных клетках, характеризуются худшим прогнозом по сравнению с пациентами, не имеющими признаков клональной эволюции (рис. ). Признак клональной эволюции является независимым неблагоприятным прогностическим фактором выживаемости пациентов с ХМЛ как в хронической фазе, так и в фазе акселерации. Значительно менее охарактеризованы другие механизмы резистентности к иматинибу, не связанные с BCR-ABL тирозинкиназой.

Активация альтернативных сигнальных путей Появление слитного гена BCR-ABL, приводящее к трансформации гемопоэтических клеток при ХМЛ, вызывает изменение ряда сигнальных путей, регулирующих, в частности, Рис. Дополнительные хромосомнеы аберрации в Ph-позитивной клетке костного мозга.

клеточную пролиферацию и апоптоз. BCR-ABL тирозинкиназа способна активировать Ras/Raf/Mek киназные пути через Grb-2 опосредованное связывание с Y177-мотивом в гене BCR или через Shc и Crkl киназы. BCR-ABL независимая активация Ras, Raf или Mek киназ может привести к нечувствительности клеток к иматинибу. Эта же ситуация может привести к резистентности в случае активации киназ семейства Src. Однако, к настоящему времени полученные данные не имеют практического применения, поскольку получены только в культуре клеток.

Повышенная экспрессия белка Pgp. P-гликопротеин (Pgp) является насосом клеточной мембраны, обеспечивающим выведение из клетки лекарственных препаратов, в частности – иматиниба. Высокая активность Р-гликопротеина теоретически может снижать внутриклеточную концентрацию иматиниба, уменьшая его терапевтический эффект.

Активность P-гликопротеина коррелирует с генотипом гена MDR1, кодирующем этот белок.

Более того, различные полиморфизмы гена MDR1 могут коррелировать с достижением молекулярного ответа на терапии иматинибом у пациентов с ХМЛ. Однако, данные о роли белка множественной лекарственной резистентности (Р-гликопротеина, Pgp), кодируемого геном множественной лекарственной резистентности MDR1, противоречивы.

Наиболее часто в исследованиях роли Р-гликопротеина в приобретенной резистентности к иматинибу использовался метод in vitro на перевиваемой BCR-ABL-позитивной иматинибчувствительной клеточной линии К562, полученной от пациента с ХМЛ. Mahon F.X. с соавт.[ 2000] исследуя иматиниб-чувствительную клеточную линию К562 и полученную в лаборатории иматиниб-резистентную линию К562r, по данным цитофлуорометрического анлиза не обнаружили в клетках иматиниб-резистентной линии К562r гиперэкспрессию P-гликопротеина (Pgp) и MRP1. Ferrao P.T. c соавт. [2003] также провели исследование на чувствительной к иматинибу клеточной линии К562, однако для выяснения роли Pgp в развитии резистентности к иматинибу для сравнения использовалась клеточная линия K562(Pgp+) с высокой экспрессией P-гликопротеина. Иммунофлуоресцентный метод показал отсутствие или слабую экспрессию Pgp в клетках матричной культуры K562 и высокий уровень экспрессии в модифицированной клеточной линии K562(Pgp+). Но более интересны данные авторов о том, что даже в клеточной культуре К562 с высокой экспрессией Р-гликопротеина его роль в инактивации иматиниба невелика. Так, клеточная линия K562(Pgp+) была резистентна к контрольному препарату даунорубицину и не была резистентна к иматинибу. Авторы делают вывод о том, что иматиниб не является субстратом для Pgp опосредованного выброса из клетки и, следовательно, Pgp не участвует в развитии резистентности к иматинибу. Напротив, Illmer T. [2004] в клеточной линии К562 с постепенно увеличивающейся экспрессией Pgp методом высокоэффективной жидкостной хроматографии обнаружили внутриклеточное снижение концентрации иматиниба и потерю его эффективности. Механизм Pgp-зависимого снижения уровня иматиниба состоит в удержании BCR-ABL тирозинкиназного паттерна фосфорилирования белка Crkl, что приводит к утрате влияния иматиниба на клеточную пролиферацию и апоптоз. Более того, авторы впервые показали, что направленное снижение активности белков Pgp с помощью циклоспорина А восстанавливает цитотоксичность иматиниба. Таким образом, по данным Illmer T. гиперэкспрессия белка, кодируемого геном MDR1, является одним из клинически важных механизмов равзития резистентности к иматинибу.

Клинические данные о роли гиперэкспрессии Pgp в развитии резистентности менее оптимистичны. Только в работе Dulucq S. c соавт.[ 2008], исследовавших полиморфизм гена множественной лекарственной устойчивости MDR1, кодирующего белок Pgp, показано различная вероятность достижения большого молекулярного ответа у пациентов с 3 видами однонуклеотидных полиморфизмов, вероятно изменяющих активность белка Pgp.

Сниженная экспрессия белка hОСТ1. В последние годы активно обсуждается роль транспортных белков клеточной мембраны, обеспечивающих поступление лекарственных препаратов из межклеточного пространства в цитоплазму клеток, в развитии фармакокинетической резистентности к терапии иматинибом, например – органического катионного транспортного белка hОСТ1, транспортирующего иматиниб внутрь клетки.

Повышенное связывание иматиниба с транспортным белком плазмы крови альфа- кислым гликопротеином может снижать терапевтически эффективную концентрацию иматиниба в плазме крови, являясь одной из причин резистентности к проводимой терапии.

Снижение концентрации иматиниба в плазме По данным различных авторов концентрация иматиниба в плазме крови является достаточно вариабельным показателем, имеющим мультифакториальную основу. Вне зависимости от механизмов изменения концентрации иматиниба в плазме крови, в настоящее время имеются сведения о том, что низкая концентрация иматиниба в плазме крови может являться причиной субоптимального ответа или отсутствия ответа на терапию иматинибом, а минимально необходимой для достижения ответа на терапию иматинибом признана концентрация не менее 1000 нг/мл.

Причиной снижения концентрации иматиниба в плазме может быть генетический полиморфизм ферментов, участвующих в метаболизме лекарственных препаратов.

Эксперименты in vitro показали, что наибольшее значение для метаболизма иматиниба имеет активность ферментной системы цитохрома Р450, а именно – изоферментов CYP3A4 и CYP3A5. Между тем, существует значительная вариабельность активности этих ферментов у разных людей, обусловливающая наблюдаемые различия в концентрации иматиниба.

Таким образом, анализ механизмов резистентности показал, что несомненное клиническое значение имеют исследования BCR-ABL зависимых механизмов резистентности к терапии иматинибом – амплификация гена BCR-ABL, выявляемая FISH анализом или цитогенетическим методом в виде дупликации Ph-хромосомы, и мутации гена BCR-ABL. Из BCR-ABL независимых механизмов наибольшее значение для практики имеет выявление цитогенетической клональной эволюции – появление дополнительных хромосомных аберраций в Ph-позитивных клетках. Анализ этих механизмов резистентности обозначен и как необходимый в рекомендациях по лечению ХМЛ, разработанных European LeukemiaNet (ELN) [Baccarani M., Cortes J., Pane F. et al., 2009].