«БИОТЕХНОЛОГИЯ (Часть 1) Микробная биотехнология Химическая энзимология Учебное пособие Составители: Т.А. Ковалева, А.И. Сливкин, А.С. Беленова С.Н. Суслина Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного ...»

МИНОБРНАУКИ РОССИИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО

ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОТЕХНОЛОГИЯ

(Часть 1)

Микробная биотехнология

Химическая энзимология

Учебное пособие Составители:

Т.А. Ковалева, А.И. Сливкин, А.С. Беленова С.Н. Суслина Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета 2011 Утверждено научно-методическим советом фармацевтического факультета 30 мая 2011 г., протокол Рецензент д-р биол. наук, доцент М.Ю. Грабович В данном учебном пособии излагаются основные этапы становления и развития фармацевтической биотехнологии, методы хранения продуцентов лекарственных препаратов и БАД на фармацевтических предприятиях, основные принципы технологии антибиотиков. Кроме того, рассмотрены вопросы основных достижений микробной биотехнологии и Инженерной энзимологии. В конце каждой главы и некоторых наиболее сложных параграфов предложены вопросы для обсуждения, а также тесты для контроля усвоения учебного материала.

Учебное пособие подготовлено на кафедре фармацевтической химии и фармацевтической технологии фармацевтического факультета Воронежского государственного университета. Рекомендовано для студентов 6 курса заочной формы обучения по специальности «Фармация».

СОДЕРЖАНИЕ

1. Биотехнология. Определение. История развития.

Основные разделы биотехнологии Вопросы для самоконтроля 2. Общая характеристика продуцентов лекарственных препаратов и биологически активных веществ Вопросы для самоконтроля 3. Слагаемые биотехнологического процесса производства лекарственных средств. Методы культивирования лекарственных препаратов и биологически активных добавок Вопросы для самоконтроля 4. Получение посевного материала, выделение, концентрирование, очистка, стандартизация, сушка и контроль фармацевтической продукции Вопросы для самоконтроля 5. Антибиотики. Классификация. Получение антибиотиков.

Биологические методы анализа антибиотиков Вопросы для самоконтроля 6. Инженерная энзимология. Общая характеристика.

Иммобилизованные ферменты Вопросы для самоконтроля 7. Применение гетерогенных биокатализаторов в промышленной технологии Вопросы для самоконтроля Тестовые задания Контрольно-измерительные материалы Список литературы 1. Биотехнология. Определение. История развития. Основные разделы биотехнологии.

В середине 60-х годов в литературе широко обсуждалась проблема возникновения «новой биологии», которая представляла собой развитие прикладных исследований, способствовавших коренному улучшению технологии получения химических и фармацевтических веществ. Это стало реальностью благодаря открытиям в биохимии, генетике, молекулярной биологии и химической технологии, и основывалось на расшифровке первичной структуры ферментов, их использовании в иммобилизованной форме в качестве биокатализаторов, открытии способов модификации ДНК, изучении плазмид и ферментов рестрикции.

Таким образом, в середине 70-х годов появился термин «биотехнология», который сразу же заполнил страницы академических и популярных изданий.

Биотехнологию относят к числу приоритетных наук, где можно прогнозировать более быстрые и важнейшие достижения для социальноэкономического прогресса общества. В биотехнологических производствах используются микроорганизмы, полученные путем индуцированного мутагенеза для получения белковых препаратов, аминокислот, вакцин, моноклональных антител. Применение новых подходов в производстве фармацевтической продукции позволило значительно удешевить себестоимость медицинских препаратов, получить новые уникальные лекарственные средства и одновременно разрешило проблемы утилизации отходов пищевой, деревообрабатывающей и нефтехимической промышленности. В настоящее время более 50 лекарственных веществ – это объект биотехнологических разработок: тромболитические агенты, дисмутазы, предупреждающие клеточные повреждения, эритропоэтин, стимулирующий эритропоэз, эпидермальный ростовой фактор, применяемый для заживления ран, моноклональные антитела для трансплантации костного мозга, лечения сепсиса и ряда других патологических состояний Важнейшим достижением биотехнологии является применение в клинической практике фармацевтических препаратов, полученных с помощью генетической инженерии: гормона роста человека (2 варианта), интерферона, активатора тканевого плазминогена для лечения тромбозов коронарных сосудов, вакцины против гепатита Б, фактора VIII для лечения гемофилии, мышиных моноклональных антител для предупреждения отторжения почечных трансплантантов.

По оценкам экспертов в ближайшие годы биотехнология обеспечит прирост сельскохозяйственной продукции на 15-20%. Биосистемы для получения энергии смогут обеспечить 10-15% необходимого производства энергии в таких странах, как Китай, США, Канада, Индия, Филиппины.

Термин биотехнология впервые был применен в 1917 г инженером Карлом Эреки для описания процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы.

По определению К.Эреки биотехнология – это все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты. Однако это довольно точное определение не получило широкого распространения.

В литературе нет единого мнения относительно определения биотехнологии как науки. М.Е. Беккер (1979) в книге «Биотехнология микробного синтеза» определяет биотехнологию как раздел науки о получении продуктов биосинтеза. По мнению А. Хастинга (1980) «Биотехнология – это промышленное получение продуктов (пива, уксуса, сыра) с использованием биохимических процессов.

В 1980 году Европейская федерация по биотехнологии дала следующее определение. Биотехнология – это приложение биологических систем или процессов к промышленности.

Эти определения в основном верные, но круг наук, практические результаты которых воплощаются в биотехнологии значительно шире.

В 1983 году на конгрессе социалистических стран по биотехнологии в Братиславе было принято следующее определение: «биотехнология – это наука, разрабатывающая научные основы крупнотоннажной реализации процессов получения с помощью биокатализаторов, различных веществ и средств защиты окружающей среды».

Академик Баев А.А. (1984) определяет биотехнологию как науку о применении биологических процессов и систем в производстве. Академик Ю.А. Овчинников считает, что биотехнология – это комплексная, многопрофильная область научно-технического прогресса, включающая микробиологический синтез в его широком понимании, генетическую и клеточную инженерию, инженерную энзимологию.

Анализ существующих определений позволяет сделать заключение, что определение, данное в конце 70-ых годов, в основном, верно. Термин биотехнология имеет два значения: с одной стороны – это наука о применении биотехнологических процессов в производстве, с другой – это комплексное научно-техническое направление, изучающее эти процессы.

Человечество использовало биотехнологические приемы многие тысячи лет (хлебопечение, виноделие, сыроварение, силосование кормов). Люди пользовались одноклеточными организмами давно, даже не подозревая об их существовании (за 6 тыс. лет до н.э.). Биотехнология возникла в процессе развития технологической микробиологии на базе традиционных микробиологических производств.

Биотехнология формировалась и эволюционировала по мере формирования и развития человеческого общества. Ее возникновение, становление и развитие условно можно подразделить на 4 периода:

эмпирический, этиологический, биотехнический и генотехнический.

В эмпирическом периоде развития биотехнологии были распространены способы получения квашеной капусты, медовых алкогольных напитков, мыла из жиров, силосование кормов, мочка лубоволокнистых растений.

Искусство ферментации, химическое превращения органических соединений с помощью ферментов, известно очень давно. Способность дрожжей вырабатывать спирт в виде пива использовалась шумерами и вавилонянами еще до шестого тысячелетия до н.э. Около 4000 г. до н. э.

египтяне обнаружили, что пивные дрожжи благодаря образуемой ими двуокиси углерода, разрыхляют тесто при выпечке хлеба.

К XIV веку во многих странах мира уже широко применяли перегонку спирта из сброженного зерна. К другим процессам ферментации, уходящим корнями в древние времена, относится культивирование уксуснокислых бактерий для получения уксуса, молочнокислых бактерий для сохранения молока, различных бактерий и плесеней для производства сыра.

Таким образом, при помощи микроорганизмов получали пищевые продукты и напитки на протяжении более чем 8 тысяч лет, до того как об их существовании стало известно в XVII веке. Датчанин Антон ван Левенгук, исследуя с помощью простых линз воду, различные пищевые остатки, обнаружил в них крошечные движущиеся организмы, которые он назвал «анималькули».

Этиологический, период охватывает вторую половину XIX века и связан с выдающимися исследованиями Л. Пастера (1822-1895 гг.), основоположника научной микробиологии и ряда микробиологических дисциплин (промышленной, медицинской, химической). Л. Пастер открыл микробную природу брожений, доказал возможность жизни в бескислородных условиях, создал научные основы вакцинопрофилактики и вакцинотерапии, предложил метод стерилизации. На основе его учений Э.

Бюхнер в 1887 г. открыл бесклеточный метаболизм.

В ряду открытий всемирного значения стоит обнаружение в 1892 г.

вируса мозаичной болезни табака Д.И. Ивановским (1864-1920).

Последовавшие за этим открытие других вирусов обеспечили становление новой научной дисциплины – вирусологии.

В 1928 г. А. Флеминг заметил, что плесневый гриб Penicillum notatum, случайно попавший в культуральные чашки, убил культуру бактерий Staphyllococcus aureus. Выделив бесклеточную жидкость из культуры, он обнаружил, что она может подавлять развитие многих бактерий. Флеминг назвал активный компонент жидкости пенициллином. В 1937 г. М. Велиш описал первый антибиотик, выделенный из стрептомицетов – актиномицетин. Работы по поиску новых антибиотических веществ, эффективных при лечении бактериальных, вирусных и раковых заболеваний, протозойных и паразитических болезний, активно развивались.

В 1933 году А. Клюйвер и Л. Перкин опубликовали работу «Методы изучения обмена веществ у плесневых грибов», в которой изложили основные технические приемы, а также подходы к оценке и интерпретации получаемых результатов при глубинном культивировании грибов. С этого времени начинается третий период в развитии биотехнологии – биотехнический, связанный с внедрением в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудования, обеспечившего проведение процессов в стерильных условиях. Особенно мощный толчок в развитии промышленного биотехнологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков.

Особую роль в формировании биотехнологии в данный период имели исследования Э. Мишера (1869 г.), открывшего нуклеиновые кислоты, Г.

Хаберланда (1902 г.), впервые продемонстрировавщего возможность длительного культивирования различных растительных тканей на питательной среде, Г.А. Надсона и Г.С. Филиппова (1925 г.), разработавших основы получения мутантов дрожжевых клеток с помощью ионизирующей радиации. Примерно за 40 лет третьего периода развития биотехнологии были разрешены задачи по конструированию биореакторов, стерилизационного оборудования, систем концентрирования и очистки фармацевтической продукции, полученной с помощью нетрадиционных технологий.

Четвертый период развития биотехнологии – генотехнический – начался в 1972 г., когда П. Берг с сотрудниками создали первую рекомбинантную молекулу ДНК. Особое значение для биотехнологии в это время имели исследования в области молекулярной биологии, изучение структуры и функций нуклеиновых кислот и белков, выделение и изучение механизма действия ферментов, осуществляющих гидролиз и синтез нуклеиновых кислот in vivo.

К основным достижениям, которые определили развитие генетической инженерии можно отнести следующие:

1. Доказательства ДНК как носителя генетической информации О.

Эйвери 1944 г. и открытия в 1953 г. Дж. Уотсоном и Ф. Криком структуры ДНК.

2. Экспериментальное подтверждение универсальности генетического кода.

3. Интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали бактерии Esherichia coli, а также вирусы и плазмидные ДНК.

4. Разработка методов выделения и очистки неповрежденных ДНК вирусов и плазмид, а также методов введения в клетки реципиента рекомбинантных ДНК, конструируемых in vitro, обеспечивающих репликацию и экспрессию кодируемых ими генов.

Для генотехнического периода характерны:

1. Использование генетической и клеточной инженерии для получения новых продуцентов; 2. Получение моноклональных антител, гибридов и изолированных протопластов; трансплантация эмбрионов; 3. Разработка и внедрение экологически чистых и безотходных технологий; 4.

Автоматизация и компьютеризация промышленного производства биотехнологической продукции.

Биотехнология открыла перспективы создания принципиально новых продуцентов биологически активных веществ, а также животных и растений, несущих функционально активные чужеродные гены.

В настоящее время появилась возможность искусственно создавать гены, кодирующие химерные полипептиды, обладающие свойствами двух или более природных белков.

Развитие биотехнологии революционизировало биологическую науку и дало мощный толчок созданию новых и совершенствованию существующих технологических процессов получения биологически активных веществ и лекарственных препаратов путем селекции высокопродуктивных штаммов, а также разработки наиболее эффективных способов выделения, очистки и стабилизации фармацевтической продукции.

Современная биотехнология имеет 3 раздела: микробная биотехнология, генетическая и клеточная инженерия, инженерная энзимология.

Микробная биотехнология – это раздел биотехнологии, изучающий промышленное получение веществ с помощью микроорганизмов.

Развитие микробной биотехнологии началось ранее, чем других разделов (генетической и клеточной инженерии и инженерной энзимологии). Этому способствовало в течение тысячелетий применение метода микробиологической ферментации для получения пищевых продуктов (уксуса, хлеба, сыра). Первые микробиологические производства появились в начале XX века – это производство органических растворителей (метанола, этанола, бутанола и изопропанола).

Важным этапом было широкое промышленное производство антибиотиков после Второй мировой войны.

Период с 1940 по 1960 год XX в. называют эрой антибиотиков или фармацевтическим периодом развития биотехнологии. В 60-70-е годы развивается «метаболическая инженерия» - получение с помощью микроорганизмов аминокислот, бактериальных полисахаридов, ферментов, белка, одноклеточных.

Промышленный биосинтетический процесс, в котором для производства коммерческой продукции используются микроорганизмы, состоит из этапов:

1. Исходная обработка сырья, чтобы его можно было использовать в качестве питательных веществ для микроорганизмов-продуцентов.

2. Ферментация и биотрансформация: рост микроорганизмов в биореакторе (более 100 л) с последующим образованием нужного метаболита (антибиотиков, ферментов, гормонов).

3. Конечная обработка: очистка продукта от компонентов культуральной жидкости или от клеточной массы.

Все препараты, получаемые в микробиологическом производстве, делятся на 3 основные группы:

1. Биопрепараты, имеющие в товарном продукте в качестве основного активного компонента жизнеспособные микроорганизмы (средства защиты растений, бактериальные удобрения, закваски для силосования кормов).

2. Биопрепараты, в состав которых входит инактивированная биомасса (кормовые дрожжи, грибной мицелий).

3. Биопрепараты, получаемые на основе очистки продуктов метаболизма микроорганизмов (витамины, аминокислоты, ферменты, антибиотики, полисахариды).

Продукты биотехнологической промышленности можно разделить на крупнотоннажные (этанол, дрожжи, органические кислоты) и малотоннажные медикаменты (аминокислоты, гормоны и другие продукты микробного синтеза).

Получение белковых веществ не является единственным направлением крупнотоннажной отрасли биотехнологии. Очень велика роль производства аминокислот кормового, пищевого и медицинского назначения, различного ряда ферментных препаратов для медицины и ветеринарии, биологических удобрений, средств защиты растений, витаминов.

Микробная биотехнология связана с геологической микробиологией. В этой связи возникла новая область биотехнологии – биогеотехнология.

Биогеотехнология – это приложение биотехнологических приемов и методов к добыче, обогащению и переработке руд, отделению и концентрированию металлов из сточных вод как вторичного сырья, экстракции остаточных порций нефти из иссекающих месторождений.

Биогеотехнология основана на применении смешанных культур микроорганизмов (ассоциаций).

Методы биогеотехнологии используются для извлечения широкого круга ценных металлов: Cu, U, Mn, Au, Ag, Pt, Zn, Ni, Sn, Cd и др.

Биотехнология получения металлов основана на способности некоторых микроорганизмов переводить металлы в растворимые соединения (выщелачивание металлов из руд). Так, Thiobacillus ferrooxidans выщелачивает железо, цинк, медь и другие металлы с помощью окисления серной кислоты, которую образуют эти организмы из сульфида.

Chromobacterium способна растворять золото при обработке отходов золотодобывающих преприятий. Получены штаммы Pseudomonas для удаления серы из угля. Таким путем может быть решена важнейшая экологическая проблема: при сгорании уголь очень сильно загрязняет окружающую среду серой. Для извлечения металлов из сточных вод перспективно использовать штаммы Citobacter, способные накапливать уран, медь, кобальт. Бактерии рода Nocardia используют для эмульгирования и сорбции углеводородов нефти из водной среды. Они способны очищать источники воды от примесей нефти. Таким образом, мы видим, что микробная биотехнология наряду с решением чисто производственных задач включается в решение и экологических проблем. Именно с ней связаны надежды, что удастся создать экологически чистые и экономически высокоэффективные фармацевтические производства, которые придут в XXI веке на смену нынешним.

Генетическая инженерия изучает способы конструирования in vitro (в пробирке) функционально активных генетических структур. В ее основе лежит перенос единиц наследственности (генов) из одного организма в другой с целью создания нового продукта или получения уже известного вещества в промышленных масштабах. С развитием генетической инженерии появилась возможность не просто отбирать высокопродуктивные штаммы, но и использовать микроорганизмы и эукариотические клетки как биологические фабрики для производства ряда низкомолекулярных веществ и макромолекул, которые в естественных условиях (в клетке) синтезируются в минимальных количествах (инсулин, интерферон, гормоны роста, вирусные антигены и ряд других белков). Живые организмы становятся естественными биореакторами, продуцирующми новые или измененные генные продукты, которые никогда не могли бы быть созданы методами мутагенеза и селекции.

Поэтому биотехнология способствует развитию принципиально новых методов диагностики и лечения различных заболеваний.

В нашей литературе употребляют как синонимы два термина:

«генетическая инженерия» и «генная инженерия». Генная инженерия короче, произносится легче, включает только манипуляции генов. Генетическая инженерия точнее выражает суть дела, и сюда можно включить все виды работ, связанных с изменением генетических программ.

Датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда была создана первая рекомбинантная ДНК. Генетическая инженерия связана с молекулярной генетикой, но становление ее зависело от химической энзимологии и химии нуклеиновых кислот. В нашей стране исследователи включились в разработку генноинженерных методов в году, с 1970 года в нашей стране ведутся исследования по селекции культур для промышленных целей.

Различают три уровня генетической инженерии: 1. Генный – прямое манипулирование рекомбинантными ДНК; 2. Хромосомный – манипуляция с большими группами генов или хромосомами; 3. Геномный – перенос всего или большей части генетического материала из одной клетки в другую.

Современная генетическая инженерия – это первый уровень, т.е. технология рекомбинантных ДНК. Геномная инженерия соответствует по существу клеточной инженерии.

Работы в области генетической инженерии включают 4 основных этапа:

1. Получение гена; 2; Встраивание в генетический элемент (вектор), способный к репликации; 3. Введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент; 4. Идентификация клеток, которые приобрели желаемый ген. Инструментом молекулярного манипулирования являются два типа ферментов: Рестриктазы – это эндонуклеазы, разрывающие связи в определенных участках ДНК; Лигазы – сшивающие фрагменты гена.

На стыке технологии рекомбинантных ДНК и биотехнологии возникла новая область – молекулярная биотехнология. Фрагментами этой дисциплины являются промышленная микробиология, молекулярная биология, генетика бактерий, энзимология, химия нуклеиновых кислот.

Конечной целью любого биотехнологического проекта является создание конечного продукта. Поэтому молекулярная биотехнология связана с экономикой. В период 1980-1983 гг. в США было создано около биотехнологических компаний, причем вице-президентами их часто были ученые, открывшие метод клонирования гена. Сегодня в США работают более 1500 биотехнологических фирм, а во всем мире их более 3000.

Большой вклад в развитие молекулярной биотехнологии внесли крупные химические и биотехнологические компании.

Молекулярная медицина выявляет предрасположенность человека к различным болезням, и возникла она благодаря молекулярной биотехнологии. Отличительная черта молекулярной медицины – лечение заболеваний (как наследственной, так и ненаследственной природы) проводится на генном уровне. В качестве лекарственного препарата выступают гены (точнее специальные генетические конструкции). Генная терапия не только устраняет определенные симптомы заболевания, а корректирует функции клеток и организма в целом. Ее терапевтический эффект может достигаться различными путями: замена «больного» гена на «здоровый», направленная коррекция фигуры и, соответственно, функции «больного» гена, частичное или полное подавление «больного» гена.

И, наконец, еще один важный принцип молекулярной медицины: любое медикаментозное лечение должно подбираться строго индивидуально, учитывая особенности генома больного. Этим занимается недавно возникшая наука – фармакогенетика.

Уже сегодня практическое применение молекулярной медицины весьма разнообразно. Это – и молекулярная диагностика наследственных заболеваний на любой стадии развития организма, в том числе и до рождения (пренатальная диагностика), и определение генов предрасположенности к некоторым распространенным болезням, и геномная «дактилоскопия» – точная идентификация личности на основе особенностей структуры его генома (именно этот метод был с успехом применен при генетическом анализе останков царской семьи).

В геноме человека насчитывается 35-50 тысяч различных генов, изменения в некоторых из них приводят к нескольким тысячам наследственных болезней. Гены практически всех наиболее частых (около 320) и сравнительно редких (около 170) наследственных болезней уже известны. Методы их обнаружения достаточно просты и универсальны и поэтому широко применяются в медицине.

Сейчас у нас в стране можно определить около 40 наиболее тяжелых наследственных болезней. Молекулярная диагностика генов наследственных болезней проводится в НИИ акушерства и гинекологии в Санкт-Петербурге, в Научном центре медецинской генетики и Институте неврологии РАМН в Москве, в Институте биохимии и генетики научного центра РАН в Уфе, в Институте медицинской генетики в Томске и в Медико-генетическом центре в Новосибирске.

Методы молекулярной диагностики позволяют выявить не только гены наследственных болезней, но и гены предрасположенности к тому или иному заболеванию. Гены предрасположенности – объект исследования многих научных групп по всей России. Так, в Санкт-Петербурге на кафедре медицинской генетики Педиатрической академии активно изучаются гены предрасположенности к тромбофлебии, варикозному расширению вен и ряду других заболеваний.

В настоящее время в мире около 400 проектов по генной терапии находятся на различных стадиях клинических испытаний: 261 из них проходит первую стадию (оценка токсичности), 133 – вторую (испытание на небольшой группе тяжелобольных пациентов) и только 3 проекта (два по лечению рака мозга и один по гемофилии) – на заключительной третьей стадии (масштабные клинические испытания). Пока генная терапия применяется в основном в онкологии (более 60% проектов). Примерно по 15% приходится на генную терапию инфекционных (СПИД, гепатит B, туберкулез) и моно генных заболеваний (муковисцидоз, семейная гиперхолестеринемия, мукополисахаридозы, гемофилия А и др.). Методы генной терапии позволяют лечить различные генетические патологии в период внутриутробного развития. Введенный ген или генная конструкция попадает во множество интенсивно делящихся клеток, предотвращая начало развития заболевания. После такой терапии нет необходимости искусственного прерывания беременности – ребенок рождается здоровым.

Но, тем не менее, вопрос о ее целесообразности поднимается все чаще – теоретически существует опасность внедрения искусственных генных конструкций в геном половых клеток, что может привести к «засорению»

генофонда.

Генная терапия успешно применяется для лечения не только наследственных, но и значительно более распространенных мультифакториальных болезней (диабет, остеопороз, ревматоидный артрит, различные опухоли). Для лечения таких заболеваний применяется не одна, а сразу много генетических конструкций, исправляющих дефекты различных стадий течения патологического процесса.

Научные работы в этой области ведутся и в России. В институте акушерства и гинекологии имени Д.О. Отта РАМН разрабатываются новые подходы к генной терапии таких тяжелых наследственных заболеваний, как мышечная дистрофия Дюшенна и муковисцидоз. Работы по генной терапии также проводятся в научных учреждениях Москвы (Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН, Институт молекулярной генетики РАН, Институт медицинской химии РАМН, Научный центр медицинской генетики РАМН) и Новосибирска.

Молекулярная геномика уже применяется в Европе и Соединенных Штатах для решения разнообразных задач медицины и медицинской генетики. Например, в Великобритании созданы информационные центры, и каждый, позвонивший туда, может получить консультацию по любым вопросам, касающимся своей наследственности и генетической предрасположенности к различным заболеваниям. Во Франции создана и используется на практике компьютерная экспертная система Сезам (SESAM – Systeme Expert Specialisee aux Analyses Medicales) для определения склонности человека к различным заболеваниям. Она включает собственно экспертную систему оценки риска возникновения заболевания, основанную на многочисленных лабораторных (иммунологических, биохимических, серологических и генетических) тестах (более 80), программу для обучения врачей основам молекулярной медицины, медицинское консультирование по результатам лабораторных тестов и популярный справочник для населения.

Клеточная инженерия – это метод конструирования клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции. Данный раздел биотехнологии начал свое развитие в 60-70-е годы XX в., хотя методы культивирования клеток были предложены в конце прошлого века. Новый этап развития биотехнологии связан в первую очередь с использованием растительных клеток. Клеточная инженерия основана на способности растений к неограниченному вегетативному размножению, т. е. к регенерации полноценного растения из черенка, а в условиях биотехнологических систем – из небольшой группы клеток или из одной клетки. При культивировании в питательных средах растительные клетки способны в одних условиях неограниченно наращивать биомассу, в других дифференцироваться, образуя вегетативные органы, формируя в пробирке миниатюрные растения. Таким образом, в неполевых, контролируемых условиях можно размножать наиболее ценные сорта растений или получать в контролируемых условиях фармацевтические препараты (убихинон-10-табак, ятрорризин-барбарис, шиконин). Благодаря биотехнологии традиционные методы гибридизации растений расширились и стали проводиться на клеточном уровне. С помощью новых методов клеточной инженерии теперь возможно слияние друг с другом клеток различных по систематическому положению растений, расширились границы спектра скрещиваемости.

Этапным периодом для развития клеточной инженерии можно считать разработку способов, получение изолированных протопластов растений, а также открытие гибридизации соматических клеток (искусственное объединение целых клеток с образованием гибридного генома).

Реконструкция гена связана с созданием жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток (ядра, цитоплазмы, хромосом). Это служит для улучшения клеток продуцентов в культуре.

Гибриды, полученные при слиянии протопластов, имеют важные отличия от половых гибридов, поскольку несут цитоплазму обоих родителей.

Возможно создание гибридов, наследующих ядерные гены одного из родителей наряду с цитоплазматическими генами обоих родителей. Особый интерес представляют гибриды растений, несущие цитоплазматические гены устойчивости к различным патогенам и стрессорным факторам от дикорастущих видов или цитоплазматические гены мужской стерильности.

Слияние протопластов используют также для получения гибридов с ценными в хозяйственном отношении свойствами между отдаленными видами, которые плохо или вообще не скрещиваются обычным путем. Удалось, например, «ресинтезировать» рапс, являющийся естественным амфидиплоидом между турнепсом и капустой, получить соматический гибрид картофеля с томатами и т.д. При слиянии протопластов создают и новые клеточные линии-продуценты биологически активных веществ.

Изменять свойства клеток можно, вводя клеточные органеллы (ядра, хлоропласты), изолированные из одних клеток, в протопласты других клеток.

Так, одним из путей активизации фотосинтеза растительной клетки может служить введение в нее высокоэффективных хлоропластов. Искусственные ассоциации растительных клеток с микроорганизмами используют для моделирования на клеточном уровне природных симбиотических отношений, играющих важную роль в обеспечении растений азотным питанием в природных экосистемах. Рассматривается возможность придания растениям способности к фиксации молекулярного азота при введении в них целых клеток азотфиксирующих микроорганизмов. Реконструкцию клеток проводят также при слиянии клеточных фрагментов, безъядерных кариопластов с ядром, содержащим лишь часть генома интактной. В результате получают клетки с различными свойствами, например, цибриды, или клетки с ядром и цитоплазмой от разных родителей. Такие конструкции используют для изучения влияния цитоплазмы в регуляции активности ядра.

Выращиваемые на искусственных питательных средах клетки и ткани растений составляют основу разнообразных технологий в сельском хозяйстве. Одни из них направлены на получение идентичных исходной форме растений и клональное микроразмножение на основе меристемных культур, создание искусственных семян, криосохранение генофонда при глубоком замораживании меристем и клеток пыльцы. Клеточные технологии при создании растений, генетически отличных от исходных, путем или облегчения и ускорения традиционного селекционного процесса. В первом случае применяют искусственное оплодотворение, культуру незрелых гибридных семяпочек и зародышей, регенерацию растений из тканей летальных гибридов, гаплоидные растения, полученные при культивировании пыльников или микроспор, во втором - формы растений создаются на основе мутантов, образующихся in vitro, и трансгенных растений. Таким путем получены растения, устойчивые к вирусам, гербицидам, способные синтезировать токсины, патогенные для насекомыхвредителей, а также растения с чужеродными генами, контролирующими синтез белков, определяющих морозоустойчивость и белков с улучшенным аминокислотным составом, растения с измененным балансом фитогормонов и др.

Важную роль в животноводстве сыграла разработка методов длительного хранения спермы в замороженном состоянии и искусственного осеменения. Реально же развернулись исследования по клеточной инженерии на млекопитающих только с освоением техники оплодотворения in vitro, обеспечившей получение зародышей на ранних стадиях развития.

Генетическое улучшение животных связано с разработкой технологии трансплантации эмбрионов и методов микроманипуляций с ними (получение однояйцевых близнецов, межвидовые пересадки эмбрионов и получение химерных животных, клонирование животных при пересадке ядер эмбриональных клеток в энуклеированные, т.е. с удаленным ядром яйцеклетки). В 1996 г. шотландским ученым из Эдинбурга впервые удалось получить овцу из энуклеированной яйцеклетки, в которую было пересажено ядро соматической клетки (вымени) взрослого животного. Эта работа открывает широкие перспективы в области клонирования животных и принципиальную возможность клонирования в будущем и человека. В этой же лаборатории было получено еще пять клонированных ягнят, в геном одного из которых был встроен ген белка человека.

Клеточная инженерия позволяет конструировать клетки нового типа с помощью мутационного процесса гибридизации, и более того, комбинировать отдельные фрагменты разных клеток, клетки различных видов, относящиеся не только к разным родам, семействам, но и царствам.

Это облегчает решение разных теоретических проблем и имеет практическое значение. Клеточная инженерия широко используется в селекции растений.

Выведены гибриды томата и картофеля, яблони и вишни. Регенерированные из таких клеток растения с измененной наследственностью позволяют синтезировать новые формы, сорта, обладающие полезными свойствами и устойчивые неблагоприятным условиям и болезням. Этот метод широко используется для «спасения» ценных сортов, пораженных вирусными болезнями.

Этим путем созданы межвидовые гибриды табака, картофеля, капусты с турнепсом и других растений. Приведем наиболее интересные гибриды, полученные в результате слияния клеток. В США получен гибридный сорт помидоров, устойчивых к вирусам (PRLV и PYV) в результате слияния протопластов дикого вида Solinum brevidens и коммерческого Solinum tuberosum.

Инженерная энзимология объединяет целый ряд областей современного естествознания: химическую энзимологию, биохимию, химическую технологию. Инженерная энзимология занимается созданием биотехнологических процессов, в которых используется каталитическое действие ферментов, выделенных из биосистем. Промышленное применение ферментов, синтезированных микроорганизмами, было начато в 90-е годы XIX века. Высокая специфичность ферментативного катализа обеспечивает больший выход целевого продукта, заметно удешевляет технологические процессы, а также позволяет перейти на практически безотходные технологии, не загрязняющие окружающую среду. Эффективность ферментативных процессов, используемых в различных областях человеческой деятельности (медицина, пищевая промышленность, энергетика, микроэлектроника) удалось увеличить с помощью иммобилизованных ферментов, связанных с нерастворимыми носителями.

Препаративное получение ферментов в промышленных масштабах позволит существенным образом изменить технологические процессы получения лекарств, методы анализа, а также внедрить в промышленность принципиально новые технологии. В отличие от многих технологических процессов в химической технологии, требующих высоких давлений и температур, реакции, катализируемые ферментами, происходят при температурах, не превышающих 60-70С, нормальном атмосферном давлении и pH 4,5-9,0. Ферменты субстратно специфичны и это создает возможность осуществлять необходимые химические преобразования одного вещества, не затрагивая другие составные части обрабатываемого материала.

Поэтому при биотехнологическом производстве фармацевтической продукции не возникает побочных соединений и применение ферментов лежит в основе экологически чистых промышленных технологий.

В настоящее время описано более 3000 ферментов. Около пятидесяти из них будут иметь в ближайшее время прикладное значение. В современных технологических процессах наибольшее значение имеют гидролитические ферменты. Они осуществляют ферментативные реакции без кофакторов и коферментов. Во многих производствах гидролазы заменили процесс кислотного гидролиза на ферментативный, продукты которого содержат минимальное количество посторонних веществ и не требуют специальных методов очистки. К этому ряду ферментов относятся амилазы и глюкоамилазы, целлюлазы, -галактозидаза, расщепляющая лактозу на глюкозу и галактозу.

Иммобилизованные ферменты можно применять многократно в непрерывном технологическом режиме.

Кроме иммобилизованных ферментов находят применение иммобилизованные микробные клетки. В жизнеспособных клетках ферменты более стабильны, чем в препаратах, они представляют собой целые полиферментные системы.

Одним из ведущих направлений фармацевтической индустрии, имеющим уже сегодня реальные достижения, является ферментативный синтез аминокислот, пептидов, нуклеотидов. В этих процессах, как правило, используют доступные метаболические предшественники. Например, при синтезе L-аспарагиновой кислоты таким веществом является фумаровая кислота, реакция осуществляется аспартазой. Для получения L-лизина источником служит отход химической промышленности DL--амино-капролактам.

Переворот в технологическом процессе получения полусинтетических пенициллинов произошел после выделения и иммобилизации пенициллинамидазы. Применение этого фермента позволило сначала получить 6-аминопенициллановую кислоту. Благодаря специфичности фермента обеспечивается высокая точность при гидролизе. Многие ферменты используются для анализа фармацевтических препаратов.

Пируваткиназа применяется для определения глицерина и фосфосодержащих метаболитов, глутаматдекарбоксилаза – для определения глутаминовой кислоты; содержание ионов аммония определяют с помощью L-глутаматдегидрогеназы. Для диагностических целей в медицине выпускают готовые препараты.

В настоящее время лидерами в области биотехнологии являются США – около 1000 биотехнологических фирм, Япония – 300, Западная Европа – 800.

В этих странах биотехнология и ее развитие поставлены на уровень государственной политики, а фундаментальные исследования в этой области отнесены к разряду приоритетных и хорошо финансируются правительствами этих стран.

Из научных учреждений России ведущее место в развитии биотехнологии занимает институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (ИБФМ). Существенный вклад в решение биотехнологических проблем внесли коллективы ВНИИ «Синтез-белок», ВНИИ биотехнологии, ВНИИА, Сибирское отделение РАН, институт молекулярной биологии РАН, институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов и др.

В России давно и хорошо известны предприятия, выпускающие биотехнологическую продукцию – антибиотики, ферменты, различные дрожжи и кормовые белки и т. д. Это же можно сказать и о предприятиях в странах СНГ. В Башкортостане примерами таких производств являются НПО «Иммунопрепарат» (г. Уфа), ББХК (г. Благовещенск) и др.

С развитием биотехнологии связаны самые большие надежды человечества:

1. Возможность точной диагностики ряда инфекционных и генетических заболеваний.

2. Значительное повышение урожайности сельскохозяйственных культур путем создания новых сортов, устойчивых к вредителям, грибковым и вирусным инфекциям и вредным воздействиям среды.

3. Создание микроорганизмов, продуцирующих различные химические соединения, антибиотики, полимеры, ферменты, аминокислоты.

4. Создание пород сельскохозяйственных животных с улучшенными наследуемыми признаками.

5. Переработка отходов промышленности и сельского хозяйства.

Но эта новая отрасль науки привела и к развитию дискуссии по следующим вопросам:

1. Не будут ли организмы, полученные методами генетической инженерии оказывать вредное воздействие на другие живые организмы или на окружающую среду?

2. Не приведет ли создание и распространение генетически модифицированных организмов к уменьшению природного генетического разнообразия?

3. Правомочно ли, используя генно-инженерные методы, изменять генетическую природу человека?

4. Следует ли патентовать животных, полученных генно-инженерными методами?

5. Не нанесет ли биотехнология вред традиционному сельскому хозяйству?

Эти и многие другие вопросы рассматривают правительственные комиссии, активно обсуждают на конференциях и в научных публикациях ученые.

1. Биотехнология как наука.

2. Основные периоды развития биотехнологии.

3. Перечислите ключевые научные открытия, послужившие толчком для развития биотехнологии.

4. Основные этапы развития микробной биотехнологии 5. Генетическая и клеточная инженерия как ключевой этап развития биотехнологии 6. История формирования и развития инженерной энзимологии.

2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУЦЕНТОВ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

ВЕЩЕСТВ

Из громадного разнообразия (более 2 млн. видов) живых организмов нашей планеты в биотехнологии исследуются для применения в качестве продуцентов и используются непосредственно лишь сотая доля процента.

Для обозначения продуцента так же, как и в других биологических дисциплинах, применяют бинарную номенклатуру, т.е. латинское название рода и вида, за которым указывают номер штамма, полученного путем селекции, например, Aspergillus awamori 16.

В настоящее время в биотехнологии в качестве продуцентов используются одноклеточные и многоклеточные организмы, построенные из клеток одного типа (бактерии, грибы, водоросли), а также клетки и ткани высших растений и животных. Объектами биотехнологии являются ферменты, нуклеиновые кислоты, простагландины, лектины, нейропептиды и различные БАВ (биологически активные вещества). В промышленной биотехнологии применяют 3 вида штаммов: 1) природные штаммы, улучшенные естественным и искусственным отбором (при производстве микробной биомассы); 2) штаммы, полученные в результате индуцированного мутагенеза; 3) генно-инженерные штаммы (обладают самой высокой генетической нестабильностью).

Промышленные штаммы должны удовлетворять следующим требованиям:

1. Безвредность для потребителя и обслуживающего персонала.

2. Высокая скорость роста биомассы и целевого продукта (БАВ) при экономичном потреблении питательной среды.

3. Направленная биосинтетическая активность при минимальном образовании побочных продуктов.

4. Генетические однородность и стабильность в отношении к субстратам и условиям культивирования.

5. Отсутствие токсических веществ в целевом продукте и промышленных стоках.

6. Устойчивость к фагам и другой посторонней микрофлоре.

7. Способность расти на дешевых и доступных субстратах, отходах пищевой и химической промышленности при высокой плотности клеток.

Только по совокупности этих и других свойств можно оценить полезность и рентабельность продуцента. Наиболее изучены и чаще Thermoanaerobacter, Bacillus, Acetobacter, Pseudomonas, Brefibacterium.

Охарактеризуем их особенности как продуцентов в биотехнологии.

Бактерии имеют очень высокую скорость размножения, их клетки делятся через 30-60 минут (некоторые виды через 8-10 минут). Они могут перерабатывать в сутки объем биомассы, превышающий массу клетки в 30раз (масса 10-12 г, объем – 10-12 мл), и за 2-4 суток способны образовывать биомассу 1010 т.

В действительности этого не происходит, так как действуют разнообразные ограничивающие факторы. Но возможности бактерий к быстрому размножению намного превосходят другие виды организмов, что является важнейшим при производстве микробного белка и БАВ. Бактерии биохимически универсальны в том смысле, что могут усваивать самые разнообразные питательные вещества и даже способны выбирать наилучшие органические соединения из смеси, поэтому могут приспосабливаться к самым разнообразным условиям существования. Например, Pseudomonas multivorans в качестве источника углерода может использовать 90 веществ, в том числе углеводы и их производные, жирные кислоты, спирты, аминокислоты и даже циклические углеводороды (фенол).

В зависимости от отношения к О2 бактерии принято делить на облигатные аэробы, факультативные анаэробы, аэротолерантные анаэробы.

Большинство продуцентов в микробной биотехнологии являются облигатными аэробами, поэтому культивирование их протекает при постоянном притоке О2, некоторые продуценты растут при низком содержании О2 (2-10%), их называют микроаэрофилами, а условия, в которых их культивируют, микроаэробными. К факультативным анаэробам относятся некоторые представители рода Bacillus, Escherichia, к аэротолерантным анаэробам – метанообразующие бактерии.

Большинство бактерий культивируют на сложных органических средах, содержащих факторы роста (витамины, аминокислоты, пурины, пиримидины). Продуценты, нуждающиеся в факторах роста, называют ауксотрофами, штаммы, не обнаруживающие эту потребность, прототрофами. Молочнокислые бактерии можно отнести к ауксотрофам.

Многие продуценты могут расти на синтетических средах, содержащих всего одно органическое вещество в качестве источника углерода. Некоторые продуценты используют в качестве источника энергии метан, метанол, метилированные амины. В микробной биотехнологии широко используется способность ряда бактерий осуществлять жизнедеятельность в результате окисления молекулярного водорода, сероводорода, аммония, нитратов, солей двухвалентного железа и некоторых других неорганических соединений. Для многих продуцентов характерен лабильный метаболизм, что выражается в способности использовать большое число разных соединений углерода, азота и др. элементов, а также переключения с одного типа питания на другой.

Большинство бактерий имеют в составе клеточной стенки пептидогликаны (состоят из N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты).

Особое значение как продуценты имеют архебактерии, древние представители прокариот. Они обитают в средах с экстремальными условиями (высокие концентрации неорганических веществ, повышенные температуры). Среди архебактерий галобактерии представляют большой интерес для биотехнологии. Они растут в среде, содержащей 20-30% NaCl (концентрированный раствор, Мертвое море), живут на сухой соленой рыбе, кожаных изделиях, имеют белки, нормальное функционирование которых происходит только при высоких концентрациях NaCl. Это палочки, кокки, квадраты, содержащие фотоактивные пигменты бактериородопсин и галородопсин. Галородопсин способен превращать электромагнитную энергию света в химическую энергию, за счет которой происходит фосфорилирование и синтез АТФ. Если пурпурные бактерии Halobacterium иммобилизовать на носителе, то при освещении можно получать электричество, АТФ и обессоливать морскую воду.

В будущем предполагают с помощью таких микропреобразователей энергии обеспечивать электричеством отдельные жилища в странах с высокой солнечной радиацией. Метаногенные бактерии широко изучаются в биотехнологии как способ получения дополнительной энергии из возобновляемого субстрата. Биологический метаногенез был известен в Китае еще во II веке до н.э. В 1911 году в г. Бирменгеме был построен завод по анаэробному разложению сточных вод. Газовый генератор превращал метан в электричество, обеспечивая жизнь целого города. В настоящее время в Китае работает более 7 млн. установок по производству биогаза. Биомассу метаногенных бактерий можно применять как концентрат витамина B12 для сельскохозяйственных животных.

Серозависимые архебактерии и термоплазмы также вызывают большой интерес биотехнологов. Они обитают в горячих и кислых водоемах, в вулканических расщелинах. Энергию получают за счет окисления Н2, S, Fe2+ сульфитов металлов. Например, Thermoproteales живут при 108 С, (не ниже 80 С), анаэробы, причем ферменты, синтезированные в их клетках, обладают высокой терморезистентностью. Основное преимущество термофильных анаэробных архебактерий состоят в следующем: 1. сокращение сроков культивирования; 2. возможность обойтись без аэрации; 3. уменьшение вероятности заражения.

Актиномицеты – группа грамположительных бактерий, клетки которых способны к ветвлению. Внешнее сходство с грибами нашло отражение в их названии («лучистые грибы», актис – луч, микес – гриб). Но фактически никакого родства с грибами, являющимися эукариотами, эти прокариотические организмы не имеют. Нити, образующие мицелий актиномицетов, имеют диаметр 0,3-1 мкм (у грибов – около 50 мкм).

Колонии многих актиномицетов окрашены различными пигментами.

Многие актиномицеты образуют плотный субстратный мицелий, врастающий в питательную среду. К антибиотикам, продуцируемым актиномицетами, относятся разнообразные химические соединения с широким спектром биологического действия: аминогликозиды, тетрациклины, актиномицины, макролиды, акзамицины.

Важнейшими продуцентами этих групп антибиотиков являются Streptomyces griseus, Saccharopolispora hisuta, Micromonospora olivoasterospora, Nocardia mediterranea.

Известно несколько основных вариантов использования бактерий для приготовления лекарств. Самый популярный основан на получении биомассы и последующем ее использовании в качестве полупродукта или же искомого препарата. Другой вариант основан на использовании биообъектов, которые накапливаются в среде выращивания. На этом принципе основано производство аминокислот, витаминов, ферментов, антибиотиков, полисахаридов.

Микробные клетки используются в качестве источника белка главным образом в кормах для животных и для микробиологических трансформаций, которые проводят с помощью растущих или даже высушенных клеток. Суть таких превращений заключается в том, что одно соединение превращают в другое, родственное по структуре, с помощью одного или нескольких образуемых клетками ферментов. В отличие от большинства небиологических химических реакций биологические превращения происходят при биологических температурах, а растворителем служит вода.

Полученные продукты отличаются высокой степенью чистоты, практически не содержат побочных продуктов. Биологическое превращение – строго специфичный процесс, т.е. каждый фермент катализирует только один вид реакции в специфическом месте молекулы субстрата. Однако при применении бактерий как продуцентов фармацевтической продукции должен быть тщательно изучен состав их липидов, так как у некоторых из них (например, у микобактерий) могут содержаться токсические компоненты. К тому же бактериальные клетки мелкие и процесс концентрирования биомассы из-за этого затруднен.

Известно около 30 видов бактерий, являющихся продуцентами различной биотехнологической продукции, в том числе и лекарственных веществ.

Источником углерода при культивировании бактерий могут служить отходы различных видов промышленности, в том числе природный и попутный газы (водород), а также метанол, этанол, пропанол. На газовых питательных средах культивируются бактерии рода Methylococcus, Pseudomonas, Methylophillus. На метаноле в Великобритании организовано производство белкового препарата прутин, содержание белка в котором 74% от сухой массы. В России разработана технология промышленного получения меприна с использованием в качестве питательной среды метанол.

В производстве белковых препаратов можно применять в качестве продуцентов и водородоокисляющие бактерии, накапливающие в клетках до 80% белка, особенно в близи химических предприятий.

Использование бактерий в качестве продуцентов белка и витаминов при производстве фармацевтической продукции имеет ряд приоритетов:

1. Возможности использования отходов пищевых и химических производств для культивирования;

2. повышенное содержание незаменимых аминокислот в бактериальных клетках по сравнению с растительными белками;

3. Высокая скорость реакции биосинтеза белка;

4. Относительно несложная технология культивирования в промышленных масштабах, независимая от сезонов и других изменяющихся условий окружающей среды;

5. Возможность направленного воздействия с помощью методов селекции на химический состав клеток для совершенствования биологической ценности целевого продукта.

Однако фармацевтическая продукция, полученная на основе клеток бактерий, должна подвергаться тщательной медико-биологической проверке для выявления канцерогенного, мутагенного, эмбриотропного действия на организм человека.

Среди грибов в качестве продуцентов лекарственных веществ применяют микромицеты (дрожжи, Penizillum, Aspergillus) и макромицеты, формирующие в процессе роста и развития плодовые тела.

Грибы имеют сходство и с растениями (верхушечный, или апикальный рост, прочная клеточная стенка, наличие вакуолей и поперечных перегородок у многих из них), и с животными (гетеротрофный тип питания, большая или меньшая потребность в витаминах, наличие хитина или хитозана, синтез гликогена). В то же время лишь грибам присуще мицелиальное строение и как следствие абсорбционный способ питания (осмотрофия). Для них известны явления дикариозиса -раздельное нахождение двух ядер в одной клетке, способных к одновременному делению и имитирующих диплоидное ядро, а также и гетерокариозиса - нахождение разнокачественных ядер в одной клетке.

Грибы имеют диаметр клеток в 3-5 раз больше, чем бактерии, и более устойчивы к фагам.

Удельная производительность ферментеров по биомассе при применении бактерий в качестве продуцентов выше, чем при культивировании грибов (для Candida lipolytica 7 г/кг·ч, для бактерий Micrococcus lactis 22 г/кг·ч). Это связано не только с высокой скоростью роста бактерий, но и со способностью окисления более широкого спектра углеводов.

В производстве спиртных напитков дрожжи представляют собой единственный промышленно используемый штамм микроорганизмов.

Помимо производства пива и вина дрожжи применяют в промышленных масштабах для получения технического спирта и глицерина, а также в качестве добавок к кормам для животных.

В качестве продуцентов используют Saccharomyces cerevisiae, Candida lipolytica. Из соединений углерода дрожжи лучше всего используют гексозы, из полисахаридов утилизируют инулин и крахмал, некоторые можно культивировать на метаноле и этаноле, органических кислотах. В качестве источника азота при производстве дрожжей применяют соли аммония (нитраты, нитриты). Большинство дрожжей растет в границах pH 3,0-8,0, оптимальная температура культивирования 28-30 С, причем пивные дрожжи имеют более широкий оптимум температуры. Спиртовое брожение у дрожжей отличается от гликолиза у высших растений лишь последними этапами (образуется этиловый спирт), что обусловлено наличием фермента пируватдекарбоксилазы, катализирующей превращение пирувата в ацетальдегид, который затем восстанавливается в этанол.

Штаммы Saccharomyu cerevisiae подразделяются на расы низового и верхового брожения. К расам низового брожения относят винные и пивные дрожжи, к расам верхового – спиртовые, хлебопекарные. Дрожжи низового брожения функционируют в производстве при 6-10 С, верховые – при 14- С. В конце брожения низовые дрожжи оседают на дно, а верховые образуют «шапку».

При культивировании дрожжей на этаноле выход по массе составляет 30% производительность ферментеров больше в 2-3 раза, чем при выращивании на n-алканах. Применение этанола для получения дрожжевой биомассы не встречает психологических возражений. В Чехии организовано производство биомассы Candida utilis на этаноле для добавления в продукты питания человека с целью улучшения их органолептических свойств.

Дрожжи используют при производстве эргостерина и -каротина. С точки зрения производства фармацевтической продукции наиболее важны продуценты родов: Aspergillus,Cephalosporium,Fusarium,Penicillum. К числу основных продуктов метаболизма их относятся антибиотики, органические кислоты и ферменты.

Для культивирования дрожжей в качестве питательной среды применяют неразветвленные углеводороды с 10-30 углеродными атомами в молекуле, т.е. жидкие фракции углеводородов нефти, а также молочную сыворотку (1 т сыворотки содержит 10 кг белка и 50 кг лактозы). В настоящее время разработана эффективная промышленная технология получения белка из молочной сыворотки методом ультрафильтрации, который применяется для получения сухого обезжиренного молока.

Жидкие отходы от этого производства (перлиат) используются далее для выращивания кормовых дрожжей. Дрожжи культивируют на метаноле и этаноле. При такой технологии препарат содержит 56-62% белков и значительно меньшее количество вредных примесей (производных бензола, аминокислот, аномальных липидов, токсинов), чем при выращивании на nпарафинах нефти.

Дрожжи по содержанию таких аминокислот, как лизин, треонин, валин и лейцин значительно превышает многие растительные белки.

Белковые препараты из дрожжевой биомассы применяются в качестве пищевых добавок. Это пивные и пищевые дрожжи Sacharomices serevisiae, Candida arborea, Candida ufilis. В США разработана рецептура приготовления сосисок из мяса индейки с добавлением 25% дрожжевого белка. В Великобритании применяют 14 видов дрожжей рода Candida для утилизации молочной сыворотки и получения биомассы, богатой белками и витаминами.. Пивные дрожжи Sacharomyces carlsbergensis содержат не менее 48% белка, 14 различных витаминов и характеризуются хорошей сбалансированностью по незаменимым аминокислотам, поэтому широко применяются в медицине и пищевой промышленности при производстве колбас в качестве заменителя казеина.

При переработке дрожжей в пищевой белок они подвергаются специальной обработке. Сначала стенки дрожжевых клеток разрушают (механическим, щелочным, кислотным воздействием или с помощью специальных ферментов), далее обрабатывают гомогенную биомассу подходящим органическим растворителем с целью освобождения от низкомолекулярных примесей и сопутствующих органических веществ.

Следующая стадия – обработка растворами щелочей для растворения белков и диализ. Очищенные с помощью таких методических приемов белки осаждают, высушивают и применяют в пищевой технологии и медицине.

Мицелиальные грибы образуют около 1200 антибиотических соединений. Наибольший интерес для клинической практики представляют пенициллины, цефалоспорины, гризеофульвин, трихотецин, фумагиллин и др. Пенициллины синтезируются определенными видами Penizillum (chrysogenium, brevicompactum, nigricans) и некоторыми видами Aspergillus (flavus, nidulans). Основным продуцентом при промышленном получении этого антибиотика является Penizillum chrysogenium, в процессе жизнедеятельности которого образуются различные формы пенициллинов, отличающиеся строением боковой части молекулы антибиотика, биологической активностью и спектром противомикробного действия.

Важнейшим продуцентом антибиотиков цефалоспоринового ряда, применяемым в фармацевтической промышленности, является Cephalosporium acremonium и актиномицет Streptococcus clavuligereus (цефалоспорин С, цефамицин С, цефалексин, цефрадин). В последние годы получены новые химические модификации цефалоспоринов (цефапарол, цефатризин, цефамандол, цефакситин).

Большие затруднения при производстве антибиотиков на основе микромицетов представляет биомасса в виде мицелия, что усложняет конструкции биореакторов и приводит к изменению гидродинамических свойств культуральной жидкости.

В качестве продуцентов в биотехнологии используют водоросли. Они медленнее растут, чем грибы. Общее содержание белка в них может достигать 40-70%, причем белки полноценные по аминокислотному составу.

При культивировании водорослей можно получить в 2-10 раз больше сухого вещества, чем при культивировании высших растений.

К макрофитам, применяемым в пищу человека относятся ульва, алария, порфира, родимения, хондрус, ундария, фурцеллярии, спирулина.

В Японии культивирование порфиры занимает 60 000 г акватории.

В нашей стране из черноморских водорослей добывают филлофору для производства иода, агар-агар производят из анфельции. Общая добыча водорослей около 3 млн. т (КНР, Япония), из них 2,2 млн т культивируют.

Спирулина добывается и культивируется в водоемах, как традиционный продукт питания на территории Мексики и Центральной Африки. В России из нее получают вкусовые и белково-витаминные добавки к овощам, консервам, соусам (содержит 9 незаменимых аминокислот). Биомассу хлореллы и спирулины применяют для замены пищевого сырья для приготовления питательных сред при культивировании микроорганизмов, клеток растений и животных. Хлорелла представляет интерес для создания искусственных экологических систем для жизнеобеспечения экипажей космических кораблей. Следует отметить, что использование водорослей в качестве компонентов пищевых продуктов связано с рядом технологических проблем: 1. необходимость удаления клеточной стенки для уменьшения количества неперевариваемых компонентов; 2. обезжиривание, так как некоторые компоненты липидной фракции придают продукту неприятный вкус; 3. детоксикация пигментированных белков.

Потенциальный продуцент биотехнологии царства животных – простейшие и различные группы почвенных беспозвоночных (дождевые черви и др.).

Хотя простейшие в настоящее время не используются в промышленном масштабе ни для производства биомассы, ни для синтеза биологически активных веществ, они наряду с другими микроорганизмами играют большую роль в биологической очистке сточных вод фармацевтических предприятий. Простейшие относятся к числу нетрадиционных объектов биотехнологии. настоящее время они лишь завоевывают себе место в исследовательской работе и микробиологической промышленности как продуценты БАВ. При этом рациональнее использовать свободноживущих простейших. Они являются важной составной частью геологических пород, почвы, пресных и морских вод, некоторые продуцируют целлюлазный мультиферментный комплекс.

Трипаносома стала первым продуцентом противоопухолевого препарата круцина (Россия, Франция), обладающего цитотоксическим эффектом при прямом контакте с опухолью.

Свободноживущий жгутиконосец Astasia longa культивируют для получения астазилида, обладающего противоопухолевым действием не через цитотоксический эффект, а при воздействии на клеточное звено иммунитета.

Эвгленовые можно рассматривать как перспективные продуценты гликанов и других гетерополисахаридов.

Важнейшие продуценты лекарственной продукции царства Лошадь, осел, Антистафилококковая плазма, Кровь 10. Змеи Антитоксические сыворотки (анти- Антигены Большинство используемых в биотехнологии продуцентов по отношению к температуре являются мезофилами: их рост и развитие происходит при температуре 25-37С. Психрофильные микроорганизмы растут при температуре 0-15С, и термофилы – при температуре 60-80С. Все биосинтетических процессов в промышленном производстве желательно использовать термофильные микроорганизмы. Отдельные термофилы растут при 110С, а в подводных выбросах сверхгорячих источников больших океанических глубин найдены микроорганизмы, развивающиеся при t 300С и под давлением.

Среди термофилов обнаружены ценные продуценты спиртов, аминокислот, ферментов, молекулярного водорода. Скорость роста и метаболическая активность у них выше, чем у мезофиллов. Ферменты, синтезируемые термофилами (протеазы), имеют высокую устойчивость к нагреванию, действию окислителей, детергентов и других неблагоприятным условиям. Применение термофилов в микробной биотехнологии (продуценты протеаз Thermus aquaticus и Termus caldophilus) позволяет снизить затраты на стерилизацию промышленного оборудования и на системы охлаждения биореакторов. Это позволит применять ферментеры без громоздких теплообменных устройств и упростить их конструкцию.

В микробиологическом синтезе для каждой культуры микроорганизмов есть оптимум, минимум и максимум pH. Большинство микроорганизмов лучше всего развивается при pH 7,0 (нейтральная среда). Ацидофильным микроорганизмам (некоторые дрожжи, плесени) необходимо иметь водородный показатель среды 1,5-4,5, базофильным – pH 8,5-9,5.

Ацидофильные формы не растут при pH выше 5,0-5,5, Thiobacillus ferrooxidans встречается в шахтных водах месторождений сульфидных минералов (pH иногда меньше 1,0). Алкалофильные бактерии растут при pH более 10 (некоторые бактерии рода Bacillus), разлагающие мочевину до аммиака. В промышленности предпочтительнее применять ацидофильные штаммы, так как посторонняя микрофлора в таких субстратах погибает и уменьшаются средства, применяемые для стерилизации.

Одним из факторов, ограничивающих рост микроорганизмов, является высокое осмотическое давление среды. К осмофильным видам относятся некоторые дрожжи (Xeromyces bisporus) и мицелиальные грибы, они могут расти на субстратах, содержащих 20% сахара и более.

В настоящее время особую значимость для производства фармацевтической продукции приобретают исследования процессов перестройки генетических программ клеток продуцентов в направлении увеличения скорости биосинтеза целевых продуктов и конверсии питательной среды методами современной генетики.

1. Преимущества использования бактерий в качестве продуцентов белка и витаминов при производстве фармацевтической продукции.

2. Биологические объекты, используемые в биотехнологии в качестве продуцентов.

3. Требования, предъявляемые к штамма микроорганизмов, используемых в промышленности.

4. Факторы, влияющие на рост микроорганизмов-продуцентов.

5. Важнейшие продуценты лекарственных веществ.

3. СЛАГАЕМЫЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА

ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ. МЕТОДЫ

КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК

Если представить любой из вариантов использования современных биотехнологий в производстве как иерархическую структуру, то биообъекты (мутанты и генно-инженерные клетки прокариот, дифференцированные клетки тканей высших растений и животных, иммобилизованные ферменты) в совокупности с управляемыми реакторами, сепараторами, системами смешивания газожидкостных потоков, флотаторами, экстракторами, абсорберами и другим оборудованием составят компоненты первой ступени этого построения.

Объединение нескольких взаимосвязанных технологических процессов и аппаратов в функциональную единую технологическую цепочку представляет собой цех фармацевтического предприятия, т.е. элемент второй ступени иерархии. Например, цех выращивания клеток меристемы женьшеня, участок отделения культурального фильтрата от биомассы коринобактерий при производстве лизина. Именно на второй ступени иерархии закладываются технологические основы создания безотходности биотехнологического производства фармацевтической продукции и оптимизации как отдельных аппаратов, так и типовых модулей.

Третья ступень иерархии: опытно-промышленная установка или же предприятие законченного цикла, где наряду с основными подсистемами присутствуют вспомогательные, а точнее общеинженерные подсистемы.

Сопоставляя структуры биотехнологического производства лекарственной продукции, можно заключить, что набор элементов на разной ступени иерархии практически одинаков. При любой поставленной цели типовой процесс предусматривает использование биообъектов, биореакторов, систем асептики, подачи пластического и энергетического материалов и разделение продуктов ферментации. Основные различия начинают выявляться со второй ступени иерархии и особенно наглядны на уровне организации вспомогательных подсистем.

Например, при производстве витамина В12, где все операции направлены на обеспечение синтетической функции биообъекта, такие подсистемы, как подача предшественника в биореактор, мембранная фильтрация для извлечения цианокобаламина из культуральной жидкости, функционально необходимы. При выращивании каллусных культур родиолы никакой необходимости в подобного рода подсистемах нет.

Среди элементной базы первой иерархической ступени есть множество как типовых, так и специфических решений, связанных с использованием разнообразных биообъектов и различиями в их потребностях к факторам пластического и энергетического обеспечения.

Эффективность производства фармацевтической продукции биотехнологическими методами зависит от всех слагаемых и общего материального и энергетического баланса. При этом следует помнить, что в биотехнологии есть два активных представителя средств производства и между ними существует взаимовлияние. Действительно, чем выше темп функционирования биообъекта, тем более высокие требования предъявляются к аппаратурному оформлению процессов с его использованием. Необходима оптимизация как биообъекта, так и процессов и аппаратов биотехнологических производств.

Общая технологическая схема производства включает:

1. подготовку посевного материала или инокулята, куда входит ряд этапов, начиная от засева пробирок и качалок колб до проведения выращивания в засевном ферментере. Все операции осуществляют в специальном цехе и при соблюдении правил микробиологических работ, в том числе и при систематической стерилизации воздуха в помещениях. Инокулят получают путем масштабирования чистой культуры продуцента.

2. подготовку питательной среды для производственного ферментера, которая включает выбор и реализацию рецептуры среды. Стерилизация должна гарантировать сохранность всех пластических и энергетических компонентов в исходном количестве и качестве. Для получения питательной среды применяют различное оборудование,причем в специальном цехе проводят и водоподготовку,включающую очистку воды.

3. подготовку ферментационного оборудования, гарантирующего сохранность от попадания в процесс контаминационной флоры.На этом этапе проводят стерилизацию всех узлов ферментеров, а также примыкающих к ним трубопроводов.

4. стадию биосинтеза, где в максимальной степени используются возможности биообъекта для получения лекарственного начала, которое накапливается внутри клетки или же секретируется в культуральную среду.При этом все производственные операции осуществляют в стерильных условиях, при определенной температуре и значении рН среды,а также в течение характерного для каждого продуцента периода времени.

5. стадию концентрирования, одновременно предназначенную и для удаления балласта;

6. стадию очистки, реализуемую за счет повтора ряда однотипных операций или же за счет набора различных препаративных приемов повышения удельной специфической активности лекарственного начала (ультрафильтрация, экстракция, сорбция, кристаллизация);

7. стадию получения конечной субстанции или готовой лекарственной формы с последующими операциями расфасовки и упаковки;

ферментация. Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в питательную среду посевного материала (инокулята) до завершения процесса роста или биосинтеза биологически активных веществ. В основе процесса ферментации лежит культивирование продуцентов, т.е. выращивание культуры микроорганизмов, клеток высших растений или плесневых грибов.

Культура микроорганизмов – это популяция микроорганизмов, выращиваемая в питательной среде и находящаяся в стадии размножения или закончившая его. При производстве лекарств и БАД применяются следующие методы культивирования.

Твердофазная поверхностная ферментация осуществляется на увлажненной, сыпучей или пастообразной среде. Рост продуцента происходит на поверхности твердых частиц, а также в порах, заполненных водой или воздухом. Типичным примером является приготовление силоса или компоста в кучах. Управляемый процесс твердофазной ферментации имеет место при производстве ферментов с помощью микромицетов.

Для поверхностного культивирования на твердых средах применяют свекловичный или виноградный жом, зерновую шелуху, пшеничные или рисовые отруби, к которым добавляются различные питательные вещества.

Оптимальная влажность субстрата 40-70%. Стерилизация осуществляется путем прямого введения пара в среду при перемешивании. Если увлажнение проводят подкисленными растворами, то стерилизация происходит 15- мин при 95 С. Обеспечение кислородом затрудняется с увеличением слоя субстрата, поэтому для каждого штамма или производства своеобразная толщина слоя питательной среды. При выращивании мицелиальных грибов перемешивание не допускается. При твердофазной поверхностной ферментации очень большая проблема - поддержание постоянной температуры во всем объеме питательной среды. Например, температура компостов увеличивается от поверхности к глубинным слоям.

Кинетика роста популяции на поверхности (пленке) отличается от глубинных условий. При твердофазном культивировании в начале роста культуры, когда в среде отсутствует градиент концентрации субстрата, все клетки в колонии могут расти с максимальной для данной среды удельной скоростью роста, т.е. по экспоненциальному закону. В центральной части субстрата рост клеток лимитирован диффузией и, таким образом, биомасса растет с максимальной удельной скоростью лишь на поверхности питательной среды.

Управляемый процесс твердофазного поверхностного культивирования применяется при производстве энзиматических лекарственных препаратов.

Рассмотрим производство амилолитических ферментов. В качестве питательной среды используют пшеничные отруби. Стерилизованную питательную среду после засева соответствующего штамма микромицета распределяют по кюветам и транспортируют в растильные камеры, где поддерживается определенная температура и влажность воздуха, а также обеспечивается вентиляция вдоль поверхности субстрата с целью аэрации.

Для Aspergillus awamori как продуцента амилаз различают 3 стадии выращивания культуры: 1. Рост до начала прорастания конидий (t - 32 С, 100% влажность воздуха); 2. Стадия интенсивного прироста биомассы при t 27С; 3. На третьей стадии прекращают подачу в камеру кондиционированного воздуха. Общая продолжительность процесса 42 часа.

Существенным недостатком этого метода является наличие больших производственных площадей, трудность автоматизации технологического процесса. В настоящее время разработаны типы механизированных растительных установок, которые в той или иной мере устраняют указанные недостатки кюветного способа. Применяют выращивание биомассы микромицетов на специальных лотках, установленных на движущемся транспортере, причем каждый лоток имеет специальный воздуховод и ворошитель.

При выращивании микроорганизмов глубинным методом клетки суспендированы в жидкости и находятся во взвешенном состоянии. В условиях лаборатории в колбы,( 50-250мл) наливают жидкую питательную среду, в которую засевают чистую культуру (из ампул ), затем ее помещают на сутки в термостат с определенной температурой, где она растет и размножается. Аэробные продуценты выращивают в специальных колбах на качалках в термокамере. Вот этот пример является периодическим глубинным культивированием, т.е. рост продуцента осуществляется в закрытой системе (обмен газами, теплом), но питательная среда и посевной материал не вводятся в процессе роста продуцента.

При периодическом культивировании выделяют несколько фаз в развитии культуры.

Управляемый процесс твердофазного поверхностного культивирования применяется при производстве энзиматических лекарственных препаратов.

Рассмотрим производство амилолитических ферментов. В качестве питательной среды используют пшеничные отруби. Стерилизованную питательную среду после засева соответствующего штамма микромицета распределяют по кюветам и транспортируют в растильные камеры, где поддерживается определенная температура и влажность воздуха, а также обеспечивается вентиляция вдоль поверхности субстрата с целью аэрации.

Для Aspergillus awamori как продуцента амилаз различают 3 стадии выращивания культуры: 1. Рост до начала прорастания конидий (t - 32 С, 100% влажность воздуха); 2. Стадия интенсивного прироста биомассы при t 27С; 3. На третьей стадии прекращают подачу в камеру кондиционированного воздуха. Общая продолжительность процесса 42 часа.

Существенным недостатком этого метода является наличие больших производственных площадей, трудность автоматизации технологического процесса. В настоящее время разработаны типы механизированных растительных установок, которые в той или иной мере устраняют указанные недостатки кюветного способа. Применяют выращивание биомассы микромицетов на специальных лотках, установленных на движущемся транспортере, причем каждый лоток имеет специальный воздуховод и ворошитель.

При выращивании микроорганизмов глубинным методом клетки суспендированы в жидкости и находятся во взвешенном состоянии. В условиях лаборатории в колбы,( 50-250мл) наливают жидкую питательную среду, в которую засевают чистую культуру (из ампул ), затем ее помещают на сутки в термостат с определенной температурой, где она растет и размножается. Аэробные продуценты выращивают в специальных колбах на качалках в термокамере. Вот этот пример является периодическим глубинным культивированием, т.е. рост продуцента осуществляется в закрытой системе (обмен газами, теплом), но питательная среда и посевной материал не вводятся в процессе роста продуцента.

При периодическом культивировании выделяют несколько фаз в развитии культуры.

1. Латентная фаза. Культура микроорганизмов осваивает питательную среду, заметного увеличения числа клеток не происходит. В этот период перестраивается метаболизм клетки, синтезируются ферменты, необходимые для использования новых субстратов, активируется биосинтез белка.2.Фаза ускорения роста культуры отличается тем,что митотическая активность клеток продуцента возрастает и плотность клеток в реакторе возрастает.

3. Фаза экспоненциального роста характеризуется быстрым накоплением биомассы и продуктов метаболизма. При этом запас питательных веществ в среде в оптимальной концентрации, увеличение числа клеток пропорционально времени, т.е. линейный рост культуры.

4. Фаза замедления роста – это непродолжительный период, в течение которого скорость роста культуры снижается, что связано с накоплением токсических продуктов метаболизма и расходованием питательных веществ среды.

5. Стационарная фаза – это скорость прироста биомассы полностью компенсируется скоростью гибели и лизиса клеток.

6. Фаза отмирания культуры – характеризуется полным истощением субстрата, накоплением веществ, ингибирующих рост, скорость прироста биомассы равно нулю.

При производстве лекарственных препаратов важную роль играет любая фаза. Так, при производстве первичных метаболитов важно сокращение до минимума латентной фазы и увеличение экспоненциальной фазы.

Продолжительность латентной фазы зависит от состава питательной среды, возраста и массы инокулята. Перенос клеток из одной среды в другую, резкое изменение условий при масштабировании может оказывать на продуцент разностороннее воздействие. Системы контроля и регуляции ферментативной активности включают и адаптационные механизм, т.е., сталкиваясь с новыми питательными веществами, клетки начинают усваивать их только после синтеза ферментов.

Первичные метаболиты синтезируются в экспоненциальной фазе (нуклеотиды, ферменты, витамины), в стационарной фазе и фазе отмирания вторичные метаболиты ( антибиотики, красящие вещества).

При непрерывном культивировании процесс постоянно протекает в экспоненциальной фазе, нет смены фаз развития культуры, как при периодическом культивировании (можно сравнить с оранжереей, где вегетация и плодоношение растений идет в течение всего года). Можно сказать, что при непрерывном культивировании жизнедеятельность культуры продлевается за счет постоянной подачи питательной среды и отбора культуральной жидкости, вместе с которой из реактора удаляются и токсические метаболиты.

Непрерывное культивирование может осуществляться в условиях крупнотоннажного производства в каскаде реакторов. Впервые данный метод был применен в 1915 году при производстве спирта, в 1940 году – для получения ацетона. В настоящее время в фармацевтическом производстве применяются следующие разновидности непрерывного культивирования продуцентов.

Одноступенчатое (в При гомогенно проточном процессе параметры постоянны во времени во всех реакторах. Основным принципом непрерывного процесса культивирования является равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и убылью в результате разбавления свежей питательной средой, причем объем заполнения ферментера остается постоянным.

При непрерывном культивировании микроорганизмов необходимо отрегулировать такую скорость притока питательной среды и вытекания культуральной жидкости из системы, чтобы предотвратить вымывание клеток из системы, т.е. концентрация клеток должна быть постоянной.

В стерильных условиях непрерывный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время.

При многостадийном непрерывном культивировании нарушение режима одного реактора влечет за собой выход из строя всей установки. Поэтому многостадийные непрерывные процессы требуют надежной системы стерильности и контроля, сложной конструкции реакторов. Длительное протекание непрерывных процессов приводит к обрастанию труб и стенок реактора прилипающими клетками или гифами мицелия. В этом случае процессы автоселекции протекают особенно интенсивно, и возникает проблема появления рекомбинантных мутантов.

При непрерывном культивировании поддержание состояния динамического равновесия в реакторе осуществляется двумя методами хемостатным и турбидостатным.

По турбидостатному принципу в системе поддерживается определенная концентрация биомассы, а по хемостатному принципу – постоянная концентрация одного из компонентов среды (углерода, кислорода, витамина и др.). Известен также метод регулирования роста культуры по значению pH (pH-стат).

При турбидостатном методе регулирования контролируется концентрация суспензии выходящей жидкости, создаваемая микробными клетками.

Хемостатный способ контроля осуществляется по входящему потоку.

Метод хемостатного регулирования непрерывного культивирования применим ко всем типам микроорганизмов и клеткам различных тканей животных или растений, которые могут расти в гомогенной перемешиваемой культуре. Биореактор, работающий в хемостатном режиме имеет: а) устройство для вливания питательной среды; б) выпускное приспособление для оттока культуральной жидкости; в) систему контроля скорости протока.

Регулирование хемостатным способом предполагает перемешивание. Это означает, что при добавлении малых объемов среды, время, необходимое для того, чтобы вещество гомогенно распределилось по всей культуре, должно быть минимальным. Если перемешивание будет недостаточное, то в ферментере образуются области, скорость разбавления в которых будет отличаться от средней скорости разбавления. Такие отклонения называют «эффектом аппаратуры». Продуценты фармацевтической продукции могут прилипать к поверхности ферментеров при непрерывном культивировании в течение длительного времени (месяцы), и наблюдаеся так называемый пристеночный рост, который может приводить к массивным обрастаниям поверхности ферментера. Чтобы поддержать в реакторе действительно гомогенные условия, нужно эти процессы свести к минимуму. Прилипание биомассы можно предотвратить силиконированием стенок и чисткой ферментера или применением оболочек из тефлона. Таким образом, хемостатный режим регулирования непрерывного культивирования дает возможность изменять скорость роста биомассы, не производя в окружающей среде никаких изменений, кроме увеличения или уменьшения концентрации лимитирующего фактра среды.

Хемостатный режим успешно применяется при малом протоке питательной среды, когда концентрация клеток изменяется незначительно.

Для турбидостатного режима непрерывного культивирования характерны высокие скорости разбавления и резкое изменение концентрации биомассы.

Этот режим применяется лишь при выращивании одноклеточных организмов.

Турбидостатный контроль с помощью фотоэлемента оправдывает себя, если при изменении скорости разбавления концентрация биомассы меняется быстро. Если скорость изменения концентрации биомассы незначительна, то турбидостатный контроль оказывается недостаточно чувствительным, чтобы поддерживать скорость разбавления культуры на постоянном уровне. В случае длительного культивирования применение турбидостата может приводить к прилипанию организмов к поверхности фотоэлементов. В настоящее время контроль при турбидостатном регулировании осуществляется не только с помощью фотоэлемента, но и другими средствами, чувствительными либо к продуктам биосинтеза, либо к диоксиду углерода.

Турбидостатный контроль можно осуществить и с помощью pHэлектрода в том случае, если в культуральной жидкости образуются органические кислоты. Для турбидостатного контроля можно также измерять концентрацию растворенного О2 с помощью специального электрода.

Непрерывный процесс можно использовать в производстве лекарственной продукции только в том случае, когда культура при длительном выращивании не теряет способности к синтезу, т.е. генетически устойчива и однородна.

Характеризуя непрерывное культивирование, надо отметить, что высокая продуктивность процесса может быть достигнута при большем значении D (скорости разбавления), а это может быть связано с выносом неутилизированного субстрата. Поэтому данный метод далеко не всегда можно применять, например, в производстве антибиотиков и других препаратов медицинского назначения.

Для штамма Brechibacterium flavium 22 (производство лизина) экономическая эффективность при непрерывном режиме в 6 раз выше, чем при периодическом культивировании.

1. Слагаемые биотехнологического процесса производства лекарственных средств.

2. Основные этапы общей технологической схемы производства.

3. Процесс ферментации. Общая характеристика.

4. Методы культивирования.

5. Периодическое культивирование: определение, типы периодического культивирования.

6. Непрерывное культивирование. Характеристика, виды непрерывного культивирования.

7. Фазы развития культуры при периодическом культивировании.

8. Методы поддержания состояния динамического равновесия в реакторе при непрерывном культивировании.

4. ПОЛУЧЕНИЕ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА, ВЫДЕЛЕНИЕ,

КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ, ОЧИСТКА, СТАНДАРТИЗАЦИЯ, СУШКА И

КОНТРОЛЬ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ

Для получения посевного материала используют исходную музейную культуру продуцента, которая поступает в заводскую лабораторию из научно-исследовательского института или с посевной станции.

Как правило, посевной материал, содержащий молодые, растущие клетки микроорганизмов на начальной стадии спорообразования (споры, конидии) поступает в пробирках на скошенных агаровых средах или в виде чистых культур в ампулах.

Каждая производственная культура имеет паспорт, в котором указаны продуцент и его коллекционный номер, серия и дата изготовления, средняя активность серии и срок годности. В паспорте представлена характеристика среды для выращивания и хранения культуры. Полученный посевной материал подвергают тщательному микробиологическому и биохимическому контролю, так как от его активности и чистоты зависит дальнейший производственный цикл.

В зависимости от вида продуцента, его физиолого-биохимических способностей приготовление посевного материала (до стадии производственной ферментации) проходит в несколько этапов: исходная культура скошенная агаровая среда выращивание на качалке в колбах на жидкой питательной среде (одна или две стадии) посевные аппараты (одна, несколько стадий) стадия производственной ферментации.

Исходную культуру при оптимальных температурах выращивают в пробирках на скошенной агаровой питательной среде. Для микроскопических грибов, актиномицетов продуценты культивируют до наступления оптимального спорообразования (72-120 час), для бактериальных культур фаза устанавливается экспериментально.

Выращенную культуру (1-5% от объема) с поверхности скошенной агаровой среды стерильно смывают водой и переносят в колбы Эрленмейера на 750 мл, содержащие 50-100 мл жидкой питательной среды. Засеянные колбы выращивают на качалке (120-240 об/мин) при температуре 28-30С в течение 18-36 часов, т.е. глубинным способом, что увеличивает скорость роста культуры. Все стадии роста продуцента контролируют по морфологическим показателям микроорганизмов. При этом установлено, что наилучшие результаты дает культура, которая находится в стадии физиологической зрелости.

Готовую культуру стерильно переносят в посевной аппарат (малый инокулятор) с предварительно простерилизованной питательной средой.

Посевной аппарат оснащен мешалкой, аэрирующим устройством, а также контрольно-измерительной аппаратурой для регулирования рН среды, температуры и степени аэрации.

Масштабирование при получении инокулята желательно осуществлять тогда, когда рост популяции происходит с максимальной скоростью, т.е. в экспоненциальной фазе.

Процесс выделения и очистки представляет собой ряд последовательных технологических операций, количество которых возрастает с повышением желаемой чистоты конечного продукта.

Культуральная жидкость весьма чувствительна к различным воздействиям, поэтому наблюдаются потери при выделении лекарственных соединений. Она представляет собой сложную многофазную систему, содержащую от 1 до 5% и более сухого вещества, отдельные микробные клетки или мицелий, продукты биосинтеза и остатки питательной среды. Как правило, выделение конечного продукта связано с определенными трудностями и в основном зависит от предварительной очистки нативного раствора.

Первой стадией подготовки кулътуральной жидкости для дальнейшей переработки является отделение взвешенной фазы или микробной массы, в состав которой входят микроорганизмы, продукты их жизнедеятельности, а также остатки неиспользованной питательной среды.

Седиментацию применяют в качестве метода выделения в тех случаях, когда диаметр осаждаемых частиц более 3 мкм, продукты достаточно стабильны и различные фракции осаждаемых продуктов содержат БАВ, необходимые для производства фармацевтической продукции.

Применяют несколько видов коагуляции: неорганическими солевыми электролитами, органическими и неорганическими кислотами, термической обработкой, добавлением веществ, образующих наполнители. Процесс коагуляции улучшается при использовании комбинированных методов: кислотное и тепловое, электролитное и тепловое воздействие.

Эффективным методом коагуляции дисперсных систем является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами – флокулянтами.

При этом в отличие от обычной коагуляции образуются флокулы или осадки рыхлой структуры, что значительно улучшает процесс фильтрации.

Более прогрессивным методом разделения является метод центрифугирования, в основе которого лежит разделение неоднородных систем под воздействием центробежных сил в центрифугах. Основное преимущество центрифугирования по сравнению с другими методами обработки неоднородных систем (отстаиванием и фильтрованием) заключается в увеличении производительности разделения, и производительность современных центрифуг непрерывного действия достигает сотен м3/ч. С помощью центрифугирования удается выделить из суспензий частицы размером до сотых долей микрометра.

Центрифугирование широко применяется в биотехнологических производствах лекарственной продукции, прежде всего для выделения из культуральной жидкости меристемы растений, биомассы дрожжей, бактерий, грибов, отделения различных продуктов микробиологического синтеза (антибиотиков, ферментов, витаминов и т.п.), переведенных предварительно в твердую фазу, а также для разделения эмульсий, образующихся при экстракции.

В биотехнологическом производстве лекарственных веществ сепараторы являются одним из самых распространенных типов центрифуг. По способу работы они делятся на три группы:

1.Сепараторы непрерывно-циклического действия, обеспечивающие разделение жидких смесей с непрерывным выводом из барабана текучих фракций и периодической ручной выгрузкой осадка из барабана;