Федеральное государственное бюджетное учреждение

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток

имени И. И. Мечникова

Российской академии медицинских наук

на правах рукописи

Буркин Максим Алексеевич

УПРАВЛЕНИЕ ЭПИТОПНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ

ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ

СОЕДИНЕНИЙ

14.03.09. – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2013 2

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Основные подходы и принципы формирования специфичности иммунохимического анализа низкомолекулярных соединений Мультиплексный и группоспецифический иммуноанализ 1.1. Селективные тесты 1.2. Дизайн иммуногена 1.3. Подходы к получению и селекции эпитоп-специфических антител 1.4. 1.4.1. Аффинная хроматография 1.4.2. Гибридомная технология 1.4.3. Технология дисплея 1.4.4. Коррекция профиля перекрестного взаимодействия малых молекул для формирования специфичности иммуноанализа

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. Материалы и методы 2.1. Материалы и реактивы 2.1.1. Антибиотики 2.1.2. Макромолекулярные носители 2.1.3. Реактивы 2.1.4. Вакцинные препараты 2.1.5. Объекты экспертизы 2.1.6. Животные 2.1.7. Оборудование Методы 2.2. 2.2.1. Методы синтеза конъюгированных молекул по функциональным группам гаптена 2.2.1.1. Аминогруппы 2.2.1.1.1. Карбодиимидная конденсация 2.2.1.1.2. Восстановительное аминирование альдегидов 2.2.1.1.3. Глутаральдегидный метод 2.2.1.1.4. Реакция с эпоксидами и оксиранами 2.2.1.2. Карбоксильные группы 2.2.1.2.1. Карбодиимидная конденсация 2.2.1.2.2. Метод активированных эфиров 2.2.1.3. Фенильные и резорциловые группы 2.2.1.3.1. Метод формальдегидной конденсации 2.2.1.4. Альдегидные группы 2.2.1.4.1. Восстановительное аминирование 2.2.1.4.2. Реакция с гидразидами 2.2.1.5. Гликольные группы 2.2.1.5.1. Метод периодатного окисления 2.2.2. Методы модификации носителя 2.2.2.1. Сукцинилирование 2.2.2.2. Аминирование 2.2.3. Введение спейсера 2.2.3.1. Этилендиамин 2.2.3.2. Янтарный ангидрид 2.2.3.3. Глутаровый альдегид 2.2.3.4. Гександиамин 2.2.3.5. Дигидразид адипиновой кислоты 2.2.3.6. Диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола 2.2.4. Спектрофотометрический анализ 2.2.5. Гибридомная технология 2.2.6. Иммуноферментный анализ 2.2.7. Аффинная хроматография 2.2.7.2. Выделение (истощение) антител на аффинных сорбентах 2.2.8. Высокоэффективная жидкостная хроматография

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Изучение влияния дизайна конъюгированных антигенов на специфичность определения антибактериальных соединений в ИФА на Фторхинолоны Тетрациклины Аминогликозиды Гликопептиды Глава 4. Контроль вакцинных препаратов. Оценка остаточного Глава 5. Определение концентрации эремомицина в плазме крови добровольцев при исследовании фармакокинетики препарата Глава 6. Использование разработанных ИФА для мониторинга

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДГ - дигидразид адипиновой кислоты АМ – амикацин АП – апрамицин БАТ-А – ботулинический анатоксин типа А БТ – бацитрацин ВКМ – ванкомицин ГА – глутаровый альдегид (конъюгированный посредством глутаральдегида) ГДА – 1,6-гександиамин ГО – глюкозооксидаза ГСИ – N-гидроксисукцинимид ГМ – гентамицин ГП – 1- кислый гликопротеин из бычьей плазмы ГФ – гемифлоксацин ГЦУ – гемоцианин лимфы улитки (KLH, keyhole limpet hemocyanin) ДГСМ – дигидрострептомицин ДГЭ - диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола ДМН – десмикозин ДМСО – диметилсульфоксид ДМФА – диметилформамид ДОС – дезоксистрептамин ДЦ – доксициклин Жел – желатина ИФА – иммуноферментный анализ КББ – 0.05 М карбонат-бикарбонатный буфер, рН 9. КДИ – 1-этил-3-(3-диметил-аминопропил) карбодиимид (КДИ конденсация) КЛИН – клиндамицин КМ – канамицин КМО – карбоксиметилоксим КГГ – гаммаглобулин кролика КСА – кроличий сывороточный альбумин ЛеФ – левофлоксацин ЛИН – линкомицин ЛМ – левомицетин (хлорамфеникол (ХАФ)) ЛМг – левомицетин глюкуронид ЛМо – левомицетин основание ЛМс – левомицетин сукцинат ЛПС – липополисахарид ЛоФ – ломефлоксацин ЛЦ – лимециклин МДУ – максимальный допустимый уровень МеЦ – метациклин МиЦ – миноциклин НА – неамин НК – налидиксовая кислота НМ – неомицин НФ – норфлоксацин ОМТ – О-микаминозилтилонолид ОТЦ – окситетрациклин ОФ – офлоксацин ПАФ – полный адъювант Фрейнда ПФ – пефлоксацин ПИ – периодат натрия (окисленный периодатом натрия углевод) ПР – перекрестная реактивность ПХ – пероксидаза хрена РИСТ – ристомицин А РС – рибостамицин РТЦ – ролитетрациклин СЗМ – сизомицин СМ – имитатор молока СПИР – спирамицин СПМ – спектиномицин СТМ – стрептомицин СФ – спарфлоксацин ТАФ – тиамфеникол ТИЛ – тилозин ТМ – тобрамицин ТМН – тилмикозин ТПЛ – тейкопланин А ТФ – трансферрин человека ТХУ – трихлоруксусная кислота ТЦ – тетрациклин Ф – формальдегид (формальдегидная конденсация) ФФ – флорфеникол Фет – фетуин ФСБ-т – фосфатно-солевой буфер, содержащий 0.05% твин 20, рН 7. ФХ – фторхинолоны ХАФ – хлорамфеникол (левомицетин (ЛМ)) ХТЦ – 7-хлортетрациклин ЦФ – ципрофлоксацин ЭДА – 1,2-этилендиамин ЭФ – энрофлоксацин ЭРМ – эремомицин ЯА – яичный альбумин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Огромное число низкомолекулярных физиологически активных соединений являются важными эндогенными субстанциями организма, используются в качестве лекарственных средств или же, напротив, токсичны и неблагоприятно влияют на здоровье человека, домашних и диких животных, растения и экосферу в целом и, в связи с этим являются предметом пристального внимания и изучения. Особое место среди этих соединений занимают антибиотики, которые служат терапевтическим средством в медицине и ветеринарии, используются для профилактики инфекционных заболеваний и стимуляции роста животных и растений, а также могут присутствовать в качестве контаминантов в продукции животноводства, воде, загрязнять почву, проникать в растения. Создавая определенный фон в окружающей среде, эти соединения оказывают влияние на экологию, способствуют селекции резистентных микроорганизмов, являются фактором, изменяющим иммунологическую реактивность населения, вызывают аллергические реакции. Рост антибиотикорезистентности среди патогенной микрофлоры вызывает серьезную обеспокоенность у клиницистов и требует создания новых активных препаратов, оптимизации и контроля за применением существующих лекарственных соединений (Страчунский Л. и др. 2002;

Волосовец А. и др., 2007; Heuer H. et. al, 2011; Wright G. 2012; WHO, 2012).

Анализ, использующий антитела в качестве специфического детектора таких соединений, остается наиболее чувствительным, сравнительно недорогим и широко используется в медицинской диагностике, для проведения лекарственного и экологического мониторинга, контроля качества продуктов питания и ветеринарно-санитарного контроля, в научных исследованиях и смежных областях. Высокая чувствительность и возможность выявления определенного антибиотика среди других соединений с антибактериальной активностью выгодно отличают иммунохимические методы анализа от рутинно возможность получения ложнопозитивных результатов из-за перекрестных взаимодействий антител с близкими структурными аналогами основного аналита, его производными или метаболитами ограничивает применение иммуноанализа как количественного теста и требует подтверждения позитивных результатов более трудоемкими и дорогостоящими физикохимическими методами. В связи с этим иммунохимические методы анализа используются в качестве скрининговых тестов.

В последние годы заметно возрос интерес к скрининговым методам, обладающим групповой специфичностью. Используя способность антител перекрестно взаимодействовать со структурно сходными соединениями, этот вид иммуноанализа позволяет выявлять целый аналитов ряд в одном тесте.

Создание таких экономически выгодных систем анализа исключительно актуально в настоящее время, о чем свидетельствуют целенаправленные разработки и публикации последних лет (Loomans E. et al., 2003; Pastor-Navarro N. et al., 2007; Wang Z. et al., 2007; Cao L., et al., 2009; Guo Y. et al., 2010).

чрезвычайно важную роль и определяет аналитические характеристики метода – селективность или групповое распознавание. Непростая проблема, стоящая перед разработчиками диагностикумов с такими характеристиками заключается в необходимости создания аналитического инструмента, способного улавливать соединениями. Создание иммуноанализа с групповой или избирательной (абсолютной) специфичностью, предполагает приготовление (селекцию) индивидуальным эпитопам соединения.

Направленность иммунного ответа к низкомолекулярному соединению определяется конструкцией молекулы иммуногена, дизайн которого должен способствовать индукции антител к интересующему эпитопу на молекулемишени. Однако, иммунная реакция организма на любой антиген поливалентна и затрагивает разные эпитопы антигена.

Современные подходы, основанные на гибридомной технологии и технологиях дисплея, позволяют из огромного репертуара потенциальных кандидатов селекционировать продуцент антител, направленных к целевому эпитопу. Тем не менее, успех обоих подходов основан на проведении трудоемкого многоэтапного скрининга, а достижение желаемого результата остается делом случайным. Возможности аффинной хроматографии поликлональных антител также могут обеспечить выделение фракций антител необходимой эпитопной специфичности, однако, из-за низкого выхода и плохой стабильности выделенных антител данный подход остается малопригодным для практики.

В настоящем исследовании для отбора эпитоп-специфических антител нами предложен альтернативный подход. Принципиальным его отличием от рассмотренных технологий селекции антител является подбор структуры антигена, с которым способна связаться только часть из всего репертуара антител сыворотки, которая и определяет эпитопную специфичность анализа.

При этом разделения и фракционирования исходного препарата, влияющих на активность и стабильность антител, не требуется. Репертуар специфичности антител сыворотки остается постоянным и может быть пригоден для создания тестов с разной эпитопной специфичностью, формируемой с помощью антигенов различного дизайна. Панель конъюгированных антигенов с экспозицией разных ключевых эпитопов гаптена, полученных в результате структурного моделирования конъюгатов гаптенноситель, позволяет варьировать условия связывания пула поликлональных антител и таким образом видоизменять и управлять специфичностью анализа.

Создание и использование в иммуноанализе гетерологичных конъюгатов (структурно отличных от иммуногена) – известный прием для улучшения чувствительности анализа низкомолекулярных соединений, неоднократно описанный в литературе (Schneider P. et al,, 1992; Sato H. et al., 1996; Kim Y. et al., 2003; Zhang Y. et al., 2007; Chen Y. et al., 2007; Zhang Q. et al., 2008; Wang Z.

et al, 2011 и др.). Тем не менее, лишь в единичных работах отмечался факт изменения профиля перекрестной активности структурных аналогов в гетерологичном формате анализа (Dumont V. et al. 2006; Fodey T. et al., 2007;

Zhang Q. et al 2008;).

Возможность управления перекрестной реактивностью с целью создания селективных или группо-специфичных иммунохимических тестов для определения малых молекул является актуальным фундаментальным вопросом, иммунодиагностики. Использование антибиотиков нескольких химических групп обеспечивают широкие возможности для структурного моделирования антигенов и позволяют оценить эффективность предлагаемого подхода многосторонне и выявить закономерности. Распространенное использование сконструированных систем анализа на самых различных объектах и определить сферу их практического применения.

Цель работы – экспериментальное обоснование возможности управления эпитопной специфичностью иммуноанализа низкомолекулярных соединений посредством структурной модификации конъюгированных антигенов и использование этого подхода для группового и избирательного определения антибактериальных препаратов.

Задачи исследования:

Создать панель реагентов для иммунохимической детекции антибиотиков различных фармакологических групп: синтезировать конъюгированные антигены на основе антибиотиков, получить специфичные к ним иммунные сыворотки и моноклональные антитела.

Разработать на основе приготовленных иммунореагентов варианты иммуноанализа для группового/селективного определения антибиотиков и изучить их аналитические характеристики.

Оценить вклад структуры иммуногена в спектр специфичности антител и влияние структурного дизайна иммобилизованного антигена на параметры специфичности анализа.

Провести сравнительный анализ характеристик иммуноферментных тестов на основе моноклональных и поликлональных антител.

Исследовать влияние матрикса вероятных объектов экспертизы на иммунохимическую реакцию, разработать процедуру пробоподготовки исследуемых объектов и адаптировать разработанные тесты для их анализа.

биологических жидкостях организма при фармакокинетических исследованиях, а также в продуктах питания животного происхождения.

Научная новизна Впервые предложен и экспериментально обоснован подход, позволяющий управлять эпитопной специфичностью иммуноанализа антибактериальных соединений на основе поликлональных антител посредством презентации ключевых эпитопов на конъюгированных антигенах.

Экспериментально доказано, что принцип предложенного подхода разделении антисыворотки к рибостамицину на аффинных сорбентах с гетерологичными гаптенами апрамицином и неомицином. Установлено, что фракции антител несвязанных с сорбентом отличны от исходной антисыворотки по профилю перекрестной активности со структурными аналогами.

Показано, что дизайн иммобилизованного антигена влияет на характер специфичности иммуноанализа, позволяет настраивать его как на селективность в отношении основного аналита, так и на групповое распознавание ряда соединений. Выявлено, что на профиль перекрестнореагирующих соединений оказывает влияние главным образом тип гаптена, входящего в структуру конъюгата, тогда как метод синтеза и сайт конъюгирования имеют второстепенное значение, а наличие и длина спейсера не являются значимыми факторами.

Впервые показано, что эквивалентная перекрестная активность структурных аналогов тилозина и тилмикозина позволяет проводить их совместное количественное определение.

Впервые синтезированы конъюгированные антигены гликопептидных антибиотиков эремомицина и ристомицина, макролида кларитромицина, соединений группы фторхинолонов гемифлоксацина и спарфлоксацина, к ним получены антитела и созданы иммуноферментные системы анализа этих соединений.

Предложены оригинальные способы синтеза конъюгированных антигенов на основе фторхинолонов (формальдегидная конденсация), тетрациклинов (взаимодействие с периодат-окисленным гликопротеином по амидной группировке), аминогликозидов (периодатное окисление рибостамицина, глутаральдегидная полимеризация неомицина) и амфениколов (конъюгирование глюкуронида левомицетина методом активированных эфиров). Продемонстрирована эффективность их использования.

Показано, что иммунореагенты на основе конъюгированных антигенов с множественной ориентацией гаптена, обеспечивают селективность анализа. Подтверждением являются разработанные иммуноанализы аминогликозидов гентамицина, канамицина, неомицина, апрамицина и стрептомицина.

Разработаны тесты группового иммуноферментного определения тетрациклинов (тетра-, хлортетра-, окси- и доксициклина с перекрестной активностью в диапазоне 100-25%), аминогликозидов (нео-, кана- и гентамицина, 100-9%), фторхинолонов (энро-, ципро-, геми-, пе-, нор, о-, ломе-, лево- и спарфлоксацина, 108-9%), макролидов (кларитро-, рокситрои эритромицина, 150-100%, тилозина, тилмикозина, (100%), тилозина, спиромицина, 100-50%) линкозамидов (клиндамицина и линкомицина, 111-100%) и гликопептидов (ристо-, ванко-, эремомицина и тейкопланина, 100-37%) с показателями групповых характеристик, не уступающими и даже превосходящими описанные в литературе для аналогичных систем анализа.

Впервые созданный иммуноферментный анализ эремомицина позволил изучить фармакокинетические параметры этого нового гликопептидного антибиотика после его инфузионного введения здоровым добровольцам и установить корреляцию с данными высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Практическая значимость Разработанный подход для регулирования специфичности иммуноанализа дает возможность более эффективно использовать потенциал иммунореагентов, позволяя на основе одного препарата антител создавать как селективные, так и групповые тесты.

Разработанные оригинальные схемы синтеза конъюгированных антигенов могут служить основанием для дальнейших работ по конструированию конъюгатов соответствующих гаптенов.

Разработаны методы иммуноферментного анализа антибиотиков фармакологических групп – с групповым распознаванием фторхинолонов, тетрациклинов, линкозамидов, аминогликозидов, 14-членных макролидов, макролидов с 16-членным лактонным кольцом, гликопептидов подгрупп ванкомицина и ристомицина, а также селективным распознаванием гемифлоксацина, левомицетина, канамицина, гентамицина, неомицина, апрамицина, стрептомицина, тилозина, эремомицина, тейкопланина и ристомицина с чувствительностью на нанограмовом уровне.

Применение разработанных тест-систем позволило выявить в ряде образцов вирусных вакцинных препаратов против кори, краснухи и паротита гентамицин, неомицин и канамицин. Контроль сырья (птичьих эмбрионов, сред, сывороток), используемого для наработки вакцинного вируса, выявил в яйцах кур и перепелов присутствие антибиотиков 5 групп - левомицетина, тетрациклина, бацитрацина, фторхинолонов и неомицина.

Разработанный иммуноферментный анализ эремомицина может быть использован в лабораторных и клинических условиях для исследования фармакокинетики антибиотиков в биологических жидкостях организма.

Предложены схемы пробоподготовки и новые пути преодоления матриксэффекта продуктов животного происхождения, основанные на использовании имитаторов матрикса.

Моделирование температурного воздействия на аминогликозиды, левомицетин, линкомицин, тилозин при стерилизации и термической обработке продуктов питания показало стабильность иммунохимической активности антибиотиков.

При скрининговом исследовании продуктов питания с помощью созданных иммунотестов получены данные о распространенности и степени контаминации продукции антибиотиками. Полученные сведения могут являться ориентиром при рассмотрении вопроса о нормировании нерегламентированных в РФ антибиотиков в продуктах питания и послужить стимулом для дальнейших направленных исследований этого вопроса.

Разработанные системы анализа пригодны для контроля содержания антибиотиков в вакцинных препаратах, для проведения лекарственного мониторинга, осуществления контроля за безопасностью продуктов питания, экологического мониторинга и в других областях, где необходимо чувствительное и специфичное определение антибиотиков, относящихся к группам фторхинолонов, тетрациклинов, амфениколов, линкозамидов, аминогликозидов, макролидов и гликопептидов.

Основные положения, выносимые на защиту Презентация ключевых эпитопов на иммобилизованных антигенах позволяет управлять эпитопной специфичностью анализа на основе поликлональных антител и конструировать тесты для селективного и группового выявления низкомолекулярных соединений.

Получены иммунореагенты и разработаны методы иммуноферментного определения антибиотиков, представителей 7 фармакологических групп:

фторхинолонов, тетрациклинов, линкозамидов, амфениколов, аминогликозидов, макролидов и гликопептидов.

Разработанные системы иммуноферментного анализа пригодны для иммунобиологических препаратах, биожидкостях организма человека и продуктах питания животного происхождения.

Внедрение результатов Иммуноанализ эремомицина был разработан в рамках НИР (№ 3-06/Меч от 15.07.2006) и использован для исследования фармакокинетических характеристик препарата при его клинических испытаниях. Лабораторные образцы иммуноферментных систем «Левомицетин-ИФА», «ТетрациклинИФА», «Гентамицин-ИФА» и «Фторхинолоны-ИФА» прошли комиссионные испытания в ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии для определения остаточных количеств антибиотиков в животноводческой продукции.

Апробация работы.

объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), Пятом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), VI Международной конференции Международном конгрессе МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии.

(Москва, 2010), Международной конференции «Пчеловодство - 21 век.

Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов с международным участием «Питание и здоровье» (Москва, 2010), Шестом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии»

(Москва, 2011), XIV Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в СанктПетербурге» (Санкт-Петербург, 2011), III Съезде фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии токсикологии и фармации» (Санкт-Петербург, 2011), Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), XIth International Conference on AgriFood Antibodies (ICAFA) (Vienna, Austria, 2012).

Апробация диссертации состоялась 31 октября 2013 года на заседании Ученого совета НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова.

Публикации.

По теме диссертационной работы опубликовано 28 печатных работ, в том числе 11 статей в российских журналах и 6 статей в зарубежных изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Основные подходы и принципы формирования специфичности иммунохимического анализа низкомолекулярных соединений Большинство низкомолекулярных химических соединений естественного и синтетического происхождения обладают физиологической активностью, и поэтому небезразличны для человека, домашних и диких животных, растений и экосферы в целом. Особого внимания заслуживают соединения, относящиеся к пестицидам, полютантам и токсинам, антибиотикам и стимуляторам роста, а также гормонам и средствам, оказывающим влияние на эндокринную систему, наркотическим и другим сильнодействующим лекарственным препаратам. Для проведения лекарственного и экологического мониторинга, допинг-контроля и судебно-медицинской экспертизы, осуществления контроля качества продуктов питания, ветеринарного и санитарного контроля, в научных исследованиях и смежных областях используются методы, позволяющие идентифицировать и количественно определять эти субстанции в самых разнообразных объектах исследования.

Иммуноанализ на протяжении нескольких десятилетий зарекомендовал себя как чувствительный, специфичный и недорогой инструмент, пригодный для широкомасштабных скрининговых исследований в упомянутых областях деятельности [43, 51, 104, 110, 148, 193, 209, 214].

МУЛЬТИПЛЕКСНЫЙ И ГРУППОСПЕЦИФИЧЕСКИЙ

ИММУНОАНАЛИЗ

Полноценность экспертизы образца обеспечивается, как правило, анализом по нескольким показателям, поэтому предпочтительными оказываются методы, позволяющие в одном тесте регистрировать одновременно несколько аналитов. В связи с этим мультипараметрические анализы, обозначаемые в зарубежной литературе синонимами “multiplex”, “multi-analyte”, “multi-residue”, “class-selective”, “group-specific”, “generic” или “assays with broad specificity”становятся все более востребованными, особенно для выполнения рутинного скрининга. Мультидетекция, присущая упомянутым тестам, достигается двумя принципиально различными подходами. Первая группа иммуноанализов основана на объединении нескольких аналитических систем на одной тест-платформе [51, 95, 106, 172, 196]. При этом каждая из систем, как правило, нацелена на специфическое выявление одного аналита.

Другая разновидность методов предполагает использование антител, распознающих общий групповой эпитоп – область молекулы гаптена, одинаковую для нескольких соединений, объединенных, как правило, в одну химическую или фармакологическую группу [70, 102, 188, 214, 223, 254].

Взаимодействие таких антител с иммобилизованным гаптеном (непрямой конкурентный анализ) или иммобилизованных антител с гаптеном, меченым изотопом, ферментом или флюорофором (прямой конкурентный анализ) может подавляться целым спектром перекрестно-реагирующих соединений. При этом реализуется возможность выявления нескольких аналитов, несущих общую распознаваемую антителами детерминанту. Перекрестное взаимодействие, уровень которого превышает 10%, принято считать удовлетворяющим достижимым на практике является уровень эквивалентной ингибирующей эффективности между структурными аналогами. В этом случае правомочно их совместное количественное определение.

мультиплексность с групповой специфичностью, что значительно расширяло аналитический спектр системы и её эффективность. Так, например, при иммобилизации антигена, детерминированного амоксициллином и хлортетрациклином, и использовании биспецифических антител групповой направленности оказалось возможным разработать тест для одновременного выявления в молоке 6 пенициллинов и 4 тетрациклинов [131]. Совместное применение двух группоспецифических антител в одном тесте, благодаря двойной ферментной метке и последовательной обработке субстратами, позволило определять антимикробные соединения двух классов – фторхинолонов и 22 сульфаниламидных препарата [128].

СЕЛЕКТИВНЫЕ ТЕСТЫ

Несмотря на экономические преимущества методов мультидетекции перед селективными тестами, в ряде случаев необходимость идентифицировать анализируемое соединение среди структурно родственных соединений диктуется особыми требованиями, предъявляемыми к аналиту – явными различиями в активности, токсичности или особенностями использования. Так, например, применение левомицетина (хлорамфеникола) для лечения продуктивных животных в странах Евросоюза запрещено из-за его токсичности [7], тогда как другие препараты группы амфениколов – тиамфеникол и флорфеникол могут использоваться, и их остаточное содержание в продукции регламентировано [9].

Доксициклин в отличие от других представителей этой группы, тетрациклина, хлортетрациклина и окситетрациклина не должен присутствовать в молоке и яйцах, предназначенных для питания, и его необходимо отличать от структурных аналогов. В тоже время в тканях животных (мясо, печень, почки) для этих соединений установлены одинаковые допустимые уровни содержания [9], поэтому их предпочтительнее выявлять совместно.

Гормоны щитовидной железы – трийодтиронин (T3) и тироксин (T4) различает степень йодирования, связанная с ним функциональная активность и содержание в крови. Перекрестное взаимодействие между молекулами Т3 и Т4, отличающимися единственным атомом йода, может быть значительным. Тем не менее, для правильной диагностики патологий щитовидной железы необходима дифференциация этих гормонов с помощью селективных тестов [53].

Алкалоиды опия, морфин и кодеин (3-метилморфин) – близкие в структурном отношении соединения, отличающиеся единственным метильным заместителем. Кодеин используется главным образом как противокашлевое средство, а морфин является наркотическим анальгетиком. Высокая степень перекрестного взаимодействия сильно затрудняет иммунохимическую дифференциацию этих соединений и их метаболитов, что особенно важно при судебно-медицинской экспертизе наркомании [50].

Таким образом, тонкая (эпитопная) специфичность иммуноанализа играет чрезвычайно важную роль для выполнения конкретных аналитических задач.

Создание инструмента с групповой или селективной специфичностью, способного улавливать общие черты или выявлять различия между структурно близкими соединениями, предполагает приготовление антител специфичных к субмолекулярным структурам - общим или индивидуальным эпитопам соединения.

селективностью для распознавания единственного низкомолекулярного аналита на примере иммуноанализа агрохимикатов (триазинов, арилмочевины и хлорацетанилидных гербицидов) посвящена работа Goodrow et al. [113]. В недавнем обзоре Zhang, et al. [254] рассмотрены основные достижения в области создания анализа для одновременного определения нескольких аналитов. Несмотря на противоположность, рассматриваемых в этих публикациях вопросов, основные подходы к их решению остаются едиными – выбор гаптена с оптимальным дизайном для приготовления иммуногена.

Несомненно, что изначальным моментом, обеспечивающим успех в разработке анализа с определенной специфичностью, является выбор гаптена и правильный дизайн конъюгата-иммуногена, который призван индуцировать образование антител направленных к интересующему эпитопу. Специфичность антител к индивидуальным детерминантам гаптена является основой для селективного теста, и, наоборот, при создании группового анализа требуются антитела к общим структурным элементам. Кроме того, та область молекулы, которая должна являться мишенью для антител, не должна быть экранирована носителем, а должна быть наилучшим образом презентирована на нем. Так как иммунокомпетентными клетками могут распознаваться лишь стерически доступные эпитопы гаптена, то, как правило, эти структуры расположены дистально от места соединения гаптена с носителем.

Holtzapple et al. [122] и Xu et al. [252] посвятили свои публикации возможностям молекулярного моделирования структуры гаптена и обзору работ, использующих ресурсы компьютерной химии. Эти программы позволяют исследователю рассчитывать минимальную энергетическую конформацию гаптена, визуализировать его трехмерную структуру с распределением заряда по поверхности молекулы и на основании этих данных конструировать иммуноген, предсказывать специфичность и прогнозировать перекрестную активность аналогов.

Иной способ моделирования предполагает в качестве пространственного образа «группового» гаптена рассматривать антитела к рецептору или ферменту, связывающему ряд лигандов/субстратов. Существенные рецепторных структур, имеющих соответствующие сайты связывания, а также сложностью четкого воссоздания взаимодействия лиганд-рецептор за счет модели идиотип-антиидиотип. Примеры анализов, которые реализовали эту возможность с помощью анти-идиотипических антител, обсуждаются в обзоре [219].

1.4. ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ И СЕЛЕКЦИИ ЭПИТОПСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

Особенностями структуры иммуногена определяют направленную стимуляцию иммунной системы организма и формирование репертуара продуцентов антител желаемой направленности. Другим важным моментом для создания иммунохимического анализа с тонкой специфичностью является получение антител. Обеспечить такую характеристику анализа могут поликлональные (ПкАт), моноклональные (МкАт) и рекомбинантные антитела (РАт), но их получение требует применения особых технологий.

Введение иммуногена индуцирует в организме образование целого спектра клонотипов В-клеток, неоднородных по эпитопной специфичности, продукция которых представляет собой комплексный препарат - ПкАт. Таким образом, специфичность антисыворотки имеет некий спектр, охватывающий разные эпитопы гаптена. Такая полиреактивность может способствовать созданию теста с широкой специфичностью, но быть препятствием для разработки селективного теста. И напротив, наличие антител, направленных к индивидуальным эпитопам соединения, могут отрицательно сказываться на параметрах группового распознавания. Таким образом, использование антисыворотки, в том виде как она есть, не всегда позволяет достичь желаемого результата.

Одним из подходов для селекции фракции антител с требуемыми свойствами является хроматографическое разделение пула сывороточных антител. Так, Wie и Hammock [248] отмечали улучшение характеристик иммуноанализа при пропускании сыворотки через колонку с аффинным носителем. Эффект от такой процедуры авторы связывали во-первых с истощением – удалением нежелательной популяции антител при аффинной хроматографии на колонке с адсорбированным антигеном; во-вторых – с выделением нужных антител на антигене и их последующей элюцией с колонки. Burkin A. и Zoryan [62] сообщили о возможности разделения антисывороток, распознающих мускариновые и никотиновые холинергические агенты с помощью атропин-детерминированного сорбента на фракции антител, специфичных в отношении агонистов и антагонистов ацетилхолинового рецептора.

Однако, принимая во внимание низкое содержание анти-гаптенных антител в составе антисыворотки, и гораздо меньшую долю эпитопспецифических антител, а также, учитывая возможные потери в активности и стабильности выделенных фракций, этот подход не нашел широкого практического применения.

Гибридомная технология [144] является подходом, который позволяет обессмертить клонотипы, индуцированные при иммунизации конъюгатом гаптен-белок, посредством гибридизации с опухолевым партнером, клонировать и отобрать продуцент антител с необходимой специфичностью и профилем перекрестной реактивности, которые наилучшим образом отвечают поставленной задаче, а также наработать МкАт в достаточном количестве [160].

Реализовать возможность селекции эпитоп-специфичных МкАт на практике оказывается довольно непросто. Во-первых, лишь несколько тысяч клонотипов из 2108 B-клеток (спленоциты BALB/c мыши) теоретически могут быть индуцированы на эпитоп [230] и порядка 10% этой совокупности B-клеточных клонов активируется [58]. Затем, даже самая эффективная процедура слияния ведет лишь к частичному образованию гибридных клонов (до 1%). Кроме того, в процессе культивирования и клонирования возможна утрата антителопродукции или жизнеспособности гибридомы [58, 230, 244, 246].. Таким образом, селекция стабильного клона, продуцирующего высокоаффинные эпитоп-специфичные антитела, остается чрезвычайно редкой удачей.

Технология получения рекомбинантных антител (РАт), изначально использовании гетерологичных антител посредством их гуманизации [161, 179], в дальнейшем своем развитии позволила получать фрагменты антител для различных аналитических целей [124, 149, 172, 207], а также варьировать такими параметрами антител, как аффинность и специфичность [219]. Наиболее эффективным в конструировании антител подходом являются технологии клеточного [56, 82], рибосомального [170] и более распространенного фагового дисплея [123]. Они обладают большим потенциалом, так как позволяют для селекции антител оперировать репертуаром 105–1011 V-генов, который может быть создан как на основе материала от иммунных, наивных (неиммунных) животных или доноров, так и синтетических библиотек антител.

Процедура селекции специфических антител из таких обширных последовательных циклов обогащения фаговых частиц, экспрессирующих на своей поверхности антитела, на антигенном материале с последующей десорбцией и амплификацией. Для улучшения свойств отобранных вариантов:

аффинности, кинетики связывания и специфичности используется целый арсенал генно-инженерных приемов для комбинирования фрагментов и последовательностей гена иммуноглобулина, а также мутагенез [123, 172].

Тем не менее, успех этих подходов основан на проведении многоэтапного скрининга сотен гибридных культур или огромных комбинаторных библиотек взаимодействует с конъюгатами гаптен-носитель или гаптен-фермент; 2) распознает свободный гаптен (конкурентный анализ); 3) обладает необходимой аффинностью и позволяет выявлять аналит с удовлетворительной чувствительностью (количественный анализ); 4) обеспечивает желаемый профиль перекрестного взаимодействия структурных аналогов (анализ специфичности); 5) стабилен и позволяет наработать антитела в достаточном количестве. Несмотря на то, что процедуры для осуществления такого скрининга постоянно совершенствуются и становятся автоматизированными, достижение желаемого результата остается делом случайным и весьма трудоемким.

1.4.4. КОРРЕКЦИЯ ПРОФИЛЯ ПЕРЕКРЕСТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

МАЛЫХ МОЛЕКУЛ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ СПЕЦИФИЧНОСТИ

ИММУНОАНАЛИЗА

Возможность регулировать специфичность иммуноанализа посредством изменения профиля перекрестного взаимодействия соединений в соответствии с поставленной задачей является заманчивой перспективой. В некоторой степени этого позволяет достичь альтернативный, более простой и часто эффективный подход, который и является предметом настоящего обзора.

Основной принцип этого подхода сходен с аффинной хроматографией ПкАт, но основное отличие заключается в том, что разделения фракций антител не происходит, а эпитоп-специфичные антитела отбираются в ходе иммуноанализа. При этом антисыворотка остается цельным и стабильным препаратом, представляющим пул антител ко всем эпитопам иммуногена, сформированный в результате иммунного ответа. Селекцию антител с необходимой эпитопной специфичностью обеспечивает структурный дизайн конъюгата, иммобилизованного на твердой фазе или используемого в качестве сигнальной молекулы (меченной ферментом, флюорофором, изотопом и др.). В связывании с видоизмененными по сравнению с иммуногеном антигенами участвует ограниченный спектр антител антисыворотки. Таким образом, формирование эпитопной специфичности анализа напрямую связано со структурной особенностью конъюгата и сводится к подбору его дизайна.

Гомологичный антиген представляет собой конъюгат гаптен-носитель, который идентичен иммуногену по дизайну гаптена и способен реагировать со всеми анти-гаптенными антителами сыворотки. Гетерологичный (структурно видоизмененный) антиген, помимо носителя, может отличаться от иммуногена типом гаптена, его пространственной ориентацией на носителе, наличием и длиной связующего звена (спейсера) между гаптеном и носителем, а также методом конъюгирования, определяющим структуру химической связи.

Антисыворотка связывается с гетерологичным антигеном благодаря лишь части антител, направленных к отдельным эпитопам гаптена, тогда как остальные антитела оказываются не вовлеченными в такое взаимодействие.

Гетерологичные конъюгаты для адсорбции на планшетах или в качестве сигнальных молекул нередко используются для улучшения чувствительности иммуноанализа низкомолекулярных соединений. Это хорошо известный прием, описанный в многочисленных публикациях [75, 139, 209, 236, 242]. Однако, исследованию влияния гетерологичных конъюгатов на профиль перекрестного взаимодействия структурных аналогов и целенаправленному моделированию антигенов для достижения желаемой специфичности иммуноанализа уделялось очень скромное внимание.

В настоящем обзоре приведены немногочисленные наиболее яркие примеры антиген-зависимого изменения профиля распознавания аналитов и обсуждаются молекулярные механизмы этого феномена. Табл. 1 включает данные нескольких показательных работ, в которых исследовалось влияние дизайна антигенов на специфичность иммуноанализа малых молекул за счет изменения профиля перекрестного взаимодействия ПкАт.

Влияние иммобилизованного или ферментного конъюгатов гаптена на профиль перекрестного взаимодействия анализируемых соединений.

[формат анализа] соединения