Главная >> Диссертации - все темы

Pages: |

| 2 |

«СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ВИРУСА ГРИППА А ...»

-- [ Страница 1 ] --

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

Матусевич Олег Владимирович

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

ВИРУСА ГРИППА А

02.00.10 – биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Научный руководитель:

д.х.н., проф. Титов М. И.

Санкт-Петербург 2013

2.3.8.1 Структурная организация и функции…………………………….. 2.3.8.2 Взаимодействие субъединиц РВ1 и РА…………………………... 2.3.8.3 Перспективы разработки противовирусных средств……………. 2.3.8.4 Взаимодействие субъединиц РВ1 и РВ2…………………………. 2.3.9 Белки PB1-F2 и PB1-F3 (N40)

2.3.10 Белки PA-X, PA-N155 и PA-N182

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1 Синтез пептидов

3.1.1 Последовательное наращивание пептидной цепи

3.1.2 Конвергентный синтез

3.2 Противовирусная активность пептидов

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Материалы и методы исследования

4.2 Синтез пептидов

5. ВЫВОДЫ

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

8.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ВВЕДЕНИЕ Среди респираторных вирусных инфекций вирус гриппа занимает особое место. По данным ВОЗ, ежегодная смертность от гриппа в мире составляет 250тысяч человек [1]. Наиболее опасным из трех типов этого вируса является вирус гриппа А: согласно [2], все пандемии гриппа с начала XX века по настоящее время были вызваны именно этим вирусом.

Ввиду непредсказуемости молекулярно-генетических и иммунологических характеристик новых эпидемических и пандемических штаммов вируса гриппа А, защита, обеспечиваемая вакцинацией, не является достаточно надежной, и химиотерапия сохраняет свою актуальность [3, 4].

Главной проблемой химиотерапии является появление штаммов, устойчивых к действию препаратов. Так, известны штаммы, резистентные к оcельтамивиру, одному из основных противогриппозных препаратов. Поэтому необходим поиск новых соединений, действующих на различных стадиях жизненного цикла вируса гриппа [3, 4, 5].

Перспективной мишенью для химиотерапии гриппа являются консервативные белки: использование таких мишеней может позволить в значительной степени избежать проблемы формирования резистентности к препаратам. Одной из таких мишеней, не задействованной в современных препаратах, использующихся в клинической практике, в случае вируса гриппа А является фермент РНК – полимераза, катализирующий синтез вирусной РНК.

Цель работы: поиск пептидов из аминокислотной последовательности белка РВ1, подавляющих репликацию вируса гриппа А. Для достижения поставленной цели в работе были решены следующие задачи:

1. выбор пептидов из аминокислотной последовательности белка РВ 2. разработка синтеза целевых соединений 3. тестирование синтезированных пептидов 4.модификация биологической активности Научная новизна исследования:

1. Разработан синтез 34 ранее неизвестных пептидов – фрагментов белка РВ РНК-полимеразы вируса гриппа А.

2. На основании изучения противовирусной активности синтезированных соединений на культуре клеток MDCK в отношении пандемического вируса гриппа A/California/07/2009 (H1N1) pdm09 впервые показано, что пептиды – фрагменты 6-13, 6-14, 26-30, 395-400, 531-540 белка РВ1, а также их производные эффективно подавляют репликацию вируса гриппа.

3. Изучение флуоресцентно-меченого фрагмента 6-14 белка РВ1 показало, что препарат действует внутри клетки на ранних стадиях репликации вируса гриппа.

Практическая ценность работы. В ряду синтезированных пептидов выявлены соединения с высокой противовирусной активностью, которые могут быть использованы в качестве основы для создания лекарственных препаратов для профилактики и лечения гриппа А. Получен патент на пептид, обладающий высокой противовирусной активностью.

На защиту выносятся результаты проведенного исследования, включающие:

1. выбор пептидов из аминокислотной последовательности белка РВ1, входящих в состав РНК-полимеразы вируса гриппа А 2. синтез 34 пептидов – фрагментов белка РВ1 РНК-полимеразы вируса гриппа А 3. изучение противовирусной активности синтезированных соединений на культуре клеток MDCK в отношении пандемического вируса гриппа A/California/07/2009 (H1N1) pdm 4. выявлены соединения, эффективно подавляющие репликацию вируса гриппа А Апробация работы. Результаты работы представлены в 10 публикациях (2 статьи, 1 патент и тезисы 7 докладов). Статьи опубликованы в журналах Вестник Санкт-Петербургского университета (2011, серия 4, вып. 2, С.155-161) и International Journal of Peptides (2013, vol. 2013, ID 370832). Материалы работы были доложены на 4 конференциях и 2 симпозиумах: Международной конференции по химии “Main Trends of Chemistry at the Beginning of XXI Century” (С.-Петербург, 2009), V Всероссийской конференции “Химия в современном мире”, (С.-Петербург, 2011), IV Российском симпозиуме “Белки и пептиды” (Казань, 2009), Европейском пептидном симпозиуме (Копенгаген, 2010), Конференции молодых специалистов “Грипп:

эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение” (С.-Петербург, 2012), 16-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология – наука ХХI века” (Пущино, 2012). Тезисы доклада на 31-ом Европейском пептидном симпозиуме были опубликованы в Journal of Peptide Science (2010, v. 16, S1, p. 65).

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю, профессору М.И. Титову, коллективу лаборатории синтеза пептидов: И.А. Глуздикову, С.К. Никольской, И.И. Елисееву, А.А. Краснощек, сотрудникам НИИ Гриппа: О.И. Киселеву, В.В. Зарубаеву, А.А. Штро, В.В.

Егорову, Ю.П. Гармаю, А.В. Слите, М.И. Дюкову за неоценимую помощь и поддержку при выполнении диссертационной работы.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Пептиды как потенциальные лекарственные средства Используемые в настоящее время лекарственные препараты могут быть разделены на следующие категории [6]: "малые" молекулы - природные или высокомолекулярные соединения с молекулярной массой, как правило, > Да, к ним относятся белки, например, антитела, а также конъюгаты белков.

Промежуточное положение в этой классификации занимают пептиды.

Подавляющее большинство современных лекарственных средств относится к классу "малых" молекул, которые удовлетворяют одному из критериев [7], необходимому для высокой биодоступности препарата при пероральном применении: соединение должно обладать молекулярной массой < 500 Да. Основными преимуществами таких соединений являются простота и рентабельность синтеза, высокая биодоступность при пероральном применении и способность проникать через биологические мембраны [8]. К их недостаткам можно отнести способность накапливаться в тканях, образовывать токсичные продукты метаболизма, вызывающие или усиливающие побочные эффекты.

В этом отношении пептиды - многообещающий класс соединений, который способен объединить терапевтические преимущества "малых" молекул и белков [6]. Кроме того, пептиды являются естественными регуляторами различных процессов в организме.

2.1.1 Преимущества и недостатки терапевтических пептидов В качестве потенциальных лекарств пептиды обладают следующими преимуществами по сравнению с белками, в том числе, антителами [9 - 11]:

лучше проникают в ткани, в том числе, в опухоли в общем случае менее иммуногенны, чем рекомбинантные белки и антитела пептиды имеют более высокую активность на единицу массы более стабильны при хранении Основными недостатками терапевтических пептидов являются [9, 12 - 14]:

низкая биодоступность при пероральном применении препарата (обычно требуется инъекция) Короткое время жизни в организме вследствие быстрого расщепления пептидов протеолитическими ферментами пищеварительной системы и плазмы крови, а также вследствие почечного и печеночного клиренса низкая способность к пересечению физиологических барьеров высокая конформационная гибкость, которая иногда приводит к недостаточной селективности при взаимодействиях с различными мишенями, что вызывает активацию нескольких мишеней и обусловливает побочные эффекты возможный риск иммуногенных эффектов высокая стоимость синтеза пептидов в сравнении с "малыми" молекулами Одним из способов преодоления перечисленных выше недостатков пептидов могут быть химические модификации [15].

2.1.2 Химические стратегии улучшения биологической активности, Процессы поглощения, распределения, метаболизма и экскреции играют ключевую роль в определении характера потенциального лекарства и, таким образом, его терапевтического эффекта [16]. Ещё несколько лет назад пептиды обычно вводили подкожно, внутримышечно или внутривенно, чтобы препарат не подвергался действию ферментов, присутствующих в желудочно-кишечном тракте. Однако в течение последних лет появились новые технологии доставки пептидов, включая парентеральный путь с контролируемым высвобождением (подкожно, внутримышечно или внутривенно), доставку через слизистые оболочки (назальные спреи, ингаляции или сублингвальный приём), пероральный приём (вещества, способствующие проникновению; ингибиторы протеаз или носители) и трансдермальный путь (пластыри) [15].

В настоящее время ведутся разработки, направленные на увеличение селективности и продолжительности пребывания пептидов в плазме крови.

Ниже приведены стратегии химической оптимизации пептидов [9, 10, 12, 13, - 35]:

Поиск минимальной активной последовательности Упрощение и/или оптимизация структуры с помощью аланинового или Dсканов для устранения потенциальных сайтов ферментативного расщепления, а также для определения аминокислотных остатков, вовлечённых во взаимодействие с интересующей мишенью.

Циклизация пептидов различными способами, в том числе, через дисульфидный, гидразиновый или лактамовый мосты для снижения конформационной гибкости линейных пептидов, уменьшения количества водородных связей, улучшения мембранной проницаемости, а также повышения их устойчивости к протеолизу эндо- и экзопептидазами.

Присоединение структуро-индуцирующих зондов, вызывающих заданную конформацию пептидов Замена аминокислотных остатков на D-аминокислоты, N-метил-аминокислоты или -аминокислоты для повышения стабильности пептида в плазме (например, устойчивости к действию эндопептидаз) и/или увеличения сродства целевого соединения к мишени.

Замещение амидной связи между двумя аминокислотными остатками с целью повышения стабильности пептидной последовательности в организме:

NH-амидное алкилирование, замена карбонильной группы пептидной связи, например, на метиленовую группу (восстановленная связь: –CH2–NH–), а также C(=S) (эндотиопептид, –C(=S)–NH–), или PO2H (фосфонамид, –P(=O)OH–NH–).

Замена NH-группы амидной связи на атомы кислорода (депсипептид, –CO–O– ), серы (сложный тиоэфир, –CO–S–) или на метиленовую группу (–CO–CH2–) Блокирование N- и/или С-концов пептида, например, N-ацилированием, Nпироглутаматом, С-амидированием и т. д. или присоединение углеводных цепей (гликозилирование) для повышения стабильности в плазме (в особенности устойчивости по отношению к действию экзопептидаз).

Модификация целевого соединения с помощью ПЭГ-, ГЭК- или ПАСилирования, а также липидизации ПЭГ-илирование представляет собой присоединение к целевой молекуле водорастворимого полимера полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой от 2 до 40 кДа, что позволяет улучшить растворимость пептидов в воде, защитить их от воздействия протеаз [22]. Другим методом увеличения биостабильности пептидов и белков является ПАС-илирование – присоединение к целевой молекуле аминокислотной последовательности, включающей остатки пролина, аланина и серина (ПАС-последовательность), длина такой последовательности может составлять 100 и более остатков [33].

Преимуществами данного подхода являются увеличение устойчивости к протеазам плазмы при сохранении способности к расщеплению почечными протеазами, высокая растворимость, низкие показатели токсичности и иммуногенности [36].

Помимо ПЭГ- и ПАС-илирования также стоит отметить метод ГЭКилирования, заключающийся в присоединении к белкам и пептидам гидроксиэтилкрахмала (ГЭК или HES). Этот метод направлен на увеличение показателей биоустойчивости и биологической активности препаратов.

Подход, основанный на липидизации, подразумевает ацилирование соединений жирными кислотами. Липидизированные соединения демонстрируют более высокую аффинность к эндогенному транспортному белку альбумину в кровотоке по сравнению с нелипидизированными соединениями. Это продлевает время удержания препарата в крови и снижает почечный и печёночный клиренс, давая возможность увеличивать временные интервалы между отдельными приёмами препарата [21].

Еще одним методом стабилизации пептидов является присоединение структуро-индуцирующих зондов, вызывающих заданную конформацию аминокислотной последовательности аналога энкефалина, смогли стабилизировать его [27].

Устойчивость пептидов к протеолизу можно повысить, включая в аминокислотную последовательность целевого соединения D-аминокислоты, так как природные ферменты ориентированы на белки и пептиды, состоящие из аминокислот L-формы [28]. В случае производных человеческого кальцитонина было показано, что замена остатка L-фенилаланина на соответствующую Dформу приводило к стабилизации этих пептидов в плазме крови по сравнению с нативной формой [30].

Включение в аминокислотную последовательность пептидов Nметилированных аминокислотных остатков позволяет повышать устойчивость пептидов к действию пептидаз. Например, укороченные аналоги нейротензина после модификации аминокислотной последовательности с помощью метилированного аргинина или создания псевдопептидной связи проявляли большую устойчивость к протеазам плазмы, чем немодифицированные аминокислотную последовательность аналогов человеческого кальцитонина [30].

К повышению стабильности пептидов также приводит включение в аминокислотную последовательность целевого соединения -аминокислот. В работе [32] было показано, что нонапептид, состоящий из -аминокислот, в опытах на крысах не подвергался ферментативному расщеплению.

Перспективным подходом для улучшения биологических характеристик пептидных препаратов является комбинация двух или более перечисленных выше методов [21]. Например, циклизация пептида и включение в его аминокислотную последовательность D-аминокислот. Таким образом был модифицирован гонадолиберин (гонадотропин высвобождающий гормон) декапептид, содержащий в аминокислотной последовательности D- и Lцистеин, который был циклизован через дисульфидный мост. Добавление модифицированного соединения к тканевым гомогенатам, содержащим большое количество протеаз, показало пролонгированную устойчивость препарата к действию ферментов по сравнению с линейным пептидом [37].

Набор описанных выше подходов существенно расширяет возможности для совершенствования как разрабатываемых, так и уже существующих пептидных и белковых лекарственных препаратов.

В общем случае наиболее подходящий метод для получения пептида определяется количеством аминокислотных звеньев, входящих в его состав.

Возможно использование химического синтеза, технологии рекомбинантной ДНК или ферментативного синтеза.

Первыми пептидами, полученными путём рекомбинантного синтеза, были соматостатин и инсулин в 1977 и 1978 годах соответственно [38-40]. Этот метод подходит для промышленного производства пептидов с длиной цепи от 50 до 100 аминокислотных остатка. Одним из недостатков данной технологии является невозможность включения в аминокислотную последовательность неприродных аминокислотных остатков, а также получения пептидных производных, например, С-концевого амида пептида [9].

Большинство фармацевтически значимых пептидов содержит до аминокислотных остатков, и для их промышленного получения наиболее подходит химический синтез, технологически более оправданный, чем методы рекомбинантной ДНК или ферментативный синтез. Использование в химическом синтезе неприродных аминокислот, а также создание псевдопептидных связей открывает возможности для получения большего разнообразия соединений, чем доступно с помощью рекомбинантных технологий [9].

Химический синтез пептидов бывает классическим, проводимым в растворе, твердофазным, проводимым с использованием полимерных носителей, а также комбинированным. В 1953 году дю Винье впервые синтезировал классическим способом гормон окситоцин [41]. Достоинствами этого метода является легкость масштабирования, использование небольших, в сравнении с твердофазным синтезом избытков реагентов, возможность контроля качества получаемых промежуточных продуктов. Поэтому классический синтез в растворе продолжает использоваться для промышленного производства олигопептидов. Так, например, дипептидный заменитель сахара аспартам (метиловый эфир N-(L--аспартил)-Lфенилаланина) в большинстве случаев синтезируется в растворе, как и ряд ингибиторов ангиотензин-конвертазы (каптоприл, эналаприл и рамиприл) [21].

Основными недостатками классического синтеза пептидов являются большие временные затраты, необходимые для синтеза целевого соединения.

Кроме того, в ряде случаев промежуточные соединения имеют низкую растворимость в подходящих для синтеза растворителях [21]. Для преодоления перечисленных ограничений требовались альтернативные подходы.

Таким подходом стал твердофазный синтез пептидов, разработанный Меррифилдом в 1963 [42]. Особенностью метода является использование для синтеза полистирольной смолы с присоединенным линкером, к которому присоединяется первый аминокислотный остаток. Растущая пептидная цепь остаётся ковалентно связанной с полимерным носителем до конца синтеза. На каждом этапе синтеза используется избыток реагентов, который отфильтровывается от полимерного носителя после завершения каждой стадии.

После завершения синтеза пептид отщепляется от полимерного носителя.

В твердофазном синтезе применяются Fmoc/t-Bu- и Boc/Bzl-стратегии, последняя в настоящее время используется все реже в силу следующих ограничений:

Для отщепления пептида от полимерного носителя требуются HF или TFMS.

При удалении временной Вос-группы под действием TFA или растворов HCl постоянные защитные группы боковых цепей аминокислот (Z-, Bzl-) частично удаляются, так как не обладают необходимой стабильностью в данных условиях [43].

На рисунке 1 приведена общая схема твердофазного синтеза пептидов с использованием Fmoc/t-Bu-стратегии и 2-хлортритилхлоридной смолы [44].

Рис. 1 Схема твердофазного синтеза пептидов с использованием Fmoc/t-Bu-стратегии.

Использование 2-хлортритилхлоридной смолы дает возможность получать пептиды с С-концевой карбоксильной группой. Для получения амидов пептидов можно использовать смолу Ринка [45]:

конвергентным. Последовательный синтез предполагает поэтапное присоединение аминокислотных остатков до тех пор, пока необходимая аминокислотная последовательность не будет получена. В общем случае таким способом получают пептиды, содержащие до 15 аминокислотных остатков. Для конвергентного синтеза аминокислотную последовательность целевого соединения разбивают на фрагменты, конденсация которых может быть проведена как твердофазно, так и в растворе. В последнем случае синтез называется комбинированным. Такой подход позволяет сократить общее время синтеза и снизить стоимость целевого соединения за счет использования меньших избытков реагентов при конденсации фрагментов, чем в случае твердофазной конденсации [46]. Комбинированный подход был использован в синтезе ингибитора слияния ВИЧ - препарата энфувиртид, аминокислотная последовательность которого была разбита на три фрагмента с последующей конденсацией в растворе [47].

Достоинствами твердофазного синтеза являются возможность автоматизации процесса, отсутствие необходимости выделения промежуточных соединений и низкие временные затраты (в сравнении с синтезом в растворе), необходимые для получения целевого соединения. На сегодняшний день использование этого метода для получения терапевтических пептидов является оптимальным [48].

Для конвергентного синтеза пептидов используются защищенные фрагменты целевого соединения, в то время как использование метода нативной химической лигации (NCL) позволяет осуществлять конденсации незащищенных фрагментов целевого соединения [49], механизм этого процесса приведен на рисунке 2 [21].

Рис. 2 Механизм нативной химической лигации. Меркапто-группа N-концевого остатка цистеина C-концевого фрагмента целевого пептида обратимо реагирует с Cконцевым тиоэфиром N-концевого фрагмента пептида. Последующий S-N-ацильный сдвиг приводит к образованию целевого соединения, содержащего нативную пептидную связь [50].

Преимущество этого метода заключается в высокой эффективности реакции конденсации, а также чистоте целевого соединения по сравнению с последовательным твердофазным синтезом.

2.3 Вирусные белки – потенциальные лекарственные мишени В функционировании различных вирусных ферментов важную роль играют белок-белковые взаимодействия (ББВ). Так, например, РНК-полимераза вируса гриппа представляет собой комплекс из трех белков [51]. Помимо низкомолекулярных веществ-посредников ББВ задействованы в регулировании многочисленных клеточных процессов, в том числе, в передаче клеточных сигналов. Особенностями ББВ являются слабые нековалентные индивидуальные контакты, временный характер связей, большое число вовлеченных атомов, разнообразие химических групп, ограниченное разнообразием стандартных аминокислот и ряда их производных, но при этом высокая специфичность. Именно высокая специфичность взаимодействий при относительном химическом однообразии делает сложным поиск соединениймодификаторов ББВ [21, 52]. Разработка ингибиторов и, в общем случае, модификаторов ББВ, важна для контроля и регулирования этих процессов.

Такие соединения могут быть как полезным инструментом в исследовательской работе, так и потенциальными терапевтическими агентами [21, 53, 54].

Участки взаимодействия белков друг с другом обычно представляют собой непрерывные мотивы длиной примерно 8-24 аминокислотных остатка или несколько коротких участков, разнесенных по длине полипептидной цепи и сближенных в пространстве. Таким образом, белковая поверхность может быть картирована в виде сегментов вдоль цепи, вместе формирующих сайт связывания. Наличие достаточно протяженных сегментов может предполагать возможность использования соответствующих пептидов для имитации участка связывания белковой молекулы с молекулой-партнёром. Синтетический пептид может затем быть использован для ингибирования связывания этих двух молекул. Способность пептидных фрагментов эффективно воспроизводить конформацию и электронные свойства функциональных нативных эпитопов полноразмерных белковых молекул была продемонстрирована в случае SH3доменов [55, 56].

Пептиды-фрагменты взаимодействующих белков могу быть как ингибиторами дальнейшей передачи сигнала посредством ББВ, так и активаторами, часто незначительно отличаясь друг от друга. Кроме того, подобные пептиды могут избирательно связываться с определенной изоформой белка, например, протеинкиназы С. Избирательное подавление или активация функции какой-либо из изоформ позволяет выяснить роль этой изоформы, что важно для последующей разработки лекарственных препаратов. Известно, что действие различных изоформ может быть клинически прямо противоположным [57], что предъявляет высокие требования при выборе изоформы-мишени и в последствии при создании высокоселективного лекарственного средства.

Пептидные модификаторы ББВ являются важным инструментом для исследования взаимодействия белков. Иногда аминокислотные замены в пептиде не отменяют связывания с белком-мишенью, но приводят к исчезновению физиологического эффекта полноразмерного белка (и пептидного фрагмента без замен) в опытах in vivo [58].

При поиске участков в белке-мишени, которые могут быть использованы для выбора аминокислотных последовательностей пептидных модификаторов ББВ, необходимо знать, с какими белками он взаимодействует. Это можно сделать с использованием как экспериментальных, так и теоретических подходов, in silico [59].

В общем случае, для поиска белка, взаимодействующего с данным белком, можно использовать следующие методы: метод двухгибридной системы (two-hybrid system), создание и анализ фаговой дисплей-библиотеки (phage display library), очистку с тандемной аффинностью (tandem affinity purification, TAP), поперечную химическую сшивку (chemical cross-linking) или иммунокопреципитацию (co-immuniprecipitation). Эти методы позволяют целенаправленно находить белки, связывающиеся с выбранным белкоммишенью. Часто исследователи не ограничиваются одним методом и используют второй для подтверждения первоначальных результатов. Кроме преимущественно для подтверждения или детального анализа взаимодействия белков: например, бимолекулярная комплементация флуоресценции (bimolecular fluorescence complementation, BiFC) и поверхностный плазмонный резонанс (surface plasmon resonance, SPR) [60-62].

Кроме того, для организмов, геном которых расшифрован полностью или в значительной степени, возможен поиск ББВ по гомологии с уже известными образующими комплекс белками. Такие масштабно проводимые исследования, называемые функциональной протеомикой, привели к картированию значительной части белковых интерактомов нескольких вирусов, бактерий, а также пар эукариотический хозяин-вирус, частично проверенных экспериментально. Такие интерактомы могут помочь выбрать для дальнейшего исследования партнер белка-мишени из всех или большей части возможных в условиях клетки вариантов [63, 64].

С помощью вышеупомянутых экспериментальных методов, а также анализа гомологичных белков, можно определить непосредственный участок взаимодействия белка с белком-партнером. Исследование in vitro связывания одного из белков с различными синтетическими пептидами-фрагментами участка взаимодействия белка-партнера позволяет уточнить размеры сайта связывания и определить аминокислотные остатки, критические для связывания. Значимость каждого из аминокислотных остатков можно оценить, в частности, путем синтеза серии пептидов с последовательными заменами аминокислотных остатков, например, на остаток аланина, и сравнения их свойств со свойствами пептидов «дикого типа», то есть без замен. Кроме того, так можно выяснить, насколько протяженные участки образованы критическими для связывания аминокислотными остатками.

последовательностей белков, а также большое количество экспериментальных данных по белкам из различных гомологичных групп, что позволяет сократить экспериментальную фазу поиска участков белков, перспективных в плане последовательностей можно осуществлять путем скрининга больших библиотек с использованием системных или статистических методов, а также рационального подхода [65, 66]. Примерами подхода крупномасштабного скрининга являются следующие методы:

(1а) Систематический поиск крупных доменов, участвующих в белокбелковых взаимодействиях. Систематический поиск основан на точном картировании сайта взаимодействия в пределах домена взаимодействия. Так, в частности, был обнаружен пептидный фрагмент киназы 3 рецептора, сопряженного с G-белком. Данный пептид ингибировал взаимодействие киназы с соответствующим рецептором – ее субстратом – и, соответственно, блокировал десенситизацию, зависящую от работы этой киназы [67].

(1б) Случайный поиск крупных доменов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях. Случайный поиск использует статистические библиотеки, состоящие из большого числа возможных пептидов определенной длины, которые синтезируются или экспрессируются вирусом и проверяются на биологическую активность. Таким образом, например, был получен ингибитор взаимодействия кальций-кальмодулин-зависимой киназы и кальмодулина. При этом найденные пептиды отличались по аминокислотной последовательности от кальмодулин-связывающего участка киназы, и, соответственно, действовали как мимитоп – то есть имитировали пространственную структуру участка субстрата, имея при этом иную аминокислотную последовательность [68].

(1в) Поиск ключевых аминокислотных остатков, участвующих в белокбелковых взаимодействиях. Осуществляется путем скрининга библиотеки, где в определенном положении пептида имеются специфические аминокислоты, например, фосфотирозин.

идентификации пептидов, модулирующих ББВ. Однако эти методы требуют использования больших библиотек, до миллиардов пептидов, создание которых сопряжено с большими трудозатратами. Кроме того, пептиды, обнаруженные с помощью этих методов, получили ограниченное применение в биологии [65].

рациональные подходы для идентификации коротких пептидов (6- аминокислотных остатков), ингибирующих ББВ. Эти пептиды использовались во многих лабораториях in vitro и in vivo для проверки на различных биологических видах, в том числе на человеке, что было описано в более чем 250 публикациях. При этом использовались несколько рациональных подходов.

Идентификация общих аминокислотных последовательностей (IIa) негомологичных белков, взаимодействующих с общим белком-партнером:

некоторые сигнальные белки взаимодействуют с несколькими в целом негомологичными белковыми партнерами; короткие участки гомологии между этими белками могут представлять собой сайт связывания с ферментом.

Пептиды, синтезированные на основе этих данных, могут регулировать ББВ и, следовательно, функцию фермента. Так, короткий участок гомологии между двумя белками, связывающими протеинкиназу С, был использован для синтеза пептида, который ингибировал действие -протеинкиназы С in vivo [69].

(IIб) Консервативные последовательности в пределах гомологичных доменов в ферментах, связанных с клеточными сигналами, могут быть критичными для какой-либо определенной функции. Одним из примеров является домен С2, присутствующий во многих белках. Пространственная структура нескольких С2-доменов имеет общую черту: бета-сэндвич, состоящий из четырех антипараллельных бета-участков. Было показано, что пептиды на основе гомологичных последовательностей синаптотагмина и -протеинкиназы С являются ингибиторами взаимодействия -протеинкиназы С и белка RACK1 и, следовательно, дальнейшей передачи сигнала [65].

В настоящее время помимо С2-домена известно несколько белковых доменов, функция которых главным образом или исключительно состоит в связывании определенных последовательностей в других белках, в частности, SH2, SH3, PDZ и PTB [66]. Известны консенсусные аминокислотные последовательности в белках-пертнерах, узнаваемых этими доменами. Так, SH2-домены содержащими фосфотирозин; SH3-домены, как уже упоминалось, с пролинбогатыми аминокислотными последовательности. Стоит отметить, что часто, как в случае последних двух доменов, эпитоп белка, узнаваемого доменом связывания, является короткой аминокислотной последовательностью, на связывание которой практически не влияет его пространственная структура.

Эти так называемые «короткие линейные мотивы» (short linear motifs) являются особенно перспективными с точки зрения создания пептидных лекарств, как в силу небольшой длины, так и в силу независимости от пространственной структуры, которая может сильно различаться у свободного пептида и пептида в составе белковой молекулы [70, 71].

Если известно, что несколько гомологичных белков с идентичной функцией связываются с одним и тем же белком-партнером (например, вирусные белки различных штаммов и один из клеточных белков), сравнение их аминокислотной последовательности позволяет точно определить консервативные аминокислотные остатки. Если консервативные участки достаточно протяженные, именно их аминокислотную последовательность используют для синтеза пептидов, способных быть антагонистами или синергистами взаимодействия соответствующих полноразмерных белков [72].

С другой стороны, если известно, что гомологичные белки связываются с различными специфичными формами другого белка, например, выполняющего регуляторные функции, то для того, чтобы повлиять на это взаимодействие, необходимо, напротив, искать участки наименьшей гомологии. Именно эти участки могут входить в состав сайта взаимодействия со специфической формой белка-партнера, и пептид-фрагмент такого участка может ингибировать взаимодействие какой-либо конкретной пары изоформ белков, не влияя не связывание в других парах [57].

(IIв) внутримолекулярными взаимодействиями. Внутримолекулярные взаимодействия в пределах различных ферментов удерживают их в неактивном состоянии. Пептиды, соответствующие этим участкам, могут быть агонистами, поскольку они блокируют ингибиторное внутримолекулярное взаимодействие.

Например, пептид-агонист -протеинкиназы С соответствует участку гомологии из шести аминокислотных остатков между -протеинкиназой С и ее RACK-белком – RACK1. Эта последовательность была выбрана, в частности, потому, что в этих белках она отличается на один заряженный аминокислотный остаток, делая возможным предположение о меньшем сродстве пептида из протеинкиназы С, чем пептида на основе последовательности в RACK1.

И действительно, пептид на основе протеинкиназы С в опытах оказался агонистом, а пептид на основе RACK1 – антагонистом [58, 65].

Вирус гриппа А имеет сегментированный РНК-геном, состоящий из минус-цепей РНК, кодирующих 16 белков [2, 73 - 75]: гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матричный белок 1 (М1), протонный канал М2, M42, нуклеопротеин (NP), неструктурный белок 1 (NS1), ядерный экспортный белок (NEP или NS2), белки PB1-F2, PB1-F3 (N40), PA-X, PA-N155, PA-N182, а также три белка, составляющие РНК-полимеразу - PB1, PB2 и РА.

Индивидуальные антигенные свойства вирусам гриппа обеспечивают поверхностные гликопротеины – гемагглютинин и нейраминидаза. К настоящему времени идентифицировано шестнадцать подтипов НА (Н1-Н16) и девять подтипов NA (N1-N9). На их основе построена классификация вирусов гриппа А: H1N1, H3N2 и т.д.

Жизненный цикл вируса гриппа включает в себя следующие стадии [3]:

первичную адсорбцию вирусных частиц на мембране клеток, взаимодействие с сиаловым рецептором, рецептор-зависимый эндоцитоз, образование эндосомы, декапсидацию вируса в эндосоме, выход нуклеоида вируса в цитоплазму, транслокацию нуклеоида в клеточное ядро, транскрипционную активность вирусного рибонуклеопротеина (РНП), репликацию вирусной РНК, транспорт вирус-специфических РНК в цитоплазму инфицированных клеток, трансляцию вирус-специфических матричных РНК (мРНК), подавление синтеза и трансляции клеточных мРНК вирусным белком NS1, накопление вирусспецифических белков, самосборку вирионов, почкование вирусных частиц и их освобождение от мембран инфицированных клеток.

Несмотря на наличие в жизненном цикле вируса множества компонентов, представляющих потенциальную мишень для специфической химиотерапии, на сегодняшний день немногие из них реализованы. В таблице 1 приведены используемые в клинической практике препараты для лечения гриппа, которые воздействуют на вирусные белки [3, 76].

Таблица 1. Этиотропные препараты для терапии гриппа амантадин осельтамивир Поверхностный гликопротеин НА присоединяет вирусную частицу к сиаловой кислоте рецепторов на поверхности клетки-хозяина и способствует высвобождению вирусных РНП-комплексов посредством мембранного слияния [77, 78]. НА представляет собой тример, разделенный на головную часть (head region) и стволовую часть (stem region); каждая из цепей синтезируется как полипептид-предшественник, а затем расщепляется на два фрагмента – НА1 и НА2, соединённых дисульфидной связью. Фрагменты НА1 и НА2 содержат и 221 аминокислотный остаток соответственно. 16 подтипов НА филогенетически делятся на две группы [79]: группу 1, состоящую из Н1, Н2, Н5, Н6, Н8, Н9, Н11, Н12, Н13 и Н16 подтипов; и группу 2, состоящую из Н3, Н4, Н7, Н10, Н14 и Н15 подтипов.

Сайт связывания рецептора находится в головной части гемагглютинина, его окружают три структурных элемента НА1 в пределах каждого мономера, включая спираль-190 (остатки 188-194), петлю-130 (остатки 134-138) и петлюостатки 221-228) [80-83].

В результате компьютерного моделирования Нанди и соавторами [84] было обнаружено два соединения – потенциальных ингибитора гемаггютинина подтипа Н5:

Вундерлих, Габриэль и Бойвин с соавторами [85-87] обнаружили, что связывание трет-бутилгидрохинона с гемагглютинином ингибирует слияние с мембраной, стабилизируя конформацию тримера в фазе, предшествующей слиянию, и предотвращает индуцируемые изменениями рН конформационные изменения НА1, необходимые для мембранного слияния.

Танг с соавторами [88] выявили селективный ингибитор для Н1-подтипа гемагглютинина:

Использующийся в России для лечения и профилактики гриппа препарат арбидол обладает комплексным действием in vivo, и, возможно, препятствует конформационным изменениям гемагглютинина. Развитие резистентности вируса гриппа к арбидолу связано с мутациями гемагглютинина на границе между субъединицами НА1 и НА2 [89].

Поверхностный гликопротеин NA представляет собой тетрамер и отвечает за высвобождение частиц вирусного потомства, отщепляя сиаловую кислоту рецепторов гемагглютинина на поверхности клеток [90], а также обеспечивает подвижность вируса в респираторном тракте [91]. Девять подтипов NA можно разделить на две группы [92]: группу 1, состоящую из N1, N4, N5 и N8 подтипов; и группу 2, состоящую из N2, N3, N6, N7 и N9 подтипов.

Определение структуры нейраминидаз группы 1 в 2006 году показало [92], что в противоположность нейраминидазам группы 2 петля-150 (остатки 147-152) принимает открытую конформацию в апо-форме, открывающей прилегающую к активному центру полость. Также значительная конфигурационная гибкость петли-150 была продемонстрирована с использованием методов молекулярной динамики [93, 94]. Полость- обеспечивает возможности для разработки N1-селективных ингибиторов. Эти задействовавших расчетные методы [95-100]. Рудравар и соавторы [100] в поисках активных производных отталкивались от N-ацетилнейраминовой кислоты, содержащей двойную связь в положении 2 (Neu5Ac2en). Производные данного соединения, содержащие аллильные и арилаллильные заместители в положении 3 селективно ингибировали нейраминидазы группы 1 по сравнению с нейраминидазами группы 2 и были одинаково эффективны против нейраминидаз дикого типа и мутантов His274Tyr. В соответствии с данными авторов [100], заместители действительно занимают полость-150 в кристаллических структурах комплексов NA-ингибиторов.

На основе структур нейраминидаз подтипов N2 и N9 [101, 102] были разработаны два ингибитора [103, 104] – занамивир и осельтамивир, применяемые в настоящее время для лечения гриппа (рисунок 3):

Рис. 3 Ингибиторы нейраминидазы – занамивир и осельтамивир.

Впоследствии были разработаны и другие ингибиторы нейраминидазы [105-108] (рисунок 4).

Рис. 4 Ингибиторы нейраминидазы - А315675, перамивир и ланинамивир (R-125489).

Проблема формирования резистентности вируса гриппа к ингибиторам нейраминидазы не теряет актуальности. Так, в эпидсезон 2008-2009 гг в странах мира были обнаружены штаммы вируса гриппа подтипа H1N1, 95% которых были устойчивы к осельтамивиру. В России доля осельтамивирустойчивых штаммов нарастала с 2005 года и достигла максимума (91%) в эпидсезон 2008-2009 гг, однако с марта 2009 года этот подтип вируса был вытеснен вирусом гриппа A(H1N1)pdm09, чувствительным к осельтамивиру.

На сегодняшний день доля осельтамивир-устойчивых штаммов не превышает 1%. Осельтамивир, в отличие от занамивира, более эффективен для вирусов гриппа с N1, N4, N5, N8 подтипами нейраминидазы, в то время как занамивир более эффективен для N2, N3, N6, N7 и N9 подтипов нейраминидаз [89].

Наиболее известными мутациями вируса гриппа, приводящими к нейраминидазах подтипа 1 и 2 соответственно [109]. Вирусы, имеющие одну из указанных мутаций, чувствительны к А315675, но лишь частично чувствительны к перамивиру [109]. Мутация Arg292Lys также придаёт частичную устойчивость к занамивиру [109, 110], использование которого приводит к появлению мутации Arg152Lys [89].

Белок М2 образует протонный канал в вирусной мембране, который необходим для снижения значения рН внутри вирусных частиц после попадания их в эндосомы. Таким образом запускаются конформационные изменения в гемагглютинине, приводящие к слиянию вирусной оболочки с мембраной эндосомы. Белок М2 представляет собой тетрамер, каждый мономер которого имеет 97 аминокислотных остатков. 25 N-концевых аминокислотных остатков являются внешними по отношению к вирусной мембране; следующие 21 аминокислотный остаток образуют одинарную трансмембранную спираль, за которой следует амфипатическая спираль из аминокислотных остатков, которая находится на поверхности раздела вирусной мембраны [111]; 35 С-концевых аминокислотных остатка находятся внутри вируса. Амфипатическая спираль связана с отпочковыванием вируса [112], а Сконцевой сегмент вовлечён в связывание с белком М1 [113].

Домен проводимости белка М2 содержит окружающий пору кластер His37-Trp41 (H37-W41) (рисунок 5). Остаток гистидина в положении отвечает как за активацию канала [114], так и за протонную селективность [115], тогда как остаток триптофана в положении 41 является ”воротами” канала, препятствуя прохождению тока протонов наружу [116].

Рис. 5 Домен проводимости белка М2, содержащий связанный амантадин (показан розовым). Желтым окрашена область, соответствующая вирусной мембране [117].

Поскольку кластер H37-W41 играет важную функциональную роль, он представляется многообещающей мишенью для разработки ингибиторов, устойчивых к вирусным мутациям [117].

адамантанового ряда - амантадина и ремантадина (рисунок 6):

Рис. 6 Ингибиторы белка М2 – амантадин и ремантадин.

Амантадин разрабатывался для лечения болезни Паркинсона, однако в ходе клинических испытаний была обнаружена активность препарата в отношении вируса гриппа [118], после чего амантадин стали использовать для профилактики и лечения гриппа А. Амантадин и ремантадин одобрены американским управлением FDA для лечения гриппа, в России для этих целей применяется ремантадин, тогда как амантадин - преимущественно для лечения болезни Паркинсона. Стоит отметить, что препараты адамантанового ряда неэффективны против гриппа В, поскольку этот тип вируса имеет другой белок (NB), аналогичный белку М2, но не содержащий адамантан-связывающего сайта.

Амантадин и ремантадин блокируют ионный канал, связываясь с тем сайтом в поре канала, в котором обнаруживаются мутации, приводящие к развитию резистентности вируса к данным препаратам [111, 119-123].

В поиске ингибиторов мутантных белков М2 исследователи [124-127] опирались на структуру амантадина, в результате чего были обнаружены более эффективные ингибиторы белка М2 дикого типа, чем амантадин, однако эти соединения оказались неэффективными против мутантов, устойчивых к амантадину.

Авторами [128] был предложен новый ингибитор белка М2 - соединение BL1743:

Исследователям [129-132] удалось разработать эффективные ингибиторы белков М2, имеющих мутации Val27Ala и Leu26Phe. Одно из таких соединений приведено ниже [131]:

Белок NP является тримером, контакты трех субъединиц (А, В и С) показаны на рисунке 7. Основная функция нуклеопротеина – заключать в капсид сегментированную РНК и связываться с тремя субъединицами РНКполимеразы для того, чтобы образовать рибонуклеопротеин (РНП), необходимый для транскрипции, репликации и упаковки РНК [133]. В каждом РНП вирусная РНК обёрнута вокруг собственной молекулы NP, которые связаны следующим образом: "хвостовая петля" (tail loop) (остатки 402-428) одной молекулы NP (498 остатков) спрятана внутри соседней молекулы NP [134, 135]. Частицы РНП связываются с белком М1 для экспорта из ядра клетки-хозяина [136].

Рис. 7 Межсубъединичные контакты белка NP. Субъединицы А, В и С показаны зеленым, красным и желтым цветами соответственно [134].

Авторами [137] было обнаружено, что нуклеозин вызывает агрегацию нуклеопротеина и ингибирует вирусную репликацию:

Карман, связывающий домен хвостовой петли (tail-loop binding pocket) в белке NP, а также РНК-связывающая бороздка (RNA binding groove) являются мишенями для рационального поиска лекарств (рисунок 8) [117]. Было установлено, что олигомеризация NP, опосредованная связыванием хвостпетля, играет важную роль в траскрипционной и репликационной активности частиц РНП, а ионные взаимодействия между остатком глутаминовой кислоты в положении 339 и остатком аргинина в положении 416 важны для связывания хвостовой петли [138].

Рис. 8 Структура мономера белка NP с хвостовой петлей (показана красным). Ионные взаимодействия, важные для связывания хвост-петля, показаны на врезке [117].

Авторами [139] был обнаружен ингибитор олигомеризации белка NP, способный подавлять вирусную репликацию у штаммов не только дикого типа, но и устойчивых к нуклеозину:

Федичевым и соавторами [140] был предложен потенциальный блокатор нуклеопротеина, воздействующий, согласно расчетным данным, на (binder) РНК-связывающую бороздку:

Данное соединение ингибировало репликацию вируса гриппа А как in vitro, так и in vivo.

Матричный белок 1 (М1) содержит 252 аминокислотных остатка и является важным структурным элементом частиц вируса гриппа А. В вирионе М1 образует промежуточный слой между связанными с мембраной НА, NA и М2 белками и восемью частицами РНП. В ядре заражённых клеток связывание М1 с вновь собранными частицами РНП играет важную роль в их экспорте [141]. М1 также важен при отпочковывании вируса [142].

Аминокислотные остатки 1-67 и 89-164 образуют пучок (bundle) из четырёх спиралей, которые укладываются в стопку друг за другом, линкер между ними также содержит короткую спираль [143, 144]. Структура Сконцевого участка не установлена, однако известно, что в ней содержится значительное число спиралей [144]. Средний домен содержит мотив ArgLysLeuLysArg105, который является клеточным сигналом внутриядерной локализации, и играет важную роль в импорте М1 в ядро заражённых клеток [145]. Этот основной мотив также вовлечён в связывание М1 с NEP [146].

Белок М42 длиннее белка М2 на два аминокислотных остатка и идентичен ему, начиная с десятого аминокислотного остатка. Известно, что белок М42 обладает всеми основными функциями белка М2 и отличается, по крайней мере, по антигенным свойствам за счет первых девяти остатков, специфичных для М42 [75].

Основные функции NS1 – подавление иммунного ответа организма, связанного с выделением зараженными клетками интерферона [147], а также регуляция синтеза вирусной РНК. В зависимости от штамма NS1 состоит из или 237 аминокислотных остатков и образует димер. Его можно разделить на два функциональных домена: N-концевой домен (остатки 1-73), который связывает двунитевую РНК [148], и С-концевой эффекторный домен (effector domain) (остатки 74-230/7), который связывает множество клеточных белков [147], включая CPSF30 – белок, необходимый для обработки 3'-конца всех клеточных пре-мРНК [149]. Авторы идентифицировали четыре соединения, способных ингибировать NS1, но при этом не было установлено сайтов связывания с этим белком.

Данный белок содержит 121 аминокислотный остаток, первые десять остатков которого идентичны таковым в белке NS1. Белок NEP является вторым белком-адаптором между частицами РНП и клеточным белком Crm1, который опосредует ядерный экспорт многих белков, содержащих богатый лейцином сигнал ядерного экспорта (NES, nuclear export signal) [146]. Nконцевой участок (остатки 1-54) NEP несёт мотив NES и связывает белок Crm1. С-концевой участок (остатки 63-116) имеет форму спиралевидной шпильки. Было установлено, что остаток триптофана в положении 78 играет ключевую роль для сайта связывания белка М1. Кроме того, белок NEP участвует в регуляции транскрипции и трансляции вирусных белков [151, 152].

Этот фермент вируса гриппа является гетеротримерным комплексом с массой 250 кДа, состоящим из трех белков: РА, РВ1 и РВ2. РНК-полимераза играет центральную роль в жизненном цикле вируса и непосредственно отвечает за синтез РНК. Полимераза вируса гриппа способна de novo реплицировать геномную РНК вируса в два шага. Первый шаг — репликация (вРНК — кРНК — вРНК) — заключается в синтезе комплементарной РНК (кРНК) на матрице вирусной РНК (вРНК), после чего происходит синтез вРНК с кРНК-матрицы, что завершает репликацию геномной РНК. Шаг транскрипции (вРНК — мРНК) заключается в синтезе в транскрибировании мРНК с вРНК-матрицы с использованием кэпированных праймеров мРНК (кэпснэтчинг). До сих пор не ясно, как регулируются все эти различные функции, осуществляемые одним большим белковым комплексом. Некоторые данные позволяют предположить существование различных состояний комплекса, соответствующих разным конформациям, между которыми полимераза может переключаться, переходя из режима репликазы в режим транскриптазы и обратно. Однако, согласно другим данным, вРНП, выделенных из вируса, было достаточно для синтеза РНК обоих типов in vitro. Поэтому было сделано предположение о том, что полимеразный комплекс способен одновременно синтезировать и мРНК, и кРНК [153].

2.3.8.1 Структурная организация и функции На данный момент детальная структурная модель гетеротримерного комплекса полимеразы вируса гриппа отсутствует, однако существуют модели на основе изображений с низким разрешением, полученные с помощью электронной микроскопии, для полимеразы как в составе вРНП-комплекса с РНК и нуклеопротеином (NP), так и для изолированной полимеразы. На рисунке 9 приведена структура комплекса, реконструированная при помощи электронно-микроскопического анализа рекомбинантных белков, входящих в его состав.

Рис. 9 Пространственная структура полимеразного комплекса вируса гриппа. А – растворимый тример, В, С – связанный с РНП [51].

Гетеротример полимеразы плотно упакован с полой центральной частью и без четких границ между субъединицами и доменами. Модели полимеразы в составе вРНП и изолированного гетеротримера полимеразы имеют различные конформации: полимераза, ассоциированная с вРНП выглядит более компактной, чем изолированная полимераза, что позволяет предположить, что при активации комплекс, возможно, претерпевает конформационные изменения [153]. Схема структурной организации полимеразного комплекса показана на рисунке 10.

Рис. 10 Схема структурной организации РНК-полимеразы вируса гриппа. Косыми линиями показаны взаимодействующие участки субъединиц.

Считается, что белок РВ1 является наиболее важным компонентом полимеразного комплекса и взаимодействует непосредственно с белками РА и РВ2. До сих пор не было свидетельств непосредственного контакта между белками РА и РВ2 [154], однако есть данные, указывающие на то, что в клетке они взаимодействуют, правда на три порядка слабее, чем при взаимодействии белков РА-РВ1 или РВ1-РВ2. Функции различных субъединиц все еще вызывают разногласия, но для белков РВ1 и РВ2 они определены более четко [155]. РВ1 — главная белковая субъединица для РНК-полимеразной активности; она связывается с вирусным промотором и отвечает за удлинение вирусной РНК и отщепление РНК-кэпа [156]. Субъединица РВ2 необходима для транскрипции вРНК [155] и может связываться с метилированным кэпом- хозяйских РНК для отщепления с помощью субъединицы РВ1 [157]. Гиллигэй и соавторами были опубликованы данные, демонстрирующие основы связывания кэпа субъединицей РВ2 [158].

Авторами [159] было идентифицировано соединение RO 0794238, которое является PB2-специфическим ингибитором связывания кэпа:

Вероятно, данное соединение связывается с минорным m7-карманом кэпсвязывающего сайта PB2.

В работе [160] было показано, что соединение T-705 обладает высокой активностью в отношении вируса гриппа, в том числе в отношении штаммов, устойчивых к ремантадину и оселтамивиру:

Роль белка РА в полимеразном гетеротримере выяснена лишь частично.

Есть сообщения о том, что он необходим для репликации и транскрипции РНК, а также для эндонуклеазного отщепления РНК-кэп-праймера [161, 162].

Проведённый авторами [163] скрининг 33-х макроциклицеских соединений позволил идентифицировать марчантин Е в качестве ингибитора эндонуклеазной активности РА. Есть данные о том, что субъединица РА также индуцирует протеолиз вирусных и хозяйских белков и, возможно, участвует в сборке вируса [164, 165].

Архитектура полимеразного комплекса интенсивно исследовалась с целью определения минимального набора компонентов, необходимого для вирусной транскрипции или репликации. Есть сообщения о том, что белок РВ не требуется для репликации и одна лишь субъединица РВ1 способна синтезировать РНК [166]. Было показано, что димер РВ1-РА синтезирует de novo транскрипт длиной в 53 нуклеотида с использованием вРНК-промотора, но не способен эффективно синтезировать РНК с кРНК-промотора [167].

Однако другие исследователи [168], используя рекомбинантный белковый комплекс, продемонстрировали, что только гетеротример способен синтезировать динуклеотиды pppApG, а димеры РВ1-РВ2 или РВ1-РА не способны осуществлять этот процесс, что согласуется с результатами предыдущих исследований, в одном из которых показана необходимость белка РВ2 для репликации [169, 170]. Точечная мутация в положении 510 белка РА, приводящая к нарушению синтеза вирусной мРНК, указывает на то, что субъединица РА также необходима для транскрипции [171]. Таким образом, вероятнее всего, для эффективной транскрипции и репликации вируса гриппа необходимы все три субъединицы.

Как было упомянуто выше, белки РА и РВ1 образуют стабильный комплекс, что было установлено в опытах на дрожжевых клетках с помощью так называемого двухгибридного метода. Путем исследования связывания белка РА и рекомбинантных белков РВ1, содержащих делеции в различных положениях, было установлено, что для образования комплекса РВ1-РА достаточно сегмента из первых 48 N-концевых аминокислотных остатков белка РВ1 [172] (таблица 2).

Таблица 2. Влияние положения делетированного участка белка РВ1 на связывание с белком РА [172] белок GAL4PB1 мутантные белки с делециями плазмида связывание белка В последующем с помощью двухгибридного метода удалось уточнить размер этого сегмента до первых N-25 концевых аминокислотных остатков. В этой работе с помощью сайт-специфического мутагенеза были также получены варианты белка РВ1, имеющие мутации в N-концевом участке, и путем оценки аминокислотных остатка. Также было проанализировано влияние этих мутаций на жизнеспособность вируса, которая в большинстве случаев была значительно снижена [173].

Дальнейшие работы были сосредоточены на оценке влияния пептидных ингибиторов на репликацию вируса в клеточной культуре. В одной из работ использовался фрагмент 1-25 белка РВ1, синтезируемый в одной рамке считывания с маркером – зеленым флуоресцентным белком, что кодировалось плазмидой, которой трансформировали клетки. При заражении этих клеток вирусом гриппа А наблюдали подавление вирусной репликации [174].

В другой работе использовался более короткий N-концевой пептид, отличающийся от соответствующей последовательности вируса гриппа В только в одном положении. Пептид был модифицирован с помощью Tat-пептида, позволяющего проникать в клетку. Было показано, что исследуемое соединение подавляет репликацию вируса гриппа А и В [175].

С учетом этой информации две группы исследователей с помощью рентгеноструктурного анализа определили структуры комплексов фрагментов соответствующих белков, демонстрирующие взаимодействие между субъединицами РА и РВ1. В первом исследовании были проанализированы клонированные С-концевой фрагмент РА, соответствующий остаткам 257- соответствующий остаткам 2-25 [176] (рисунок 11).

Рис. 11 Доменная структура С-концевой части белка РА и положение N-концевого пептида РВ1 в комплексе с белком РА по Хе и соавт. (2008) [176].

Во втором исследовании были проанализированы клонированные Сконцевой фрагмент РА, соответствующий остаткам 239-716 штамма А/Puerto Rico/8/1934 (H5N1) и N-концевой фрагмент РВ1, соответствующий остаткам 1Структура была определена с разрешением 2,9 и 3, соответственно.

Пространственные структуры, полученные этими двумя группами исследователей, демонстрируют сходный тип взаимодействия РА и РВ1.

Исследованные фрагменты белка РА организованы в виде двух доменов:

домена I (“brain”), состоящего из семи -слоев, окруженных пятью -спиралями и короткой 310-спиралью, и домена II (“mouth”), состоящий из семи -слоев и восьми -спиралей (рисунок 11). N-концевой фрагмент белка РВ1 (PB1N), включающий аминокислотные остатки 1-15, имеет спиральную конформацию и расположен между четырьмя спиралями домена II белка РА, приблизительно параллельно по отношению к ним, причем N-конец белка РВ1 направлен внутрь домена II субъединицы РА. Четыре -спиральных сегмента белка РА образуют гидрофобный карман, находящийся в тесном взаимодействии с фрагментом белка РВ1 посредством гидрофобных взаимодействий, водородных связей и Ван-дер-Ваальсовых сил (рисунок 12).

Рис. 12 Пространственная структура комплекса С-концевого фрагмента белка РА и N-концевого фрагмента белка РВ1 на основе рентгеноструктурного анализа (слева, рисунки a) и b), модель гидрофобных контактов (вверху справа) и водородных связей (внизу справа) по Обаяши и соавт. (2008) [177].

Согласно полученным пространственным структурам, короткий мотив LeuLeuPheLeu, включающий аминокислотные остатки 7-10 белка PB1, взаимодействует с гидрофобным кором С-концевого фрагмента белка РА, который образован аминокислотными остатками Phe411, Met595, Leu666, Trp706, Phe710 и Leu640. Кроме того, посредством водородных связей остаток Trp706 белка РА контактирует с остатками Val3 и Asn4 белка PB1, остатки Gln408 и Asn412 белка РА контактируют с остатками Val3 и Asp2 белка PB1, а остаток Gln670 - с остатками Phe9, Val12, Pro13 и Ala14 белка PB1 (рисунок 13). Двойные мутации белка РА в положениях Trp706Ala/Gln670Ala, Leu666Gly/Phe710Glu, Leu666Gly/Phe710Gly и Trp706Ala/Phe710Gln нарушают связывание N-концевого фрагмента белка PB1 с С-концевым фрагментом белка РА.

Рис. 13 Схема водородных связей между аминокислотными остатками С-концевого фрагмента белка РА и N-концевого фрагмента белка PB1 [178].

В работе Вундерлиха и соавторов была проведена детальная оценка значимости каждого из первых 15 N-концевых аминокислотных остатка белка РВ1 для связывания с белком РА, а также были выявлены замены, увеличивающие связывание с белком РА. В результате было выяснено, что помимо кора 5-11 для связывания in vitro с белком РА важны также остатки 1, 3, 12, 14 и 15 [179]. Ключевая роль кора 5-11 подтверждается также данными по количественной оценке взаимодействия серии N-концевых фрагментов белка РВ1 с белком РА [175].

2.3.8.3 Перспективы разработки противовирусных средств N-концевой фрагмент белка PB1 ингибирует репликацию вируса гриппа А, подавляя полимеразную активность [174], вероятнее всего, за счет блокирования сборки полимеразного гетеротримера. Данные о структуре Сконцевого фрагмента белка РА позволяют определить участок, отвечающий за связывание с белком РВ1, и поэтому могут быть использованы как основа для разработки новых соединений, подавляющих сборку и активность РНКполимеразы. Обычно в белок-белковых контактах задействована большая площадь поверхности, что создает проблемы для разработки новых лекарств.

Однако в данном случае в образовании связей между белками РВ1 и РА участвует относительно небольшое число аминокислотных остатков, что делает осуществимым дизайн малых молекул-ингибиторов этого взаимодействия.

Было показано, что замена определенных аминокислотных остатков в Nконцевой части белка PB1, включая остатки Val3, Asn4, Leu7, Leu8, Pro5, Phe и Leu10, приводит к снижению эффективности связывания более чем на две трети со значительным уменьшением полимеразной активности и репликации вируса. Мутации Asp2Val и Ala14Asp в белке PB1 не снижают значительно сродство этого пептида к белку РА, но подавляют полимеразную активность и вирусную репродукцию, что указывает на то, что у этих аминокислотных остатков есть другие важные функции. Мутация Leu13Pro в белке РВ1 вируса субтипа Н7N7 связана с повышенной вирулентностью [180]. Согласно структурным данным, замена остатка лейцина на пролин в положении должна нарушить целостность спирали, и связанные с этим структурные изменения могут привести к увеличению эффективности синтеза РНК субъединицей РВ1. Аминокислотные остатки N-концевой части белка PB1, взаимодействующие с белком РА, консервативны во всей группе типов вируса гриппа А, В и С, как и аминокислотные остатки белка РА, взаимодействующие с белком PB1, настолько же консервативны. Поэтому предполагается, что ингибирующие пептиды или другие соединения, разработанные на основе аминокислотной последовательности N-концевой части белка PB1 будут эффективны в отношении большинства штаммов вируса гриппа А. Кроме того, высокая консервативность PB1N-связывающего сайта белка РА предполагает то, что противовирусные препараты, нацеленные на этот сайт, будут меньше подвержены проблемам формирования устойчивости к ним, которые создают трудности в применении лекарственных средств, направленных против нейраминидазы.

Как уже упоминалось, синтетические пептиды, разработанные на основе PB1N, показали высокое сродство к С-концевому фрагменту белка РА in vitro и способны блокировать образование функционального комплекса белков РА и РВ1. Однако при этом проблема проникновения в клетку решалась либо за счет трансформации клеток соответствующей генетической конструкцией, что неприемлемо при терапевтическом использовании, либо за счет добавления дополнительной аминокислотной последовательности, способствующей проникновению в клетку. Это делает актуальным проверку ингибирующих свойств пептидов по отношению к репликации вируса на клеточных культурах, помимо оценки связывания с РА in vitro. Кроме того, нельзя считать законченным поиск оптимальной аминокислотной последовательности ингибирующего полимеразу пептида, которая должна оптимально сочетать в себе связывание с белком-мишенью, способность проникать в клетку с минимумом модификаций, а также приемлемую длину. Ввиду вышеуказанных причин представляется перспективным направление исследований, ставящих своей целью разработку противогриппозных средств, направленных на специфическое подавление сборки вирусной РНК-полимеразы.

Для начала синтеза мРНК вируса гриппа необходимо предварительное отщепление от хозяйской пре-мРНК олигонуклеотида, содержащего 5’-кэп – процесс, получивший название кэп-снэтчинг (cap snatching). Олигонуклеотид затем удлиняется с использованием вирусной РНК в качестве матрицы.

Ключевым событием в инициации синтеза вирусной мРНК является образование комплекса между РНК-связывающей субъединицей полимеразы РВ1 и кэп-связывающей субъединицей РВ2 [181]. При этом со стороны одной из субъединиц во взаимодействии участвует короткий N-концевой участок - так же, как и в случае взаимодействия белков РВ1 и РА [176, 177] (рисунок 14). И точно так же это открывает возможности для ингибирования взаимодействия посредством низкомолекулярных соединений, в частности, пептидов [182].

Рис. 14 Схема расположения функциональных доменов и участков взаимодействия субъединиц полимеразы вируса гриппа. Черным отмечены остатки, определяющие специфичность к хозяину. Также отмечены мотивы pre-A, B, C, D и Е полимеразного домена субъединицы РВ1 [181].

иммунопреципитации и введением делеций указывали на наличие двух контактов между субъединицами РВ2 и РВ1 [154], в последних работах достоверно показано наличие одного такого контакта; прочие участки взаимодействия, если имеются, то играют второстепенную роль [182, 183]. Так, опыты с использованием копреципитации показали, что стабильный комплекс образуется между 86 С-концевыми аминокислотными остатками субъединицы РВ1 (678-757) и 37 N-терминальными остатками РВ2 (1-37) [183]. При этом сравнение аминокислотных последовательностей различных штаммов, в частности, птичьих и человеческих, демонстрирует, что эти участки являются высококонсервативными [182].

Рентгеноструктурный анализ кристаллов комплекса соответствующих фрагментов белков РВ1 и РВ2 выявил, что каждый из этих фрагментов организован в виде трех -спиралей. В отличие от контакта субъединиц РВ1 и РА, где главную роль играют гидрофобные взаимодействия [176, 177], во взаимодействии белков РВ1 и РВ2 преобладают водородные связи и ионные взаимодействия [182]. Со стороны белка РВ2 почти все аминокислотные остатки, взаимодействующие с белком РВ1, сосредоточены в N-концевой спирали, которая соответствует аминокислотным остаткам 1-12 (рисунок 15).

Рис. 15 Схема взаимодействия субъединиц РВ1 и РВ2 полимеразы вируса гриппа с указанием аминокислотных остатков, предположительно образующих контакты [182].

Анализ мутантов показал, что замены остатков лейцина в положении 7 в белке РВ2, и, в несколько меньшей степени, изолейцина в положении 4 на аспарагиновую кислоту, а также двойные мутации Ile4Ser/Leu7Ser и Leu7Ser/Leu10Ser заметно подавляют связывание С-концевого фрагмента РВ1 с N-концевым фрагментом РВ2 и синтез вирусной мРНК, что свидетельствует о важности остатков Ile-4, Leu-10 и, в особенности, Leu-7 субъединицы РВ2.

Ключевая роль остатка Leu-7 субъединицы РВ2 подтверждается его непосредственной близостью с остатками Phe-699 и Leu-715 белка РВ1 в исследованном комплексе, что указывает на возможное гидрофобное взаимодействие между ними [182]. С другой стороны, замены в участке взаимодействия субъединицы РВ1 имеют менее однозначный эффект. Так, двойные мутации Val715Ser/Ile750Ser и Ile746Ser/Ile750Ser подавляют синтез вирусной мРНК, хоть в меньшей степени, чем вышеупомянутые мутации в Nконцевой части РВ2. Мутация Leu695Asp также снижает активность полимеразы, но очень незначительно. Однако мутации Ile750Asp и Phe699Ala ослабляют связь между С-концевым фрагментом РВ1 и N-концевым фрагментом РВ2, но повышают активность полимеразы. Напротив, мутация Val715Ser, активность полимеразы [182]. Результаты анализа указанных аминокислотных замен в C-концевой области белка РВ1 свидетельствуют о том, что контакт субъединиц РВ1 и РВ2 является не просто местом прикрепления одной субъединицы к другой, а играет более сложную регуляторную роль, обладая структурной и функциональной гибкостью. Это необходимо учитывать при создании ингибиторов взаимодействия этих двух субъединиц. Тем не менее, с учетом компактности области контакта и консервативности соответствующей аминокислотной последовательности участки взаимодействия субъединиц РВ и РВ2 сохраняют перспективность как мишень для противовирусных препаратов.

Также, как и белок РВ1, данные белки кодируются сегментом вирусного генома. Белок PB1-F2, содержащий 87-90 аминокислотных остатков, образуется при начале трансляции с альтернативного старт-кодона и в другой рамке считывания, нежели белок PB1 и локализуется в митохондриальных мембранах. Функции PB1-F2 разнообразны и включают, по крайней мере, у изученных вирусных штаммов, активацию апоптоза, а также регуляцию интерферонового ответа организма на вирусную инфекцию. Белок PB1-N транслируется в той же рамке считывания, что и PB1, но с другого старт-кодона и является вариантом белка PB1, укороченным с N-конца на аминокислотных остатков. Его функции в настоящее время достоверно неизвестны [184].

Сегментом 3 вирусного генома кодируются белки PA и PA-X, последний способен подавлять экспрессию клеточных генов, снижать вирулентность и регулировать различные сигнальные пути в реакции организма на гриппозную инфекцию. Белок PA-X образуется за счет сдвига рамки считывания в процессе трансляции белка PA и содержит N-концевую часть белка РА длиной в аминокислотный остаток и отличную от белка PA С-концевую часть длиной в 60 или, реже, 40 аминокислотных остатков [73].

Есть сообщения о том, что в клетках, инфицированных различными штаммами вируса гриппа А, синтезируются укороченные с N-конца варианты белка PA, обозначаемые как PA-N155 и PA-N182. Эти белки образуются за счет начала трансляции с одиннадцатого и тринадцатого старт-кодонов соответственно, находящихся в той рамке считывания, что и белок PA.

Одновременная экспрессия белков PA-N155 и PA-N182 и субъединиц полимеразы PB1 и PB2 не приводит к появлению полимеразной активности, но при отсутствии белков PA-N155 и PA-N182 вирус размножается медленнее и обладает более низкой патогенностью [74].

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

аминокислотной последовательности белка РВ1 (штамм A/Hong Kong/156/97(H5N1)) были выбраны выделенные на рисунке 16 области: 1-30, 111-130, 271-290, 381-420, 525-540.

высокопатогенного штамма H5N1 и наиболее актуального A/California/07/ (H1N1) pdm09 отличаются лишь на 1 неэквивалентную замену Met119Val.

Рис. 16 Аминокислотная последовательность белка РВ1 вируса гриппа A/Hong Kong/156/97(H5N1) [185]. Серым цветом выделены выбранные для исследования области.

Из литературы известно, что наиболее важным для связывания с белком РА является фрагмент 1-15 белка РВ1 [179]. Наличие в клетке фрагмента 1- белка РВ1 подавляет репликацию вируса в клетке [174]. Авторы исследований при этом полагают, что пептидный ингибитор конкурирует с белком РВ1 за связывание с белком РА. Учитывая вышеперечисленное, мы решили более детально изучить эту область.

При анализе первичной структуры N-концевой части белка РВ1 было установлено, что фрагмент 6-25 содержит зеркально-симметричный мотив (рисунок 17). Из литературы известно, что такие мотивы чаще встречаются вблизи функционально значимых участков белков [186].

Рис. 17 Зеркально-симметричный мотив в структуре фрагмента 6-25 белка РВ1.

Аминокислотные остатки в симметричных позициях обозначены жирным шрифтом, а взаимодействующие с белком РА подчёркнуты.

Для изучения пространственной структуры фрагмента 6-25 сотрудниками лаборатории структурной и функциональной протеомики НИИ Гриппа было проведено компьютерное моделирование структуры этого пептида методами молекулярной динамики. По расчетным данным, соединение образует структуры типа -шпильки (рисунок 18); аминокислотные остатки, необходимые для стабилизации данной структуры, находятся в районе фрагмента 6-13 [187].

Рис. 18 Пространственная структура фрагмента 6-25 белка РВ1 по данным компьютерного моделирования.

По результатам моделирования пространственной структуры фрагмента 6-13 было установлено, что данный пептид склонен к образованию линейной структуры и не образует внутримолекулярные связи. На основании вышеизложенного мы предполагаем, что фрагменты 6-13 и 6-25 белка РВ могут взаимодействовать друг с другом вследствие конкуренции за внутримолекулярные связи фрагмента 6-13 с той частью молекулы пептида 6которая образует -структуру. Таким образом возможна стабилизация Nконцевой части белка РВ1 в виде -структуры, препятствующей взаимодействию белков РВ1 и РА, что, как следствие, будет приводить к ингибированию вирусной репликации в клетке.

Выбор пептидов, не принадлежащих N-концу белка РВ1, был во многом произвольным, при этом принимались во внимание такие факторы, как гидрофобность, растворимость, способность проникать сквозь клеточную мембрану, наличие кластеров повторяющихся аминокислотных остатков.

Так, например, фрагмент 525-540 белка РВ1 был выбран, поскольку содержит кластер из остатков аспарагина. Известно, что кластеры остатков аспарагина или глутамина повышают склонность белков к образованию амилоидных агрегатов, где преобладает -складчатая структура [188, 189]. На основании вышесказанного было сделано предположение, что пептид РВ1 531может быть блокатором образования -складчатой структуры и нарушать стабильность соответствующего домена полноразмерного белка. По сходному принципу был выбран участок 111-130, содержащий повтор глутамина, а также повтор остатков валина.

Сравнение различных вариантов проводилось согласно расчетам индексов, предложенных в 2005 году Хэлбринком и соавторами [190].

В результате для синтеза были выбраны следующие пептиды - фрагменты белка PB1: 1-5, 1-25, 6-13, 6-14, 6-25, 14-25, 26-30, 111-130, 271-290, 381-386, 381-390, 381-400, 391-400, 395-400, 411-420, 525-530, 525-535, 531-540.

Синтез пептидов проводили твердофазным методом на 2хлортритилхлоридной и Ринк-амидной смолах по Fmoc-/t-Bu стратегии с использованием как стандартных методик последовательного наращивания цепи, так и конвергентного подхода [44]. Очистку полученных пептидов проводили методом препаративной обращеннофазной ВЭЖХ, их структура подтверждена масс-спектрометрически (ESI).

Для фрагментов 6-13, 6-14, 26-30, 395-400 и 531-540 были получены амиды, а также N-ацетилированные производные пептидов и их амидов.

Аминокислотные последовательности синтезированных пептидов и их производных представлены в таблицах 3 и 4 соответственно.

Таблица 3. Базовые пептиды 1- Leu8-Phe9-Leu10-Lys11-Val12-Pro13-||-Ala14- H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-||- Ala9-Gln10-Asn11-Ala12-Ile13-Ser14-Thr15-Thr16- H-Met1-Glu2-Val3-Val4-Gln5-||-Gln6-Thr7-Arg8- Met9-Asp10-Lys11-Leu12-Thr13-||-Gln14-Gly15- H-Phe1-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg6-||-Lys7-Lys8- Ile9-Glu10-Lys11-Ile12-Arg13-Pro14-||-Leu15- H-Met1-Phe2-Asn3-Met4-Leu5-Ser6-Thr7-Val8- H-Lys1-Asn2-Asn3-Met4-Ile5-Asn6-Asn7-Asp8- Примечание: знаком || обозначены фрагменты для конвергентного синтеза.

*выход приведен для пептида, синтезированного последовательным наращиванием пептидной цепи Таблица 4. Производные базовых пептидов 3 а-в, 4 а-г, 7 а-в, 14 а-в, 18 а-в H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-NH Ac-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-OH Ac-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-NH FITC-Ahx1-Thr2-Leu3-Leu4-Phe5-Leu6-Lys7-Val8- 3.1.1 Последовательное наращивание пептидной цепи Все представленные в таблице 1 пептиды, кроме PB1(111-130) и PB1(381были синтезированы последовательным наращиванием пептидной цепи по одной аминокислоте. Пептид РВ1 (1-25) был синтезирован двумя способами – указанным выше, а также конвергентно.

Синтетические проблемы при “посадке” следующего аминокислотного остатка или же деблокировании Fmoc-группы при синтезе всех обсуждаемых пространственно-затрудненными защищенными аминокислотами – Val, Leu, Ile, Asn, Gln, а также Lys, особенно, если таковые оказывались соседними в аминокислотной последовательности.

Фрагмент 111-130 белка РВ1 (соединение 8) не удалось получить последовательным наращиванием пептидной цепи - проблемы в синтезе были отмечены при присоединении остатка глутамина в положении 6:

Fmoc-Gln6(Trt)-OH H2N-Thr7(t-Bu)-Arg8(Pbf)-Met9-Asp10(O-tBu)-Lys11(Boc)Leu12-Thr13(t-Bu)-Gln14(Trt)-Gly15-Arg16(Pbf)-Gln17(Trt)-Thr18(t-Bu)-Tyr19(t-Bu)- Asp20(O-tBu) Fmoc-Gln (Trt)-Thr (t-Bu)-Arg (Pbf)-Met9-Asp10(O-tBu)-Lys11(Boc)-Leu12- Thr13(t-Bu)-Gln14(Trt)-Gly15-Arg16(Pbf)-Gln17(Trt)-Thr18(t-Bu)-Tyr19(t-Bu)-Asp20(O- tBu) Реакцию не удавалось провести до конца. Хроматограмма полученной после финального деблокирования смеси продуктов содержала два пика, отвечающие, по данным масс-спектрометрии, пептидам 6-20 и 7-20 соответственно:

H-Thr-Arg-Met-Asp-Lys-Leu-Thr-Gln-Gly-Arg-Gln-Thr-Tyr-Asp-OH H-Gln-Thr-Arg-Met-Asp-Lys-Leu-Thr-Gln-Gly-Arg-Gln-Thr-Tyr-Asp-OH Целевое соединение удалось получить конвергентным методом при использовании фрагментов 1-5, 6-13 и 14-20.

последовательным наращиванием пептидной цепи, содержит два остатка метионина в положениях 19 и 20. После финального деблокирования данного пептида на хроматограмме полученной смеси присутствовало 4 пика (рисунок 19а).

Рис. 19 Хроматограммы пептида PB1(271-290) восстановления.

Мы предположили, что пики 1-3 соответствуют соединениям, содержащим окисленные формы остатков метионина (рисунок 21):

Рис. 21 Окисленные формы остатков метионина.

Действительно, восстановление данной смеси с помощью 1,2-этандитиола и триметилбромсилана в растворе трифторуксусной кислоты привело к целевому соединению, соответствующему пику 4 (рисунок 19б).

Аналогичная картина наблюдалась с пептидом PB1 (525-535) (соединение 17), содержащим один остаток метионина в положении 10 – на рисунке представлены хроматограммы до (а) и после (б) его восстановления: пики 1 и соответствуют окисленной форме, а пик 2 - целевому соединению. Пику соответствует Fmoc-защищенный пептид, что подтверждается исчезновением данной группы пиков (3 и 4) после обработки смеси водным раствором аммиака.

Синтез фрагмента 6-13 белка РВ1 (соединение 3) и его Nацетилированного производного (соединение 3б, таблица 2) H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-OH Ac-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-OH не представляет сложностей в условиях твердофазного синтеза. Однако синтез в таких же условиях фрагмента 6-14 белка РВ1 и его N-ацетилированного производного (соединения 4 и 4б), H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9-OH Ac-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9-OH отличающихся от фрагмента 6-13 остатком аланина в положении 9, приводит к возникновению проблем как с присоединением треонина-1, так и с последующим деблокированием Fmoc-группы. В данном случае эти проблемы решаются увеличением избытка реагентов на стадии присоединения Thr-1, а также времени протекания реакции. Для деблокирования Fmoc-группы Thr-1 в случае соединений 4 и 4б возникает необходимость в использовании более эффективного реагента DBU (1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен).

Амид фрагмента 6-13 (соединение 3а) был получен амидированием, гидроксибензотриазола и диизопропилкарбодиимида:

Boc-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6(Boc)-Val7-Pro8-OH H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-NH Получить соединения 3в и 7в описанным выше способом не удалось – реакции не проходили до конца при увеличении как избытка реагентов, так и времени протекания реакции. Синтез соединения 3в также осложнялся плохой растворимостью защищенного пептида:

Ac-Thr1(t-Bu)-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6(Boc)-Val7-Pro8-OH Поэтому соединения 3в и 7в, а также соединения 4а, 4в, 4г, 7а, 14а, 14в, 18а, 18в были синтезированы с использованием Ринк-амидной смолы, позволяющей получать соответствующие амиды на стадии отщепления от полимерного носителя. Получаемые таким образом амиды не содержат примесей соответствующих кислот (как в случае проведения реакции амидирования с помощью карбодиимида), что упрощает очистку целевых соединений.

Конвергентно были синтезированы пептиды PB1 (1-25), PB1 (111-130) и PB1 (381-400) (таблица 5).

Таблица 5. Конвергентный синтез пептидов Наличие в молекулах PB1 (1-25), PB1(381-400) остатков пролина в положениях 5, 13 (для PB1 (1-25)), 14 (для PB1(381-400)) открыло возможности для использования в их синтезе фрагментных конденсаций с разбивкой аминокислотной последовательности по данной аминокислоте. Такой выбор обусловлен весьма низкой способностью пролина подвергаться рацемизации.

В случае пептида PB1(381-400) разбивку проводили также по аргинину в положении 6. В конденсациях использовали 2-3.5-кратные избытки защищенных фрагментов.

использованием конвергентного синтеза на хроматограмме совпадало с таковым, полученным последовательным наращиванием пептидной цепи.

Лучшие результаты были получены в случае конвергентного синтеза.

Испытания по противовирусной активности пептидов были проведены сотрудниками лаборатории молекулярных основ химиотерапии вирусных инфекций НИИ Гриппа на культуре клеток MDCK, активность оценивали в отношении вируса гриппа (A/California/07/2009 (H1N1) pdm09), вызвавшего пандемию в 2009 году. В экспериментах оценивали 50%-е цитотоксическую (CTD50) и эффективную (ED50) дозы, на основании которых рассчитывали индекс селективности (SI). Считались активными препараты, имеющие SI >10.

Первоначально были протестированы базовые соединения 1-18 (таблица 6), для дальнейшей работы были выбраны наиболее активные. В качестве препаратов сравнения были выбраны ремантадин, в отношении которого исследуемый штамм обладает устойчивостью, а также осельтамивир, к которому он чувствителен.

Таблица 6. Противовирусная активность базовых пептидов Как следует из приведенных в таблице 6 данных, синтезированные соединения нетоксичны для клеток. Наиболее активными в отношении вируса гриппа пептидами являются фрагменты 6-13, 6-14, 26-30, 395-400, 531- белка РВ1 (соединения 3, 4, 7, 14, 18). Интересно отметить, что соединения 14 и 18 не являются фрагментами N-концевой области белка РВ1, необходимой для связывания с белком РА.

Индексы селективности фрагментов 6-13 и 6-14 белка РВ1 (соединения и 4) отличаются почти в три раза. Возможно, это связано с увеличением количества проникшего в клетки соединения 4 по сравнению с соединением за счет наличия в составе соединения 4 гидрофобного остатка аланина. Кроме того, остаток аланина в положении 14 белка РВ1 взаимодействует с остатком глутамина-670 белка РА.

Для увеличения стабильности и биодоступности наиболее активных соединений было решено синтезировать модифицированные пептиды – ацетилированные по N-концевой аминогруппе и амидированные по С-концевой карбоксильной группе. Данные модификации позволяют повысить устойчивость пептидов к экзопептидазам и облегчить их проникновение через клеточную мембрану. Результаты тестирования представлены в таблице 7.

Таблица 7. Противовирусная активность модифицированных пептидов № аминокислотная последовательность показатели активности H-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-OH H-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-NH H-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-OH H-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH 4б Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-OH 1000 85 11. 4в Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH2 >500 4.5 > 4г FITC-Ahx-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro- >500 5 > H-Leu-Leu-Val-Glu-Gly-Thr-OH H-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-LeuGly-OH 18а H-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-Leu- 1000 50 20. 18б Ac-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-Leu- 1000 83 12. 18в Ac-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-Leu- 1000 128 7. Как следует из таблицы, во всех случаях, кроме производных фрагмента 395-400 (соединения 14, 14 а-в), амиды оказались более активными, чем соответствующие кислоты, а введение N-концевой ацетильной группы в амиды пептидов привело к увеличению активности только в случае фрагментов 6-13 и 6-14 белка РВ1 (соединения 3 и 4). Наиболее активным из всех протестированных соединений оказалось соединение 4в, имеющее SI >111.

Для изучения механизма противовирусной активности этого соединения в следующей серии опытов были изучены его вирулицидные свойства (противовирусная активность вне клеток) и клеточная локализация.

Эксперименты по вирулицидному действию соединений 4в и 4г показали снижение титра вируса на 1.5 и 1 lgEID50 по сравнению с контролем, что свидетельствует об их слабом вирулицидном действии. Вероятно, данный механизм не является основным для этих соединений.

Также был проведен эксперимент по изучению влияния соединения 4в на различные стадии жизненного цикла вируса гриппа. Для этого препарат добавляли в культуру клеток MDCK до, одновременно и в различные сроки после заражения вирусом гриппа, после чего оценивали разницу в титрах вируса по сравнению с контролем (рисунок 23).

Рис. 22 Оценка влияния времени добавления препарата на снижение титров вируса гриппа. После внесения вируса клетки инкубировали в течение часа при температуре 4С. В этих условиях вирус связывается с клеточными рецепторами, но не проникает внутрь клетки. Все остальное время эксперимент проводили при 37С. Время проникновения вируса в клетку является точкой отсчета (обозначено как 0). Время присутствия соединения 4в в системе обозначено в часах относительно точки отсчета.

Наибольшее снижение титра вируса было отмечено в эксперименте (-2) – 10, то есть в том случае, когда препарат был добавлен за два часа до проникновения вируса в клетки и находился в системе в течение всего времени эксперимента. Кроме того, снижение титра вируса наблюдалось в экспериментах (-1) – 0 и 0 – 1, а также (-2) – (-1) и 0 – 2. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что, вероятно, соединение 4в влияет на ранние стадии жизненного цикла вируса гриппа.

Для изучения способности соединения 4в к проникновению в клетки в амид соответствующего пептида была введена флуоресцентная метка с помощью флуоресцеин-5-изотиоцианата, линкером выступала 6аминогексановая кислота. Введение флуоресцентной метки практически не отразилось на противовирусной активности изучаемого препарата (4г, таблица 7) что свидетельствует о сходстве механизмов действия соединений 4в и 4г.

Исследование локализации флуоресцентно-меченого соединения 4г в клетках MDCK с помощью проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии позволило сделать вывод о том, что исследуемое соединение цитофлуориметрии было показано, что данный пептид способен к связыванию с живыми клетками MDCK. Изучение окрашенных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии показало, что окрашивание происходит за счёт проникновения соединения 4г сквозь мембрану клетки.

Вероятно, противовирусная активность соединения 4в – Nацетилированного амида фрагмента 6-14 белка РВ1 реализуется путем нарушения сборки комплекса РНК-полимеразы либо за счет связывания пептида 4в с белком РА, либо за счет стабилизации -структурированного состояния N-концевой части белка РВ1.

Данное соединение, на наш взгляд, является перспективной основой для создания лекарственных препаратов для профилактики и лечения гриппа А.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Cинтез и очистка пептидов [44, 191]. Синтез пептидов проводили твердофазным методом на 2-хлортритилхлоридной (2-Chlorotrityl chloride resin, 100-200 mesh, емкость смолы 1,0-1,6 ммоль/г) и Ринк-амидной (Fmoc-Rink amide AM polystyrene resin, 100-200 mesh, емкость смолы 0,40-0,74 ммоль/г) смолах по Fmoc-/t-Bu стратегии с использованием как стандартных методик последовательного наращивания цепи, так и конвергентного подхода. В работе использовали реактивы фирмы Iris Biotech (Германия) чистотой не менее 98 %.

В реакциях последовательного наращивания пептидной цепи в качестве конденсирующих агентов использовали N, N’-диизопропилкарбодиимид (DIC) и 1-гидрокси-бензотриазол (HOBt) (20% мольные избытки относительно активируемых аминокислот), реакции проводили в диметилформамиде (DMF).

В реакциях использовали 2х-5 кратные избытки защищенных аминокислот. Для фрагментных конденсаций наряду с указанными реагентами использовались также 1-гидрокси-7-аза-бензотриазол (HOAt) и N-метилпирролидон (NMP).

Полноту протекания реакций оценивали с помощью нингидринового теста Кайзера на свободные аминогруппы [192]. В случае завершения реакции (отрицательный тест Кайзера) для последующих операций смолу промывали 6раз DMF от компонентов реакционного раствора. В случае положительного теста реакцию повторяли, увеличивая избыток реагентов и время протекания реакций.

Для временной защиты -аминогрупп использовалась 9флуоренилметилоксикарбонильная (Fmoc) – группа, удаление которой проводили 2х-3х кратной обработкой смолы 20 % раствором диэтиламина в диметилформамиде в течение 5 – 20 минут. В некоторых случаях смолу обрабатывали смесью DMF : диэтиламин : DBU (1,8-диазабицикло[5.4.0]ундецен) в объемном соотношении 48:1:1 в течение 10 минут. Для удаления остаточных количеств диэтиламина или DBU смолу промывали 6-8 раз DMF.

В случае неполного деблокирования Fmoc-группы после отщепления целевого соединения от полимерного носителя пептид выдерживали при перемешивании в концентрированном водном растворе аммиака в течение часа, после чего раствор концентрировали на ротационном испарителе и подвергали лиофилизации.

В качестве постоянных защитных групп использовались: третбултилоксикарбонильная (BOC) – для -аминогруппы лизина, 2,2,4,6,7пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонильная (Pbf) – для гуанидиновой группы аргинина, трифенилметильная (Trt) – для амидных групп глутамина и аспарагина, трет-бутильная (tBu) – для ОН-групп треонина, тирозина и серина, (О-tBu) для - и - карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот.

дихлорметаном (DCM), 10-15 раз по 1,5-2 минуты обрабатывали 1% раствором трифторуксусной кислоты (TFA) в DCM; полученные растворы объединяли в колбе, содержащей 10% раствор пиридина в метаноле, смесь концентрировали отфильтровывали. Чистота полученных в указанных условиях защищенных пептидных фрагментов по данным ВЭЖХ составила более 95%.

отщепления его от полимерного носителя, смолу в течение двух часов обрабатывали раствором TFA, содержащим воду и триизопропилсилан (TIS) в метионинсодержащих пептидов использовали раствор TFA, содержащий воду, триизопропилсилан (TIS) и 1,2-этандитиол (EDT) в следующих объемных соотношениях 92,5:2,5:2,5:2,5. Полученный раствор концентрировали на ротационном испарителе. После добавления к остатку метилтретбутилового (MTBE) или диэтилового эфиров продукт отфильтровывали. Полноту деблокирования боковых функциональных групп контролировали с помощью аналитической обращеннофазной ВЭЖХ, при необходимости указанную процедуру повторяли.

Восстановление метионинсодержащих пептидов проводили по методу, описанному в [44]: к раствору пептида в TFA добавляли EDT и триметилбромсилан (TMSBr) в количестве 15,7 и 13 мкл/мл соответственно, раствор выдерживали 15-30 минут при перемешивании, далее концентрировали и выделяли продукт с использованием MTBE, как описано выше.

В случае Ринк-амидной смолы перед финальным деблокированием смолу промывали 50 % раствором уксусной кислоты в дихлорметане (2х10 мл) в течение 5 и 10 минут соответственно. Условия финального деблокирования совпадают с таковыми для 2-хлортритилхлоридной смолы.

Очистку полученных пептидов проводили методом препаративной обращеннофазной ВЭЖХ в градиентном режиме в системе ацетонитрил-водаTFA. Фракции, содержащие целевой компонент, после объединения и концентрирования в вакууме подвергались лиофилизации на приборе Chris Alfa 1-2 LD plus.

Аналитическую жидкостную хроматографию проводили на хроматографе Shimadzu LC-20AD, препаративную - на хроматографе KNAUER Preparative pump K-1800. Указанные приборы оснащены спектрофотометрическими детекторами. Анализ проводили при длине волны 214 нм.

При проведении аналитической ВЭЖХ использовали колонку Waters Symmetry, C-18, 3.5 мкм, 2.1150 мм при скорости потока элюента 0.3 мл/мин.

Для градиентного элюирования использовали следующие системы: фаза А TFA, фаза Б - 0.1 TFA в ацетонитриле (осч сорт 0, “Криохром”, СПб).

Метод 1: изменение концентрации фазы Б в А от 0 до 97 за 15 минут при скорости потока элюента 0.3 мл/мин; метод 2: изменение концентрации фазы Б в А от 0 до 97 за 15 минут при скорости потока элюента 0.4 мл/мин. При проведении препаративной ВЭЖХ использовали колонку Waters X Bridge C18, 10мкм, 127, 50250 мм при скорости потока элюента 50 мл/мин.

Масс-спектры регистрировали на приборе Bruker micrоTOF, оборудованном ионным источником типа электроспрей (ESI). Разрешение прибора составляло 10000 на полувысоте пика. Для проведения массспектрометрических исследований образцы растворялись в воде, метаноле, ацетонитриле или дихлорметане. Верхняя граница концентрации раствора составляла ~5 15 мкг/мл. Полученный раствор подавался в капилляр с помощью шприцевого насоса KDScientific. Напряжение, создаваемое на конечном электроде, и напряжение на капилляре составляли 500 В и 4500 В (ESI+-MS), при потоке раствора образца через капилляр 3 мкл/мин. Напряжение на выходе капилляра составляло ±70 или ±150 В. Масс-спектры регистрировали в диапазоне m/z от 50 до 3000.

компьютерное моделирование их структуры было проведено сотрудниками НИИ Гриппа Минзравсоцразвития РФ (СПб). Проточная цитофлуориметрия проводилась в НИИ Экспериментальной Медицины СЗО РАМН (СПб).

A/California/07/09 (H1N1)pdm09. Вирус пассировали в аллантоисной полости 10-12 дневных куриных эмбрионов в течение 48 часов при 36°С. Для экспериментов на клеточных культурах использовали культуру клеток MDCK (клетки почки собаки) (ATCC CCL-34), выращенные на 96 луночных панелях на среде Альфа-МЕМ в присутствии 10 % сыворотки плода коровы.

Титрование вируса. Из исходного вируссодержащего материала готовили серию 10-кратных разведений (10-1 – 10-7) на среде МЕМ. В лунки 96луночного планшета добавляли по 100 мкл разведений вируса и оставляли на двое суток при 36С и 5% CO2. Через 48 часов из лунок отбирали по 100 мкл культуральной жидкости и вносили в планшет для иммунологических реакций, затем проводили реакцию гемагглютинации (РГА). Для этого в лунки с отобранной культуральной жидкостью добавляли равное количество 1% суспензии куриных эритроцитов в физиологическом растворе. Результаты учитывали через 30 минут инкубации при комнатной температуре. За инфекционный титр вируса принимали наибольшее разведение вируса, вызвавшее полную агглютинацию эритроцитов. Титр выражали в десятичных логарифмах 50% экспериментальной инфекционной дозы (lg EID50).

Pages: |

| 2 |

Главная >> Диссертации - все темы

[ СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА .pdf ]

Похожие работы:

«БАГАРЯКОВ Алексей Владимирович СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ИНВЕСТИЦИОННОЙ НОЛИТИКИ В РЕГИОНЕ Специальность: 08.00.05 - экономика и управление народным хозяйством (управление инновациями и инвестиционной деятельностью) Диссертация на соискание ученой степени кандидата экономических наук Научный руководитель - СВ. Раевский, доктор экономических...»

«04.9.30 010404' ЗОЛОТАРЕВА Елена Константиновна ПЕДАГОГИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ ОСОЗНАНИЯ РЕБЕНКОМ-ДОШКОЛЬНИКОМ НРАВСТВЕННОЙ ЦЕННОСТИ ПОСТУПКА ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Специальность 13.00.01 - Теория и история педагогики Научный руководитель : доктор психологических наук, профессор Т.А. РЕПИНА Москва - СОДЕРЖАНИЕ ВЕДЕНИЕ.... Глава I. ПРОБЛЕМА, ЗАДАЧИ И МЕТОДЫ...»

«Михаил Геннадьевич Ревнивцев ИССЛЕДОВАНИЕ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ОТ АККРЕЦИРУЮЩИХ ЧЕРНЫХ ДЫР И НЕЙТРОННЫХ ЗВЕЗД 01.03.02 Астрофизика и радиоастрономия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель доктор физ.-мат. наук М.Р. Гильфанов Москва 1999 2 Огромное спасибо моему научному руководителю Марату Равильевичу Гильфанову за отличную научную школу. Также хотелось бы...»

«Сычёва Елена Николаевна ПОЭТИЧЕСКАЯ ФРАЗЕОЛОГИЯ И АФОРИСТИКА Ф.И. ТЮТЧЕВА: СТРУКТУРНО-СЕМАНТИЧЕСКИЙ АСПЕКТ Специальность: 10.02.01 – русский язык Диссертация на соискание ученой степени кандидата филологических наук Научный руководитель : доктор...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Лю Цунъин Особенности этнического самосознания современной учащейся молодёжи Китая Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Лю Цунъин. Особенности этнического самосознания современной учащейся молодёжи Китая [Электронный ресурс] : Дис. . канд. психол. наук : 19.00.01. М.: РГБ, 2006. (Из фондов Российской Государственной Библиотеки). Общая психология, психология личности, история психологии Полный текст:...»

«ХОЛОДОВА Мария Владимировна МУЗЫКАЛЬНЫЙ ТЕАТР Г.И. БАНЩИКОВА: ЖАНРОВО-ДРАМАТУРГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОИЗВЕДЕНИЙ НА СЮЖЕТЫ РУССКОЙ КЛАССИЧЕСКОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Специальность 17.00.02-17 – Музыкальное искусство Диссертация на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Научный руководитель : доктор искусствоведения,...»

«ЛИШНЕВСКИЙ АНДРЕЙ ЭРИКОВИЧ ВАРИАЦИИ РАДИАЦИОННОЙ ОБСТАНОВКИ НА МЕЖДУНАРОДНОЙ КОСМИЧЕСКОЙ СТАНЦИИ НА ФАЗЕ СПАДА 23-го ЦИКЛА СОЛНЕЧНОЙ АКТИВНОСТИ Специальность 01.04.08 - физика плазмы диссертация на соискание учной степени кандидата физико-математических наук Научные руководители: доктор физ. -...»

«Денисов Сергей Александрович ГАЗОФАЗНОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ И ЭЛЕКТРОФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДЕТОНАЦИОННОГО НАНОАЛМАЗА 02.00.04 – физическая химия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата химических наук Научный руководитель д. х. н. Спицын Борис Владимирович Москва – Содержание. Список сокращений и условных обозначений Введение Обзор...»

«СТЕПАНОВ СЕРГЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ ОРГАНИЗАЦИОННО-СОДЕРЖАТЕЛЬНЫЕ УСЛОВИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕТОДИЧЕСКОЙ И СОЦИАЛЬНОПЕДАГОГИЧЕСКОЙ СЛУЖБ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЙ ШКОЛЫ 13.00.01 – Общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель – доктор педагогических наук, профессор В.Н. Гуров Ставрополь, СОДЕРЖАНИЕ Введение...........................»

«Тощаков Александр Михайлович ИССЛЕДОВАНИЕ ГАЗОДИНАМИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ СИСТЕМЫ МЕЖТУРБИННОГО ПЕРЕХОДНОГО КАНАЛА И ДИАГОНАЛЬНОГО СОПЛОВОГО АППАРАТА ПЕРВОЙ СТУПЕНИ ТУРБИНЫ НИЗКОГО ДАВЛЕНИЯ Специальность 05.07.05 – Тепловые, электроракетные двигатели и энергоустановки летательных аппаратов Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Данилов Александр Анатольевич Технология построения неструктурированных сеток и монотонная дискретизация уравнения диффузии 05.13.18 – Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель д. ф.-м. н. Василевский Юрий Викторович Москва – 2010 Содержание Введение..................»

«Мухаммед Ариж Абделькаримовна ИССЛЕДОВАНИЕ ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВЕЩЕСТВ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ НА ОСНОВЕ ЧЕСНОКА, РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ И ПИЩЕВЫХ ВОЛОКОН (Экспериментальное исследование) 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология Диссертация на...»

«Т.Ю. Репкина mailto:[email protected] МОРФОЛИТОДИНАМИКА ПОБЕРЕЖЬЯ И ШЕЛЬФА ЮГО-ВОСТОЧНОЙ ЧАСТИ БАРЕНЦЕВА МОРЯ 25.00.25. - Геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель : кандидат географических наук В.И. Мысливец МОСКВА, Введение Список сокращений Глава 1. Физико-географические условия развития...»

«УТЕУБАЕВ МАРАТ ТОЛЕУТЕМИРОВИЧ Языковая проблема в казахстанском образовательном пространстве: история и перспективы 07.00.02 – отечественная история (История Республики Казахстан) Диссертация на соискание ученой степени кандидата исторических наук Научный руководитель доктор исторических наук, профессор Дукенбаева З.О. Республика Казахстан Павлодар, СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ВОЗНИКНОВЕНИЕ ЯЗЫКОВОЙ ПРОБЛЕМЫ:...»

«ПЕТРОСЯН Лилит Грантовна ОЦЕНКА НЕЙРОПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ КСЕНОНА ПРИ ОПЕРАЦИЯХ У БОЛЬНЫХ С ОБЪЕМНЫМИ ОБРАЗОВАНИЯМИ ГОЛОВНОГО МОЗГА 14.01.20 – Анестезиология и реаниматология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор В.М. МИЗИКОВ Москва – ОГЛАВЛЕНИЕ Список сокращений Введение ГЛАВА 1. Современные проблемы защиты мозга....»

«ТОЛМАЧЕВ Сергей Игоревич СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОРАЖЕНИЙ, ПРИЧИНЕННЫХ ИЗ СРЕДСТВ САМООБОРОНЫ, СНАРЯЖЕННЫХ ИРРИТАНТОМ ДИБЕНЗОКСАЗЕПИНОМ (ВЕЩЕСТВОМ CR) Специальности: 14.03.05 – судебная медицина 14.03.04 – токсикология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор...»

«РЫБАКОВА Ирина Викторовна ТРАДИЦИЯ И НОВАЦИЯ В АРГОНАВТИКЕ АПОЛЛОНИЯ РОДОССКОГО (лексика – композиция – стиль) Специальность 10.02.14 – классическая филология, византийская и новогреческая филология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени...»

«СУХАРЕВА Ольга Андреевна НАПРАВЛЕНИЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВИНОГРАДАРСТВА В СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ОРГАНИЗАЦИЯХ (по материалам Краснодарского края) Специальность 08.00.05 – экономика и управление народным хозяйством: экономика, организация и управление предприятиями, отраслями, комплексами (АПК и сельское хозяйство) ДИССЕРТАЦИЯ...»

«vy vy из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Соломатина, Татьяна Борисовна 1. Социальная адаптация студенческой молодежи в процессе профессиональногообразования 1.1. Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2002 Соломатина, Татьяна Борисовна Социальная адаптация студенческой молодежи в процессе профессиональногообразования [Электронный ресурс]: Дис.. канд. пед. наук : 13.00.08 М.: РГБ, 2002 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Теория и методика профессионального...»

«Покачалова Анна Сергеевна ДОГОВОР ОБ ОБЯЗАТЕЛЬНОМ ПЕНСИОННОМ СТРАХОВАНИИ: ГРАЖДАНСКО-ПРАВОВОЙ АСПЕКТ 12.00.03 — гражданское право; предпринимательское право; семейное право; международное частное право Диссертация на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный руководитель – кандидат юридических наук, доцент...»

наверх

<< ГЛАВНАЯ | КОНТАКТЫ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА (Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)