МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М. В. ЛОМОНОСОВА

ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На правах рукописи

УДК 632. 954: 631.417

Куликова Наталья Александровна

СВЯЗЫВАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ И ДЕТОКСИЦИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ГУМУСОВЫХ

КИСЛОТ ПО ОТНОШЕНИЮ К АТРАЗИНУ

(Специальность 03.00.27-почвоведение) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

кандидат биологических наук, доцент Г.Ф. Лебедева кандидат химических наук, старший научный сотрудник И.В. Перминова Научные консультанты:

доктор биологических наук Д.Н. Маторин доктор биологических наук П.С. Венедиктов МОСКВА –

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение и свойства гумусовых кислот

1.1.1. Общая характеристика гумусовых кислот

1.1.2. Взаимодействие гумусовых кислот с минералами

1.2. Взаимодействие гумусовых кислот с атразином

1.2.1. Поведение сим-триазиновых гербицидов в почве

1.2.2. Взаимодействие атразина с гумусовыми кислотами в почвенной среде

1.3. Детоксицирующие свойства гумусовых кислот по отношению к атразину

1.3.1. Гербицидная активность атразина

1.3.2. Физиологическая активность гумусовых кислот

1.3.3. Детоксицирующие свойства гумусовых кислот по отношению к симтриазиновым гербицидам

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Отбор и характеристика почвенных образцов

2.2. Выделение препаратов гумусовых кислот

2.3. Характеристика гумусовых кислот

2.3.1. Элементный анализ

2.3.2. Методика 13С ЯМР спектроскопического анализа

2.3.3. Методика гель-хроматографического определения молекулярных масс

2.3.4. Методика потенциометрического определения кислотных групп...... 2.4. Методика приготовления адсорбционных комплексов каолинит-гумусовые кислоты

2.5. Исследование связывания атразина гумусовыми кислотами

2.5.1. Методика определения связывающей способности растворенных гумусовых кислот по отношению к атразину с использованием ультрафильтрации

2.5.2. Техника экспериментов по определению связывающей способности адсорбционных комплексов гумусовых кислот по отношению к атразину

2.6. Постановка токсикологических экспериментов

2.6.1. Постановка лабораторно-вегетационных экспериментов

2.6.2. Проведение токсикологических экспериментов в водных средах...... Глава 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Характеристика исследованных почв

3.2. Выделение и характеристика препаратов гумусовых кислот

3.2.1. Элементный состав

3.2.2. Молекулярно-массовые характеристики исследованных препаратов гумусовых кислот

3.2.3. Распределение углерода в исследованных препаратах гумусовых кислот по данным 13С ЯМР спектроскопии

3.2.4. Содержание кислотных групп в препаратах гумусовых кислот.......... 3.2.5. Классификация исследованных препаратов гумусовых кислот с помощью кластерного анализа

3.3. Получение адсорбционных комплексов гумусовых кислот с каолинитом.... 3.4. Взаимодействие атразина с гумусовыми кислотами

3.4.1. Взаимодействие атразина с растворенными гумусовыми кислотами

3.4.2. Связывание атразина адсорбционными комплексами гумусовых кислот с каолинитом

3.5. Детоксицирующие свойства растворенных гумусовых кислот по отношению к атразину

3.5.1. Количественная оценка детоксицирующих свойств гумусовых кислот

3.5.2. Исследование детоксицирующих свойств растворенных гумусовых кислот по отношению к атразину с использованием растений мягкой пшеницы Triticum aestivum

3.5.3. Исследование детоксицирующих свойств растворенных гумусовых кислот по отношению к атразину с использованием одноклеточной водоросли Chlorella vulgaris

гумусовых кислот по отношению к атразину с использованием хлоропластов

использованием различных тест-объектов

3.6. Детоксицирующие свойства гумусовых кислот по отношению к атразину на дерново-подзолистых почвах

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

подтверждена отечественной и мировой практикой земледелия. Так, сокращение объема применения гербицидов в России за последние 7 лет с 32 до 17 млн. га привело к удвоению потерь от сорняков (Захаренко, 1998). В тоже время использование гербицидов имеет негативные последствия: накопление связанных остатков в почве, поступление в грунтовые и поверхностные воды.

Особо опасно загрязнение персистентными гербицидами, одним из наиболее распространенных представителей которых является атразин (Захаренко, 1990).

Время его жизни в почве составляет от нескольких недель до четырех лет и более. Атразин принадлежит к классу сим-триазиновых гербицидов - сильных специфических ингибиторов фотосинтеза. Согласно многочисленным исследованиям, основным фактором, определяющим закрепление атразина в почвенном профиле и уровень проявляемой им токсичности, является связывание с гумусовыми кислотами (Лебедева и др., 1990; Овчинникова, 1987).

При этом в качестве единственного механизма детоксикации атразина в почве обычно предполагают образование нетоксичных комплексов с гумусовыми кислотами. Однако ввиду сложности и неоднозначности взаимодействий, которые могут проистекать в системе минеральная матрица - гумусовые кислоты - гербицид - растение, данное предположение носит гипотетический характер.

Его подтверждение требует постановки экспериментов, позволяющих оценить действие каждого из возможных факторов и их совокупности. Это определяет предусматривающих изучение собственного воздействия гумусовых кислот на фотосинтезирующие организмы, количественную оценку связывающей и минеральной матрице гумусовых кислот в отношении атразина и их последующее сопоставление. Указанные проблемы определили постановку цели и задач настоящей работы.

детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к атразину.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

выделить и охарактеризовать препараты гумусовых кислот и получить их адсорбционные комплексы с минералами;

количественно охарактеризовать связывание атразина с гумусовыми кислотами в растворенном и адсорбированном состоянии;

выявить взаимосвязь между строением гумусовых кислот и их связывающей способностью по отношению к атразину;

количественно охарактеризовать детоксицирующие свойства препаратов гумусовых кислот по отношению к атразину и установить их взаимосвязь со строением гумусовых кислот;

изучить собственное воздействие гумусовых кислот на тестируемые объекты;

на основании комплекса данных по связывающей и детоксицирующей способности гумусовых кислот сделать вывод о механизме детоксикации атразина растворенными и адсорбированными гумусовыми кислотами.

1.1. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ

1.1.1. Общая характеристика гумусовых кислот почвообразовании и формировании почвенного плодородия (Орлов, 1992). В его состав входят как неспецифические (полисахариды, полифенолы, и т.д.), так и специфические (гуминовые) вещества. Гуминовые вещества - это совокупность соединений, образующихся в процессе разложения и трансформации растительных и животных остатков, не имеющих аналогов в живых организмах и характеризующихся темной окраской, полидисперсностью, высокими молекулярными массами и биотермодинамической устойчивостью (Орлов и др., 1996). Гуминовые вещества составляют 85-90% от общего содержания органического вещества почв (Кононова, 1963; Орлов, 1992). Наряду с почвой, гуминовые вещества присутствуют в других природных объектах, таких как торфа, угли, пресные и морские воды. Растворенное органическое вещество поверхностных вод на 60-80% состоит из гуминовых веществ (Орлов, 1993;

Rashid, 1985). По данным Тишковича (1984) содержание гуминовых веществ в торфе составляет порядка 55% на сухое вещество и достигает 73% от органического вещества торфа (Белькевич и Чистова, 1979). Гуминовые вещества, входящие в состав органической массы углей, составляют от 5-15% в блестящих бурых и до 60% в окисленных каменных углях (Аронов, 1988).

Фракция гуминовых веществ кислотной природы получила общее название гумусовых кислот, к которым в настоящее время относят гуминовые (ГК), гиматомелановые и фульвокислоты (ФК) (Орлов, 1996). ГК - наиболее обширная группа гуминовых веществ - имеют темно-бурую, а в сухом состоянии - до черной, окраску. ГК извлекают из природных сред щелочными растворами, из которых они выпадают в осадок после подкисления до рН 1-2. Гиматомелановые кислоты извлекают из ГК этиловым спиртом; в котором они имеют темнокрасную окраску (Глебова, 1985; Орлов, 1996). Под ФК в настоящее время понимают как всю совокупность кислоторастворимых органических веществ, остающихся в растворе после осаждения ГК (Тюрин, 1965), так и их фракцию, сорбирующуюся из раствора на смолах Amberlite XAD (Swift, 1996).

По своей химической природе гумусовые кислоты представляют собой высокомолекулярные азотсодержащие ароматические карбоновые кислоты (Кононова, 1963; Александрова, 1980). Наличие ароматического каркаса, замещенного карбоксильными, карбонильными, гидроксильными и метоксильными функциональными группами и периферической части, представленной в основном фрагментами полисахаридов и полипептидов, обуславливает химическую гетерогенность и широкий спектр реакционной способности гумусовых кислот по отношению к веществам различных химических классов (Wershaw et al., 1977; Schnitzer, 1986; Орлов, 1992).

Среди важнейших характеристик гумусовых кислот, определяющих их свойства, можно выделить следующие:

элементный состав;

качественный и количественный состав структурных фрагментов;

молекулярно-массовое распределение.

Элементный состав гумусовых кислот Основными элементами, образующими молекулы гумусовых кислот, являются углерод, водород и кислород. Азот и сера содержатся в гумусовых кислотах на уровне 1-5% (Кононова, 1963; Орлов, 1992, 1993), обязательной составной частью гумусовых кислот являются микроэлементы и вода (Орлов, 1992). Брутто-формулу гумусовых кислот можно записать в общем виде следующим образом:

где М – ионы металлов.

Данные по элементному составу позволяют оценить простейшие структурные параметры: атомные соотношения элементов, степень окисленности, степень ненасыщенности, относительный вклад ароматических и алифатических фрагментов, предельные содержания функциональных групп (Perdue, 1984; Орлов, 1996). Эти параметры широко используют для характеристики особенностей генезиса гумусовых кислот различных источников происхождения (Stuermer et al., 1978; Visser, 1986; Орлов, 1992).

Согласно Орлову (1990), для объективной оценки окисленности гумусовых кислот необходимо учитывать количество всех электроотрицательных (N, O, C) и электроположительных (Н) по отношению к углероду атомов. В связи с тем, что содержание азота и серы сравнительно невелико, автором была предложена следующая формула для расчета степени окисленности гумусовых кислот:

где QO, QH и QC - количество атомов кислорода, водорода и углерода, соответственно.

По данным того же автора степень окисленности гумусовых кислот невелика и колеблется в пределах ±0,22.

Средний элементный состав ГК и ФК различного происхождения 38-50 4,3-6,8 1,0-6,8 37-55 Рассчитана из данных таблицы по формуле (1.1).

Данные по элементному составу ГК и ФК, полученные авторами обзора (Rice and MacCarthy, 1991) в результате усреднения опубликованных результатов элементного анализа более чем четырехсот образцов, приведены в табл. 1.1, где для каждого элемента даны как средние значения, так и границы содержания элементов.

Как видно из табл. 1.1, несмотря на химическую гетерогенность и статистический принцип формирования молекул гумусовых кислот, изменению элементного состава в зависимости от источника происхождения и фракционного состава (ФК или ГК) присуща внутренняя закономерность.

Содержание углерода в ГК в среднем выше, чем в ФК. Для содержания кислорода наблюдается обратная тенденция. Как следует из табл. 1.1, ГК и ФК различного происхождения могут существенно отличаться по своему элементному составу. Так, например, элементный состав ФК поверхностных вод существенно отличается от ФК почв, а почвенных ГК - от ГК торфа (Steelink, 1985). Элементный состав гумусовых кислот одинакового происхождения может варьировать в зависимости от конкретного источника: различного типа почв (Орлов, 1990), вод (Rashid, 1985) и т. д. Таким образом, определение элементного состава является одним из ключевых этапов в анализе структурных и генетических особенностей гумусовых кислот.

Характеристика структуры гумусовых кислот Гумусовые кислоты являются природными полимерами переменного состава и нерегулярной структуры (Орлов, 1992). Одним из подходов к численному описанию таких объектов является расчет их фрагментного состава, под которым понимают содержание основных структурных единиц, образующих молекулы исследуемых соединений. Такой подход использован для характеристики структурных особенностей нефтей различных месторождений (Кушнарев, 1997) и был недавно успешно применен для исследования структуры гумусовых кислот (Ковалевский 1998).

Для выявления структурных фрагментов, составляющих молекулы гумусовых кислот, обычно используют методы деструкции: гидролиз, окисление, пиролиз. Методами гидролиза изучают так называемую периферическую часть гумусовых кислот, методом окисления - ядерную часть, или каркас (Орлов, 1992). Однако в результате деструкции получаются видоизмененные, по сравнению с состоянием в молекулах гумусовых кислот, осколки молекул, что существенно затрудняет интерпретацию получаемых данных. Поэтому в последнее время все большее распространение получает недеструктивный метод исследования структуры органических соединений - спектроскопия ЯМР.

Типичный С ЯМР спектр гумусовых кислот приведен на рис 1.1. Как видно из рисунка, полидисперсность и химическая гетерогенность гумусовых кислот приводит к тому, что их C ЯМР спектры не содержат разрешенных индивидуальных пиков, представляя собой суперпозицию большого числа сигналов.

Рис. 1.1. Типичный 13С ЯМР спектр ГК почв (Ковалевский, 1998) гумусовых кислот является разбиение на спектральные диапазоны, соответствующие сигналам атомов углерода со сходным химическим окружением (табл. 1.2).

Анализ данных С ЯМР дает возможность установить различия в структуре ГК и ФК различных природных источников. Так, согласно данным исследования Хэтчера (Hatcher et al., 1980), ГК дерново-подзолистых и серых лесных почв содержат примерно в два раза больше ароматических фрагментов по сравнению с ФК. Аналогичные данные получены в работе Престона и Блэквелла (Preston and Blackwell, 1985). Многими авторами (Shin and Moon, 1961; Михайленко и Михальчук, 1987; Preston and Schnitzer, 1987; Ricca and Severini, 1993; Conte et al., 1997; Cook and Langford, 1998) помимо этого отмечается, что ФК почв характеризуются в целом более высоким (на 2-10% абс.) содержанием СООН групп, в то время как содержание алкильных фрагментов в них несколько ниже по сравнению с ГК. Для ГК и ФК черноземов наблюдаются сходные закономерности (Wilson et al., 1987). Согласно большей части опубликованных данных, содержание углеводных структур в ФК почв превышает таковое для ГК в 1,5-3 раза, однако в ряде работ (Ricca and Severini, 1993; Shin and Moon, 1996; Conte et al., 1997; Cook and Langford, 1998) приводятся результаты исследования, говорящие о том, что содержание углеводов в ГК и ФК почв практически идентично.

Основные диапазоны сигналов в С ЯМР спектре гумусовых кислот химических сдвигов 5-48 м.д. алифатические С- и H-замещенные атомы углерода (CAlk);

48-90 м.д. алифатические атомы углерода, связанные простой связью с 90-108 м.д. ацетальные атомы углерода, связанные простыми связями с двумя 108-145 м.д. ароматические С- и Н-замещенные атомы углерода (CAr-H,C);

145-165 м.д. ароматические О-замещенные атомы углерода (CAr-O);

165-187 м.д. атомы углерода карбоксильных групп и их производных (CCOOH(R));

187-220 м.д. атомы углерода кетонных и хинонных групп (CС=О).

Cодержание углеводных структур в ФК природных вод находится на уровне такового в ГК или несколько ниже (Михайленко и Михальчук, 1975; Malcolm, 1990; Humic substances…, 1994; Knulst et al., 1998). В то же время прочие закономерности, обнаруженные для ГК и ФК почв, сохраняются для ГК и ФК природных вод. Так, содержание СООН групп в ФК природных вод выше, чем в ГК, а содержание ароматических фрагментов - ниже. Согласно (Malcolm, 1990;

Humic substances…, 1994) ФК содержат больше алкильных фрагментов, однако данные некоторых исследователей (Михайленко и Михальчук, 1975; Knulst et al., 1998) находятся в противоречии с этим выводом.

В ряде работ было выполнено сопоставление фрагментного состава гумусовых кислот различного происхождения. Так, на основании сопоставления результатов С ЯМР исследования структуры препаратов ФК дерновоподзолистых почв и природных вод, в работе (Malcolm, 1990) показано, что последние характеризуются более высоким содержанием алифатических фрагментов, в то время как фрагментный состав ГК этих природных сред довольно близок. Сходные данные были получены в работе (Shin and Moon, 1996).

В работах (Wilson et al., 1983; Wilson and Goh, 1983) проводилось сопоставление гумусовых кислот торфа и дерново-подзолистых почв. Показано, что гумусовые кислоты торфа характеризуются более высоким содержанием ароматических и углеводных фрагментов, нежели гумусовых кислот почв, а содержание карбоксильных и алкильных групп в случае гумусовых кислот торфа несколько ниже.

Сравнительное исследование структуры ГК бурых углей, ФК и ГК дерновоподзолистых почв, выполненное в работах (Choudhry and Webster, 1989; Shin and Moon, 1996), показало, что содержание СООН групп в ГК угля ниже, чем в ФК почв, однако выше, нежели в ГК почв. По сравнению с гумусовыми кислотами почв ГК угля характеризуются значительно более высокой ароматичностью, и очень низким содержанием углеводных структур.

Таким образом, данные по количественному исследованию структурных фрагментов гумусовых кислот свидетельствуют о том, что все гумусовые кислоты независимо от источника происхождения обладают сходным набором основных структурных фрагментов. При этом количественное соотношение структурных фрагментов может варьировать в зависимости от источника.

Важная информация о строении углеродного скелета хорошо дополняется данными о распределении кислорода в структуре гумусовых кислот, получаемых с помощью функционального анализа. В настоящее время в гумусовых кислотах карбоксильные, фенольные и спиртовые гидроксильные, карбонильные, хинонные, метоксильные, сложноэфирные, енольные, амино-, амидо- и имидогруппы, сульфогруппы, тиольные и дисульфидные группы (Schnitzer and Khan, 1972). Поскольку суммарное содержание серы и азота в гумусовых функциональные группы гумусовых кислот представлены, в основном, кислородсодержащими функциональными группами. Обобщенные сведения о распределении кислорода по различным функциональным группам в гумусовых кислот приведены в табл. 1.3.

Распределение кислорода между функциональными группами в молекулах (по данным Schnitzer and Khan, 1972; Stevenson, 1982; Орлов, 1992) Как видно из табл. 1.3, около 75% кислорода в молекулах ГК и около 95% – в ФК распределено между четырьмя типами функциональных групп:

карбонильными, причем вклад этих групп в общее содержание кислорода различен для гуминовых и фульвокислот. Доля кислорода, входящего в состав карбоксильных групп, существенно выше для фульвокислот.

Обращает внимание тот факт, что в ФК доля кислорода, входящего в состав перечисленных в таблице групп значительно выше, чем в ГК. Это может быть связано, с одной стороны, с наличием в структуре ГК большего количества конформационными эффектами, препятствующими полному определению карбоксильных и гидроксильных групп в гуминовых кислотах методами функционального анализа (Schnitzer and Khan, 1972). До настоящего времени однозначно не установлено, какая из указанных причин является основной.

Величины, приведенные в табл. 1.3 показывают, что преобладающими функциональными группами гумусовых кислот являются карбоксильные и фенольные и спиртовые гидроксильные. Именно этими группами в основном обусловлены их кислотно-основные и комплексообразующие свойства (Орлов, 1992).

Согласно литературным данным (Драгунов, 1951; Stevenson, 1985; Perdue, 1985), содержание функциональных групп в гумусовых кислотах варьирует в зависимости от источника происхождения. Препараты водного происхождения, как правило, характеризуются повышенным содержанием карбоксильных групп (Ziechman, 1980). Однако более отчетливо прослеживается уже отмеченная тенденция: независимо от источника происхождения ФК характеризуются более высоким содержанием карбоксильных групп, чем ГК.

Молекулярно-массовые характеристики гумусовых кислот Молекулярная масса (ММ) - фундаментальное свойство любого вещества, в том числе ГК и ФК. От размеров и конфигурации молекул гумусовых кислот зависят их растворимость, способность к миграции, сорбируемость почвенными растениями (Орлов, 1992). В отличие от простых органических веществ, полидисперсны, то есть обладают набором молекулярных масс. Поэтому их характеризуют молекулярно-массовым распределением (ММР), на основании которого рассчитывают среднюю ММ. В зависимости от способа усреднения получают три вида средних молекулярных масс: среднечисловую ( M n), средневесовую ( M w) и среднюю ( M z) (Swift, 1989; Орлов, 1992).

Среднечисловая ММ - усреднение по числу молекул в полимере рассчитывается как:

где ni - число i-тых молекул с молекулярной массой Mi.

Средневесовая ММ - усреднение по массе молекул в полимере - может быть рассчитана в соответствии со следующей формулой:

Средняя ММ выражается уравнением:

Если в монодисперсных системах все способы усреднения приводят к получению одной и той же величины молекулярной массы, то в полидисперсных системах выполняется соотношение:

при этом отношение M w/ M n используется как показатель степени полидисперсности. Для характеристики гумусовых кислот наиболее часто используют их средневесовую молекулярную массу (Орлов, 1992; Swift, 1989).

Вследствие нерегулярности строения, высокой полидисперсности и полиэлектролитных свойств гумусовых кислот, все существующие экспериментальные методы определения ММ лишь ограниченно применимы для анализа данных соединений. Поэтому опубликованные величины ММ гумусовых кислот колеблются в широких пределах. Так, методы определения ММ, основанные на измерении коллигативных свойств полимера (осмометрия, криоскопия, эбулиоскопия), чрезвычайно чувствительны к присутствию низкомолекулярных примесей в анализируемом образце. Поэтому их применение для анализа препаратов гумусовых кислот, которые практически всегда содержат низкомолекулярные зольные компоненты, может приводить к существенному занижению ММ ( M n) (Aiken and Gillam, 1989). Использование метода скоростной седиментации, напротив, приводит к завышенным значениям ММ ( M z) (Swift, 1989). На определяемые методом ультрафильтрации величины ММ ( M w) большое значение оказывает взаимодействие гумусовых кислот с мембранами (De Nobili et al., 1989). При этом следует отметить, что все указанные методы позволяют определять либо среднюю молекулярную массу полидисперсного образца, либо распределение массы вещества по фракциям, соответствующим диапазонам пропускания фильтрующих мембран. В тоже время гораздо более фундаментальной молекулярно-массовой характеристикой полидисперсного вещества является кривая его молекулярно-массового распределения.

Наиболее доступным и широко распространенным способом исследования ММР полимеров и гумусовых кислот, в частности, является эксклюзионная гельхроматография. Данный метод основан на различной способности молекул разного размера проникать в поры неионогенного геля, который служит неподвижной фазой (Беленький, 1998). При этом эффективным размером молекулы в условиях гель-хроматографического анализа является ее гидродинамический радиус. Однако вследствие полиэлектролитной природы гумусовых кислот использование гель-хроматографического анализа для определения их ММ затрудняется наличием неэксклюзионных эффектов, а именно сверхэксклюзии и адсорбции (Беленький и Виленчик, 1978; De Nobili et al., 1989). Ряд гелей (декстрановые, полиакриламидные) содержат остаточные карбоксильные группы, ионизация которых приводит к образованию отрицательного заряда на частицах геля. Вследствие этого полианион гумусовых кислот исключается из пор по законам значительно более сильной ионной эксклюзии. Поэтому при слабой ионной силе молекулы гумусовых кислот выходят из колонки раньше, чем этого можно было бы ожидать исходя из их размера (De Nobili et al., 1989). Этот эффект хорошо изучен для синтетических полиэлектролитов. Для его устранения гель-хроматографический анализ полиэлектролитов обычно проводят в среде низкомолекулярного электролита.

Данный прием широко применяется и при анализе гумусовых кислот, однако использование солевых растворов в качестве элюентов приводит к адсорбции гумусовых кислот на геле (Posner, 1963, De Nobili et al., 1989). Величина указанного эффекта зависит от свойств геля и анализируемых гумусовых кислот.

Влияние рН пробы, вводимой в колонку, на результаты фракционирования гумусовых кислот, а именно, уменьшение объема эксклюзии с возрастанием рН, также было отмечено рядом исследователей (Schtig, 1972; Sapek, 1973).

Наблюдаемый эффект объясняется, с одной стороны, изменением состояния молекул гумусовых кислот (например их ассоциацией в кислых условиях), а, с другой, вышеупомянутым влиянием ионной силы. Необходимо также отметить, что при несоответствии ионной силы вводимой пробы и используемого элюента вид получаемой гель-хроматограммы искажается из-за так называемого "солевого пика" (Posner, 1963).

Помимо описанного выше влияния неэксклюзионных эффектов на результаты фракционирования гумусовых кислот, не менее сложной проблемой является отсутствие адекватных стандартных веществ, необходимых для калибровки гель-хроматографической колонки. В идеальном случае анализируемое. Однако для гумусовых кислот это условие невыполнимо, поэтому в качестве стандартов при анализе гумусовых кислот обычно используют набор полидекстранов (ПД) или полиэтиленгликолей с известными ММ (Perminova et al., 1998). Некоторые исследователи (Chin et al., 1994) рекомендуют для этих целей использование полистиролсульфоновых кислот полиэлектролиты, их гель-хроматографические характеристики могут также существенно меняться под влиянием неэксклюзионных эффектов. Поэтому нужно проявлять особую осторожность при сопоставлении абсолютных величин ММ, рассчитанных при использовании различных калибровочных веществ.

Хорошей иллюстрацией данному тезису являются результаты исследования, предпринятого в работе Перминовой с сотр. (Perminova et al., 1998). Авторами показано, что абсолютные значения одного и того же препарата гумусовых кислот, определенные с использованием четырех наборов калибровочных веществ (полиакриловые, полиметакриловые и полистиролсульфоновые кислоты, а также полидекстраны) различались почти на порядок. При этом определяемая величина ММ непосредственно зависела от плотности удельного заряда полимеров, использованных в качестве калибровочных веществ. Так, использование калибровочной кривой, построенной по полиакриловым кислотам, имеющим максимальную плотность заряда, приводило к получению минимальных значений ММ. В то же время использование калибровки, построенной по неиногенным полидекстранам, приводило к получению промежуточное положение. Как уже указывалось, максимальный диапазон различий составлял около одного порядка.

Поэтому приводимые в литературе величины ММ гумусовых кислот колеблются в широких пределах, причем наблюдаемые различия во многом связаны с условиями проведения гель-хроматографического анализа (табл. 1.4).

На основании данных табл. 1.4 можно сделать вывод о зависимости ММ гумусовых кислот от источника их происхождения. Согласно данным Перминовой и др. (Perminova et al., 1998), гумусовые кислоты можно расположить в следующий ряд по возрастанию их ММ: ФК природных вод < ФК почв < ГК почв < ГК+ФК торфов. С другой стороны, обращает на себя внимание большой разброс приводимых различными исследователями величин ММ гумусовых кислот, выделенных из сходных источников. Например, по данным Анисимовой и др. (1998) ММ ГК черноземно-луговой почвы составила 15,5 КДа, тогда как Вишнякова и др. (1996) для аналогичных ГК в качестве ММ преобладающей фракции ГК указывает 100 КДа, то есть приводимые величины различаются в 6 раз. Указанные расхождения еще раз подтверждают существенную зависимость получаемых абсолютных значений ММ гумусовых кислот от условий проведения гель-хроматографического анализа, что делает их мало пригодными в целях сравнительного анализа.

Наиболее ярким примером низкой достоверности абсолютных величин ММ гумусовых кислот, получаемых методом гель-хроматографии, являются данные Карпухина и Фокина (1977), согласно которым ММ преобладающих фракций ФК чернозема и краснозема составили всего 170 Да. Очевидно, что данная величина существенно занижена, так как ММ глюкозы и фталевой кислоты - простейших строительных блоков гумусовых кислот - составляют и 160 КДа, соответственно. Кроме того, согласно Орлову (1992), нижний предел M n, вычисленный на основе простейших формул гуминовых и фульвокислот в расчете на фрагмент, содержащий 1 атом азота, для ГК составляет 308, а для ФК - 381 Да.

Молекулярные массы гумусовых кислот различного происхождения, ГК+ФК торфа (среднее по - в работе приведены значения среднепиковых ММ.

Таким образом, данные гель-хроматографического анализа гумусовых кислот характеризуются не только низкой достоверностью абсолютных значений ММ, но и являются малопригодными для сравнительного анализа в случае, когда были использованы различные условия проведения экспериментов. Обобщая существующие данные по гель-хроматографическому определению Mw гумусовых кислот, Д.С. Орлов (1992) для ГК и ФК почв приводит диапазоны 5-650 и 4-15 КДа, соответственно.

1.1.2. Взаимодействие гумусовых кислот с минералами Органическое вещество почвы активно взаимодействует с минеральными компонентами почвы. Образование органоминеральных соединений (в частности, минералорганических) - характерная и неотъемлемая черта почвообразования. (Орлов, 1992). Исследования ряда авторов (Greenland, 1971;

Davis and Glour, 1981; Sibanda and Young, 1986) показали, что растворенные гумусовые кислоты могут быть иммобилизованы минеральными поверхностями.

Дэвис (Davis, 1980) продемонстрировал способность гиббсита адсорбировать ГК и ФК, выделенных из донных отложений. Различные синтетические минералы оксидов и гидроксидов железа также могут адсорбировать значительные количества растворенного органического вещества (Schwertmann, 1966; Sibanda and Young, 1986).

Количественно поглощение минералами гумусовых кислот может быть описано изотермой Лэнгмюра:

где S - количество адсорбированных гумусовых кислот; С - равновесная концентрация гумусовых кислот в растворе; b - максимальная адсорбция; K параметр, характеризующий силу связывания. Величина K имеет размерность л/кг ОС.

По данным различных авторов максимальная адсорбция гумусовых кислот (b) составляет десятки-сотни граммов на килограмм минерала (табл. 1.5) Максимальная адсорбция (b) гумусовых кислот на почвенных минералах Na-монтмориллонит1 1100 г/кг Schnitzer and Kodama, - цифры получены автором диссертации из графического материала, представленного в работе.

- минералы подкласса гидроксидов - глинистые минералы подкласса слоистых алюмосиликатов - минерал подкласса простых оксидов Механизм адсорбции гумусовых кислот на минералах к настоящему времени еще до конца не изучен. Так, для минералов подкласса гидроксидов (гетит, гиббсит, лепидокрокит и др.) рядом исследователей (Inoue and Wada, 1968; Greenland, 1971) в качестве основного механизма их взаимодействия с гумусовыми кислотами был предложен анионный обмен: анионы гумусовых кислот замещают ОН-группы минерала. Парфитт (Parfitt et al., 1977) также высказал предположение, что карбоксильные группы гумусовых кислот могут замещать поверхностные ОН-группы гиббсита, гетита и имоголита.

Возможность участия в лигандном обмене координированных ОН-групп также была отмечена Типпингом (Tipping, 1981). Адсорбция гумусовых кислот по данному механизму должна являться легко обратимой, а образующиеся минералорганические соединения легко разрушаться при увеличении рН выше 8, когда положительный заряд гидроксида алюминия или железа полностью нейтрализуется. Однако, как свидетельствует сам автор, невозможность полной экстракции гумусовых кислот из почв говорит о том, что связывание гумусовых кислот минералами может протекать также и по иным механизмам.

Для взаимодействия гумусовых кислот с глинистыми минералами предложено несколько механизмов. Ряд исследователей (Evans and Russell, 1959;

Kodama and Schnitzer, 1974) полагают, что органическое вещество может адсорбироваться по механизму неионного гидрофобного связывания. Эванс и Расселл (Evans and Russell, 1959) отмечают однако незначительный вклад гидрофобного механизма во взаимодействия гумусовых кислот. Гринлэнд (Greenland, 1971) предположил, что адсорбция гумусовых кислот на глинах происходит путем образования связей через поливалентные металлы на поверхности минерала. Подобное взаимодействие может осуществляться как по механизму "лигандного обмена", так и путем анионного обмена. Дэвис (Davis, 1982) высказал предположение, что последний механизм преобладает при адсорбции ФК и ГК на положительно заряженных сколах каолинита.

Александрова (1980) в качестве вероятных форм связи между гумусовыми кислотами и минералами указывает хемосорбцию и адгезию (рис. 1.2).

Рис. 1.2. Схема строения глиногумусового комплекса алюмосиликатов (Александрова, 1980).

В работе (Murphy and Zachara, 1995) приводятся следующие механизмы адсорбции гумусовых кислот на минеральных поверхностях:

электростатическое притяжение;

специфическая адсорбция путем лигандного обмена с протонированными поверхностными ОН-группами;

образование катионных мостиков;

образование водных мостиков в присутствии на поверхности минерала гидратированных катионов;

гидрофобное взаимодействие.

насыщающего глинистый минерал. Он приводит результаты опыта по сравнительной адсорбции гуминовых кислот на монтмориллоните, насыщенном катионами различной валентности. При смене насыщающего катиона с одноNa+) на двухвалентный количество связанных с минералом ГК возрастает в 8- раз, а при насыщении Fe3+ и Al3+ в 15-20 раз и более. Эванс и Расселл (Evans and Russell, 1959) также показали, что эффективность адсорбции гумусовых кислот на бентоните была больше при насыщении глины Ca2+, чем Na+.

В результате адсорбции гумусовых кислот на почвенных минералах происходит образование органоминеральных коллоидов, при этом конформационное состояние гумусовых кислот существенно изменяется. Так, Шнитцер и Кодама (Snitzer and Kodama, 1967) при изучении комплексов фульвокислот с монтмориллонитом методом ИК-спектроскопии показали, что в комплексе фульвокислоты существуют главным образом в недиссоциированной или слабо диссоциированной формах, что приводит к гидрофобизации глинистой поверхности (Murphy et al., 1992). В результате, адсорбционная емкость образующегося минералорганического комплекса по отношению к гидрофобным органическим веществам значительно превышает суммарную адсорбционную емкость исходных компонентов (глинистого минерала и гумусовых кислот) (Murphy et al., 1990). Таким образом, при перенесении результатов исследований взаимодействия гумусовых кислот с экотоксикантами на реальные системы необходимо учитывать не только содержание, но и форму существования гумусовых кислот в природе.

1.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ С АТРАЗИНОМ

1.2.1. Поведение сим-триазиновых гербицидов в почве Атразин является типичным представителем класса триазиновых гербицидов (табл. 1.6), имеющих следующую структурную формулу:

особенностями поведения в почве, что обусловлено, прежде всего, различиями в заместителях в положении 2 триазинового кольца. Так, сим-триазины, имеющие в положении 2 атом хлора (атразин), являются наиболее устойчивыми в почве:

срок их последействия в зависимости от дозы и условий применения может колебаться от нескольких недель (8-10) до 4 лет, тогда как эта величина для метилтиотриазинов составляет всего 3-10 недель (Майер-Боде, 1972).

Способность сим-триазинов к сорбции в большой мере обусловлена степенью их основности и распределением электронной плотности в молекуле.

Присутствие метокси- и особенно метилтиогруппы, увеличение числа алкильных групп при атоме азота в боковых цепях повышает основность молекул и, соответственно, степень их поглощения органическими адсорбентами. Кроме того, наличие метилтиогруппы влияет на электронную плотность триазинового кольца, обусловливая более прочную связь между гербицидом и почвенным коллоидом.

При попадании в почву сим-триазины, как и другие гербициды, могут претерпевать различные превращения: разлагаться химически и биологически, вымываться, испаряться и т.п. (рис. 1.3).

коллоидами Рис. 1.3. Процессы, происходящие при попадании сим-триазиновых гербицидов в почву.

Сим-триазиновые гербициды прежде всего сорбируются почвой, причем в большинстве случаев - ее органической частью (Лебедева, 1990). Бэйли и Уайт (Bailey and White, 1964) приводят данные о том, что 77% вариации ЕД симазина (дозы гербицида, снижающей накопление сухой биомассы на 50%) предсказуемо по содержанию органического вещества, причем с учетом содержания глины, рН и ЕКО процент предсказуемой вариации составляет 87%.

Пайа-Перец и др. (Paya-Perez et al., 1992) установили, что коэффициент распределения атразина (Kd) между почвенной и водной фазами в наибольшей степени определяется содержанием почвенного органического вещества, в то время как ЕКО, содержание глины, оксидов алюминия и марганца не оказывают существенного влияния. Этими же авторами на основании исследования поведения атразина в 24 почвенных профилях было высказано предположение о том, что не только общее количество органического вещества в почве, но и его состав играют существенную роль в сорбции атразина почвой. Раман и др.

(Raman et al., 1988) также обнаружили значимую корреляцию между степенью сорбции атразина почвой и содержанием в ней органического вещества.

Барриусо и Калвет (Barriuso and Calvet, 1992) установили, что содержание органического вещества в почве является основным показателем, определяющим Kd атразина. По мнению Хана (Khan, 1980), образование связанных остатков сим-триазинов в почве обусловлено их взаимодействием с гумусовыми веществами.

Наряду с сорбцией, в почве происходит также и разложение симтриазинов. В отличие от большинства гербицидов, для атразина характерна преимущественно химическая деградация, главным образом, гидролиз (Сюняев, 1984; Лунев, 1992). При этом атразин переходит в нефитотоксичный гидроксиатразин. Гидролиз атразина ускоряется с повышением температуры и влажности почвы (Лунев, 1992). Повышение уровня кислотности, как правило, также приводит в увеличению скорости гидролиза (там же). В качестве катализаторов гидролиза атразина могут выступать некоторые неорганические катионы (например Al3+), а также гумусовые кислоты почв (Khan, 1978;

Овчинникова, 1987).

Биологическое разложение атразина происходит при наличии в почве микроорганизмов, способных метаболизировать атразин. В настоящее время показано, что атразин разлагается с участием ряда грибов, таких как Aspergillus fumigatus, A. flavipes, A. ustus, Rhizopus stolonifer, Penicillium decumbens, P.

rugulosum, P. luteum (Круглов, 1984; Рэуце и Кырстя, 1986), и бактерий Arthrobacter spp., Microbacterium spp., Pseudomonas spp. (Papilloud et al., 1996). По мнению Круглова (1984), биологическая деградация сим-триазинов начинается с деалкилирования боковых цепей, затем следует раскрытие триазинового кольца и минерализация молекулы сим-триазина с выделением СО2. Бактериальное разложение может играть значительную роль при нейтральных значениях рН;

низкий уровень рН способствует разложению гербицида почвенными грибами (Kaufman and Kearny, 1969).

Связывание гербицида с почвенными коллоидами заметно снижает скорость его разложения. В экспериментах с меченным атразином 83% метки 14С через девять лет после внесения все еще находилось в почве, а 50% этого остатка, включая исходное соединение, представляло собой связанное вещество (Capriel et al., 1985). Показано, что сорбированный атразин становится менее доступным для микроорганизмов (Соколов и Галиулин, 1987).

Соколов и Галиулин (1987) указывают на неоднозначное влияние гумуса на разложение пестицидов в почве:

вблизи органоминеральных почвенных частиц наблюдается локальное повышение концентрации микроорганизмов, что способствует разложению пестицида;

гумусовые кислоты могут выступать в качестве катализаторов химического гидролиза пестицида;

гумусовые кислоты могут выступать в качестве косубстратов при биодеградации пестицидов;

связывание пестицида гуминовые веществами приводит к снижению доли доступного для микроорганизмов пестицида, то есть к снижению скорости биологического разложения;

химическая трансформация пестицида не происходит, если он адсорбирован органическим веществом;

комплекс гумус-пестицид может быть более устойчив в окружающей среде, чем свободная форма пестицида.

Овчинникова (1987) также отмечает двойственную роль почвенного гумуса в разложении пестицидов: если на первоначальных стадиях он способствует ускорению деградации, то впоследствии - замедлению.

Передвижение сим-триазинов в почве, как и их разложение, зависит от сорбции гербицидов почвенными коллоидами. Согласно современным представлениям гербициды класса сим-триазинов характеризуются ограниченной миграцией по почвенному профилю. Основная масса симтриазинов обычно содержится в верхнем слое 0-5 см. Опытами Лебедевой и Шустровой (1975), изучавших влияние свойств почв на перемещение симазина, было показано, что в торфе и глине гербицид не перемещался ниже 5 см даже в условиях интенсивного промывания. В дерново-подзолистой суглинистой хорошо окультуренной почве максимальная концентрация гербицида наблюдалась в слое 0-15 см, а в песке самым токсичным оказался слой 15-20 см.

Таким образом, утяжеление механического состава и увеличение содержания органического вещества способствовало адсорбционному закреплению токсиканта и ограничению его перемещения. Данный вывод можно отнести ко всем гербицидам группы сим-триазинов. Некоторыми авторами, однако, было показано, что миграция сим-триазиновых гербицидов не ограничивается только верхним слоем почвы, а может распространяться на весь пахотный слой и глубже. Глубина миграции атразина при многолетнем применении может составлять до 30-60 см и более (Лунев, 1992). Отмечается, что в определенных условиях симазин может мигрировать с капиллярной водой из нижних слоев в верхние, вследствие чего содержание гербицида в этих слоях повышается и на кривых динамики наблюдаются локальные максимумы (там же). В целом, симтриазиновые гербициды относят к классу среднеподвижных в почве (Khan, 1980).

Таким образом, адсорбция атразина на органическом веществе почвы, главным образом на гумусовых кислотах, определяет его поведение в почвенном профиле. Поэтому далее нами будет рассмотрено взаимодействие атразина с гумусовыми кислотами.

1.2.2. Взаимодействие атразина с гумусовыми кислотами в почвенной среде Как уже упоминалось, при попадании в почву атразин связывается ее органической частью, а именно, гумусовыми кислотами, находящимися как в растворенной, так и иммобилизованной формах. При этом как количество связанного атразина, так и механизм образования комплекса атразин-гумусовые кислоты будет определяться, главным образом, формой существования гумусовых кислот. Поэтому для более полной оценки взаимодействия атразина с гумусовыми кислотами в реальных условиях необходимо рассматривать процессы взаимодействия гербицида как с растворенными гумусовыми кислотами, так и с их адсорбционными комплексами с глинистыми минералами.

Количественная оценка взаимодействия атразина с гумусовыми кислотами Для количественной оценки взаимодействия атразина с гумусовыми кислотами используют два показателя: адсорбционную емкость гумусовых кислот по отношению к атразину и константу связывания (KOC). Адсорбционная емкость характеризует максимальное количество атразина, которое может быть связано гумусовыми кислотами, а KOC характеризует силу этого взаимодействия.

Для описания адсорбции атразина гумусовыми кислотами в большинстве случаев используют уравнение адсорбции Фрейндлиха (Khan, 1978):

где Aads - количество адсорбированного вещества при его равновесной концентрации [A]; HS - масса гумусовых кислот; K - константа равновесия и n степень нелинейности изотермы. В связи с тем, что концентрация гумусовых кислот не может быть выражена в молях, в отличие от индивидуальных вещества, константа имеет размерность л/кг.

Величину n в выражении Фрейндлиха часто принимают равной 1, что отвечает линейной зависимости между количеством адсорбированного вещества и равновесной концентрацией в растворе (Тинсли, 1982). Поэтому распределение вещества между раствором и адсорбентом описывается с помощью коэффициента пропорциональности:

где Kd (л/кг) - коэффициент распределения атразина между двумя фазами (раствором и гумусовыми кислотами).

Для расчета адсорбции вещества на гумусовых кислотах используют соотношение в котором количество адсорбированного вещества рассчитывается на органический углерод (ОС). Константа KOC имеет размерность л/кг ОС.

Принимая, что где CA и [A] - начальная и равновесная концентрации атразина, соответственно; CHS - концентрация гумусовых кислот и V - объем раствора, выражение (1.8) можно преобразовать как:

Следовательно Таким образом, KOC может быть рассчитана как тангенс угла наклона экспериментально получаемой зависимости ( -1) от CHS.

Следует также отметить, что рассчитываемая таким способом константа взаимодействия соответствует константе равновесия реакции:

Константа равновесия в данном случае запишется как:

где KOC - константа связывания гумусовых кислот с атразином, [A-HS] и [A] - концентрация связанной и несвязанной форм атразина, соответственно; [HS] концентрация гумусовых кислот в кг ОС/л.

Ввиду того, что в условиях эксперимента общая концентрация гумусовых кислот (CHS) намного больше таковой атразина (CA), можно принять [HS] = CHS.

Учитывая, что [A-HS] = CA-[A], выражение (1.15) можно преобразовать в следующее:

адсорбционной емкости гумусовых кислот по отношению к атразину является разделение образующегося комплекса атразин-гумусовые кислоты и свободного атразина. Для этого в настоящее время используют ультрафильтрацию (Wang et al., 1989) или равновесный диализ (Hesketh et al., 1996; Devitt and Weisner, 1998).

Оба метода основаны на предположении, что молекулы гумусовых кислот, обладающие большими молекулярными массами, не могут проникать через мембранные фильтры. Таким образом, мембраны являются непроницаемыми для связанного с гумусовыми кислотами атразина и проницаемыми - для свободного атразина. В ряде случаев, когда концентрация гумусовых кислот достаточно большая, возможно разделение свободного и связанного атразина центрифугированием (Celis et. al., 1997), при этом связанный атразин осаждается вместе с гумусовыми кислотами, а свободный остается в растворе.

Значения адсорбционной емкости гумусовых кислот по отношению к атразину, приводимые в литературе, составляют десятки-сотни мкмоль атразина на грамм гумусовых кислот (табл. 7).

Адсорбционная емкость (S) гумусовых кислот по отношению к атразину кислоты мкмоль/г связанного атразина К сожалению, крайне небольшой объем данных не позволяет делать на их основе выводы о зависимости адсорбционной емкости гумусовых кислот по отношению к атразину от их происхождения или свойств. Тем не менее, можно заключить, что почвенные ГК и ФК обладают сходной адсорбционной емкостью, в то время как угольные ГК характеризуются на порядок большей адсорбционной емкостью по отношению к атразину, чем почвенные.

Константы связывания (KOC) атразина гумусовыми кислотами - KOC рассчитана автором диссертации на основании графического материала, представленного в работе.

Значения KOC, приводимые в литературе, составляют от 25 до 600 л/кг (табл. 1.8).

Как показывает табл. 1.8, величины KOC для взаимодействия атразина с многочисленными данными по константам взаимодействия гумусовых кислот с ПАУ (104-105 л/кг ОС) (Gauthier et al., 1987, Schlautman and Morgan, 1993, Perminova et al., 1999) показывает, что сродство гумусовых кислот к атразину весьма незначительно. Принимая во внимание низкую концентрацию водорастворимых гумусовых кислот в почве (Когут, 1996), можно сделать вывод о том, что связывание с растворенными гумусовыми кислотами не может существования в почвенной среде.

кислотами Единого мнения о механизме взаимодействия гумусовых кислот с атразином не существует. В качестве возможных механизмов рассматривают взаимодействий (Hayes, 1970), хемосорбцию за счет ионного обмена (Gilmour and Coleman, 1971), водородное связывание (Sullivan and Felbeck, 1968), лигандный обмен и донорно-акцепторное взаимодействие (Hayes, 1970). При этом доминирующими механизмами взаимодействия по мнению различных исследователей являются ионный обмен и водородное связывание (Gilmour and Coleman, 1971) или образование комплексов с переносом заряда (Piccolo et al., 1992).

Процесс ионного обмена возникает при протонировании триазинового гербицида в почвенном растворе:

где Т - триазиновый гербицид. Далее может идти реакция:

где R-COOX - гипотетическая молекула гумусовых кислот, а Х - обменный катион (например Н+ или Са2+).

взаимодействия между:

карбонильными группами органических кислот и аминогруппами триазинов (органическое вещество - донор электронной пары) фенольными или гидроксильными группами гумусовых кислот и кислородом, хлором или серой в положении 2 триазинового кольца (органическое вещество - акцептор электронной пары).

Специальное исследование, предпринятое Ли и Фелбеком (Li and Felbeck, 1972), по выявлению роли различных функциональных групп гумусовых кислот в связывании атразина, показало ведущую роль карбоксильных и/или фенольных групп. Салливан и Фелбек (Sullivan and Felbeck, 1968) отмечают также вклад в данное взаимодействие карбонильных и спиртовых гидроксильных групп в составе органического вещества. Гилмор и Колеман (Gilmour and Coleman, 1971) указывают на связь между константой сорбции сим-триазинов гуминовыми кислотами и насыщенностью последних Са, который, с одной стороны, конкурирует с гербицидом за места адсорбции на гуминовых кислотах, а с другой, увеличивает количество мест возможного обмена. В целом, с увеличением насыщенности гуминовых кислот Са количество адсорбированного гербицида уменьшается (там же). Кроме того, в зависимости от содержания Са меняется тип адсорбции гербицида: если при низкой насыщенности адсорбция хорошо описывается уравнением обмена, то при высокой степени насыщенности ионный обмен играет незначительную роль (Hayes, 1970).

спектроскопии обнаружили, что молекула атразина существует в виде смеси четырех таутомерных форм. При этом электронная пара азота в триазиновом кольце делокализована, поляризуя при этом молекулу атразина (кислые цепочечные NH-группы и основные атомы N в кольце) и способствуя гидрофобному связыванию. Таким образом, относительно устойчивые комплексы атразин-гуминовые вещества (ГВ) могут образовываться при участии амидных или карбоксильных функциональных групп ГВ.

Образование комплексов с переносом заряда (КПЗ) может происходить путем переноса электрона от азота в боковой цепочке молекулы гербицида (триазин - донор) к хинону молекулы ГВ (ГВ - акцептор) (Sposito et al., 1996).

Другой возможный механизм - образование так называемых - комплексов, когда заряд делокализуется между ароматическим кольцом ГВ и триазиновым кольцом гербицида (Clapp et al., 1997; Senesi et al., 1995). Общая схема возможных взаимодействий приведена на рис. 1.4.

взаимодействие водородное связывание (атразин - акцептор) Рис. 1.4. Схема взаимодействия атразина с гумусовыми кислотами (Clapp et al., 1997) Вследствие специфики описанных механизмов связывания гумусовых кислот с триазиновыми гербицидами, взаимодействие данных соединений в существенной степени зависит от условий проведения реакции. При этом наиболее важными факторами являются рН, ионная сила и концентрация реагентов. Их значимость для протекания взаимодействия в системе почвенные ГК (ФК) - атразин наглядно демонстрируется Уангом и др. (Wang et al., 1990, 1991). При возрастании концентрации ФК происходит уменьшение адсорбции на них атразина (Wang et al., 1990), (рис. 1.5), а увеличение концентрации ГК приводит к увеличению адсорбции гербицида (Wang et al., 1991), (рис. 1.6).

Рис. 1.5. Концентрационная зависимость связывания атразина ФК (Wang et al., 1990) Рис. 1.6. Концентрационная зависимость связывания атразина ГК (Wang et al., 1991) Авторы объясняют наблюдаемый эффект агрегированием ФК при высоких взаимодействия. При этом агрегирования ГК при сходных концентрациях не происходит. Теми же авторами отмечается зависимость адсорбции атразина от кислотности среды: максимальное связывание атразина С ГК происходит при рН 3,05 (Wang et al., 1991), а с ФК при рН 1,40, причем при рН > 5,5 связывание атразина с ФК практически не происходит (Wang et al., 1990), (рис. 1.7 и 1.8). В тоже время Ладонин и Алиев (1991) указывают на противоречивость данных о влиянии кислотности среды на степень адсорбции сим-триазинов органическим веществом.

Рис. 1.7. Зависимость связывания атразина ФК от рН среды (Wang et al., 1990) Рис. 1.8. Зависимость связывания атразина ГК от рН среды (Wang et al., 1990) Исходя из приведенных выше механизмов, можно сделать вывод о зависимости этого взаимодействия не только от условий среды, но и от свойств органического вещества, таких как состав и количество функциональных групп, насыщенность Са, молекулярная масса и т.п. Так как органическое вещество не является однородным по этим свойствам, то можно ожидать, что сорбционная емкость различных фракций органического вещества по отношению к симтриазиновым гербицидам должна быть разной. Действительно, в работе (Овчинникова, 1987) показано, что атразин сорбируется преимущественно гумином и ФК, тогда как симазин - ГК и ФК. Существуют также данные о том, что пестициды сорбируются в первую очередь мобильными ФК и лишь затем остальными фракциями органического вещества (Сизов и др., 1990). Однако Уанг с соавт. (Wang et al., 1990) в своих исследованиях пришли к прямо противоположному выводу: ведущую роль в связывании гербицида атразина играет высокомолекулярная фракция гумусовых кислот. Стюарт (Stewart, 1984), отмечая быстрое связывание сим-триазинов высокомолекулярной коллоидной фракцией водорастворимых гумусовых кислот, также указывает на различия в низкомолекулярной фракциями гумусовых кислот: в первом случае идет низкоэнергетическое взаимодействие (адсорбция), а во втором высокоэнергетическое (ковалентное связывание).

Связывание атразина адсорбционными комплексами гумусовых кислот с минералами Почвенные коллоиды являются органоминеральными образованиями различных почвенных компонентов. В большинстве случаев это глинистоорганический комплекс, в котором глина покрыта пленкой органических веществ (Greenland, 1965; Ahlrichs, 1972). Разделение комплекса без нарушения адсорбционных свойств входящих в него глины и органического вещества практически невозможно (Edwards and Bremner, 1967). Таким образом, при исследовании свойств отдельных почвенных компонентов результаты не могут быть использованы для оценки реальных объектов. В связи с этим в последнее время стали появляться работы, посвященные изучению адсорбционных свойств модельных коллоидов или непосредственно полученных из почвы минералорганических фракций по отношению к загрязняющим веществам.

Получение модельных минералорганических комплексов в большинстве случаев подразумевает предварительное насыщение выбранного глинистого минерала ионом какого-либо металла (например Na+, Ca+) для того чтобы снять отрицательный заряд поверхности минерала и тем самым повысить его адсорбционную емкость по отношению к гумусовым кислотам (Murphy et al., 1990).

Адсорбцию атразина на почвенных и модельных коллоидах обычно характеризуют коэффициентом распределения Kd (Celis et al., 1998):

где Aads - количество адсорбированного на сорбенте атразина; [A] равновесная концентрация гербицида.

Для расчета константы связывания атразина адсорбированными на минерале гумусовыми кислотами KOC пользуются уравнением (Celis et al., 1998):

где OC,% - содержание органического углерода в сорбенте.

Исследованию адсорбции атразина и симазина на моделях почвенных коллоидов посвящена работа Селиса и др. (Celis et al., 1998). В качестве моделей монтмориллонитом и гидроксидом железа (III). Авторами было установлено, что КОС для растворенных ГК составляет 310, а для адсорбированных на монтмориллоните - 1475 л/кг, т.е. константа связывания возросла в три раза.

Аналогичное увеличение констант связывания было установлено при исследовании сорбции ПАУ на иммобилизованных на каолините и гематите торфяных ГК и ФК (Murphy et al., 1990).

Приводимые в литературе значения констант связывания атразина реальными почвенными частицами значительно ниже. Так, вычисленные нами на основании данных Хлебниковой (1975) значения КОС атразина для дерновоподзолистой почвы, чернозема и краснозема составили, соответственно, 161, и 152 л/кг ОС. Максимальная сорбция атразина, наблюдавшаяся для чернозема, была 37,1 мкг/кг почвы. Лайрд и др. (Laird et al., 1994) получили сходные величины сорбции атразина почвенными глинистыми частицами разного размера: 9,75-21,38 мкг/кг почвы. Обработка изученных глинистых фракций перекисью водорода с целью разложения органического вещества приводила к снижению показателей сорбции в 1,2-16,0 раз. Согласно оценкам, приводимым в цитируемой выше работе, вклад органического вещества в определение сорбционной способности почвенных частиц по отношению к атразину составил 68%.

Интересные результаты приводят Березовский и Немова (1973):

коэффициент распределения атразина (Kd) в торфяной и дерново-подзолистой почвах составил 26,1 и 1,4 л/кг почвы, при этом вычисленные автором диссертации на основе их данных КОС составили 85 и 103 л/кг ОС, соответственно. Это свидетельствует о предпочтительной сорбции атразина на минералорганических комплексах по сравнению с чистым органическим веществом.

Сета и Каратанасис (Seta and Karathanasis, 1997) также установили наличие статистически значимой корреляции между содержанием органического вещества в почвенных коллоидах и их способностью адсорбировать атразин. В качестве главных механизмов взаимодействия атразина с адсорбированным органическим веществом авторами были предложены физическая адсорбция и гидрофобное связывание. Другими исследователями (Laird et al., 1994), однако, отмечается возможность хемосорбции атразина на минералорганических комплексах в случаях, когда в состав комплекса входит грубодисперсная (>2 мкм) глинистая фракция. Авторы объясняют этот факт относительной обогащенностью сорбированных на грубодисперсной глинистой фракции гумусовых кислот функциональными группами по сравнению с сорбированными на тонкодисперсной фракции.

Адсорбция атразина почвенными минералорганическим адсорбционными комплексами приводит к снижению его концентрации в почвенном растворе, и, как следствие, к снижению его токсичности. Таким образом, гумусовые кислоты и их минералорганические комплексы выступают как природные детоксиканты.

Более подробно детоксицирующая способность гумусовых кислот будет рассмотрена в следующем разделе.

1.3. ДЕТОКСИЦИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ ПО

ОТНОШЕНИЮ К АТРАЗИНУ

В результате взаимодействия атразина с растворенными и связанными в адсорбционные комплексы гумусовыми кислотами, в почве атразин может находиться в нескольких формах:

свободный атразин;

атразин, связанный с растворенными гумусовыми кислотами;

атразин, сорбированный на минералорганических комплексах гумусовых кислотах.

(Вследствие образования минералорганических комплексов гумусовых кислот с почвенными минералами поверхность последних практически недоступна для молекул гербицидов (Hance, 1969)).

Токсичность атразина для растений в этом случае может быть обусловлена только теми его формами, которые находятся в растворе, то есть свободным атразином и атразином, связанным с растворенными гумусовыми кислотами.

Оценка уровня токсичности в подобной системе осложняется присутствием растворенных гумусовых кислот, которые могут непосредственно влиять на состояние растений. Поэтому для корректной оценки воздействия такой системы на растение необходимо предварительно определить действие каждого компонента, а именно: свободного атразина, гумусовых кислот и атразина в присутствии гумусовых кислот.

1.3.1. Гербицидная активность атразина Как уже указывалось ранее, атразин относится к классу сим-триазинов, гербицидная активность которых установлена еще в 1952 году (Майер-Боде, 1972). Поступление этих гербицидов в растения происходит через корневую систему, они являются гербицидами системного действия. В настоящее время доказано, что сим-триазины ингибируют реакцию фотолиза воды (реакция Хилла) в процессе фотосинтеза растений, блокируя отток электронов от акцепторной части фотосистемы II (ФС II) (Гольдфельд и Карапетян, 1989), т.е.

нарушают нециклический транспорт электронов. Являясь ингибиторами транспорта электронов, они действуют исключительно на мембранные стадии их переноса между двумя ФС при участии пластохинонного подвижного переносчика.

Так как триазины угнетают световую стадию фотосинтеза, то на степень проявления их фитотоксичности оказывает влияние освещенность: чем она выше, тем сильнее действие гербицидов. Кроме того, для проявления токсичности сим-триазинов необходимо наличие у растения сформировавшегося фотосинтетического аппарата. Гербицидная активность сим-триазинов в почве теряется при их гидролизе, когда они переходят в гидрокситриазины, у которых заместителем в положении 2 является ОН-группа. В растениях инактивация симтриазинов может происходить двумя путями: во-первых, за счет образования нетоксичного комплекса гербицида с фенольными соединениями и, во-вторых, в результате разрушения триазинового кольца полифенолоксидазной системой растения (Зинченко, 1971).

1.3.2. Физиологическая активность гумусовых кислот Принципиальная возможность поступления гумусовых кислот в растение была показана в работах Христевой (1951), Прата (Prat, 1963; Prat and Pospisil, 1959) и Фокина (Фокин и др., 1975). Коллективом авторов под руководством Фокина (1975) установлено, что гуминовые кислоты могут проникать непосредственно в клетки растений, достигая их важнейших органелл - ядра, митохондрий, хлоропластов. Cогласно исследованиям Христевой (1951), гумусовые кислоты могут выступать в качестве питательных веществ для растений или же играть роль физиологически активных веществ (ФАВ), причем большей физиологической активностью обладают наиболее низкомолекулярные фракции гумуса. Кроме того, было показано, что физиологическое действие присуще лишь истинным растворам гумусовых кислот; при их осаждении исчезает как положительный эффект на растения (проявляющийся при малых концентрациях), так и негативный (проявляется при высоких концентрациях).

Физиологической активности гумусовых кислот посвящен обзор Виссера (Visser, 1986), где приводятся следующие возможные механизмы влияния гумусовых кислот на рост и развитие растений:

увеличение количества доступного железа за счет образования железогумусовых комплексов;

изменение поглощения 2-х и 3-х валентных катионов (Ca2+, Mg2+, Fe3+, Al3+);

облегчение ионного обмена между протоплазмой и почвенным раствором;

влияние на вязкость и коллоидную структуру протоплазмы;

влияние на проницаемость клеточной мембраны: в высоких концентрациях гумусовые кислоты могут повреждать клеточную мембрану;

непосредственное поглощение гумусовых кислот клетками; ФК могут поглощаться в большей степени, нежели ГК;

взаимодействие с ферментами: ферменты могут встраиваться в молекулы гумуса, придавая им ферментативную активность; ФК в этом отношении активнее, чем ГК.

В качестве механизмов влияния гумусовых кислот на рост и развитие растений чаще всего предлагаются две гипотезы из выше перечисленных.

Прежде всего, гумусовые кислоты могут действовать как растительные гормоны (Mller-Wegener, 1988; Раковский и Пигулевская, 1978). Несмотря на то, что некоторые авторы (Phuong and Tichy, 1976) избегают проводить прямые аналогии между гумусовыми кислотами и растительными гормонами, такими как ауксин, гиббереллин и цитокинин, физиологическая активность гумусовых кислот в настоящее время достоверно установлена (Пивоваров, 1962; Христева, 1952; Христева, 1968; Христева и др., 1968).

Другое возможное объяснение - действие гумусовых кислот как высокодисперсного золя, увеличивающего проницаемость плазмалеммы и способствующего поступлению питательных веществ в растения (Баталкин и др., 1983, Вахмистров и др., 1987).

Кроме перечисленных, Христева (1951, 1957, 1962) предлагает еще один возможный механизм физиологической активности гумусовых кислот - их действие как промежуточных катализаторов процесса дыхания. Данный механизм обусловлен наличием в структуре гумусовых кислот полифенольных и хинонных фрагментов, которые используются растением для усиления фенолазной окислительной системы, следствием чего является активизация дыхания и обмена веществ в целом. Кроме того, по мнению Христевой, часть полифенольных групп гуминовых кислот может функционировать как донор водорода для промежуточных акцепторов дыхательной цепи, благодаря чему активизация кислородного обмена может происходить и без участия полифенолокисдазы Христева, 1967).

Никлевский с сотрудниками (1971) (цит. по Христевой, 1973), касаясь природы биологической активности препаратов гуминовых веществ, отмечает, что гуматы в основном затрагивают в растениях процессы дыхания и фотосинтеза. Подробное исследование влияния гумусовых кислот на отдельные стадии фотосинтеза было проведено Бобырем (1980). Было установлено, что внесение гуматов натрия при выращивании культуры гороха активируют скорость транспорта электронов в электрон-транспортной цепи выделенных из них хлоропластов, циклическое и нециклическое фотофосфорилирование. При добавлении гуматов натрия непосредственно в среду инкубации хлоропластов гороха наблюдали снятие трансмембранного протонного градиента, начиная с определенной концентрации препарата. Это свидетельствует о том, что в больших концентрациях гуматы натрия разобщают транспорт электронов и фотофосфорилирование. Автор приходит к выводу, что влияние гумусовых кислот на фотосинтез не является специфическим, а обусловлено их воздействием на мембранную, фитогормональную, белоксинтезирующую и др.

системы, приводящим к структурным изменениям в растительном организме.

В силу полидисперсности гумусовых кислот их различные фракции могут оказывать действие на растение, различное как по силе, так и по направленности.

В связи с этим целый ряд работ посвящен выявлению наиболее активной части гумусовых кислот, а также зависимости действия органического вещества почвы от его свойств. Так, Виссер (Visser, 1986) приводит данные о большей степени поглощения растениями ФК, чем ГК. Кроме того, указывается на зависимость степени поглощения от молекулярной массы и состава функциональных групп гумусовых кислот. Алиев (1987), изучая действие гумусовых кислот как ФАВ, пришел к выводу о том, что наиболее активными являются самые низкомолекулярные фракции гумусовых кислот, характеризующиеся наибольшим содержанием функциональных групп и свободных радикалов.

Фуонг и Тиши (Phuong and Tichy, 1976) при рассмотрении ауксинового, гиббереллинового и цитокининового действия ГК, гиматомелановой кислоты и ФК из торфа получили результаты, свидетельствующие о наибольшей активности ФК. Интересные исследования, посвященные связи поверхностноактивных свойств ГК с их физиологической активностью, были проведены Вахмистровым с соавт. (1987). Авторы обнаружили, что при снижении поверхностного натяжения раствора ГК (за счет увеличения их концентрации) с 72 до 65 дин/см происходит стимуляция роста корней огурцов. При дальнейшем снижении поверхностного натяжения до 61 дин/см наблюдали резкое угнетение роста. Проведенные опыты с модельным ПАВ Твин 20 не показали аналогичного эффекта: при поверхностном натяжении 65-61 дин/см наблюдали лишь выход на некоторое постоянное значение, но не угнетение. Авторы пришли к выводу о специфического действия ГК на клеточные мембраны растений.

Физиологическая активность растворенного органического вещества (РОВ) исследовалась, в основном, по отношению к одноклеточным организмам и бактериям. По-видимому, это связано с тем, что в данных исследованиях использовался РОВ рек и озер, хотя существуют исследования, проведенные с почвенным РОВ (Stewart, 1984). Прежде всего необходимо отметить, что РОВ поверхностных вод представлен гумусовыми кислотами на 50-80% (Rashid, 1985;

Petersen, 1991), почвенный - на 60% (Easthouse et al., 1992). Кроме того, в состав РОВ могут входить витамины, растительные гормоны (Орлов и др., 1985). В целом, авторы отмечают угнетающее действие наиболее низкомолекулярной высокомолекулярных фракций. Петерсен (Petersen, 1991) отмечает, что при внесении водорастворимых гумусовых веществ скорость роста Daphnia magna снижалась и объясняет наблюдаемый эффект поверхностно-активными свойствами гумусовых кислот. Тулонен с соавт. (Tulonen et al., 1992), изучая зависимость действия РОВ на бактерии и одноклеточные водоросли, обнаружили уменьшение скорости роста и биомассы бактерий и водорослей в присутствии