Государственное учреждение

ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

ОВАНЕСОВ

Михаил Владимирович Влияние факторов внутреннего пути свертывания крови на пространственную динамику роста сгустка 03.00.02 - биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов Москва Final Aug2002 diss15(final)15print(final).doc

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О КОАГУЛЯЦИОННОМ ЗВЕНЕ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА

1.1.1. Коагуляционное звено системы гемостаза

1.1.2. Внутренний и внешний пути каскада свертывания крови

1.1.3. Петли положительной обратной связи и образование комплексов

1.1.4. Образование фибриновой сети

1.1.5. Естественные ингибиторы свертывания

1.1.6. Лизис фибринового сгустка

1.2. МАТЕМАТИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ КИНЕТИКИ СВЕРТЫВАНИЯ. АВТОВОЛНОВАЯ ГИПОТЕЗА

1.3. ГЕМОФИЛИИ А, В И С

1.3.1. Гемофилии - дефициты факторов внутреннего пути свертывания

1.3.2. Гипотезы о механизмах нарушения гемостаза при гемофилиях

1.4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ ГЕМОФИЛИИ IN VITRO

1.4.1. Классификация экспериментальных постановок

1.4.2. Исследования гомогенной кинетики

1.4.3. Пространственно-распределенные системы

1.4.4. Пространственная динамика роста сгустка в неперемешиваемой плазме крови

1.5. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. МАТЕРИАЛЫ

2.2. ДОНОРЫ КРОВИ

2.3. ПОЛУЧЕНИЕ ПЛАЗМЫ КРОВИ

2.4. СТАБИЛИЗАЦИЯ РН ПЛАЗМЫ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТОЙ

2.5. РЕКАЛЬЦИФИКАЦИЯ ПЛАЗМЫ

2.6. СТАНДАРТНЫЕ ТЕСТЫ АЧТВ, ПВ И ТВ

2.7. КУЛЬТУРА ФИБРОБЛАСТОВ И ЛИМФОЦИТОВ

2.8. ВОСПОЛНЕНИЕ ДЕФИЦИТА ФVIII IN VITRO

2.9. СОРБЦИЯ ТРОМБИНА И ТРОМБОПЛАСТИНА НА ПВДФ МЕМБРАНУ

2.10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВРЕМЕНИ ПОЛУЖИЗНИ "АГЕМФИЛА В"

2.11. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СИСТЕМА

2.11.1. Конструкция кюветы

2.11.2. Установка

2.12. ПРОГРАММНЫЙ КОМПЛЕКС ПОЛУЧЕНИЯ И ОБРАБОТКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИЗОБРАЖЕНИЙ

2.12.1. Получение изображений

2.12.2. Обработка экспериментальных кадров.

2.12.2.1. Сигнал светорассеяния

2.12.2.2. Флуоресценция

2.12.2.3. Алгоритм восстановления распределения активных факторов свертывания

2.13. ЧИСЛЕННЫЕ МЕТОДЫ

2.13.1. Вычисление производных и фильтрация шумов

2.13.2. Решение уравнений с диффузией

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. ИССЛЕДОВАНИЕ РОСТА СГУСТКА В НОРМАЛЬНОЙ ПЛАЗМЕ

3.1.1. Рост сгустка, активированный по внутреннему пути свертывания

3.1.2. Рост сгустка, активированный по внешнему пути свертывания

3.1.3. Влияние плотности фибробластов в слое на рост сгустка в нормальной плазме

3.1.4. Влияние системы контактной активации на пространственный рост сгустка

3.1.4.1. Ингибирование контактной фазы свертывания с помощью КТИ

3.1.4.2. Влияние материала и геометрических параметров экспериментальной кюветы на характер роста сгустка

3.1.5. Оценка тромбогенности материалов по пространственной динамике формирования сгустка

3.1.5.1. Модификация поверхности стекла

3.1.5.2. Изучение in vitro тромбогенности внутривенных катетеров

3.1.6. Активация роста сгустка иммобилизованным тромбином

3.2. РОСТ СГУСТКА В ПЛАЗМЕ БОЛЬНЫХ ТЯЖЕЛОЙ ФОРМОЙ ГЕМОФИЛИЙ А И В

3.2.1. Рост сгустка, активированный по внутреннему пути свертывания

3.2.2. Рост сгустка, активированный по внешнему пути свертывания

3.2.3. Влияние силы внешней активации на динамику роста сгустка

3.3. РОСТ СГУСТКА В ПЛАЗМЕ БОЛЬНЫХ С ДЕФИЦИТАМИ ФАКТОРА XI И ФАКТОРА X

3.4. ИЗМЕНЕНИЕ ДИНАМИКИ РОСТА СГУСТКА ПРИ ВОСПОЛНЕНИИ ДЕФИЦИТОВ ФАКТОРОВ ВНУТРЕННЕГО ПУТИ

СВЕРТЫВАНИЯ

3.4.1. Влияние высокоочищенного фактора VIII на пространственную динамику роста сгустка в плазме больных гемофилией А

3.4.1.1. Восполнение дефицита фактора VIII in vitro высокоочищенным фактором VIII человека.

3.4.1.2. Влияние плотности фибробластов на скорость роста сгустка при разных концентрациях добавленного фVIII

3.4.1.3. Влияние контактной фазы свертывания на эффект фVIII на рост сгустка в плазме больных гемофилией

3.4.1.4. Пространственная динамика свертывания в плазме больного гемофилией А (фVIII < 1%) с высоким титром ингибитора

3.4.2. Проверка тромбогенности высокоочищенного фVIII путем добавления к нормальной плазме.. 3.4.3. Восполнение дефицита фактора VIII свежей донорской плазмой

3.4.4. Нормализация свертывания препаратами «Агемфил А» и «Агемфил В»

3.4.4.1. Фармакокинетика "Агемфила В"

3.4.4.2. Динамика роста сгустка в плазме больных гемофилией В при лечении "Агемфилом В".

3.4.4.3. Динамика роста сгустка в плазме больных гемофилией А при лечении "Агемфилом А"

пространственной динамикой роста сгустка

3.4.6. Влияние фактора VIIa на пространственную динамику свертывания

3.5. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ДИНАМИКА РАСПРОСТРАНЕНИЯ ТРОМБИНА ВО ВРЕМЯ РОСТА СГУСТКА

3.5.1. Методика измерения пространственной динамики активных факторов свертывания.............. распределений ферментативной активности

3.5.3. Распределения тромбина в ходе роста сгустка в нормальной плазме

3.5.4. Распределения тромбина в ходе роста сгустка при гемофилиях А и В

3.6. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ДИНАМИКА ЛИЗИСА СГУСТКА

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. ПРОСТРАНСТВЕННЫЕ ФАЗА ИНИЦИАЦИИ И ФАЗА РОСТА ФИБРИНОВОГО СГУСТКА

4.1.1. Характеристика экспериментальной системы

4.1.2. Фазы пространственного свертывания плазмы крови

4.2. НАРУШЕНИЕ ФАЗЫ РОСТА СГУСТКА ПРИ ДЕФИЦИТАХ ФАКТОРОВ ВНУТРЕННЕГО ПУТИ СВЕРТЫВАНИЯ...........

4.3. НОРМАЛИЗАЦИЯ ПРОСТРАНСТВЕННОГО РОСТА СГУСТКА ПРИ ВОСПОЛНЕНИИ ДЕФИЦИТА ФАКТОРОВ

ВНУТРЕННЕГО ПУТИ СВЕРТЫВАНИЯ

4.4. МЕХАНИЗМ НАРУШЕНИЯ РОСТА СГУСТКА ПРИ ГЕМОФИЛИЯХ

4.5. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ДИНАМИКА СВЕРТЫВАНИЯ КАК НОВЫЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений.

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время КТИ - ингибитор трипсина из зерен кукурузы (ингибитор фактора ТАФИ - активируемый тромбином ингибитор фибринолиза фVIII:C - коагуляционная активность фактора VIII фIX:C - коагуляционная активность фактора IX фXII - фактор XII фXIII - фактор XIII АМС - 4-метил-7-аминокумарин С1-И - С1-ингибитор rVIIa - рекомбинантный фактор VIIa S2 - BOC-Ala-Pro-Arg-AMC (t-N-бутоксикарбонил-аланилпролил-аргинил-7-амино-4-метилкумарин) S3 - BOC-Ile-Gly-Arg-AMC 2-М 2–макроглобулин В организме человека в ответ на нарушение целостности стенки кровеносного сосуда инициируется система гемостаза. В месте повреждения образуется гемостатический тромб, который предотвращает потерю крови. Основу тромба составляет свернувшаяся плазма крови - сгусток. Нарушения свертывания - неконтролируемые кровоточивость или тромбообразование - сопровождают большинство патологических процессов с летальным исходом. Поэтому изучение механизмов инициации и развития коагуляционного процесса является одной из важнейших задач современной биофизики и медицины.

Настоящая работа посвящена изучению роста сгустка в нормальной плазме и в плазме больных дефицитами факторов внутреннего пути свертывания (гемофилии) in vitro.

Гемофилии - самые распространенные вызывающие кровоточивость патологии свертывания.

Гемофилии хорошо изучены с клинической стороны. Однако, анализ литературы показывает, что вопрос о механизме нарушения тромбообразования при этом заболевании остается до сих пор спорным. Связано это с тем, что при повреждении сосуда свертывание инициируется только по внешнему пути, а при гемофилии нарушен другой, внутренний путь свертывания.

Более того, стандартные тесты внешнего пути свертывания не отражают нарушений в образовании сгустка у гемофиликов. Интерес к исследованию именно пространственного свертывания вызван рядом причин. Во-первых, современные экспериментальные и теоретические работы указывают на то, что при гемофилии может быть нарушена пространственная фаза роста сгустка. Однако прямых экспериментальных подтверждений этой гипотезы нет, поскольку фаза роста изучена слабо. Во-вторых, изучение различных режимов формирования сгустка в пространстве при нарушенных функциональных частях каскада свертывания является в свою очередь инструментом в исследовании. Действительно, система свертывания обладает пороговыми свойствами и автокатализом, и поэтому ее поведение в пространстве может иметь много общего с активными средами. В работах проф.

Атауллаханова Ф.И. и Гурия Г.Т. [4] была выдвинута гипотеза, согласно которой пространственное (но не гомогенное) формирование сгустка происходит автоволновым образом. Анализ литературы показывает, что автоволновая фаза роста может быть нарушена при дефиците именно факторов внутреннего пути свертывания. Определение влияния факторов внутреннего пути на пространственную фазу роста сгустка позволит понять не только природу кровоточивости у больных гемофилией, но и механизмы функционирования системы свертывания в целом.

Пространственно неоднородный процесс роста сгустка можно исследовать только в пространственно распределенной системе, в которой активация осуществляется локально, а сгусток растет в плазме, свободной от привнесенных активаторов. В гомогенной системе с полным перемешиванием получить ограниченные тромбы нельзя, т.к. в этом случае активатор не локализован, а распределен во всем объеме, поэтому происходит образование множественных сгустков, и свертывание охватывает изучаемый образец плазмы целиком. В настоящее время практически отсутствуют постановки экспериментов, позволяющие измерять рост фибринового сгустка in vitro. Поэтому в качестве объекта изучения роли пространства в динамике формирования сгустка была выбрана модель коагуляции, которая с одной стороны упрощена (сгусток растет в неперемешиваемом слое рекальцифицированной свободной от тромбоцитов плазмы крови человека, приведенной в контакт с поверхностью активатора (монослой фибробластов, искусственные тромбогенные поверхности)), но с другой стороны именно в такой постановке пространственный аспект свертывания проявляется наиболее сильно.

Цель работы: экспериментальное определение пространственной динамики роста сгустка в плазме крови, дефицитной по факторам внутреннего пути, при активации по внешнему и внутреннему путям свертывания. Исследование пространственной динамики свертывания в нормальной плазме.

Задачи исследования:

1) разработать методику, позволяющую изучать пространственное формирование тромба и распределение активных факторов свертывания;

2) исследовать динамические характеристики роста сгустка от различных активаторов внешнего и внутреннего путей свертывания;

3) определить влияние дефицита факторов внутреннего пути свертывания на фазы образования сгустка;

4) исследовать влияние препаратов, возмещающих дефицит факторов свертывания при гемофилии, на пространственный рост сгустка.

Научная новизна. Предложена новая экспериментальная система включающая в себя кювету, регистрирующую установку и комплекс программ обработки данных, которая позволяет исследовать пространственную динамику роста сгустка в плазме крови in vitro.

Измерена неизвестная ранее динамика образования фибриновых сгустков в тонком слое неперемешиваемой рекальцифицированной плазмы доноров и больных гемофилиями А, В при активации как внешним, так и внутренним путями свертывания. Установлено влияние дефицита факторов внутреннего пути свертывания (факторы VIII и IX) на фазы пространственного образования сгустка. Определен эффект препаратов, возмещающих дефицит факторов свертывания при гемофилии, на пространственный рост сгустка.

Показано, что, факторы внутреннего пути свертывания важны не для инициации, а для роста сгустка. Обнаружено, что у больных гемофилией пространственный рост сгустка происходит в два-три раза медленнее, чем в плазме здоровых доноров, и для восстановления динамики роста сгустка in vitro достаточно восполнения дефицита фактора свертывания до 5-10% от нормального уровня. Впервые найдено, что фибробласты могут инициировать лизис сгустка.

Научно-практическим значением работы является вклад в понимание механизмов формирования сгустка (тромба) в пространстве, а также механизма нарушения свертывания при гемофилиях. Результаты данной работы найдут практическое применение при разработке математических моделей свертывания крови, экспериментальном исследовании коагуляционных процессов в условиях, отражающих события, происходящие in vivo.

Разработанная система может послужить основой для новых методов диагностики, а также исследования влияния различных препаратов на системы гемостаза и фибринолиза in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту:

Разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать пространственную динамику коагуляционных процессов, активированных по внешнему и внутреннему путям свертывания.

Охарактеризован пространственный рост сгустка в нормальной и гемофильной плазме, инициированный рядом активирующих поверхностей.

Обнаружено, что при формировании сгустка в плазме больных гемофилией наиболее нарушена не инициация, а пространственная фаза свертывания.

Показано, что факторы внутреннего пути свертывания важны именно для пространственного формирования гемостатического тромба.

Исследовано влияние ряда препаратов, возмещающих дефицит факторов свертывания при гемофилии, и показано, что 5-10% от нормальной концентрации факторов VIII или IX достаточно для достижения нормальной динамики роста сгустка Глава 1. Обзор литературы 1.1. Современные представления о коагуляционном звене системы гемостаза 1.1.1. Коагуляционное звено системы гемостаза Гемостатический процесс начинается с повреждения эндотелия, а заканчивается образованием тромба, который служит механическим затвором, предотвращающим дальнейшую кровопотерю, и очагом для восстановления тканей [10,15,16,131].

В образовании тромба участвуют тромбоцитарное, коагуляционное и сосудистое звенья гемостаза. Коагуляционное (плазменное) звено системы гемостаза обеспечивает свертывание плазмы крови: образование защитного сгустка непосредственно в месте повреждения стенки сосуда. Свернувшаяся плазма, или сгусток, представляет собой нерастворимые полимеры фибрина, которые составляют основу гемостатического тромба.

Предшественник фибрина, фибриноген, присутствует в плазме в растворимой форме, и является конечным субстратом протеолитического каскада, составляющего систему свертывания (рис. 1А). В каскаде свертывания участвуют тринадцать белков - факторов свертывания крови (см. Табл. 1). Из них семь активируются до сериновых протеаз (факторы XII, XI, IX, X, II, VII и прекалликреин), три являются кофакторами этих реакций (факторы V, VIII и кининоген с высокой молекулярной массой, ВМК), один — кофактор/рецептор (тканевой фактор, ТФ), еще один — трансглутаминаза (фактор XIII). В каскаде свертывания продукт каждой ферментативной реакции является катализатором для следующей реакции [65,126]. На каждой стадии профермент (предшественник) превращается в соответствующий фермент (сериновую протеазу), который катализирует превращение следующего профермента в сериновую протеазу. Значительное усиление свертывания осуществляется через петли положительных обратных связей, охватывающих каскад (фактор IIaфакторы VIIa и XIa, фактор IIaкофакторы Va и VIIIa, фактор Хaфактор VIIa), и через образование фактор:кофакторных комплексов (фVIIa:ТФ, фIXa:фVIIIa, фXa:фVa), что увеличивает активность соответствующих ферментов в 105-107 раз. Эти особенности приводят к тому, что динамика свертывания обладает сложным, нелинейным поведением.

Данная работа посвящена изучению динамических особенностей процесса роста сгустка в пространстве, и поэтому в последующем изложении основное внимание будет уделено механизмам регуляции производства активных факторов свертывания, а не структурным характеристикам и метаболизму отдельных белков гемостаза.

1.1.2. Внутренний и внешний пути каскада свертывания крови Известно, что in vitro коагуляционный процесс инициируется по двум путям, внутреннему и внешнему [10,15,16,131]. Кровь, взятая из организма, свернется обязательно, и в этом случае инициация осуществляется по внутреннему пути каскада, контактом с любым искусственным материалом [27,63,199]. Первым по времени результатом этого соприкосновения является адсорбция ряда белков плазмы на поверхность материала [26,38,199]. В зависимости от свойств поверхности, порядок и скорость осаждения различных белков, а также их последовательное замещение в молекулярном поверхностном слое могут сильно варьировать, но, в конечном итоге, всегда на поверхности оказываются так называемые активируемые поверхностью белки (surface activating proteins, SAPs) [26,96,199].

Рис. 1. Прокоагулянтные реакции системы свертывания крови.

(А) Внутренний и внешний пути свертывания: TФ – тканевой фактор, Fg – фибриноген, Fn(s) – растворимый фибрин, Fn(i) – нерастворимый фибрин, СКА – система контактной активации. (Б) Система контактной активации свертывания: ПК - прекалликреин, К - калликреин, ВМК - кининоген с высокой молекулярной массой.

Серые стрелки показывают каталитическое действие ферментов и комплексов, относительная толщина стрелок условно показывает скорости реакций. Тонкие черные стрелки - протеолитические реакции активации факторов и кофакторов. Серыми овалами с надписью (Ca2+) помечены Ca2+-зависимые компоненты каскада:

комплексы фVIIa:ТФ (внешняя теназа), фIXa:фVIIIa (внутренняя теназа) и фXa:фVa (протромбиназа) и фактор XIa.

название (высокомолекулярный кининоген) тканевой фактор) Таблица составлена с использованием материалов [10,15,64,131].

Концентрации факторов даны приблизительно: в норме наблюдаются вариации (от -50/+100% для фVIII до ±20% для большинства других факторов). Кроме того, существует разброс в данных разных авторов, вызванный разными подходами к оценке концентраций белков свертывания.

В крови помимо фVII циркулируют следовые количества активированной формы фактора (0.1-0.01%) [205].

Современные данные показывают, что ТФ может находиться в крови: в составе лимфоцитов и, возможно, тромбоцитов; всего - не более 0.2 пМ [75].

Конформационные изменения, которые происходят вследствие сорбции, у активируемых поверхностью белков приводят к такому изменению их активности, что они становятся способны инициировать систему контактной активации [63]. Контактная активация участвует в запуске систем свертывания, фибринолиза и комплемента [27,63], и состоит (в случае свертывания) из активируемых поверхностью профермента фXII и кофактора кининогена с высокой молекулярной массой (ВМК), и профермента прекалликреина, которые объединены рядом положительных обратных связей (рис. 1Б). В результате работы системы контактной активации образуются большие концентрации фактора XIIa, который активирует фактор XI. Вслед за этим происходит последовательная активация факторов IX, X и протромбина. Поскольку для образования тромбина достаточно белков, которые изначально присутствуют в плазме, контактный механизм запуска коагуляции получил название внутреннего пути свертывания крови. Сравнительно рано было показано, что люди с дефицитами контактных белков фXII [93], ВМК [61] и ПК [81] не страдают кровотечениям, или имеют склонность к повышенному свертыванию [125]. Современные исследования подтверждают отсутствие каких либо признаков гипокоагуляции при дефиците факторов контактной активации [77,80,102,117]. Эти данные, и тот факт, что до сих пор не найдено физиологического активатора контактной фазы, который бы эффективно инициировал свертывание при повреждении сосуда, в последнее десятилетие привели исследователей гемостаза к мнению, что in vivo в образовании нормального гемостатического ответа внутренний путь не участвует [131,147,168,171].

Другой механизм образования сгустка запускается трансмембранным гликопротеином – тканевым фактором (ТФ) [58,147]. Показано, что ТФ отсутствует на мембране тех клеток, которые в норме соприкасаются с плазмой крови – на клетках крови и эндотелия [68,202]. На всех остальных клетках ТФ присутствует, поэтому, когда нарушается эндотелиальный барьер, и кровь вступает в контакт с поверхностью субэндотелия (т.е.

гладкомышечными клетками и фибробластами), ТФ оказывается экспрессированным в кровь [202], и только в месте повреждения сосуда. С этого момента запускаются реакции внешнего пути свертывания крови, начиная с образования комплекса фVIIa:ТФ [52,170]. Известно, что небольшая часть (~0.1-0.01%) молекул фактора VII циркулирует в крови уже в активированной форме, но сам по себе фVIIa обладает исчезающе малой коагуляционной ферментативной активностью [91,178]. После сборки на фосфолипидной мембране, ферменткоферментный комплекс фVIIa:ТФ (внешняя теназа, extrinsic Xase) становится способным быстро активировать фактор X и, с меньшей скоростью (~2-10 раз), фактор IX [97,169] (см.

рис. 1А). Фактор Ха, в свою очередь, активирует протромбин, и оба эти фактора (фХа и фIIa [165,51]) расщепляют неактивную молекулу фVII с образованием активного фермента фVIIa.

Таким образом, число инициирующих свертывание комплексов фVIIa:ТФ быстро растет в результате работы положительных обратных связей фХафVIIa и тромбинфVIIa. При этом, хотя фХа и активирует фVII в 570 раз быстрее, чем тромбин [51], из-за значительной разницы в концентрациях фХа и тромбина, в фазе инициации свертывания (in vitro) основную роль играет последняя реакция [52].

1.1.3. Петли положительной обратной связи и образование комплексов Дальнейшие реакции, необходимые для образования сгустка, являются одинаковыми для внутреннего и внешнего путей. Эти реакции включают усиление работы каскада свертывания через петли положительной обратной связи и образование крайне активных фактор-кофакторных комплексов. На последних ступенях каскада происходит образование фибрина и формирование полимерной сети, сгустка.

Известно, что петли обратной связи существенно меняют кинетику ферментативных каскадов [8,98,121]. Для системы свертывания известно, что тромбин, последний фермент каскада, является не только ферментом, превращающим фибриноген в фибрин, но и катализатором своего производства [40]. Молекулы тромбина, образованные на первых стадиях работы каскада свертывания, осуществляют три петли положительной обратной связи, активируя факторы V [148,162], VIII [162,173] и XI [72,145] (рис. 1А). Последняя реакция активации фактора XI довольно медленна [72,145,182], и многие исследователи предполагают, что на кинетике образования первичного сгустка, т.е. первых этапах роста тромба, она должна сказываться слабо [50,118,130,131,182]. Однако, экспериментального доказательства или опровержения этого утверждения пока не получено. Что касается первых реакций, то активированные тромбином факторы V и VIII сами по себе не обладают ферментативной активностью [101], но участвуют в образовании двух ферменткоферментных комплексов: протромбиназы фXa:фVa и внутренней теназы фIXa:фVIIIa [35,115,128,129]. Формирование этих комплексов является ключевым этапом процесса свертывания, т.к. протромбиназа и теназа в ~105-107 раз более эффективны по отношению к своим субстратам фII и фХ, чем факторы Ха и IXa соответственно [67,128,129,148].

Сборка и структура протромбиназы и теназы имеют ряд общих закономерностей [128,188]. В качестве неспецифичной подложки для комплексов системы свертывания могут выступать любые фосфолипидные слои, содержащие отрицательно заряженные фосфолипиды (большое значение также имеет относительный состав липидов) [128]. Как показали исследования ряда авторов, в первую очередь работы группы K.G. Mann’а [115,128,129,148,149], сборка протромбиназы начинается со связывания фХа или фVа с фосфолипидной мембраной. Затем на плоскости мембраны происходит образование комплекса фХа:фVа, что изменяет конформацию и ориентацию как фермента, так и субстрата протромбиназного комплекса [128]. Субстраты теназы и протромбиназы, фактор Х и протромбин, могут сначала связываться с фосфолипидами, и потом входить в комплекс со своим активатором, или из объема плазмы сразу вступать в тройные комплексы фХ:фIXa:фVIIIа и фII:фXa:фVа. В любом случае, каждый из трех компонентов субстрат:фермент:коферментного комплекса оказывается связан с мембраной. Хотя фосфолипидной подложке и происходит концентрирование фермента и субстрата, именно кофакторы фVа и фVIIIa значительно ускоряют конверсию протромбина в тромбин и фХ в фХа факторами Ха и IXa соответственно. После активации меняются константы связывания комплексов, и активированный продукт покидает подложку и уходит в объем плазмы [128].

Для связывания факторов свертывания и, следовательно, оптимального функционирования теназы и протромбиназы липидная мембрана должна содержать заметное количество отрицательно заряженного фосфолипида - фосфатидилсерина [128].

Фосфатидилсерин (ФС) присутствует в мембранах тромбоцитов, эритроцитов, лимфоцитов, а также эндотелиальных клеток [215] (5-30% от общего состава мембранных липидов). В нативном состоянии распределение липидов в клеточной мембране асимметрично, и на наружней поверхности клеток находятся небольшие количества ФС [215]. В результате повреждения, старения и ряда других патологических событий может происходить перестройка мембраны клеток, потеря асимметрии, и ФС в значительной мере выходит на поверхность. Следует отметить, что в настоящее время данные о необходимости активации экспрессии клеточного ФС для формирования фибринового сгустка противоречивы [55,56,161,175]. Во-первых, как уже было отмечено, ФС уже имеется на нативных клеточных мембранах [161,175,215]. Во-вторых, в результате ряда процессов (клеточного старения) клетки (эндотелиальные, тромбоциты, эритроциты, лимфоциты) теряют часть своей мембраны в виде везикул. Большая (70 %) часть этих везикул (фосфолипидных микрочастиц) в крови происходит из мембран тромбоцитов (~600 везикул/104 тромбоцитов по данным Nomura S. et al. [151] или ~250106/л по данным Berckmans R.J. et al. [43]), остальные из эритроцитов (~30106/л), гранулоцитов (~50106/л) и эндотелиальных клеток (~70106/л) [43]. Поскольку фосфолипидный состав везикул соответствует клеточному, но асимметрия нарушена, поверхность везикул богата фосфатидилсерином. В-третьих, в плазме постоянно присутствует заметное количество ФС (приблизительно половина содержащегося в мембранах клеток крови) в составе липопротеинов [175]. Показано, что перечисленных источников ФС достаточно для поддержания свертывания in vitro [43,55,56].

1.1.4. Образование фибриновой сети Конечной целью активации коагуляционного каскада является образование фибрина основы гемостатического тромба. Каскадно-комплексное устройство системы свертывания (каскад + сборка фактор:кофакторных комплексов) и положительные обратные связи приводят к взрывному, автокаталитическому производству последнего фермента каскада тромбина, который и осуществляет превращение фибриногена в фибрин, и тем самым осуществляет свертывание крови. Фибриноген является гликопротеином, присутствующим в плазме в концентрации ~9 мМ и в -гранулах тромбоцитов [44,142]. Фибриноген состоит из трех пар полипептидов, связанных между собой дисульфидными мостиками. Эти полипептиды обозначаются как А-, B- и -цепи. Показано, что образование фибрина в крови и в плазме начинается с первого момента появления тромбина [44,49]. Превращение фибриногена в фибрин протекает в три этапа [10,44,49,142]. На первом этапе тромбин воздействует на N-концевые участки цепей А и В фибриногена, вызывая протеолиз, который отделяет от аминного конца этих цепей две молекулы фибринопептида А и две молекулы фибринопептида В. Фибринопептиды А отщепляются тромбином от N-конца А-цепи при протеолизе связи Arg16-Gly17. Фибринопептиды В отщепляются тромбином от N-конца Bцепи при протеолизе связи Arg14-Gly15. В результате этой реакции фибриноген преобразуется в фибрин-мономер, в центре которого образуется реакционная поверхность с измененным электронным зарядом. Реакционная поверхность фибрин-мономера взаимодействует с комплементарными поверхностями на N-концах других молекул фибринмономера. Таким образом, происходит спонтанная агрегация фибрин мономеров - их полимеризация (второй этап). При этом, фибрин-мономеры оказываются соединены между собой посредством гидрофобных, ионных и водородных взаимодействий. Такой полимер фибрина считается растворимым, так как он легко растворяется в растворах мочевины, гуанидина и бромида натрия при кислом рН. Фибриновые волокна-жгуты в сечении состоят из трех-десяти молекул фибрина [201] и в пространстве образуют ветвящуюся сеть.

На третьем этапе под влиянием фактора XIIIa, активированного тромбином, растворимый фибрин-полимер (фибрин S) превращается в нерастворимый (фибрин I) [44,49].

Фактор XIII является эндо--карбоксиглютамил--амино-лизил-трансферазой, которая катализирует образование пептидной связи между глютамином и лизином через последовательные aцилирование и деацилирование. Эта реация высоко специфична и происходит только между отдельными лизиновыми и глютаминовыми остатками фибрина и стабилизации трансглутаминазой (фXIIIа), многократно повышается устойчивость сгустка к действию химических растворителей и системы фибринолиза. Также многократно увеличивается жесткость сгустка [76,144,179]. Однако, структура сгустка (размер волокон, ячеек сети) практически не зависит от присутствия или отсутствия фXIII [144,179].

Несмотря на то, что концентрация фибриногена в 10 раз выше всех остальных факторов свертывания (см. Табл. 1), потребляется он очень быстро. Тромбин in vitro даже в малых концентрациях превращает весь фибриноген в фибрин. Поэтому в ходе свертывания полное потребление (исчерпание) фибриногена наступает, вероятно, довольно рано.

Согласно данным многих авторов [39,59,167], видимое свертывание плазмы и крови (образование сгустка) происходит в момент, когда нарабатывается ~10% тромбина.

Волокна фибрина укрепляют и фиксируют в месте повреждения сосуда первичный тромбоцитарный тромб, препятствуя, таким образом, его размыванию кровотоком.

Нарушение кинетики роста сгустка приводит к геморрагиям и тромбоэмболиям, что подчеркивает важность фибринового тромба для гемостаза.

1.1.5. Естественные ингибиторы свертывания Процесс свертывания крови строго контролируется присутствующими в плазме и активируемыми в ходе свертывания белками-ингибиторами, которые ограничивают выраженность протеолитических реакций и обеспечивают защиту от нежелательного тромбообразования [10,16,131].

Главными ингибиторами факторов свертывания крови являются: серпины антитромбин III (AT III), гепариновый кофактор II (ГК II) и С1-ингибитор (С1-И); ингибитор типа Кюница - ингибитор пути тканевого фактора (ТФПИ); 2-макроглобулин (2-М) ингибитор-"мусорщик" [16] (активный центр сериновой протеазы не участвует в образовании комплекса с 2-М) и система протеина С: сериновая протеаза активированный протеин С (АПС) и кофактор протеин S (ПS). Большая часть перечисленных ингибиторов не требует активации. Исключение составляют АПС и ТФПИ, которые начинают оказывать тормозящее действие уже в ходе свертывания крови, после появления факторов IIa и Ха.

AT III, ГК II, 2-М и С1-И (рис. 2А) присутствуют в плазме в концентрациях, многократно превышающих концентрации предшественников всех факторов свертывания