«ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЙ ДИСБАЛАНС У ПАЦИЕНТОВ С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ, АССОЦИИРОВАННОЙ С НАРУШЕНИЯМИ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА ...»

Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Научно-исследовательский институт кардиологии»

Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

На правах рукописи

КОЛОГРИВОВА

Ирина Вячеславовна

ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЙ ДИСБАЛАНС У

ПАЦИЕНТОВ С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ,

АССОЦИИРОВАННОЙ С НАРУШЕНИЯМИ

УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА

14.03.03 – патологическая физиология 14.01.05 – кардиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Кошельская О.А.

кандидат медицинских наук Суслова Т.Е.

Томск – Оглавление Введение……………………………………………………………………………….. Глава 1. Обзор литературы………………………………………………………… 1.1. Сахарный диабет 2-го типа – «неинфекционная эпидемия»

современности…………………………………………………………………. …….. 1.2. Взаимосвязь артериальной гипертензии и сахарного диабета 2-го типа…….. 1.3. Проявление воспалительных реакций при сахарном диабете 2-го типа …….. 1.4. Роль Т-хелперов 17-го типа в модуляции воспаления………………………… 1.5. Т-регуляторные лимфоциты как антагонисты Th17……………………........... 1.6. Метаболизм глюкозы как модулятор активности Т-лимфоцитов… ………… Глава 2. Материалы и методы исследования …………………………………... 2.1. Характеристика обследованных групп … ………………………………........... 2.2. Материал и методы исследования … ………………………………………….. 2.2.1. Материал исследования ………………………………………………………. 2.2.2. Культивирование мононуклеаров крови в среде с различными концентрациями инсулина и глюкозы ……………………………………………... 2.2.3. Определение фенотипа лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии …………………………………………………………………... 2.2.3.1. Анализ основных субпопуляций лимфоцитов … …………………………. 2.2.3.2. Анализ содержания Th17- и Th1-лимфоцитов … …………………………. 2.2.3.3. Определение содержания Т-регуляторных лимфоцитов…………………. 2.2.4. Определение концентрации цитокинов методом мультиплексного анализа………………………………………………………………………………… 2.2.5. Иммуноферментный анализ ………………………………………………….. 2.2.5.1. Определение концентрации инсулина в сыворотке крови……………….. 2.2.5.2. Определение концентрации С-пептида инсулина в сыворотке крови …... 2.2.5.3. Определение концентрации С-реактивного белка высокочувствительным методом в сыворотке крови …………………………………………………………. 2.2.5.4. Определение концентрации ревматоидного фактора в сыворотке крови…………………………………………………………………………………... 2.2.5.5. Определение концентрации антител к митохондриям подтипа М2 в сыворотке крови …………………………………………………………………….. 2.2.5.6. Определение концентрации антител к экстрагируемым ядерным антигенам в сыворотке крови ……………………………………………………….. 2.2.5.7. Определение концентрации металлопротеиназ-2 и -9 в сыворотке крови…………………………………………………………………………………... 2.2.5.8. Определение концентрации тканевого ингибитора металлопротеиназ- (TIMP-1) в сыворотке крови … ……………………………………………………... 2.2.5.9. Определение концентрации IL-1 ………………………………………….. 2.2.5.10. Определение концентрации IL-17 ………………………………………… 2.2.5.11. Определение концентрации IL-23 ………………………………………… 2.2.5.12. Определение концентрации TGF- ……………………………………….. 2.2.6. Определение содержания антител к ткани сердца методом непрямой иммунофлуоресценции … …………………………………………………………... 2.2.7. Биохимические методы ………………..……………………………………… 2.2.7.1. Определение липидного спектра сыворотки крови ………………………. 2.2.7.2.Определение содержания глюкозы глюкозооксидазным методом……….. 2.2.8. Определение содержания гликозилированного гемоглобина иммунотурбодиметрическим методом … ………………………………………….. 2.3. Методы статистической обработки результатов исследования ……………… Глава 3. Результаты и обсуждение … ……………………………………………. 3.1. Оценка параметров углеводного и липидного обменов в исследуемых группах ………………………………………………………………………………... 3.2.Оценка популяционного состава лимфоцитов в крови………………………... 3.3. Оценка содержания Th1 и Th17 в крови ………………………………………. 3.4. Оценка содержания FoxP3+-регуляторных Т-лимфоцитов в крови …………. 3.5. Оценка секреции цитокинов … ………………………………………………… 3.5.1. Оценка содержания цитокинов в сыворотке крови…………………………. 3.5.2. Оценка содержания цитокинов в супернатантах суточных культур клеток крови … …………………………………………………………………………....... 3.6. Оценка содержания аутоантител различной специфичности в сыворотке крови … ……………………………………………………………………………... 3.7. Оценка состояния сывороточной системы матриксных металлопротеиназ при артериальной гипертензии, ассоциированной с нарушениями углеводного обмена … ……………………………………………………………………………. 3.8. Корреляционный и регрессионный анализ взаимосвязей между показателями параметрами…………………………………………………………………………. 3.9. Взаимосвязь иммунологических маркеров воспаления с клиникометаболическими особенностями течения артериальной гипертензии, ассоциированной с сахарным диабетом 2-го типа………………………………... 3.9.1. Особенности функционирования субпопуляций Т-лимфоцитов в зависимости от выраженности субклинического воспаления при артериальной гипертензии, ассоциированной с сахарным диабетом 2-го типа………………… 3.9.2. Особенности функционирования субпопуляций Т-лимфоцитов в зависимости от контроля гликемии при артериальной гипертензии, ассоциированной с сахарным диабетом 2-го типа …………………...………….. 3.9.3. Изменение функциональной активности Т-лимфоцитов в зависимости от степени инсулинорезистентности … ……………………………………………… 3.10. Влияние различных концентраций глюкозы и инсулина на функциональную активность Th17-лимфоциов in vitro … …………………………………………... Заключение … ……………………………………………………………………... Выводы… …………………………………………………………………………... Практические рекомендации……………………………………………………. Список сокращений … …………………………………………………………… Литература … ……………………………………………………………………… Актуальность темы исследования Ассоциация артериальной гипертензии (АГ) с сахарным диабетом (СД) 2-го типа многократно увеличивает риск развития микрососудистых осложнений, макроангиопатий и смертности у пациентов [149, 238]. Наличие СД 2-го типа у пациентов даже в отсутствии ишемической болезни сердца (ИБС) приравнивает их по степени риску развития коронарных событий к пациентам, перенесшим инфаркт миокарда [7, 19]. Распространенность СД 2-го типа неуклонно растет и, на сегодняшний день, приобрела характер неинфекционной эпидемии [7].

Стремительный рост числа больных СД во многом обусловлен тем, что пациенты на стадии латентных нарушений углеводного обмена зачастую не получают адекватного лечения, считаясь «условно здоровыми» [7].

Было показано, что субклиническое воспаление может вносить вклад в патогенез СД 2-го типа, но механизмы его развития остаются изученными недостаточно [122, 134, 268]. Считается, что макрофаги являются основными клетками-эффекторами при воспалительных нарушениях, ассоциированных с СД 2-го типа [165, 253, 290]. Оказалось, что наряду с макрофагами в жировой ткани пациентов с СД 2-го типа находится большое количество Т-лимфоцитов, которые могут выступать в роли важных регуляторов активности других клеток [89, 300].

Нарушение равновесия между субпопуляциями провоспалительных Тхелперов 17-го и 1-го типа (Th1 и Th17) и Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) является патогенетическим звеном многих заболеваний, таких как ревматоидный артрит, системный склероз, сахарный диабет 1-го типа и ряда других патологий, сопровождающихся развитием воспаления [68, 140, 223, 232, 257, 267]. Th17 и Тreg тесно взаимосвязаны: их активность зависит от общих ростовых факторов, они происходят из одного клеточного предшественника и обладают пластичностью по отношению друг к другу и другим субпопуляциям Т-хелперов [54, 197, 287].

Следствием нарушения равновесия между субпопуляциями Th17/Tregлимфоцитов является увеличение продукции провоспалительных цитокинов, предрасположенность к отмене иммунологической толерантности и усилению вышеперечисленные факторы могут иметь место у пациентов с сочетанием АГ и СД 2-го типа, способствовать поддержанию провоспалительного тканевого микроокружения и еще большему усугублению инсулинорезистентности. Кроме того, хроническое воспаление является фактором риска и неотъемлимым компонентом одного из наиболее распространенных и грозных осложнений СД 2го типа – атеросклероза [110, 153].

Степень разработанности темы исследования В экспериментальных исследованиях отмечена ассоциация ожирения и инсулинорезистентности с увеличением содержания провоспалительных Тh17 и Th1 и снижением количества иммуносупрессорных FoxP3+T-регуляторных лимфоцитов в жировой ткани и селезенке [98, 295]. Однако имеется лишь функционирования Th17 и Treg у пациентов с СД 2-го типа, в которых взаимосвязь между метаболическими и иммунологическими параметрами не изучалась [128, 308]. Также мы не встретили данных о состоянии хелперных субпопуляций Т-лимфоцитов при НТУ.

Дифференцировка и пролиферация Th17 в высокой степени зависят от клеточного метаболизма глюкозы [127, 224, 293]. Было показано, что как инсулин, так и глюкоза могут не только регулировать обменные процессы в Тлимфоцитах, но и влиять на их дифференцировку в направлении определенных субпопуляций [64, 77, 180, 251]. Однако в литературе нет данных о том, как влияет состояние гипергликемии и внеклеточная концентрация инсулина на функциональную активность Th17.

В связи с тем, что Тh17 и Т-регуляторные клетки за счет своей пластичности и разносторонней активности обладают мощным регуляторным потенциалом, и их дифференцировка зависит от инсулинового сигналинга и обмена глюкозы, можно предположить, что они представляют собой одно из связующих звеньев между метаболическими нарушениями и воспалительными явлениями при СД 2-го типа и атеросклерозе. Таким образом, установление патогенетической роли субпопуляций CD4+-лимфоцитов в развитии хронического субклинического воспаления у больных АГ, ассоциированной с СД 2 типа и НТУ, представляется актуальным.

Цель работы:

Выявить особенности иммунорегуляторного дисбаланса у пациентов с артериальной гипертензией, ассоциированной с предиабетом и сахарным диабетом 2-го типа.

Задачи исследования:

субпопуляций CD4+ Т-лимфоцитов в крови, сывороточную концентрацию и секрецию цитокинов в культуре клеток крови у пациентов с артериальной гипертензией без нарушений углеводного обмена и у пациентов с артериальной гипертензией, ассоциированной с нарушением толерантности к углеводам и сахарным диабетом 2-го типа.

показателями и параметрами углеводного и липидного метаболизма у пациентов с артериальной гипертензией при наличии и отсутствии нарушений углеводного обмена.

3. Изучить содержание Th17-, Th1- и Т-регуляторных лимфоцитов в крови, сывороточную концентрацию и секрецию цитокинов в культуре клеток крови в зависимости от особенностей клинического варианта заболевания и характера структурных изменений магистральных артерий у пациентов с артериальной гипертензией, ассоциированной с сахарным диабетом 2-го типа.

матриксных металлопротеиназ (матриксные металлопротеиназы-2 и -9, тканевый ингибитор металлопротеиназ-1) и спектра аутоантител (ревматоидный фактор, антитела к митохондриям, экстрагируемым ядерным антигенам, ткани сердца) у пациентов с артериальной гипертензией, ассоциированной с нарушением толерантности к углеводам и сахарным диабетом 2-го типа.

5. Исследовать влияние различных концентраций инсулина и глюкозы in vitro на секрецию IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-23, TGF-, TNF-, IFNмононуклеарами крови и внутриклеточную продукцию IL-17 Т-хелперами-17 у пациентов с сочетанием артериальной гипертензии и сахарного диабета 2-го типа.

Научная новизна Получены новые данные об особенностях иммунорегуляторного дисбаланса при хроническом субклиническом воспалении у пациентов с артериальной гипертензией без нарушений углеводного обмена и у пациентов с артериальной гипертензией, ассоциированной с нарушением толерантности к углеводам и сахарным диабетом 2-го типа.

Установлено, что повышение провоспалительного потенциала иммунных реакций имеет место уже на латентной стадии нарушений углеводного обмена и проявляется снижением содержания иммуносупрессорных FoxP3+ Трегуляторных лимфоцитов, увеличением содержания Th17-, Th1-, Th1/Th17-, ILR+-лимфоцитов в крови, IL-1 в супернатантах интактных культур клеток крови и повышением концентрации аутоантител к митохондриям подтипа М2 в крови. У пациентов с сочетанием артериальной гипертензии и сахарного диабета 2-го типа увеличение содержания Th17-, Th1-, IL-23R+-лимфоцитов в крови, возрастание концентрации IL-17 в сыворотке и супернатантах интактных культур клеток крови при сниженной секреции противовоспалительного IL-10 и дефиците FoxP3+ T-регуляторных лимфоцитов сочетается с повышением частоты выявления антител к ткани сердца и содержания тканевого ингибитора металлопротеиназ-1 (TIMP-1) в сыворотке крови.

Показано, что снижение содержания FoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов, увеличение количества IFN-+ Th1-лимфоцитов в крови и концентрации IL-17 в супернатантах интактных культур клеток крови связаны с неудовлетворительным контролем гликемии, высокой степенью абдоминального ожирения и инсулинорезистентности у пациентов с сочетанием артериальной гипертензии и неудовлетворительном контроле гликемии снижение содержания Т-регуляторных лимфоцитов и IL-10 в супернатантах интактных культур клеток крови ассоциируется с увеличением концентрации ММР-9 в крови и наличием признаков субклинического атеросклероза сонных артерий.

Приведены новые данные о влиянии различных концентраций инсулина и глюкозы на функциональную активность Th17 in vitro у пациентов с артериальной гипертензией, ассоциированной с сахарным диабетом 2-го типа. Культивирование мононуклеаров в присутствии глюкозы и инсулина приводит к увеличению содержания IL-17+ Th17-лимфоцитов in vitro как у пациентов с сочетанием артериальной гипертензии и сахарного диабета 2-го типа, так и у здоровых людей.

При этом показано, что у пациентов с сочетанием артериальной гипертензии и сахарного диабета 2-го типа, в отличие от здоровых лиц, отсутствует ингибирующее влияние инсулина на секрецию IL-23, IL-6, TGFмононуклеарами крови in vitro.

Теоретическая и практическая значимость работы в ходе исследования данные носят фундаментальный и прикладной характер, и свидетельствуют о системной дисрегуляции функционирования субпопуляций Т-лимфоцитов-хелперов у пациентов с артериальной гипертензией, ассоциированной с нарушениями углеводного обмена. Выявленные изменения проявляются увеличением функциональной активности Т-хелперов с провоспалительным потенциалом (Th17- и Th1-лимфоциты) и снижением содержания Т-регуляторных лимфоцитов, выполняющих иммуносупрессорную функцию.

Результаты данного исследования могут быть использованы для разработки лабораторных алгоритмов выявления иммунологически опосредованного хронического субклинического воспаления при артериальной гипертензии, ассоциированной с нарушениями углеводного обмена. Проведенное исследование указывает на возможность коррекции иммунорегуляторного дисбаланса у пациентов с артериальной гипертензией, ассоциированной с сахарным диабетом 2-го типа с помощью терапии, направленной на повышение периферической чувствительности к инсулину и изменение активности ренин-ангиотензинальдостероновой системы (РААС).

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр иммунологии и аллергологии (раздел «Регуляция иммунного ответа»), молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики (раздел «Молекулярные основы патологии») ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.

Методология и методы исследования Для достижения поставленной цели на базе ФГБУ «НИИ кардиологии» СО РАМН (директор – д-р мед. наук, академик РАН Р.С.Карпов) было проведено одномоментное, проспективное, сравнительное исследование. Были сформированы 4 группы: пациенты с АГ, ассоциированной с НТУ или СД 2-го типа, пациенты с АГ без нарушений углеводного обмена и здоровые добровольцы. Всем пациентам проводили комплексное клиникоинструментальное обследование и ультразвуковое исследование сонных артерий.

Материалом исследования являлись мононуклеары периферической крови, супернатанты клеточных культур, сыворотка крови и цельная кровь с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА).

Основные методы исследования:

1. Выделение и культивирование мононуклеаров периферической крови;

2. Определение содержания основных субпопуляций лимфоцитов и субпопуляций CD4+ Т-лимфоцитов методом проточной цитометрии;

3. Определение концентрации цитокинов методом мультиплексного анализа;

4. Определение содержания антител к ткани сердца методом непрямой иммунофлуоресценции;

5. Иммуноферментный анализ;

6. Биохимические методы;

7. Статистический анализ результатов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Хроническое субклиническое воспаление у пациентов с артериальной гипертензией и нарушениями углеводного обмена формируется на фоне иммунорегуляторного дисбаланса, который проявляется в активации T-хелперовувеличение внутриклеточной продукции IFN-), T-хелперов-17 (увеличение внутриклеточной продукции и секреции IL-17), повышении экспрессии рецепторов к провоспалительному IL-23 и снижении количества циркулирующих в крови FoxP3+ T-регуляторных лимфоцитов.

2. Функциональная активность субпопуляций CD4+ Т-лимфоцитов и нарушения в системе цитокинов (IL-17, IFN-, IL-10) у пациентов с сочетанием артериальной гипертензии и сахарного диабета 2-го типа взаимосвязаны с клиническими особенностями заболевания: гипертриглицеролемией, степенью контроля гликемии, абдоминального ожирения и гиперинсулинемии/ инсулинорезистентности.

внутриклеточную продукцию IL-17 как у здоровых добровольцев, так и у пациентов с сочетанием артериальной гипертензии и сахарного диабета 2-го типа.

У пациентов с артериальной гипертензией, ассоциированной с сахарным диабетом 2-го типа, в отличие от здоровых добровольцев, отсутствует ингибирующий эффект инсулина в отношении секреции IL-23, IL-6 и трансформирующего фактора роста (TGF)-, регулирующих активность Th17.

Степень достоверности и апробация результатов Высокая степень достоверности результатов, представленных в работе, обоснована достаточным объемом выборок, применением современных методов исследования, высокотехнологического оборудования и подтверждена адекватными методами статистической обработки.

Результаты исследования доложены и обсуждены на XI (2010), XII (2011), XIII (2012), XIV (2014) ежегодном семинаре Молодых ученых «Актуальные Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010), Пятой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов»

(Новосибирск, 2011), 4-ом Международном конгрессе по предиабету и метаболическому синдрому «Epidemiology, management and prevention of diabetes and cardiovascular disease» (Мадрид, 2011), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Абакан, 2011), XIV Всероссийском форуме с международным участием им. академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), Отчетной научной сессии НИИ кардиологии СО РАМН «Актуальные проблемы кардиологии» (Томск, 2012), Международной виртуальной конференции «Медицина в ХХI веке: традиции и перспективы» (2012), 1-ой Международной академической конференции «Applied and Fundamental studies» (Сент-Луис, 2012), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Сахарный диабет, метаболический синдром и сердечно-сосудистые заболевания:

современные подходы к диагностике и лечению» (Томск, 2012), Международной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 15-летию СПбГМУ им.

акад. И.П. Павлова «Дни биохимии в СПбГМУ» (Санкт-Петербург, 2012), Российском национальном конгрессе кардиологов (Санкт-Петербург, 2013).

По материалам диссертации опубликовано 28 печатных работ, из них – 7 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 209 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы.

Работа иллюстрирована 26 таблицами и 40 рисунками. Список литературы включает источников (28 – отечественных и 286 – иностранных).

1.1. Сахарный диабет 2-го типа – «неинфекционная эпидемия»

Распространенность сахарного диабета (СД) с каждым годом неуклонно растет. Численность больных СД в мире в 2011 году составила 366 млн человек.

По прогнозам Всемирной диабетической федерации к 2030 году эта цифра увеличится в 1,5 раза и составит 522 млн, главным образом, за счет пациентов с СД 2-го типа [7, 20]. Организация Объединенных Наций (ООН) и Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) приводят следующие статистические данные, касающиеся заболеваемости и смертности от сахарного диабета: каждые 7 секунд в мире умирает 1 больной, каждые 10 секунд заболевают 12 человек;

ежегодно умирает около 4,6 млн больных. Такой стремительный рост числа больных СД во многом обусловлен тем, что пациенты на стадии предиабета (нарушения толерантности к углеводам, НТУ) зачастую не получают адекватного лечения, считаясь «условно здоровыми», хотя уже сегодня более 500 млн человек в мире характеризуются наличием метаболического синдрома или НТУ. За счет них ежегодно число заболевших СД 2-го типа увеличивается на 15% [7].

В России в 2011 году насчитывалось 3 млн 112 тыс. пациентов с СД 2-го типа. Однако полагают, что реальная цифра еще более внушительна и превышает данное число в 3 – 4 раза (5,5% всего населения Российской Федерации) [7, 20].

На Первой глобальной министерской конференции по здоровому образу жизни и неинфекционным заболеваниям, которая прошла в 2011 г. в Москве и была поддержана Министерством здравоохранения и социального развития России и ВОЗ, сахарный диабет был признан одним из четырех важнейших неинфекционных заболеваний (наряду с сердечно-сосудистыми, онкологическими и заболеваниями легких), требующих принятия немедленных действий по его профилактике [7].

Сахарный диабет 2-го типа обычно проявляется уже во взрослом возрасте и характеризуется инсулинорезистентностью с относительным дефицитом инсулина или преимущественно нарушением секреции инсулина с развитием инсулинорезистентности [35]. На фоне инсулинорезистентности увеличивается масса и инсулин-продуцирующая активность -клеток поджелудочной железы.

инсулинорезистентности, толерантность к глюкозе у индивидов сохраняется на нормальном уровне. Когда функциональные резервы поджелудочной железы становятся недостаточными, чтобы компенсировать все более усугубляющуюся инсулинорезистентность и развивающуюся гипергликемию, манифестируется СД 2-го типа [82, 89].

При НТУ концентрация глюкозы через 2 часа после глюкозотолерантного теста превышает границы референсного интервала, но ниже, чем у пациентов с диабетом (т.е. колеблется от 7,8 до 11,0 ммоль/л). При этом содержание глюкозы натощак может оставаться нормальным (в отличии от нарушенной тощаковой гликемии) [36]. Время, в течение которого ранние метаболические нарушения (в частности, нарушение толерантности к углеводам) трансформируются в диабет, может составлять годы. Тем не менее, у большинства пациентов с НТУ (до 70%) рано или поздно развивается сахарный диабет 2-го типа [191, 218].

СД 2-го типа многократно увеличивает риск развития макроангиопатий (атеросклероз) и микрососудистых осложнений (ретинопатии, нейропатии, нефропатии), причем частота сердечно-сосудистых осложнений кратно возрастает, если СД 2-го типа сочетается с артериальной гипертензией (АГ) [89, 219, 249].

1.2. Взаимосвязь артериальной гипертензии и сахарного диабета СД 2-го типа ассоциируется с АГ в 50-80% случаев. При увеличении артериального давления на каждые 10 мм рт.ст. риск развития сердечнососудистых событий у пациентов с СД 2-го типа увеличивается на 20% [249]. При этом встречаемость АГ у диабетических пациентов примерно в 2 раза выше, чем у пациентов без диабета. В то время как у нелеченных пациентов с эссенциальной гипертензией содержание инсулина натощак и после приема пищи выше, чем у пациентов с нормальным артериальным давлением, независимо от индекса массы тела (ИМТ) [238].

Существует ряд гипотез, объясняющих распространение сочетания АГ и СД 2-го типа, таких как генетическая предрасположенность и нарушение инсулинового сигналинга. Последнее приводит к изменению ионообменных процессов в клеточных мембранах, активации симпатической нервной системы и ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), а также к подавлению активности предсердного натрийуретического пептида, задержке натрия в организме и последующему увеличению объема жидкости, прогрессирующей почечной патологии, гипертрофии левого желудочка, дислипидемии, хронической гипергликемии и оксидативному стрессу [149, 238]. Кроме того, ожирение является фактором риска развития как СД 2-го типа, так и АГ. При этом от ожирения страдает до 90% пациентов с СД 2-го типа [173].

Гипергликемия при СД способствует повреждению почек и артериальной стенки посредством депонирования конечных продуктов гликозилирования, генерации активных форм кислорода и активации протеин киназы С [149].

Роль гиперинсулинемии в патогенезе АГ по-прежнему обсуждается. Так, у пациентов с инсулиномой не наблюдается увеличения частоты выявления повышенного давления. Однако при инсулинорезистентности наблюдается ингибировнаие ряда сигнальных путей инсулина, что вносит вклад в развитие вазоконстрикции. Инсулинорезистентность зачастую присутствует у пациентов с нарушением содержания глюкозы натощак и является фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний даже при отсутствии выраженной гипергликемии [238].

В результате гиперинсулинемии повышается тонус симпатической нервной системы и активность РААС, что может приводить к реабсорбции натрия, увеличению объема циркулирующей крови, что, в свою очередь, еще более усиливает активацию РААС. При этом сниженная эластичность артерий способствует развитию АГ посредством увеличения сосудистого сопротивления [149].

Таким образом, инсулинорезистентность является отличительной чертой АГ, ассоциированной с СД 2-го типа. Однако только у трети пациентов с инсулинорезистентностью действительно манифестируется сахарный диабет. У большинства -клетки оказываются способными компенсировать все более возрастающую потребность в инсулине и гипергликемия не развивается [89].

Причины такой гетерогенности в популяции до конца не ясны.

субклинического воспаления, и воспаление может быть вовлечено в патогенез инсулинорезистентности [122, 134, 268].

1.3. Проявление воспалительных реакций при сахарном диабете 2-го Воспаление развивается как комплексная реакция на повреждение ткани, обусловленное каким-либо патогенным агентом. Острое воспаление, как правило, высоко координировано и имеет своей целью устранение патогенного агента и восстановление целостности поврежденной ткани. При хроническом воспалении устранить повреждение не удается в течение продолжительного времени, и реакции, в норме призванные контролировать гомеостаз, приобретают патологический характер и только усугубляют нарушение функционирования метаболическими нарушениями, рядом авторов обозначается как «метавоспаление» [122].

Впервые о роли воспаления в развитии «более легкой формы» СД (предположительно имеется в виду именно СД 2-го типа) заговорили еще в году, когда было показано, что назначение салицилатов значительно снижает уровень глюкозурии у пациентов [253].

Результаты многочисленных эпидемиологических исследований показали, что для пациентов с СД 2-го типа характерно увеличение содержания белков острой фазы, хемокинов и цитокинов в сыворотке крови. В 1993 году внимание исследователей привлек фактор некроза опухоли (TNF)-, как провоспалительный цитокин, который был способен вызывать инсулинорезистентность [253], однако попытки использования антагонистов TNF- для лечения СД 2-го типа пока не привели к ощутимому контролю за уровнем гликемии [89]. Особая роль в диагностике мета-воспаления на сегодняшний день отводится С-реактивному белку, определенному высокочувствительным методом (hsCRP), а также провоспалительные маркеры могут служить предикторами развития СД 2-го типа [89]. В проспективном популяционном исследовании EPIC-Потсдам (European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition) было показано, что у пациентов с повышенным уровнем IL-6 и определяемым количеством IL-1 в сыворотке в течение последующих двух лет развивался СД 2-го типа. Эта закономерность отсутствовала, если изначально у пациентов был повышен только уровень IL- [258].

Как правило, для пациентов с СД 2-го типа характерно абдоминальное васкуляризированная, рассматривается как один из главных источников провоспалительных агентов. Основное внимание при исследовании воспаления, ассоциированного с СД 2-го типа, до недавнего времени уделялось самим адипоцитам и макрофагам жировой ткани [165]. Известно, что адипоциты способны продуцировать моноцитарный хемоаттрактант, monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), таким образом привлекая моноциты [253]. У мышей, инсулинорезистентности, индуцированной высококалорийной диетой, и доля макрофагов в жировой ткани [Weisberg, S. P., 2006]. Однако тот факт, что инфильтрация макрофагами и признаки воспаления в жировой ткани все-таки сохраняются, свидетельствует в пользу того, что имеются и другие стимулы, помимо МСР-1, которые способствуют созданию провоспалительного окружения при СД 2-го типа.

Одной из отличительных черт СД 2-го типа является проградиентное снижение функциональной активности инсулинопродуцирующих -клеток островков Лангерганса поджелудочной железы и нарушение первой фазы секреции инсулина [261]. В данном процессе также показана роль воспаления и инфильтрация островков Лангерганса макрофагами [92]. Снижение функции клеток ассоциируется с отложением амилоида в ткани железы, характерным компонентом которого является островковый амилоидный полипептид (islet amyloid polypepetide, IAPP) или амилин. Причем его количество в поджелудочной железе коррелирует с тяжестью заболевания. Показано, что при фагоцитозе IAPP макрофагами активируется процессинг и секреция IL-1 [175]. Вероятно, изначально целью индукции воспалительного ответа в ткани поджелудочной железы подобным образом является стремление организма восстановить функцию -клеток. Однако в дальнейшем, по мере перехода острого воспаления в хроническое, вместо регенерации наблюдаются выраженные процессы повреждения и потери функции органа [88]. За счет того, что экспрессия антагониста рецептора IL-1 (IL-1RA) в поджелудочной железе при СД 2-го типа снижена, и -клетки островков Лангерганса несут большое количество рецепторов 1-го типа к IL-1 (IL-1R1), воспаление, индуцированное IL-1, еще более усиливается и нарушается секреторная функция железы [89]. В течение трех месяцев после однократной инъекции моноклональных антител к IL-1 у пациентов с СД 2-го типа наблюдалось снижение уровня гликозилированного гемоглобина и улучшение секреторной функции -клеток. Похожий эффект вызывало и введение IL-1RA [89]. За счет того, что в условиях гипергликемии увеличивается экспрессия рецептора Fas, которой также способствует повышенное содержание IL-1, развивается апоптоз -клеток [88, 89].

Признаки воспаления при сахарном диабете обнаруживаются и в печени. До 5% клеток печени составляют клетки Купфера. В процессе развития метаболических нарушений их функциональная активность возрастает [253].

Хроническое системное воспаление, характерное для состояния инсулинорезистентности, наряду с АГ, дислипидемией и протромботическим состоянием, многократно увеличивает риск развития атеросклероза у пациентов с СД 2-го типа [284]. В ходе атерогенеза моноциты рекрутируются во внутреннюю оболочку сосуда (интиму, в норме состоящую из эндотелиальных клеток), в которой происходит их дифференцировка в макрофаги и фагоцитоз модифицированных липопротеинов с формированием «пенистых» клеток.

Помимо макрофагов в формировании атеросклеротической бляшки принимают участие и другие клетки иммунной системы: нейтрофилы, тучные клетки и Тлимфоциты. В процессе развития атеросклеротического поражения стенки сосуда в результате миграции иммуноцитов, а также пролиферации гладкомышечных клеток и миграции их из медии в интиму сосуда, происходит набухание интимы и увеличение толщины комплекса «интима-медиа», которое можно зафикисровать при ультразвуковом исследовании сонных артерий уже в доклиническом периоде течения атеросклероза [172, 211, 297].

Нет точных данных о том, является ли воспаление при СД 2-го типа неспецифическим или антигензависимым. В качестве кандидатов на роль антигенов выступают вещества, которые образуются при стресс-реакции или повреждении клеток, например, белок теплового шока 60 или окисленные липопротеины, которые способствуют развитию воспаления в жировой ткани и сосудистой стенке [134].

Имеются свидетельства в пользу того, что воспаление предшествует развитию СД 2-го типа, а не является его следствием, то есть может служить одним из этиопатогенетических факторов развития СД 2-го типа. Признаки субклинического воспаления наблюдаются не только при выраженном СД 2-го типа, но и у пациентов с нарушением толерантности к углеводам. Кроме того, результаты проспективных исследований показали развитие воспалительных изменений, таких как лейкоцитоз и увеличение провоспалительных медиаторов в сыворотке крови, за много лет до постановки пациентам диагноза СД 2-го типа [134].

Возможным механизмом, за счет которого цитокины, в частности TNF-, могут вызывать инсулинорезистентность, является активация c-Jun NH2терминальной киназы. Это приводит к фосфорилированию субстратов инсулинового рецептора (IRS)-1 и IRS-2, и, следовательно, к ингибированию сигналинга инсулина. Также происходит стимуляция белков, которые связывают IRS-1 и IRS-2 и вызывают их деградацию, так называемых белков-супрессоров сигналинга цитокинов (SOCS). Провоспалительные цитокины, такие как TNF-, IL-1 и IL-6, также снижают экспрессию PPAR- (пролифератор-активируемые рецепторы пероксисом) [216].

Однако нарушения метаболизма при СД 2-го типа также способствуют развитию воспалительного ответа. Так, при интенсивном увеличении массы жировой ткани развивается гипоксия, сопровождающаяся клеточной гибелью и привлечением макрофагов; при развитии метаболического стресса происходит активация провоспалительных сигнальных путей IB киназы- (IKK-) и JUN Nтерминальной киназы (JNK); свободные жирные кислоты и высокие концентрации глюкозы стимулируют продукцию провоспалительных цитокинов (IL-6 и IL-1) и хемокинов [89]. Таким образом, образуется порочный круг, в котором метаболические и воспалительные изменения могут индуцировать и потенцировать развитие друг друга, и особенно важным становится более полное понимание патогенеза СД 2-го типа.

Важную регуляторную функцию в процессе развития воспаления играет иммунная система, в частности, лимфоциты. Именно они привлекают к очагу воспаления лейкоциты общевоспалительного назначения – нейтрофилы, моноциты, базофилы, тучные клетки и способствуют активации или синтезу гуморальных факторов воспаления [23].

После обнаружения в жировой ткани Т-лимфоцитов, вполне вероятной становится концепция, согласно которой макрофаги и адипоциты выступают в роли эффекторных клеток, а регулирующую функцию при развитии воспаления выполняют именно Т-клетки [89, 300] (Рисунок 1). Лимфоциты составляют примерно 10% от всей клеточной массы абдоминальной жировой ткани у мышей C57BL/6 [98]. Причем различные Т-клеточные субпопуляции играют различную роль. Так, Т-хелперы 1-го типа (Th1) и CD8+ Т-лимфоциты являются провоспалительными, а forkhead box P3 (FoxP3+) Т-регуляторные лимфоциты препятствуют развитию воспаления [98, 125].

Рисунок 1. Схема развития воспаления при сахарном диабете 2-го типа (представлен перевод схемы, составленной M.Y. Donath и S.E. Shoelson, (2011)).

При избыточном поступлении глюкозы и свободных жирных кислот в тканях, чувствительных к инсулину, происходит наработка и секреция цитокинов и хемокинов, наряду со снижением продукции антагониста рецептора IL-1. В результате клетки иммунной системы привлекаются в ткани и вносят вклад в развитие воспаления. Высвобождение цитокинов и хемокинов из жировой ткани в циркуляцию вызывает воспаление в других тканях.

В последнее время пересматривается парадигма, предложенная T.R.

дифференцируются в два подкласса с реципрокными функциями и различным набором секретируемых цитокинов – Т-хелперы 1-го типа (Th1) и Т-хелперы 2-го типа (Th2) [115, 187, 207]. Появляются сведения о новых субпопуляциях Тлимфоцитов-хелперов [204]. К ним, в частности, относятся Т-лимфоциты 17-го типа (Th17), являющиеся перспективными для изучения патогенетических аспектов СД 2-го типа, так как они могут вносить весомый вклад в развитие воспаления.

1.4. Роль Т-хелперов 17-го типа в модуляции воспаления Th17 были впервые выделены в отдельную субпопуляцию в 2005 году [115, 207]. В норме Th17 защищают организм хозяина от внеклеточных и опубликованными данными – и от вирусных инфекций [14, 26, 287]. Основным местом их локализации являются барьерные ткани, в особенности – lamina propria слизистой кишечника [287]. Но было показано, что патологические эффекты Th проявляются при целом ряде заболеваний, затрагивающих различные органы и ткани. В частности, чрезмерная активация Th17 наблюдается при ревматоидном артрите, псориазе, системном склерозе, воспалительной болезни кишечника, репродуктивной дисфункции [4, 16, 267]. Активно изучается роль Th17 в развитии воспалительных респираторных и сердечно-сосудистых заболеваний [68, 140, 223, 257]. IL-17 вовлечен в патогенез атеросклероза, артериальной гипертензии, вирусного миокардита и дилатационной кардиомиопатии, а также вносит вклад в повреждение тканей при ишемии/реперфузии мозга, почек и кишечника [152].

При СД 1-го типа нарушение баланса между Т-регуляторными лимфоцитами и Th17 приводит к развитию субклинического воспаления и прогрессированию микрососудистых осложнений [232].

Исследования, касающиеся участия Th17 в развитии воспаления у пациентов с СД 2-го типа, немногочисленны [128, 308]. Несмотря на то, что эти дифференцировки Т-лимфоцитов в сторону данной провоспалительной субпопуляции при нарушениях углеводного обмена остаются плохо изученными.

В целом, молекулярные основы функционирования Th17 активно изучаются с момента их открытия вот уже почти 10 лет. Были прояснены многие аспекты, касающиеся особенностей их дифференцировки, эффекторных свойств и роли в иммунном ответе.

Tранскрипционными факторами Th17 у мышей являются RORt (retinoid orphan nuclear receptor), ROR и STAT3 [305, 306]. У человека аналогом RORt дифференцировку и активность Th17, относятся TGF- (в том случае, если его действие дополняется IL-6), IL-23 и IL-21 [32, 115, 136, 196, 207, 278]. Причем ILпродуцируется самими Th17 и осуществляет аутокринную регуляцию их функциональной активности по принципу положительной обратной связи [136, 196, 204]. Кроме того, было показано, что у человека важную роль в дифференцировке Th17 играет IL-1. Он может усиливать стимулирующее действие IL-6 и IL-23 [30].

К поверхностным маркерам Th17 относят рецептор к IL-23 (IL-23R), рецепторы к хемокинам CXCR4 и CXCR6 [38]. Также для Th17 характерна высокая экспрессия CCR4, CCR5 и CCR6 [38]. Кроме того, все Th17-лимфоциты у людей являются CD161-позитивными [40]. CD161 имеет два лиганда. Один из них, лигандоподобный транскрипт-1, белок, относящийся к лектинам, вероятно, служит для трансэндотелиальной миграции Th17 в ткани. Второй, индуцируемый пролиферацией лимфоцит-ассоциированный рецептор (PILAR), увеличивает экспрессию антиапоптотического белка Bcl-xL [40]. Вероятно, именно сигналинг через Bcl-xL, а также Bcl-2 (факторы, высоко экспрессированые в Th17) обуславливает резистентность к апоптозу и большую продолжительность жизни данной субпопуляции лимфоцитов, которые можно сопоставить даже со стволовыми клетками [138, 288].

Основными цитокинами, которые продуцируют Th17, являются IL-17A и IL-17F. IL-17 был известен задолго до открытия Th17. Человеческий IL-17А был впервые клонирован в 1995 году и первоначально носил название CTLA-8 [31]. В ранних работах показаны его многочисленные воспалительные и гемопоэтические эффекты на эпителиальные, эндотелиальные клетки и фибробласты [262].

IL-17F является наиболее близким гомологом IL-17A [139]. IL-17A и IL-17F оба являются гомодимерными цитокинами, но, согласно последним данным, человеческие и мышиные Т-клетки также продуцируют IL-17A/F – гетеродимер [151, 298]. В настоящее время о воспалительных эффектах IL-17F известно меньше, чем об IL-17A, но, в основном, они являются цитокинами-синергистами.

IL-17A индуцирует синтез IL-1, TNF-, IL-6, IL-8, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагального CSF (GM-CSF) и других провоспалительных факторов, а также вызывает увеличение синтеза мРНК циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) [121, 241]. Показано, что IL-17A увеличивает экспрессию таких костимуляторных молекул, как ICAM- (inter-cellular adhesion molecule 1), с помощью других цитокинов усиливая Тклеточную активацию [31]. В ряде клеток, в частности, в -клетках поджелудочной железы, эндотелиальных клетках и клетках костного мозга, IL- стимулирует активность индуцибельной NO-синтазы (iNOS) и приводит к высвобождению NO [181] (Рисунок 2).

Установлено, что IL-17F совместно с IL-17A индуцирует синтез хемокинов моноцитарного хемотаксического протеина-1 (MCP-1) и макрофагального воспалительного протеина-2 (MIP-2) мезангиальными клетками [162] (Рисунок 2).

Th17 способны участвовать в метаболизме соединительной ткани. IL-17F вызывает CD40-опосредованное увеличение экспрессии мРНК коллагена-1, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и ангиогенина [117]. Показано, что ILвлияет на продукцию металлопротеиназ и их ингибиторов [207] (Рисунок 2).

Мыши, дефицитные по IL-17A, характеризовались сниженной экспрессией металлорпотеиназ-2 и -9 и снижением их активности [44].

Сведения о том, какое влияние Th17 оказывают на гуморальный иммунный ответ, являются противоречивыми. Было показано, что добавление IL-17 in vitro не оказывало влияния на продукцию антител мышиными В-лимфоцитами [252]. В то же время у мышей Th17 были обнаружены в В-клеточных фолликулах лимфоузлов и характеризовались высокой экспрессией индуцибельного Тклеточного костимулятора (ICOS) – костимуляторной молекулы, важной для Вклеточного ответа [208]. Человеческие Th17 индуцировали продукцию IgG, IgM и IgA В-лимфоцитами, но не влияли на продукцию IgE [227] (Рисунок 2).

Рисунок 2. Роль Th17 в реализации воспаления (Схема составлена по данным H. Park, 2005; D. Miljkovic, 2005; B.Afzali, 2007; S. Romagnani, 2008; S.M.

Schulz, 2008; T. Hirata, 2008; M. Iyoda, 2010) Кроме популяции CD4+-клеток IL-17 также продуцируется -Т-клетками, CD8+-Т-клетками, натуральными киллерами (NK-клетками) и NKT-клетками. В определенных условиях IL-17 может также вырабатываться тучными клетками, альвеолярными макрофагами и нейтрофилами [197].

Мышиные и человеческие Th17 секретируют и другие провоспалительные цитокины: TNF-, IL-6, IL-22 и IL-26 [30, 67, 71, 294]. IL-22 и IL- поддерживают тканевые реакции врожденного иммунитета. Хотя Th17 клетки обладают способностью продуцировать IL-22 совместно с IL-17, обычно коэкспрессии этих цитокинов не наблюдается [275].

экспрессируют IL-10 наряду с IL-17. IL-10 является противовоспалительным цитокином, который помогает контролировать Th1- и Th2-зависимые процессы [177]. Продолжительное воздействие TGF- и IL-6 приводит к увеличению синтеза IL-10, но при рестимуляции посредством IL-23 эти клетки приобретают патологическую активность, и продукция IL-10 прекращается. Эти IL-17+IL-10+ клетки, скорее всего, не являются отдельной клеточной линией, а продукция IL- служит механизмом саморегуляции и необходима для ограничения потенциально опасного для собственного организма Th17-иммунного ответа [269].

Главной функцией Th17 является индукция синтеза различных цитокинов и хемокинов и, посредством этого, привлечение других клеток в очаг воспаления [227]. Считается, что IL-17 является ключевым цитокином для активации и миграции нейтрофилов [227]. В то же время, было показано, что у трансгенных мышей, отличающихся повышенной экспрессией IL-17, макрофаги существенно доминировали над нейтрофилами в воспалительных инфильтратах в легких, что подтвердило важную роль IL-17 в развитии аутоиммунных заболеваний, так как макрофаги являются главными воспалительными клетками при аллергическом энцефаломиелите и коллаген-индуцированном артрите у мышей [207].

Особенностью субпопуляции Th17 является то, что закономерности их функционирования у мышей и у человека оказались различающимися по ряду дифференцировки наивных T-хелперов в Th17, а служил исключительно для стабилизации фенотипа и пролиферации уже дифференцированных клеток, в то время как у человека IL-23 оказался критическим для экспрессии RORС. Кроме того, у людей лимитирующим фактором для синтеза и секреции IL-17 клетками, являлось присутствие в среде IL-1 [227]. Поэтому результаты, характеризующие особенности патогенеза заболеваний с участием Th17, полученные на мышиных моделях, невозможно безапелляционно экстраполировать на людей. Человеческие Th17 характеризовались незначительным цитотоксическим потенциалом, а также оказались менее подверженными супрессорному воздействию FoxP3+ Tregлимфоцитов по сравнению с Th1 и Th2 [227]. Несмотря на ранее опубликованные сведения о том, что Th17 характеризуются низким пролиферативным потенциалом, более поздние исследования свидетельствуют о высокой пролиферационной активности данной клеточной субпопуляции [138, 227].

Th17 были открыты как антагонисты Th1-лимфоцитов. Изначально считалось, что при патологии, опосредованной Th17, Th1 играют роль клетокпротекторов. Однако впоследствии появились данные, свидетельствующие в пользу того, что взаимоотношения между Th1 и Th17 гораздо сложнее, чем полагали ранее, и их активация не является взаимоисключающей. Напротив, Th и Th17 могут дополнять действие друг друга [204]. Так, на мышиной модели артрита было показано, что Th1 активировали моноциты с воспалительным фенотипом, которые впоследствии способствовали развитию аутореактивных Th17 и IL-17-опосредованного локального воспаления в лимфоузлах [254]. Было показано существование клеток, которые одновременно продуцировали IFN- и IL-17. Они получили название «двойные позитивные Т-лимфоциты» или «Th1/Th17-лимфоциты». Функциональные черты Th17 и Th1/Th17 оказались довольно схожими. [13, 38]. Кроме того, Th17 обладают пластичностью по отношению к Th1: под влиянием IL-12 или IL-23 в отсутствии TGF- они начинают экспрессировать STAT-4 и T-bet вместо ROR-t и ROR- и переключаются на синтез IFN- вместо IL-17A и IL-17F. При этом Th1 не способны превращаться в Th17 ни при каких условиях [40]. Существует гипотеза, что пластичность субпопуляций Т-лимфоцитов регулируется микро-РНК [244].

Ряд авторов склоняются к мнению, что Th17 являются не столько провоспалительными, сколько выступают в роли модуляторов иммунного ответа [197, 287]. В пользу данной гипотезы свидетельствует тесная взаимосвязь Th17 с FoxP3+ T-регуляторными лимфоцитами, что делает целесообразным комплексное изучение данных клеточных субпопуляций.

1.5. Т-регуляторные лимфоциты как антагонисты Th В связи с тем, что эффекторные лимфоциты отличаются высокой активностью, значительной продолжительностью жизни и распознают разнообразные антигены, возникает риск развития аутоиммунного заболевания или иммунного ответа, неадекватного по силе антигенной нагрузке. Поэтому в ходе эволюции потребовалось выработать механизмы, способные контролировать эффекторные клетки иммунной системы хозяина. Различают внутренние механизмы поддержания аутотолерантности (клональная селекция в центральных органах иммунной системы, редактирование клеточных рецепторов, увеличение порога клеточной активации) и внешние, опосредуемые Т-регуляторными лимфоцитами (Treg). В настоящее время показано, что снижение содержания или нарушение функционирования Treg приводит к формированию воспалительных или аутоиммунных реакций в организме человека [237, 287].

Поиск субпопуляции Т-лимфоцитов, опосредующих супрессорные функции в отношении других клеток иммунной системы, начался более 40 лет назад.

Однако в то время оказалось невозможным идентифицировать клеточные маркеры, специфичные для данной субпопуляции, и исследования в данном направлении были прекращены, будучи признанными бесперспективными [245].

В 1995 году S. Sakaguchi et al. впервые описали CD4+CD25+ клетки у мышей, участвующие в поддержании аутотолерантности, которые впоследствии и получили название Т-регуляторные лимфоциты [234].

Различают естественные Т-регуляторные клетки (nTreg), которые образуются в тимусе, и адаптивные, которые развиваются из наивных Тлимфоцитов на периферии при встрече с антигеном (iTreg). Основная функция естественных Treg заключается в предотвращении аутоиммунных процессов, в то время как адаптивные Treg ограничивают иммунный ответ на заключительных этапах [28, 245]. Многие авторы обозначают адаптивные Treg как Т-хелперы 3-го типа (Th3) [212].

Treg несут на своей поверхности TCR, которые могут распознавать как свои, так и чужеродные антигены. Однако после активации подавление иммунного ответа осуществляется по антигеннезависимому механизму [235, 245].

Было показано, что специфическим транскрипционным фактором и маркером Treg является FoxP3 (forkhead box P3), который необходим для супрессорной активности клеток и подавления альтернативных путей дифференцировки Т-лимфоцитов [101, 212]. Экспрессия FoxP3 индуцируется в nTreg в тимусе и может активироваться в наивных Т-лимфоцитах на периферии под влиянием TGF-, IL-2, ретиноевой кислоты, 17--эстрадиола и сигналинга через рецептор 1-го типа к сфингозин-1-фосфату, что в результате приводит к образованию iTreg [212].

Фенотип nTreg хорошо описан. В покое они являются CD45RA+FoxP3low, а в активированном состоянии – CD45RO+FoxP3high [48, 155]. Treg экспрессируют в большом количестве CD25 (-цепь рецептора к IL-2) и IL-2 является важным ростовым факторов для FoxP3+ регуляторных Т-лимфоцитов [245]. Показано, что металлопротеиназа-9 может влиять на развитие Treg. Вероятно, ее действие может опосредоваться именно увеличением продукции IL-2 [50, 282]. У людей, в отличие от грызунов, не существует дискретной субпопуляции CD25+лимфоцитов (CD25 в определенных количествах может определяться на активированных Т-клетках других субпопуляций), и при фенотипировании выделяют CD4+CD25highFoxP3+ клетки [245, 250] К другим маркерам активированных nTreg относятся: CD45RO, молекулы адгезии CD62L и CD44, CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte associated protein-4; протеин-4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами), CD28, хемокиновые рецепторы CCR7 и CXCR4, GITR (glucocorticoid-induced TNFR-related protein; индуцированный глюкокортикоидами белок, связанный с TNFR), OX40 (CD134), рецептор фолатаПокоящиеся nTreg-клетки отличаются тем, что несут на своей поверхности CD45RB вместо CD45RO, экспрессируют интегрин 47 и хемокиновый рецептор CCR9. Адаптивные Treg также являются FoxP3-позитивными и не имеют специфических маркеров, в связи с чем, не представляется возможным фенотипически дифференцировать их от nTreg-лимфоцитов [21, 212].

Treg подавляют пролиферацию и активацию Т- и В-лимфоцитов, дендритных клеток, NK- и NKT-клеток, моноцитов/макрофагов, тучных клеток, базофилов, эозинофилов и остеобластов [212, 236]. Для трансгенных линий мышей, имеющих дефицит регуляторных Т-клеток, характерно увеличение содержания антител к митохондриям и ядерным антигенам в циркуляции [145, 309].

Выделяют несколько механизмов, за счет которых CD4+CD25+FoxP3+ Treg могут осуществлять иммуносупрессорную функцию.

Во-первых, регуляторное действие может реализовываться за счет растворимых факторов. Было показано, что Treg секретируют TGF- и IL-10, отличающиеся ингибирующими свойствами в отношении клеток иммунной системы. Однако добавление специфических моноклональных антител к данным цитокинам in vitro не влияло на супрессорную активность Treg [183]. Позже было выявлено, что Treg могут также продуцировать ингибиторный цитокин IL-35, уровень мРНК которого был увеличен в активно функционирующих Трегуляторных клетках, что поддерживало теорию о цитокин-опосредованном функционировании Treg [73]. К супрессорным молекулам, секретируемым Treg, относится и фибриногеноподобный протеин 2 (FGL2), связывание которого со специфическим рецептором FcRIIB ингибирует созревание дендритных клеток и активацию Т-лимфоцитов, а также вызывает апоптоз В-лимфоцитов [160].

Вторичный мессенджер циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) негативно влияет на функционирование эффекторных Т-лимфоцитов [112, 202].

Показано, что Treg способны транспортировать цАМФ в клетки-мишени напрямую через образующиеся межмембранные контакты [56]. Более того, Treg несут на своей поверхности CD39 (эктонуклеозид трифосфат дифосфогидролаза) и CD73 (экто-5'-нуклеотидаза). Эти эктоэнзимы катализируют генерацию внеклеточного аденозина, который оказывает ингибирующее влияние на эффекторные клетки через взаимодействие с аденозиновыми А2А рецепторами.

[81]. Вероятно, сами Treg при этом оказываются защищенными от апоптоза, опосредуемого повышенным содержанием АТФ во внеклеточной среде при повреждении тканей [311].

Во-вторых, важную роль в реализации супрессорной функции Treg играет контактный механизм регуляции. Поверхностные молекулы Т-регуляторных лимфоцитов: CTLA-4, LAG-3 (активирующий лимфоциты ген-3) и нейропилин-1, связываются с антигенпрезентирующими клетками (АПК). Следствием является нарушение созревания и функционирования АПК, и, в дальнейшем, угнетение активации и функций Т-лимфоцитов [123, 183, 239]. Кроме того, Treg обладают киллерной активностью, которая реализуется через цитолитические молекулы, такие как гранзимы А/В и перфорины, или через TRAIL-DR5 путь (tumor-necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand-death receptor 5 pathway) [245].

Контактный механизм действия Treg может осуществляться и за счет мембраносвязанной формы галектина-1, который также необходим для нормального созревания T-регуляторных лимфоцитов. Галектин-1 при связывании с гликопротеиновыми рецепторами эффекторных клеток (такими как CD45, CD43 и CD7) вызывает остановку клеточного роста и апоптоз [27, 106].

И, наконец, Treg могут конкурировать с эффекторными клетками за факторы роста. Поверхностный маркер CD25 не только стимулирует созревание Treg, но и адсорбирует IL-2 из микроокружения, таким образом, приводя к апоптозу эффекторных Т-лимфоцитов [205].

Помимо CD4+CD25+FoxP3+-лимфоцитов описаны и другие субпопуляции регуляторных клеток: регуляторные Т-клетки 1-го типа (Tr1), различные классы CD8+ регуляторных Т-лимфоцитов, двойные негативные (CD4-CD8-CD3+) Тклетки и даже регуляторные В-лимфоциты, продуцирующие IL-10 и TGF- [66, 95, 130, 171, 212, 229, 245, 256, 289, 301]. Показано, что Т-лимфоциты и Тнатуральные киллеры также осуществляют иммунорегуляторную функцию [109, 158]. Однако именно субпопуляция CD4+CD25+FoxP3+ Treg наиболее хорошо изучена и тесно связана с Th17-лимфоцитами на функциональном и, скорее всего, на эволюционном уровне.

Фактор роста TGF- является критическим для дифференцировки как Th17, так и Treg [281]. Под воздействием TGF- наивные Т-лимфоциты приобретают «переходный» фенотип, экспрессируя одновременно FoxP3 и ROR-t+ROR [136, 195, 275]. В дальнейшем клетки могут подвергнуться влиянию провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-21, которые ингибируют FoxP3 и запускают программу развития Th17, или продолжить дифференцировку по пути Treg под действием TGF- [136, 212, 275].

Показано, что FoxP3 подавляет программу развития Th17, напрямую связывая и инактивируя факторы ROR. Идентифицированы домены, через которые осуществляется взаимодействие FoxP3 и ROR. Под влиянием провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-21 и IL-23) STAT3 отменяет FoxP3опосредуемую репрессию RORt и ROR. Следствием является угнетение дифференцировки iTreg и коммитирование клеток в сторону линии Th17лимфоцитов [287].

Если в активированных Treg-клетках снижается экспрессия FoxP3, они утрачивают супрессорную функцию и могут продуцировать IL-17 или IFN-.

Причем тип провоспалительного цитокина, который продуцируют Treg, специфичен для органа, в котором они локализуются. Например, в селезенке, печени и периферических лимфатических узлах ex-FoxP3+ клетки продуцируют IFN-. А клетки из лимфатических фолликулов желудочно-кишечного тракта переключаются на синтез IL-17 [54, 312].

Была открыта популяция RORt+FoxP3+-T-клеток, которые способны оказывать супрессорное действие на эффекторные лимфоциты, но продолжают секретировать IL-17 при рестимуляции [51, 279]. Такие «гибридные» клетки могут демонстрировать супрессорное или провоспалительное влияние, или оставаться «нейтральными по отношению к воспалению», в зависимости от локального микроокружения [197, 287].

Так же как и Th17, iTreg в большом количестве содержатся в слизистой кишечника. Если основной функцией Th17 является защита организма от патогенных микроорганизмов, то Treg призваны ограничивать чрезмерный Тклеточный ответ, с целью создания толерантности к пищевым антигенам и поддержанию комменсальной микрофлоры. При их взаимодействии в кишечнике на фоне постоянно высокой продукции TGF- проявляется функциональный антагонизм данных субпопуляций. Если дендритные клетки продуцируют ретиноевую кислоту (метаболит витамина А, поступающего с пищей), то происходит развитие iTreg и супрессия иммунного ответа. Если же на дендритные клетки поступают сигналы от патогенных микроорганизмов, они начинают вырабатывать IL-6, который в комплексе с TGF- активирует программу дифференцировки Th17 [287]. Схематично данные процессы представлены на рисунке 3. Имеется мнение, что ко-эволюция линий iTreg и Th17 в кишечнике легла в основу развития приобретенного иммунитета у позвоночных, и линии iTreg/Th17 являются самыми древними среди путей дифференцировки CD4+ Тлимфоцитов. В пользу данной гипотезы свидетельствует и тот факт, что Th17 и iTreg обладают пластичностью в отношении других линий, но другие эффекторные Т-лимфоциты не способны трансформироваться в Th17 и iTreg ни при каких известных на сегодняшний день условиях [54, 287].

Имеются данные, что активность Treg находится в тесной взаимосвязи с метаболическими параметрами. У мышей доля Treg-клеток в висцеральной жировой ткани значительно выше, чем в других лимфоидных и нелимфоидных тканях организма [98]. Treg жировой ткани отличаются повышенной экспрессией рецептора PPAR, который при ожирении играет роль в восстановлении чувствительности к инсулину [72]. При избирательном разрушении Treg-клеток с помощью дифтерийного токсина в жировой ткани мышей нарастала продукция провоспалительных цитокинов, и значительно увеличивалось содержание инсулина в крови, что косвенно свидетельствовало о развивающейся инсулинорезистентности [98]. Количество Treg обратно коррелирует с содержанием лептина – гормона, секретируемого жировой тканью, концентрация которого у пациентов с СД 2-го типа зачастую повышена [184, 285].

Рисунок 3. Дифференцировка адаптивных Treg и Th17 в микроокружении, обогащенном TGF- на примере кишечника (представлен перевод схемы из работы C.T. Weaver и R.D. Hatton, 2009). ДК – дендритные клетки Исследования, касающиеся изучения роли Treg в развитии СД 2-го типа у людей являются немногочисленными. Имеются данные, что у пациентов с ожирением, которое, как правило, сопровождает развитие СД 2-го типа, CD4+CD25+FoxP3+ Treg доминируют в циркуляции по сравнению с другими линиями Т-клеток [273]. Но результаты ряда других работ свидетельствуют о том, что для пациентов с СД 2-го типа характерен дефицит FoxP3+ T-регуляторных лимфоцитов, что может вносить вклад в развитие субклинического воспаления [128, 308].

Механизмы, которые обуславливают изменение субпопуляционного состава Т-лимфоцитов при развитии СД 2-го типа, остаются плохо изученными. В то же время, показано, что глюкоза и инсулин, содержание которых критически изменяется при развитии СД 2-го типа, могут оказывать существенное влияние на функционирование клеток иммунной системы.

1.6. Метаболизм глюкозы как модулятор активности Т-лимфоцитов Иммунная и эндокринная системы связаны на различных уровнях. В макроорганизме они постоянно взаимодействуют через сложную и тонко регулируемую сеть гормонов, цитокинов и хемокинов, которые служат для формирования координированного ответа на различные сигналы тревоги и поддержания гомеостаза [91]. Не менее важным является и то, как регулируется метаболизм на уровне клетки. Т-лимфоциты подвергаются метаболическому репрограммированию на всей продолжительности их жизненного цикла, и непосредственно сказывается на эффективности иммунного ответа [168].

Глюкоза и глутамин являются основными источниками энергии Тлимфоцитов. Для образования АТФ, универсального клеточного макроэрга, глюкоза может метаболизироваться по пути гликолиза или окислительного фосфорилирования. Для покоящихся лимфоцитов требуется мало энергии, и практически весь АТФ клетка получает в результате окислительного фософорилирования. При активации лимфоцита анаболизм преобладает над катаболизмом, и происходит усиление аэробного гликолиза, даже при наличии достаточного количества кислорода для утилизации глюкозы по пути окислительного фосфорилирования (аналогично эффекту Варбурга в клетках злокачественных опухолей) [169, 251, 283].

Наличие глюкозы в среде является лимитирующим фактором выживания и пролиферации Т-лимфоцитов [127]. При стимуляции TCR-рецептора, а также под влиянием различных цитокинов (IL-3, IL-7), факторов роста и гормонов, на поверхности Т-клеток увеличивает экспрессия Glut1, основного транспортера глюкозы в лимфоцитах. Если этого не происходит, эффективность гликолиза активируются белки семейства Bcl-2 и клетка подвергается апоптозу [224, 293]. У пациентов с СД 2-го типа на мембране лимфоцитов появляется Glut4. Возможно, это связано со стимуляцией его экспрессии в условиях гиперинсулинемии и гипергликемии [263]. B. Oleszczak et al. (2012) показали, что в условиях внутриклеточное количество молекул Glut1 и Glut3, в то время как количество Glut4, напротив, увеличивается [199].

В таких тканях, как жировая и мышечная, метаболизм глюкозы контролируется, главным образом, инсулином. Связывание этого гормона поджелудочной железы со специфическим рецептором приводит к активации фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и далее – протеин киназы В (PKB; другое название - Akt), что, в свою очередь, усиливает транспорт и утилизацию глюкозы по пути гликолиза. В Т-лимфоцитах связывание костимуляторного рецептора CD28 с лигандами (CD80 или CD86 на антигенпрезентирующих клетках) активирует путь PI3K/Akt аналогично инсулину. Стимуляция CD3/CD28 в Тлимфоцитах вызывает увеличение экспрессии Glut1 и, следовательно, возрастание транспорта глюкозы, а также сопровождается индукцией аэробного гликолиза [103].

На трансгенных мышах, избыточно экспрессирующих Glut1 на Тлимфоцитах, было показано, что следствием избыточного поступления глюкозы в периферические Т-клетки является увеличение их размера, возрастание продукции IL-2, IFN- и появление на клеточной поверхности большего числа гипергаммаглобулинемией и отложением иммунных комплексов в почках [127].

Несмотря на потенцирующее действие глюкозы в отношении Тлимфоцитов, данные о влиянии гипергликемии на их функциональную активность являются противоречивыми. Так, даже лимфоциты различных линий мышей реагируют на повышение концентрации глюкозы по-разному: Т- и Влимфоциты мышей BALB/cByJ характеризовались снижением жизнеспособности и пролиферативной активности, вероятно, под действием оксидативного стресса, в то время как у мышей линии C57Bl/6J не было выявлено влияния гипергликемии на лимфоциты [230].

От того, какой сигнальный путь используется в качестве основного источника энергии в клетке, зависит не только пролиферация и активация Тлимфоцитов, но и их дифференцировка. Показано, что конечный продукт гликолиза, лактат, стимулирует продукцию IL-17 в спленоцитах мышей [302].

Важную роль играют сигнальные молекулы-регуляторы метаболизма глюкозы.

Усиление гликолиза происходит через сигнальный путь, регулируемый mTOR (mammalian target of rapamycin). Активация сигнального пути АМФ-зависимой протеин киназы (AMPK) приводит к противоположному эффекту: сигналинг mTOR ингибируется и активируются окислительные процессы в митохондриях [180]. Имеются данные, что запуск mTOR-опосредуемого гликолиза приводит к образованию Т-клеток-эффекторов, в то время как для дифференцировки в сторону Т-регуляторных лимфоцитов требуется активация пути AMPK и переключение клеточного метаболизма на окисление липидов. При этом Treg характеризуются низкой экспрессией как поверхностного Glut1, так и его внутриклеточной формы. Th17 являются особо чувствительной субпопуляцией эффекторных Т-лимфоцитов – в отсутствии глюкозы в среде культивирования дифференцировка в направлении Th17 оказалась невозможной [180].

Показано, что лептин, адипокин-регулятор метаболизма глюкозы, вызывает активацию mTOR и, таким образом, способен направлять дифференцировку Тлимфоцитов в сторону провоспалительных субпопуляций [221]. При сахарном диабете 2-го типа, зачастую ассоциированном с увеличением содержания лептина в крови, регуляция пути, контролируемого mTOR, нарушается [99, 143].

Синтез ферментов, вовлеченных в гликолиз, зависит от транскрипционного фактора HIF1 (hypoxia-inducible factor 1; индуцируемый гипоксией фактор 1), состоящего из субъединиц HIF1 и HIF. Содержание HIF1 увеличивается в состоянии нормоксии при активации NF-B и повышено в Th17-лимфоцитах, в то время как Treg имеет минимальную концентрацию данного фактора среди всех субпопуляций Т-лимфоцитов. Полагают, что HIF1 является ключевым регулятором «судьбы» Т-лимфоцитов, и от него зависит, дифференцируется ли наивный Т-лимфоцит в Th17 в условиях активно протекающего гликолиза, или продолжит развитие по пути Treg, в которых основным источником энергии является окисление липидов [77, 251]. HIF1 вызывает деградацию транскрипционного фактора FoxP3. Вследствие этого развитие Treg-лимфоцитов нарушается и активируется путь дифференцировки, контролируемый ROR-t, результатом которого является образование Th17-лимфоцитов [64] (Рисунок 4).

В то же время, известно, что определенные полиморфизмы HIF ассоциируются с повышенным риском развития СД 2-го типа, а ингибирование данного фактора у мышей способствует снижению ожирения и степени инсулинорезистентности [303, 307].

При активации митогенами или антигенами Т-лимфоциты активно экспрессируют рецептор к инсулину, который отсутствует на клеточной поверхности в состоянии покоя [169, 260]. После связывания с рецептором инсулин в Т-лимфоцитах оказывает классическое воздействие на метаболизм:

стимулирует поступление в клетку и утилизацию глюкозы, активирует транспорт аминокислот, липогенез и синтез белков. Благодаря своим эффектам, инсулин поддерживает активированное состояние Т-клеток и усиливает действие регуляторных, ростовых и дифференцировочных факторов. F.B. Stentz et al. (2003) показали, что ответ ФГА-стимулированных Т-лимфоцитов на инсулин отражает состояние углеводного обмена в организме хозяина. У пациентов с диабетическим кетоацидозом и гипергликемией было выявлено увеличение продукции провоспалительных цитокинов и активация CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов [260].

Рисунок 4. Метаболизм глюкозы в клетке и направление дифференцировки Т-лимфоцитов контролируется общим фактором HIF-1; Ub – убиквитин; ROS – активные формы кислорода; PDK1 – киназа-1 пируватдегидрогеназы (По данным M. Demaria et al., 2010; L.Z. Shi et al., 2011; E.V. Dang et al., 2011; A. CaroMaldonado et al., 2012) В ряде исследований установлена важная роль поддержания нормальной концентрации инсулина в среде для полноценного функционирования Тлимфоцитов. В Т-лимфоцитах крыс в отсутствии инсулина происходит ингибирование аденозинкиназы, повышение образования аденозина и, как следствие, цАМФ, что, в конечном итоге, приводит к подавлению пролиферации Т-лимфоцитов и нарушению иммунного ответа [209]. В то же время, N. Mito et al.

(2002) показали, что при высоких концентрациях инсулина происходит ингибирование пролиферативной активности лейкозных Т-клеточных линий [182].

Было показано, что помимо влияния на метаболизм глюкозы, протеинов и липидов, инсулин может направлять дифференцировку Т-лимфоцитов в сторону Соответственно, развитие инсулинорезистентности при сахарном диабете 2-го типа и ожирении создает условия, благоприятные для поляризации лимфоцитов в направлении провоспалительных субпопуляций [169]. Показано, что при пролиферации CD3+-лимфоцитов [310].

Было выявлено, что синтез инсулина и функционирование Т-лимфоцитов активируемого кальцинейрином [144, 167]. Этим можно объяснить высокую частоту (до 20%) развития сахарного диабета у пациентов, перенесших трансплантацию почки и подвергавшихся лечению цитостатиками [144]. При этом TGF-, фактор роста, участвующий в развитии Th17 и FoxP3+ Tregлимфоцитов, ингибирует транскрипцию гена инсулина в -клетках поджелудочной железы [156].

Таким образом, механизмы регуляции метаболизма глюкозы тесно переплетаются с механизмами поддержания сбалансированного иммунного ответа на различных уровнях.

В целом, исходя из данных литературы, представленных в обзоре, можно предположить, что при инсулинорезистентности и гипергликемии (состояниях, характерных для артериальной гипертензии, ассоциированной с сахарным провоспалительных (Th1-, Th17-лимфоцитов) и иммуносупрессорных (FoxP3+ Tрегуляторных) лимфоцитов, что, в свою очередь, может вносить вклад в развитие субклинического воспаления и аутореактивных процессов. Причем, активация Th17 может быть опосредована высокими концентрациями глюкозы и инсулина, которые играют важную роль при метаболическом репрограммировании данной провоспалительной субпопуляции. Особое медико-социальное значение имеет высокая распространенность артериальной гипертензии, ассоциированной с сахарным диабетом 2-го типа, в связи с повышенной летальностью и высокой частотой развития микро- и макрососудистых осложнений в этой группе пациентов. В связи с тем, что сведения об особенностях функционирования субпопуляций CD4+ Т-лимфоцитов при метаболических нарушениях, характерных для пациентов с сочетанием артериальной гипертензии и нарушений углеводного обмена крайне немногочислены, исследование в данном направлении является актуальным.

Для достижения поставленной цели было проведено одномоментное проспективное сравнительное исследование. Исследование было выполнено в ФГБУ «НИИ кардиологии» СО РАМН (директор – д-р мед. наук, академик РАН Р.С.Карпов). Набор клинического материала проводился на базе отделения атеросклероза и хронической ишемической болезни сердца (руководитель – д-р мед. наук, академик РАН Р.С. Карпов). Дизайн исследования представлен на рисунке 5.

Обследовано 90 человек (42 мужчины и 48 женщин) в возрасте от 32 до лет. Все лица, включенные в исследование, были разделены по группам:

1 группа – пациенты с медикаментозно контролируемой артериальной гипертензией, ассоциированной с сахарным диабетом 2-го типа (далее – пациенты с сахарным диабетом 2-го типа) – 35 человек;

2 группа – пациенты с медикаментозно контролируемой артериальной гипертензией, ассоциированной с нарушением толерантности к углеводам (далее – пациенты с нарушением толерантности к углеводам) – 16 человек;

3 группа – в качестве группы сравнения обследовано 15 пациентов с медикаментозно контролируемой артериальной гипертензией без нарушений углеводного обмена;

4 группа – в качестве контрольной группы обследовано 24 здоровых лица сопоставимого возраста и пола (здоровые добровольцы).

Характеристика пациентов и здоровых добровольцев представлена в таблице 1.

Всем пациентам проводили комплексное клинико-инструментальное и лабораторное обследование для верификации диагноза, исключения вторичных форм АГ, определения сочетания метаболических факторов риска и уточнения состояния органов-мишеней.

гипертензией ассоциированной с Сыворотка крови Иммуноферментный Метод непрямой иммуноFoxP3+ флуоресценции Статистическая обработка результатов Рисунок 5. Дизайн исследования Характеристика пациентов и здоровых добровольцев, (Me (Q1 – Q3)) Возраст (лет) Ишемическая Примечание: здесь и далее во всех таблицах Ме-медиана, Q1 – 25-ый процентиль, Q3 – 75-ый процентиль; n – число обследованных Диагноз АГ и стратификация риска больных устанавливались на основе действующих национальных рекомендаций по управлению АГ (2010) [8]. У всех пациентов, включенных в исследование, до назначения антигипертензивного систолического артериального давления (САД) в пределах 140-159 мм рт. ст. и диастолического артериального давления (ДАД) – в пределах 90 -99 мм рт. ст.;

артериальную гипертонию 2-ой степени – как повышение САД в пределах 160мм рт.ст. и ДАД – в пределах 100 – 109 мм рт.ст. Степень АГ оценивали путем измерения офисных значений артериального давления по методу Короткова Н.С., ориентируясь на данные многократных «случайных» измерений.

По результатам данных лабораторного обследования (определение сывороточного содержания мочевой кислоты, креатинина, калия, альдостерона, кортизола, активности ренина), ультразвукового исследования магистральных почечных и внутрипочечных артерий и динамической радионуклидной реносцинтиграфии были исключены клинически выраженная нефроангиопатия и другие хронические почечные заболевания.

Диагноз НТУ и СД 2-го типа устанавливался в соответствии с критериями современной классификации сахарного диабета (Standards of Medical Care in Diabetes, 2013) [259] и отечественными методическими рекомендациями Федеральной программы «Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом» под ред. Дедова И.И., Шестаковой М.В. (2013) [1].

Диагноз был подтвержден врачом-эндокринологом ФГБУ «НИИ кардиологии»

СО РАМН канд. мед. наук Бабич Е.Н. Качество контроля углеводного обмена оценивали по содержанию гликозилированного гемоглобина (HbA1c) и пре-и постпрандиальной (натощак и через 2 ч после приема пищи) концентрации глюкозы в плазме.

У 11 пациентов с СД 2-го типа и 9 пациентов с НТУ была диагностирована ишемическая болезнь сердца (ИБС) (Таблица 1). Для верификации ИБС использовали: опросник Роуза; электрокардиограмму (ЭКГ) в покое (патологический зубец Q, комплекс QS, отрицательный коронарный зубец T, горизонтальная или косонисходящая депрессия сегмента ST); эхокардиографию (снижение локальной сократимости левого желудочка); суточное мониторирование ЭКГ; сцинтиграфию миокарда с технетрилом и нагрузочные пробы (велоэргометрию, Стресс-ЭхоКГ с дипиридамолом, добутамином).

Больные не имели в анамнезе перенесенного инфаркта миокарда, операционных вмешательств на коронарных артериях, получали адекватное медикаментозное лечение. Стенокардия напряжения не превышала I-II функционального класса (ФК).

Пациентам было проведено ультразвуковое исследование сонных артерий.

Ультразвуковое сканирование в В-режиме в правой и левой общей сонной артерии проводилось на ультразвуковой диагностической системе «ACUSON»

128 XP/10 (США). Оценивали наличие атеросклеротических бляшек, степень стенозирования, проводили количественную оценку толщины комплекса «интима-медиа» (КИМ) сонных артерий. Субклинический атеросклероз стенозирования просвета сосуда менее 50% [76, 270]. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Частота встречаемости структурных изменений общих сонных артерий у Всем пациентам выполнялся общий анализ крови на автоматическом гематологическом анализаторе ABX Micros 60 (Франция).

Большинство пациентов, отобранных в исследование, по крайней мере, в течение 10-14 дней терапию статинами не получали; 7 пациентов с СД 2-го типа, 6 пациентов с НТУ и 4 пациента с АГ находились на неинтенсивных режимах лечения статинами: аторвастатином и розувастатином в средних дозах 15 мг и 7, мг, соответственно. Все обследованные пациенты получали регулярную антигипертензивную терапию, включающую комбинацию блокаторов ренинангиотензин-альдостероновой системы (РААС) (ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (иАПФ) или сартанов) индапамидом ретардом и блокаторами медленных кальциевых каналов либо бета-блокаторами.

Проводимая антигипертензивная терапия позволила достичь значений АД < 140/85 мм рт. ст. у большинства пациентов, включенных в исследование. У 94,3 % больных с СД 2-го типа проводилась сахароснижающая терапия бигуанидами и инсулинотерапии (Таблицы 3, 4). Здоровые добровольцы на момент исследования медикаментозных препаратов не получали.

Особенности терапии пациентов, включенных в исследование +сахароснижающая терапия (n=28) Характер антигипертензивной и сахароснижающей терапии пациентов, отсутствовали клинические и лабораторные признаки острого воспаления.

Критериями включения в исследование для пациентов являлись:

установленный по результатам расширенного клиникоинструментального обследования диагноз артериальная гипертензия информированное согласие пациента на участие в исследовании.

Критериями исключения являлись:

возраст младше 30 лет, старше 65 лет;

аутоиммунные заболевания у пациента и у близких родственников обострение воспалительных заболеваний за месяц или на момент иммуномодулирующая терапия;

кризовое или злокачественное течение АГ;

острые сосудистые осложнения (инсульт, транзиторная ишемическая атака, инфаркт миокарда) менее, чем за 1 год до включения в нестабильная стенокардия, нарушения ритма сердца, требующие хроническая сердечная недостаточность выше 2 ФК (NYHA);

выраженный периферический атеросклероз;

отказ пациента от участия в исследовании.

врачебный осмотр, измерение артериального давления, комплексное лабораторное обследование (общий и биохимический анализ крови). Критериями включения были информированное согласие на участие в исследовании, возраст, отсутствие клинических проявлений острых воспалительных процессов, нормальное артериальное давление, отсутствие отклонений от референсных значений показателей углеводного, липидного обмена, серологических маркеров острого воспаления и показателей общего анализа крови, отсутствие аллергических и аутоиммунных заболеваний в анамнезе. Исключалось донорство и вакцинация в течение месяца, предшествующего обследованию.

Материалом исследования являлись сыворотка крови, цельная кровь с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА), супернатанты суточных культур клеток крови, мононуклеары периферической крови.

Взятие периферической венозной крови производилось утром натощак в пробирки-вакутейнеры без коагулянта и пробирки-вакутейнеры с ЭДТА и гепарином.

Свернувшуюся кровь без антикоагулянта центрифугировали при ускорении 1500 g. После центрифугирования и ретракции сгустка сыворотку крови аликвотировали в пластиковые пробирки, замораживали при -40С и хранили до последующего исследования.

Супернатанты культур клеток крови получали после культивирования и митогенной активации клеток крови с помощью набора реагентов «ЦИТОКИНСТИМУЛ-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) [17]. Для этого кровь с гепарином вносили во флакон, содержащий питательную среду Игла, модифицированную Дульбекком (ДМЕМ), и во флакон, содержащий среду ДМЕМ и комплекс поликлональных активаторов (фитогемагглютинин, конканавалин А и липополисахарид). Клетки культивировали в течение 24 ч при температуре 37 С и концентрации СО2 5%. По окончании инкубации пробы переносили в пробирки для центрифугирования и осаждали клетки центрифугированием при ускорении замораживали и хранили при -40С до проведения анализа.

Для получения мононуклеаров крови венозную кровь с гепарином разводили в 2 раза фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и центрифугировали на градиенте плотности (Histopaque 1077, Sigma Aldrich, США) при ускорении 400g в течение 30 мин. Полученное кольцо мононуклеарных клеток переносили в другую пробирку и отмывали центрифугированием в PBS с фетальной бычьей сывороткой при ускорении 400g двукратно в течение 10 мин.

Клетки ресуспендировали в 1 мл PBS. Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева под микроскопом ЛОМО (Биолам, Россия). Концентрацию клеток доводили до 2х106 клеток на мл [12].

2.2.2. Культивирование мононуклеаров крови в среде с различными Повышенная постпрандиальная концентрация глюкозы (после приема пищи) является основным фактором риска развития микро- и макрососудистых осложнений при СД 2-го типа [266]. У пациентов с СД 2-го типа постпрандиальная гипергликемия может достигать 20 ммоль/л при норме ммоль/л. На стадии предиабета повышение концентрации глюкозы после приема пищи не так выражено и обычно не превышает 10 ммоль/л [33]. В ответ на гипергликемию для поддержания гомеостаза глюкозы происходит повышение секреции инсулина -клетками поджелудочной железы, развивается гиперинсулинемия. По мере прогрессирования инсулинорезистентности наблюдается десенситизации -клеток с ухудшением их секреторной активности [220, 247]. Таким образом, концентрация инсулина и глюкозы в крови изменяется в ходе развития СД 2-го типа.

Для изучения влияния инсулина и глюкозы на функциональную активность Th17-лимфоцитов, их in vitro концентрации были подобраны таким образом, чтобы соответствовать условиям, которые имеют место in vivo в ходе развития СД 2-го типа.

У 11 здоровых добровольцев и 13 пациентов с СД 2-го типа мононуклерных клеток культивировали в пробирках емкостью 15 мл в течение ч при 37 °С и 5% CO2 в 1 мл среды RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина. В культуральную среду добавляли инсулин и D-глюкозу в различных концентрациях (оба реагента - Sigma Aldrich, США). Три пробирки имели концентрацию D-глюкозы 5 ммоль/л, 10 ммоль/л и 20 ммоль/л и не содержали инсулина. В трех пробирках было создано следующее сочетание концентраций инсулина и D-глюкозы: 5 ммоль/л глюкозы и 10-10 моль/л инсулина; 5 ммоль/л глюкозы и 10-8 моль/л инсулина; 20 ммоль/л глюкозы и 10-8 моль/л инсулина. Для контроля осмолярности была использована пробирка, содержащая 5 ммоль/л Dглюкозы и 15 ммоль/л D-маннитола. Через 24 ч супернатанты клеточных культур собирали и хранили при -40 °С для последующего определения содержания в них цитокинов. Клетки ресуспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе.

Для оценки жизнеспособности клетки окрашивали 7-актиноаминомицином D (7AAD, Becton Dickinson, США). Жизнеспособность клеток варьировала от 95% до 98%. В дальнейшем в мононуклеарах периферической крови определяли базальную и активированную внутриклеточную продукцию IL-17 методом проточной цитометрии.

2.2.3. Определение фенотипа лимфоцитов методом проточной Проточная цитометрия представляет собой современный метод быстрого измерения различных характеристик клеток, который не только ускоряет анализ, но и позволяет обнаружить и охарактеризовать редкие события и минорные субпопуляции клеток. Принципом метода является гидродинамическое фокусирование клеток в струе жидкости. После того, как клетки пересекают луч лазера, они отражают свет под разными углами (что позволяет судить о размере клеток, соотношении ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы) и, за счет использования моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромами, испускают флуоресценцию (что позволяет идентифицировать различные вне- и внутриклеточные маркеры) [5, 162, 248].

2.2.3.1. Анализ основных субпопуляций лимфоцитов Содержание основных субпопуляций лимфоцитов (Т-хелперов, Тцитотоксических лимфоцитов, В-лимфоцитов, NK-клеток, NKТ-лимфоцитов) учитывали в цельной крови с ЭДТА.

В полистирольные пробирки 12х75 мм для проточной цитометрии вносили по 50 мкл крови с ЭДТА. Для фенотипирования клеток использовали следующие моноклональные антитела, меченные флуорохромами: анти-CD3флуоресцеинизотиоцианат (FITC), анти-CD45-перидинин хлорофилл протеин (PerCP), анти-CD4-фикоэритрин (PE), анти-CD8-PE, анти-CD19-PE, антиCD16+56-PE (Becton Dickinson, США). После инкубации с моноклональными антителами в образцы добавляли лизирующий раствор для лизиса эритроцитов.

Пробы анализировали на четырехцветном проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы CEllQuestPro (BD Biosciences, США). При сборе данных учитывали 10000 событий. Результаты выражали в проценте клеток от общего количества лейкоцитов.

Для расчета абсолютного количества клеток проводили общий анализ крови с помощью автоматического гематологического анализатора ABX Micros 60 OT 18 (HORIBA ABX Diagnostics Inc., Франция). Абсолютное количество лимфоцитов различных субпопуляций рассчитывали по формуле:

где a – абсолютное количество лейкоцитов;

b – относительное содержание лимфоцитов определенной субпопуляции.

Результаты выражали в количестве клеток х 109/ л.

2.2.3.2. Анализ содержания Th17- и Th1-лимфоцитов Принадлежность клеток к субпопуляциям Th17- и Th1-лимфоцитов оценивали по их способности к внутриклеточной продукции IL-17 и IFNсоответственно [96].

Для оценки внутриклеточной продукции цитокинов мононуклеарные клетки культивировали в течение 6 ч на среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина, при 37 °С и концентрации СО2 5%. Через 2 ч после начала культивирования в среду добавляли GolgiPlug (активное вещество - брефельдин А) (BD Pharmingen, США) в концентрации, рекомендованной производителем, для ингибирования секреции цитокинов. Часть фракции мононуклеаров стимулировали форбол 12-миристат 13-ацетатом (ФМА) в концентрации 50 нг/мл (Sigma Aldrich) и иономицином ( мкг/мл, Sigma Aldrich). Часть фракции мононуклеров периферической крови оставляли нестимулированными для оценки спонтанной внутриклеточной продукции цитокинов.

После культивирования по 100 мкл клеточной суспензии каждого образца переносили в две полистирольные пробирки 12х75 мм для проточной цитометрии.

В одной из пробирок оценивали внутриклеточную продукцию IL-17 и IFN-; в другой – количество IL-23R+ Т-лимфоцитов. Для определения фенотипа клеток были использованы следующие моноклональные антитела: фикоэритрин карбоксициан-5 (PECy5)-меченные анти-CD4 (Becton Dickinson, США), внутриклеточного окрашивания клетки фиксировали 1% параформальдегидом (CellFIX, BD Biosciences, США) и увеличивали проницаемость клеток для моноклональных антител (пермеабилизировали) FACS-пермеабилизирующим раствором (BD Biosciences, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Затем клетки инкубировали с PE-меченными анти-IL-17 (R&D, США) и FITC-меченными анти-IFN- (Becton Dickinson, США) антителами в течение 30 мин при комнатной температуре. После окрашивания клетки отмывали однократно и фиксировали 1% параформальдегидом. В качестве контрольного образца использовали неокрашенные мононуклеары крови.

Рисунок 6. Определение относительного содержания Th17- и Th1лимфоцитов.

FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения CellQuestPro (BD, США). При сборе данных учитывали от 50000 до 200000 событий. Результаты выражали в проценте клеток от CD4+-лимфоцитов и в средней интенсивности флуоресценции (MFI). Клетки, позитивные как по IL-17, так и по IFN-, относили к двойным позитивным Th1/Th17 лимфоцитам.

Используемая стратегия гейтирования представлена на рисунке 6.

Абсолютное содержание Th17- и Th1-лимфоцитов рассчитывали по следующей формуле:

где c – абсолютное количество CD4+-лимфоцитов, рассчитанное по результатам общего анализа крови и анализа основных субпопуляций лимфоцитов;

d – относительное содержание IL-17+ или IFN-+ Т-хелперов.

Результаты выражали в количестве клеток х 103/л или х 106/л (для стимулированной внутриклеточной продукции IFN-).

2.2.3.3. Определение содержания Т-регуляторных лимфоцитов Содержание Т-регуляторных лимфоцитов определяли во фракции мононуклеаров периферической крови. Treg идентифицировали по высокой экспрессии молекулы CD25 и внутриклеточного фактора транскрипции FoxP [166].

Для этого 100 мкл клеточной суспензии помещали в полистирольную пробирку 12х75 мм для проточной цитометрии. Для фенотипирования клеток были использованы FITC-меченные анти-CD4 и APC-меченные анти-CD моноклональные антитела (Becton Dickinson, США). После окрашивания поверхностных маркеров клетки фиксировали и пермеабилизировали с помощью специализированных буферных растворов для детекции FoxP3+ Treg-лимфоцитов (eBioscience, США). Затем клетки инкубировали с РЕ-меченными анти-FoxP антителами (Becton Dickinson, США) для выявления внутриклеточного фактора транскрипции. В качестве контрольного образца использовали неокрашенные мононуклеары крови.

FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения CellQuestPro (BD). Последовательность выделения целевой субпопуляции лимфоцитов представлена на рисунке 7. Были гейтированы CD4+лимфоциты с исключением CD4+-моноцитов, характеризовавшихся более низкой экспрессией маркера. В связи с тем, что у людей выделение дискретной субпопуляции CD25high лимфоцитов представляет сложность, мы опирались на данные Lhn K. et al. (2007), которые показали, что для CD25high Treg-лимфоцитов характерна несколько сниженная экспрессия CD4 (Рисунок 7) [164]. Результаты выражали в проценте CD4+CD25high-клеток и CD4+FoxP3+-клеток от CD4+лимфоцитов. CD25high Treg гейтировали и определяли относительное содержание CD25high клеток среди всех CD4+FoxP3+ лимфоцитов.

Рисунок 7. Определение содержания CD4+CD25high и CD4+FoxP3+ лимфоцитов.

Абсолютное содержание FoxP3+ Treg-лимфоцитов рассчитывали по следующей формуле:

где c – абсолютное количество CD4+-лимфоцитов, рассчитанное по результатам общего анализа крови и анализа основных субпопуляций лимфоцитов;

e – относительное содержание FoxP3+ Treg-лимфоцитов.

Результаты выражали в количестве клеток х 106/л.

2.2.4. Определение концентрации цитокинов методом мультиплексного Принципом мультиплексного анализа является связывание растворимых аналитов гранулами, отличающимися по размеру и интенсивности флуоресценции, что позволяет в дальнейшем определить концентрацию аналитов методом проточной цитометрии. Преимуществом метода является возможность одновременного определения большого числа аналитов в малом объеме образца [185, 265].

В работе использовался набор для мультиплексного анализа содержания Th1/Th2/Th17 цитокинов человека (BD Bioscience, США), который позволяет определять концентрацию IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IFN- и TNF-.

50 мкл сыворотки крови, супернатантов суточной культуры клеток крови или супернатантов суточной культуры мононуклеаров, инкубированных в среде с различной концентрацией инсулина и глюкозы, помещали в полистирольные пробирки 12х75 мм для проточной цитометрии. В каждую пробирку добавляли приготовленную смесь гранул, отличающихся по интенсивности флуоресценции, и меченных моноклональными антителами к IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IFN- и TNF-. К смеси анализируемого образца и гранул добавляли 50 мкл антител для детекции, меченных фикоэритрином (РЕ). В ходе инкубации формировались комплексы «специфические гранулы + определенный цитокин + антитела для детекции». Интенсивность флуоресценции каждого комплекса была пропорциональна концентрации цитокина в образце. Параллельно подготавливались стандартные растворы цитокинов, в которых концентрация каждого цитокина варьировала от 0 до 5000 пг/мл (калибровочные образцы).

Пробы и калибровочные образцы анализировали на четырехцветном проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения CellQuestPro (BD). Пример точечной гистограммы представлен на рисунке 8. Затем с помощью программы FCAP Array software (Soft Flow, США), в которой были построены калибровочные кривые для каждого цитокина, определяли концентрацию цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IFNи TNF- в каждом образце.

мультиплексного анализа (калибровочный образец с концентрацией цитокинов пг/мл) Для супернатантов суточных культур клеток периферической крови рассчитывали концентрацию цитокинов на 106 лейкоцитов, исходя из общего количества лейкоцитов у пациентов и фактора разведения образца в процессе культивирования с помощью набора «ЦИТОКИН-СТИМУЛ-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Формулы представлены ниже.

где x – концентрация цитокина в супернатанте интактной культуры клеток крови в пг/мл на 106 лейкоцитов;

y – концентрация цитокина в супернатанте митоген-активированной культуры клеток крови в пг/мл на 106 лейкоцитов;

a – концентрация цитокина в супернатанте интактной культуры клеток крови в пг/мл;

c – концентрация цитокина в супернатанте митоген-активированной культуры клеток крови в пг/мл;

b – общее количество лейкоцитов;

0,2 и 0,8 – факторы разведения образца.

иммуноферментного анализа (ИФА). Антитела к одному из эпитопов определяемого антигена были сорбированы на твердой фазе (лунка 96-луночного полистирольного планшета). Анализируемую пробу добавляли к твердой фазе, инкубировали и отмывали. После отмывки вносили конъюгат антител ко второму эпитопу антигена с ферментом. После инкубации и отмывки добавляли субстратный реагент. Интенсивность окрашивания продукта ферментативной реакции регистрировалась фотометрически и была прямопропорциональна содержанию антигена в пробе [12].

2.2.5.1. Определение концентрации инсулина в сыворотке крови Для определения концентрации инсулина в сыворотке крови использовали набор AccuBind (Monobind, США).