«МЕХАНИЗМЫ НЕЙРОТОКСИЧНОСТИ, ВЫЗВАННОЙ АКТИВАЦИЕЙ РЕЦЕПТОРОВ ГЛУТАМАТА В ЦЕНТРАЛЬНЫХ И ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ НЕЙРОНАХ КРЫС ...»

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова

На правах рукописи

АБУШИК ПОЛИНА АЛЕКСАНДРОВНА

МЕХАНИЗМЫ НЕЙРОТОКСИЧНОСТИ, ВЫЗВАННОЙ АКТИВАЦИЕЙ

РЕЦЕПТОРОВ ГЛУТАМАТА В ЦЕНТРАЛЬНЫХ И ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ

НЕЙРОНАХ КРЫС

Специальность 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Антонов С.М.

Санкт-Петербург

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ………………………………………………………....

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

……...……………………………….... Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ …..……………………………………………… 1.1 Строение и функции глутаматергического синапса ….………..….….….... 1.2 Структурно-молекулярная организация рецепторов глутамата ………….. 1.2.1 АМПА/KA–ионотропные рецепторы глутамата ………………....... 1.2.2 NMDA-чувствительные ионотропные рецепторы глутамата.......... 1.2.3 Метаботропные рецепторы глутамата ……………………………... 1.3 Нейротоксическое действие глутамата …………………………….............. 1.4 Глутамат-индуцированная дисрегуляция кальциевого баланса клетки...... 1.5 Рецепторы глутамата в периферической нервной системе…………..……. 1.6 Гомоцистеин, как эндогенный агонист рецепторов глутамата ………........ Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДИКИ ………………………………………….……. 2.1. Приготовление первичных культур нейронов……………..….….…….….. 2.1.1. Первичная культура нейронов коры головного мозга крыс …............ 2.1.2. Первичная культура нейронов тригеминального ганглия крыс….….. 2.2. Идентификация нейронов и глиальных клеток в культурах……..……..…. 2.2.1. Идентификация клеток в первичной культуре коры головного мозга крыс ……………………………………………………………………………... Идентификация клеток в первичной культуре тригеминального 2.2.2.

ганглия крыс …………………………………………………………………… 2.3. Флуориметрическая регистрация внутриклеточного Ca2+...………..…..… 2.4. Флуориметрическое определение митохондриального мембранного потенциала..………………………………………………………………………... 2.5. Регистрация токов нейронов методом локальной фиксации потенциала... 2.6. Определение апоптотических и некротических клеток путем последовательного окрашивания акридиновым оранжевым и бромистым этидием …………………………………………………………………………….. 2.7. Порядок проведения экспериментов ………………..…………………........ 2.8. Обработка данных …………………………….……………….………….…. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ..……………………………………………………..…… 3.1. Исследование состава рецепторов глутамата, обеспечивающих вход Са2+ при действии агонистов рецепторов глутамата в нейронах первичной культуры коры мозга крыс ………………………………………………………………..….. 3.1.1 Внутриклеточные Са2+ ответы и токи в нейронах при действии агонистов рецепторов глутамата NMDA и АМПА/KA типа..……................ 3.1.2. Зависимость внутриклеточных Са2+ ответов нейронов от Са2+ внеклеточного раствора……………………………………..….……………… 3.1.3. Вклад NMDA рецепторов различного субъединичного состава в генерацию внутриклеточного Са2+ сигнала ………………………………….. 3.1.4. Вклад АМПА рецепторов различного субъединичного состава в генерацию внутриклеточного Са2+ сигнала и интегральных токов....……… Исследование нейротоксического эффекта гомоцистеина на нейроны 3.2.

первичной культуры коры мозга крыс…………………………………………… 3.2.1. Нейротоксический эффект долговременного действия гомоцистеина…………………………………………………………………… Са2+ 3.2.2. Внутрикелеточные ответы при кратковременном и долговременном действии гомоцистеина ………………

3.2.3. Интегральные токи, вызванные гомоцистеином

Исследование нейротоксического эффекта гомоцистеина на нейроны 3.3.

первичной культуры тригеминального ганглия крыс…………………………… 3.3.1. Внутриклеточные Са2+ ответы при действии гомоцистеина …….….. 3.3.2. Интегральные токи, вызванные гомоцистеином…………………….... гомоцистеина…………………………………………………………………… 3.4.

тригеминального ганглия крыс на гомоцистеин, NMDA и глутамат………....... 3.4.1. Внутриклеточные Са2+ ответы…………………………………………. 3.4.2. Митохондриальный мембранный потенциал…………….……...……. Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ………………………………………………………….. ВЫВОДЫ ………………………………………………………………………...... СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………………………

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АО акридиновый оранжевый АМПА -амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота G-белок-связанный рецептор (G-protein coupled receptor) GPCR [Ca2+]i концентрация внутриклеточного Ca2+ IP мембранный митохондриальный потенциал мГлуР5 метаботропный рецептор глутамата 5 типа МД митохондриальная деполяризация NMDA N-метил-D-аспартат ОКД отсроченная кальциевая дисрегуляция PKC Rho ЭПР эндоплазматический ретикулум

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

млекопитающих (Curtis et al., 1959), который обеспечивает проведение возбуждения от нейрона к нейрону в глутаматергических синапсах. Благодаря участию постсинаптических рецепторов Глу в синаптической пластичности, сам Глу вовлечен в такие когнитивные функции, как обучение и память. Однако в условиях гиперактивации различных типов рецепторов Глу, в нейронах могут развиваться нейродегенеративные процессы, связанные с нарушением Са2+ регуляции, которые запускают внутриклеточные сигнальные каскады, приводящие к гибели нейронов (Khodorov, 2004). Известно, что нейротоксичность Глу участвует в патогенезе таких социально значимых неврологических заболеваний как эпилепсия, ишемический инсульт, мигрень, боковой амилотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона. В связи с этим, изучение механизмов нейротоксического действия Глу и агонистов его рецепторов является одним из наиболее актуальных направлений в современной нейробиолгии.

Известно, что в первую очередь, нейротоксическое действие Глу реализуется в глутамат-чувствительных нейронах ЦНС. Однако часть нейродегенеративных заболеваний, сопряженных с гиперакивацией рецепторов Глу развивается на периферии, в нейронах неглутаматергической природы. Тем не менее, вопрос экспрессии рецепторов Глу и механизмов нейротоксического действия Глу в тканях периферической нервной системы (ПНС) остается мало изученным.

Исследование механизмов развития патологических процессов на целом мозге и ПНС, затруднено из–за их сложной структурной организации и ограничений в применимости современных методов исследований. Большой прогресс в изучении многих аспектов нейродегенерации был достигнут в экспериментах на первичных культурах ткани различных отделов мозга (Bading et al., 1995; Kim, Pae, 1996; Kim et al., 1999), так как данный экспериментальный подход позволяет контролировать внеклеточную среду и рост клеток, дает возможность для исследования внутриклеточных механизмов и межнейронных взаимодействий в нейронной сети. Тем не менее, остается открытым вопрос о сохранности структурно-функциональной специализации нейронов, выделенных из эмбриональной ткани и подверженных культивированию в течение нескольких дней. Являются ли нейроны, выращенные в искусственных условиях гомогенными по своим функциональным свойствам? – Исследование данного вопроса представляется весьма актуальным для правильной интерпретации результатов, полученных на первичной культуре нейронов, и их сопоставления с процессами, происходящими в нейронах мозга взрослых животных.

На сегодняшний день известно, что патогенез многих нейродегенеративных заболеваний сопряжен с увеличением концентрации гомоцистеина (ГЦ) в кровотоке и цереброспинальной жидкости (Kruman et al., 2002; Sachdev, 2005).

Данная аминокислота может накапливаться в результате нарушения синтеза метионина и цистеина, вызванного недостатком фолиевой кислоты и витаминов группы В, или вследствие, генетически обусловленного полиморфизма – точечной мутации, заключающейся в замене с цитозина (С) на тимин (Т) в нуклеотиде (C677T) гена 5’-10’-метилентетрагидрофолат редуктазы (Rozen 1997;

Sachdev, 2005; Isobe, Terayama, 2010). Исследования последних лет показали, что ГЦ может взаимодействовать с сайтом связывания Глу или глицина NMDA рецептора (Poddar, Paul, 2013), а значит может быть рассмотрен как новый эндогенный активатор рецепторов Глу (Lipton et al., 1997). Известно, что чрезмерная активация NMDA рецепторов вызывает сильный окислительный стресс, и как следствие, сильную деполяризацию митохондрий (Reyes et al., 2012).

Наряду с этим было показано, что в одних экспериментальных моделях, например в эпителиальных клетках, ГЦ вызывал окислительный эффект (Outinen et al., 1998), а в других, таких как нейроны и астроциты, оказывал восстанавливающий эффект (Loureiro et al., 2010). В связи с этим, вопрос вовлеченности ГЦ в индукцию окислительного стресса пока остается открытым.

Несмотря на то, что из-за актуальности для практической медицины изучение цитотоксического действия ГЦ является активно развивающимся направлением нейробиологии, нейротоксическое действие ГЦ, его вовлеченность в окислительный стресс и роль ГЦ в Са2+ сигнализации в центральных и периферических нейронах остаются мало изученными.

Цель исследования. В центральных и периферических нейронах крыс исследовать рецепторные механизмы нейротоксического действия агонистов митохондриального мембранного потенциала.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие конкретные задачи исследования.

Изучить динамику увеличения концентрации кальция, вызванного активацией NMDA и АМПА рецепторов в нейронах коры мозга крыс in vitro.

C использованием избирательных блокаторов, изучить субъединичный состав NMDA и АМПА рецепторов, вовлеченных в генерацию кальциевых ответов в нейронах коры мозга крыс in vitro.

В нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре ткани исследовать нейротоксический эффект долговременного действия гомоцистеина.

В нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре сопоставить амплитудно-временные характеристики внутриклеточных кальциевых ответов на гомоцистеин, NMDA и глутамат.

Изучить изменения митохондриального мембранного потенциала (mit), вызванные кратковременным действием гомоцистеина, NMDA и глутамата в нейронах первичной культуры коры мозга и тригеминального ганглия крыс.

Научная новизна. Исследованы Са2+ ответы нейронов коры мозга крыс на каинат, который является сильным нейротоксическим агентом и избирательным агонистом рецепторов АМПА типа. Впервые обнаружено, что Са2+ ответы при действии каината развивались гораздо медленнее, чем при активации NMDA рецепторов в нейронах коры мозга. Это обусловлено наличием АМПА рецепторов, которые обладают различной проводимостью для Са2+ в зависимости от экспрессии субъединицы, что отражает функциональные характеристики нейрона. Таким образом, было впервые показано, что нейроны в первичной культуре являются гетерогенными и обладают морфофунциональной специализацией, характерной для нейронов коры мозга крыс.

Впервые показано, что нейротоксический эффект ГЦ определяется синергизмом активации NMDA рецепторов и метаботропных рецепторов глутамата, так как избирательные антагонисты каждого из этих рецепторов предотвращали гибель глутамат-чувствительных центральных нейронов, а также пуринергических и пептидергических периферических нейронов. Были впервые зарегистрированы интегральные трансмембранные токи, вызванные ГЦ в нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс, и продемонстрировано, что они генерируются в результате активации NMDA рецепторов. Впервые было показано, что в отличие от Глу и NMDA, ГЦ индуцирует кратковременные быстрые кальциевые ответы осцилляторного типа и не вызывает деполяризацию мембраны митохондрий на начальных этапах нейротоксического действия в нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре ткани.

Основные положения, выносимые на защиту.

Нейроны коры мозга крыс в первичной культуре ткани, по экспрессии рецепторов Глу различного субъединичного состава, являются гетерогенными и обладают морфофункциональной специализацией, характерной для нейронов коры мозга крыс.

Несмотря на различную медиаторную природу синаптических сигналов нейронов коры мозга и тригеминального ганглия крыс, нейротоксический эффект гомоцистеина в обоих типах нейронов развивается через активацию ионотропных NMDA рецепторов и метаботропных рецепторов глутамата 5 типа.

кратковременные быстрые кальциевые ответы осцилляторного типа и не вызывает падения митохондриального мембранного потенциала в нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре, а следовательно, не вызывает окислительный стресс на начальных этапах нейротоксического действия.

Теоретическая и практическая значимость.

Работа имеет значение для фундаментальной науки в области исследования нейродегенеративных процессов, участвующих в патогенезе таких социально значимых заболеваний, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона. Теоретическое значение работы состоит в расширении представлений о механизмах нейродегенерации, вызванной чрезмерной активацией рецепторов Глу. Результаты исследования могут быть нейродегенеративных состояний, неврологических расстройств в ЦНС и ПНС, а также для выявления возможных механизмов защиты нейронов от гибели.

Результаты работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов университетов и медицинских институтов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, 4 из которых статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций (в том числе 3 статьи в международных журналах), 10 тезисов докладов.

Апробация работы. Результаты исследования представлены на XXI и XII съезде физиологического общества им. И.М. Павлова (Калуга, 2010; Волгоград, 2013), на XVIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), на четырнадцатом международном совещание и седьмой школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011) на III Съезде Физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Украина, Ялта, 2011), на восьмом форуме европейской федерации нейробиологов 8 th FENS Forum of Neuroscience 2012 (Испания, Барселона, 2012), на седьмом и восьмом ежегодном симпозиуме Университета восточной Финляндии The Annual PostGraduate Symposium of the Doctoral Program in Molecular Medicine: Winter School нейробиологов Neuroscience 2013 (США, Сан-Диего, 2013).

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора экспериментов – глава 2, результатов исследования – глава 3, обсуждения включающего 184 источника (из них 164 иностранных). Работа иллюстрирована 26 рисунками и 1 таблицей.

1.1 Строение и функции глутаматергического синапса В 1893 году появились первые сообщения о способе взаимодействия нервных клеток через специфические контакты или синапсы. Термин синапс был введен в 1897 году Чарльзом Шеррингтоном. А открытие синаптических контактов принадлежит испанскому ученому Рамон-и-Кахалю, который, благодоря использованию метода Гольджи (насыщение серебром нейронов), обнаружил у большинства нейронов два функционально разных отростка:

дендрит и аксон. Он впервые обосновал морфологическую самостоятельность нейронов и глиальных клеток, а также показал, что в нервной системе отсутствуют синцитиальные отношения (Cheah, Watkins, 1965). Спустя 50 лет после открытий Кахаля стало очевидным, что передача нервного импульса осуществляется через синапсы, а ключевым компонентом такой передачи является наличие в мембране окончаний нейрона синаптических рецепторов.

Позже, при изучении влияния различных веществ на электрическую активность нейронов изолированного спинного мозга Куртис и Ваткинс сформировали гипотезу о медиаторной роли дикарбоновых аминокислот (Cheah, Watkins, 1965; Curtis, Johnston, 1974). В результате этих экспериментов было установлено, что Глу является основным возбуждающим медиатором в синапсах ЦНС позвоночных, и он удовлетворяет основные требования, необходимые для признания вещества медиатором. Открытие специфических рецепторов Глу стало определяющим феноменологическим признаком его медиаторной роли.

Глу является заменимой аминокислотой, которая не способна проникать через гематоэнцифалический барьер, т.е. не поступающей в мозг через кровь.

Молекула глутаминовой кислоты имеет достаточно простую структуру HOOC– СН2–СН2–СН(NH2)–СООН (Curtis, Johnston, 1974; Антонов и др., 1988; Калинина и др., 1989; Collingridge, Singer 1990). Е синтез происходит в основном внутри нейронов мозга, хотя небольшая часть Глу находится в глиальных клетках астроцитах. Глу может быть синтезирован несколькими путями: из кетоглутарата с помощью прямого восстановительного аминирования или трансаминирования, из глутамина ферментом глутаминазой, а также из орнитина ферментом орнитинаминотрансферазой (Петров и др., 1997). Известно, что глутаматергические синапсы широко распространены в большинстве отделов ЦНС, в частности, в коре больших полушарий мозга, в гиппокампе, черной субстанции, мозжечке, стриатуме, среднем мозге, гипоталамусе и в спинном мозге.

плазматической мембраны, осуществляют транспорт-захват Глу из синаптической щели и его перенос внутрь глиальных клеток и нейронов (Masson et al., 1999;

Tanaka 2000; Антонов, 2001). За счет функционирования данных переносчиков в синаптической щели поддерживается низкая концентрация медиатора (Ноздрачев и др., 2001; Никколс и др., 2003). В цитозоле нейронов и глиальных клеток концентрация Глу достигает 10 мМ. Известно, что благодаря энергии трансмембранных ионных градиентов происходит захват Глу против его химического градиента. Так как для Na+ и K+ (примерно 140 мМ Na+ во внеклеточной среде и около 10 мМ внутри клеток; и наоборот 130 мМ К + внутри электрохимический градиент между внеклеточной и внутриклеточной средой, молекулы Глу транспортируются в клетку совместно с ионами Na+, при этом происходит выход ионов К+. Доказательством этого служит опыт по замене ионов Na+ на ионы Li+ в наружной среде, что приводило к блокированию транспорта Глу (Антонов 1989). Попав в нейроны, Глу накапливается в синаптических везикулах с помощью протонзависимых везикулярных транспортеров (рис. 1.1). Из глиальных клеток в нейроны Глу транспортируется с небольшими метаболическими превращениями. В астроцитах Глу превращается в глутамин за счет фермента глутаминсинтазы. Важно, что глутамин способен проходить через билипидные мембраны, неактивируя рецепторы Глу. Таким образом, глутамин захватывается нейронами из внеклеточного пространства. Митохондриальный фермент нейронов глутаминаза превращает глутамин обратно в Глу, кторорый снова попадает в синаптическую везикулу (Masson et al., 1999).

Глутаматергический синапс, подобно другим химическим синапсам, представляет собой сложное структурное образование, состоящее из пресинаптической мембраны (пресинапс, чаще всего это концевое разветвление аксона), постсинаптической мембраны (постсинапс, чаще всего это участок мембраны тела или дендрита другого нейрона), а также синаптической щели.

Важным участником синаптической передачи являются глиальные клетки, поддерживающие локальный гомеостаз в синаптической щели.

Еще до того, как были выяснены многие существенные особенности процесса высвобождения медиатора, было установлено, что пресинаптические окончания проявляют спонтанную секреторную активность. Постоянно выделяемые небольшие порции медиатора вызывают в постсинаптической клетке токи, называемые спонтанными миниатюрными постсинаптическими токами. При исследовании нервно-мышечного синапса лягушки было обнаружено, что в мышце в области постсинаптической мембраны сами по себе, без всякого воздействия на нерв, через случайные промежутки времени возникают небольшие колебания потенциала (Fatt, Katz, 1950). Высвобождение медиатора, несвязанное с нервным импульсом помогло установить его квантовый характер - в покое в химическом синапсе медиатор выделяется небольшими порциями (Зефиров, 2000).

1.2 Структурно-молекулярная организация рецепторов глутамата В ЦНС находится порядка 108 глутаматергических нейронов. С помощью методов электрофизиологии и молекулярной биологии, было выявлено существование 4 типов глутаматных рецепторов. Среди 4 типов глутаматных рецепторов 3 типа являются ионотропными рецепторами и 1 тип метаботропным рецептором. К ионотропным рецепторам глутамата относятся: (N-метил-Dаспартатные (NMDA) рецептры, каинатные (KA) рецепторы и рецепторы 2амино-3(3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-ил) пропионовой (AMПA) кислоты. Эти рецепторы являются лиганд-управляемыми ионными каналами. Современная классификация ионотропных рецепторов основана на их разной чувствительности метилизоксазол-4-ил) пропионовой кислоты и каината. Все ионотропные рецепторы Глу являются тетрамерами. В соответствии с классификацией международной организации по изучению генома человека (HUGO, URL:

http://www.genenames.org/) субъединицы ионотропных рецепторов Глу разделяют на: субъединицы GluA1 – GluA4 (AMПA рецепторы), субъединицы GluK1 – GluK5 (КА рецепторы), субъединицы GluN1,GluN2A–2D, NR3A–3B (NMDA рецепторы) и субъединицы Метаботропные рецепторы глутамата разделяют на три группы (рис. 1.1): I группа, в основном экспрессируются на постсинапсе (mGluR1 и mGluR подтипы), II группа (mGluR2, mGluR3 подтипы) и III группа (mGluR4, mGluR6mGluR8 подтипы) метаботропных рецепторов глутамата, представлены на пресинаптическом окончании и участвуют в регуляции выброса Глу (Grueter, Winder, 2009).

Известно, что в нормальных условиях у млекопитающих все типы рецепторов Глу активируются самим Глу и, возможно, L-аспартатом (McBain, Mayer, 1994; Dingledine et al., 1999). В отличие от ЦНС позвоночных, у беспозвоночных рецепторы Глу могут формировать катионный или анионный канал, и при этом возможна регистрация как деполяризующего, так и гиперполяризующего ответа клеток при аппликации агонистов (Shinozaki 1988).

Данные о клонировании субъединиц рецепторов Глу (Hollmann et al., 1989) позволили узнать аминокислотные последовательности рецепторных субъединиц и их топологию в мембране. На данное время клонированно 18 субъединиц рецепторов Глу, для которых возможено редактирование, приводящие к изменению аминокислотной последовательности (Sobolevsky 2003; Traynelis et al., 2010). Известно, что субъединицы всех известных рецепторов Глу, включая АМПА, каинатные, NMDA и delta-глутаматные рецепторы, имеют подобную архитектуру (Traynelis et al., 2010).

Рисунок 1.1. Схематическое представление глутаматергического синапса, с указанием возможного положения различных рецепторов глутамата. ЭПР – эндоплазматический ретикулюм, EAAT – транспортер глутамата. Объяснения в тексте.

Все ионотропные рецепторы Глу имеют одинаковую топологию строения, и являются мембранными протеинами, которые состоят из четырх частей, образующих ионный канал. Субъединицы включают в себя четыре домена (рис.

1.2.а): внеклеточный N-терминальный домен, внеклеточный лиганд-связывающий домен, C-терминальный домен и трансмембранный домен, включающий в себя три сегмента и одну возвратную петлю (Sobolevsky et al., 2009). Различные типы рецепторов Глу сформированы различными сочетаниями субъединиц. Так AMПA рецепторы состоят из четырех видов субъединиц, KA рецепторы и NMDA рецепторы – из пяти (Dingledine et al.,1999).

1.2.1 АМПА/KA–ионотропные рецепторы глутамата АМПА/KA рецепторы обладают гораздо более быстрой кинетикой постсинаптических потенциалов. При этом открывание ионных каналов АМПА/KA рецепторов не зависит от величины мембранного потенциала. Такие каналы относятся к потенциал-независимому типу и опосредуют потенциалнезависимое возбуждение в нейрональных синапсах. АМПА рецепторный ионный канал может состоять из четырех различных субъединиц (GluA1–GluA4), в то время как KA рецептор может состоять из пяти различных типов субъединиц (GluK1–GluK5).

Рисунок. 1.2. Структура АМПА рецептора. (а) Структура субъединицы АМПА рецептора. (б) АМПА рецептор как тетрамерный комплекс, состоящий из четырех субъединиц GluR1,3,4 и GluR2.

Природный канал АМПА рецептора представляет собой тетрамерную структуру, состоящую из четырех субъединиц GluA1 – GluA4, каждая из которых состоит из N-терминального домена, формирующего конструкцию рецептора, трансмембранных доменов (M1, M3 и M4), возвратной петли (M2), соединяющей пору канала с цитоплазматическим C-терминальным доменом, который влияет на транспорт канала (рис. 1.2.а). Считается, что гетеромерный рецептор состоит из двух GluA2 субъединиц и двух других GluA1, GluA3 или GluA4 (рис. 1.2.б) (Mansour et al., 2001; Greger et al., 2003; 2007; Isaac et al., 2007). Q/R-сайт, локализованный в поре канала над M2 доменом, оказывает сильное влияние на биофизические свойства АМПА рецептора, изменяя проводимость канала для двухвалентных катионов и его чувствительность к полиаминам (Jonas, Burnashev, 1995, Hume et al., 1991; Blaschke et al., 1993; Washburn, Dingledine, 1996). Q-сайт представлен глутамином и находится в GluA1, GluA3 и GluA4 субъединицах, Rсайт представлен аргинином только в GluA2 субъединице (рис.1.2.б). АМПА рецепторы, не включающие в свой состав GluA2, обладают проводимостью для Ca2+ и легко блокируются эндогенными внутриклеточными полиаминами (например, спермином). Каналы рецепторов, имеющих GluA2 субъединицу, пропускают только Na+ и K+, и нечувствительны к полиаминам. Таким образом, чувствительность к полиаминам, с последующим блокированием рецептора, определяется отсутствием или наличием GluA2 субъединицы (Washburn et al., 1997; Fleming, England, 2010).

KA рецепторы имеют пять типов субъединиц GluK1 – GluK5, кодируемых генами GRIK1–GRIK5 соответственно (Dingledine et al.,1999). Структурно KA рецептор представляет собой комплекс, состоящий из четырех субъединиц.

Важно, что субъединицы GluK4 и GluK5 могут формировать функциональный рецептор лишь в присутствии одной из GluK1-GluK3 субъединиц (Dingledine et al.,1999). Рецепторы KA, подобно АМПА рецепторам, имеют N-терминальный домен, лиганд-связывающий домен, сегменты M1–M4, включая возвратную петлю (M2). Ионный канал, сформированный KA рецептором, проницаем только для Na+ и K+. Открывание канала KA рецептора происходит быстрее, чем канала АМПА рецептора (Huettner 2003). В отличие от АМПА рецепторов, KA рецепторы играют второстепенную роль в передаче сигнала. Скорее, рецепторы KA принимают большее участие в синаптической пластичности (Contractor et al., 2000; Trussell, Fischbach, 1989).

Физиологическая роль рецепторов не-NMDA типа изучена не так хорошо, как NMDA рецепторов, что объясняется отсутствием широкого набора специфических агонистов и антагонистов АМПА/КА типа рецепторов. KA является смешанным агонистом KA и АМПА рецепторов, при этом активируя, он не вызывает десенситизацию АМПА рецепторов (Kiskin et al., 1986). Из наиболее известных конкурентных антагонистов АМПА/KA рецепторов можно назвать CNQX (6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион), который селективно блокирует их в присутствии в среде глицина (Гли). Это происходит из-за большего сродства CNQX к Гли-связывающему сайту в NMDA рецепторно-ионофорном комплексе, чем в АМПА/KA рецепторе.

Впервые с использованием аргиотоксина636 (Herlitze et al., 1996), он же – аргиопин (Гришин и др., 1986; Магазаник и др., 1986; Antonov et al., 1987), было показано, что эффективность блокады каналов АМПА рецепторов также, как и Ca2+ проводимость, определяется отсутствием в структуре рецептора GluА субъединицы. В частности, если в состав АМПА рецептора входит GluА2, то канал непроницаем для Ca2+ и все каналоблокаторы неэффективны. Эти закономерности справедливы для ИЭМ-1460 – блокатора Са2+ проницаемых АМПА рецепторов, не содержащих GluA2 субъединицу (Antonov et al., 1995;

Antonov et al., 1998; Магазаник и др., 1984). Этот блокатор с ЕД50 около 1 мкМ блокирует канал Ca2+-проницаемых АМПА рецепторов (Magazanik et al., 1997).

Для блокады каналов NMDA рецепторов и Ca2+-непроницаемых АМПА рецепторов необходимы более чем на порядок большие концентрации ИЭМ- (Magazanik et al., 1997; Antonov, Johnson, 1996).

Известно, что разные типы нейронов коры и гиппокампа экспрессируют AMПA рецепторы различного субъединичного состава. В частности, пирамидные нейроны коры и гиппокампа экспрессируют AMПA рецепторы, содержащие GluА2, а вставочные нейроны – АМПА рецепторы, не содержащие GluА (Samoilova et al., 1999). Использование избирательных блокаторов АМПА рецепторов позволяет соотнести типы действия ИЭМ-1460 на внутриклеточный Ca2+ сигнал, вызванный гиперактивацией АМПА рецепторов с помощью КА, с морфофункциональными типами нейронов коры (Angulo et al., 1997; Kondo et al., 1997; Kumar et al., 2002).

Для исследования нейротоксического действия Глу и агонистов широко применяются первичные культуры ткани. Однако вопрос гетерогенности в отношении эксспресии рецепторов Глу в нейронах первичной культуры коры мозга остается неясным и является одной из задач данной работы. Этот вопрос является принципиально важным с точки зрения нейробиологии, так как до сих пор не известно, сохраняют ли клетки в культуре ткани исходный субъединичный состав рецепторов Глу на плазматической мембране. К тому же мало изучена Са 2+ регуляция при действии КА, как агониста АМПА/КА рецепторов. Этот вопрос также является предметом исследования данной работы.

1.2.2 NMDA-чувствительные ионотропные рецепторы глутамата NMDA рецептор включает в свой состав: сайт специфического связывания медиатора (Глу) в лиганд-связывающем домене, сайт связывания коагониста (Гли) и аллостерические модуляторные сайты, расположенные во внеклеточной области рецептора и в ионном канале (сайты связывания двухвалентных катионов и потенциалзависимый Mg2+-связывающий участок). Показано, что NMDA рецептор является гетеромерной структурой, состоящий из субъединиц трех типов: GluN1, GluN2A – GluN2D, GluN3A – 3B. Один рецептор всегда состоит из четырех субъединиц, при этом GluN1 субъединица является необходимой для формирования рецептора, так как при ее отсутствии рецептор не способен активироваться (Pachernegg Структурные различия субъединиц определяют функциональную гетерогенность NMDA рецепторов в различных нейрональных клетках (Pachernegg et al., 2012). Более того, соотношение субъединиц, входящих в состав рецепторного комплекса, может изменяется с возрастом и в зависимости от степени активности синапсов.

Все субъединицы NMDA рецепотра расположены в мембране одинаково.

Каждая субъединица имеет три трансмембранных домена (М1, М3 и М4), и один внутримембранный домен М2, N-терминальный домен, расположенный внеклеточно, и внутриклеточный С-терминальный домен. В образовании канала рецептора участвуют М2 домены четырх субъединиц (рис. 1.3). Сайт связывания Глу находится на двух доменах, расположенных на N-терминальном домене перед М1 доменом и на М3–М4 петле, соответственно, причем эти домены принадлежат GluN2 субъединицам. Те же самые места на субъединицах GluN1 и GluN3 типа служат местом связывания (Гли) (Pachernegg et al., 2012). В зависимости от субъединичного состава NMDA рецепторы могут приобретать различные свойства. Например, NMDA рецепторы с GluN2A cубъединицей, десенситизируются быстрее, чем рецепторы, содержащие GluN2D субъединицу.

Основным молекулярным механизмом, который ограничивает длительность постсинаптического сигнала, является десенситизация рецепторов Глу. Более того, все ионотропные рецепторы Глу различаются по кинетическим параметрам десенситизации. Известно, что NMDA рецепторы переходят медленно в десенситизированное состояние, при этом описано множествомеханизмов их десенситизации. В отличие от NMDA рецепторов, АМПА/KA рецепторы переходят в десенситизированное состояние быстро, при этом их десенситизации больше (Dingledine et al., 1999). Известно, что в зависимости от скоростей открытия и закрытия каналов рецепторов Глу, десенситизация может увеличивать или уменьшать длительность синаптических токов (Jones, Westbrook, 1996;

Johnson, Ascher, 1987).

Большую роль в функциионировании ионотропных рецепторов Глу играют пост-трансляционные модификации, наиболее важной из которых является фосфорилирование рецепторных субъединиц. Известно, что в мозге млекопитающих 10 – 70 % GluN1 и GluN2 субъединиц NMDA рецепторов фосфорилированы по нескольким сайтам. В основном именно изменение соотношения фосфорилированых и нефосфорилированых субъединиц определяет возможности регуляции глутаматергической синаптической передачи (Dingledine et al., 1999).

связывающим сайтом NMDA рецептора, называют агонистами и конкурентными антагонистами NMDA рецептора. А соединения, блокирующие канал NMDA рецептора назвают неконкурентными антагонистами. Агонистами Глу связывающего сайта NMDA рецептора кроме Глу являются сам NMDA, иботеновая кислота, аспартат и другие. Антагонистам конкурентного типа взаимодействуют с местами связывания Глу, предотвращая активацию рецептора (Калинина и др., 1989).

NMDA рецептор, помимо сайта связывания для Глу, имеет специфический сайт связывания для коагониста Гли, который взаимодействует с рецептором при низких концентрациях - ЕС50 составляет 10 – 30 мкМ (Jоhnsоn, Ascher, 1987; Sinоr et al., 2000). Известно, что связывание Гли с GluN1 субъединицей увеличивает вероятность активации NMDA рецептора, при этом уменьшеется скорость десенситизации. Более того, в малых концентрациях (1 – 10 мкМ) Гли увеличивает амплитуду токов, вызванных активацией NMDA рецепторов. В отсутствие Гли рецепторы NMDA типа активируются слабо или не активируется Глу вовсе. Известно, что агонистом сайта связывания Гли на NMDA рецепторе является эндогенный D-серин. Одним из эндогенных антагонистов, для сайта связывания Гли является кинуриновая кислота, которая синтезируется в глиальных клетках. Эффект блокады кинуриновой кислотой NMDA-вызванных токов может быть снят за счет добавления Гли или D-серина.

Важно, что в отличие от других ионотропных рецепторов Глу, каналы рецепторов являются потенциалозависимыми. Так при обычном NMDA потенциале покоя (от -70 мВ до -80 мВ) NMDA практически не вызывает входящие токи. При увеличении потенциала покоя токи значительно возрастают и достигают максимума при мембранном потенциале от -30 до -20 мВ. Прежде всего, это связано с тем, что при потенциале покоя -70 мВ, канал NMDA рецептора, независимо от открытия канала, блокирован ионами Mg2+(Mayer et al., 1984; Nоwak et al., 1984; Antоnоv, Jоhnsоn, 1999). При деполяризации мембраны сродство Mg2+ к каналу NMDA рецептора снижается и канал в отсутствии Mg2+ обретает способность проводить ионы Na+ и Ca2+ в нейрон (Mayer et al., 1984;

Nоwak et al., 1984). Механизм блокирующего действия Mg2+ заключается в том, что Mg2+ взаимодействует с специальным сайтом связывания, препятствуя прохождению других ионов через канал. Обычно, в дальнейшем Mg2+ диссоциирует обратно во внеклеточный раствор. Место связывания наружного Mg2+ расположено достаточно глубоко в области трансмембранной поры рецептора, на которой происходит полное падение мембранного потенциала. В результате сродство наружного Mg2+ к его месту связывания в канале зависит от мембранного потенциала: чем отрицателее мембранный потенциал, тем выше сродство Mg2+ и эффективность его блока канала. Таким образом, можно сказать, что Mg2+ является одним из важнейших эндогенных модуляторов. Известно, что наружный Mg2+ способен потенцировать активность NMDA рецептора, как повышая сродство Гли к рецептору (Antоnоv, Jоhnsоn, 1999; Wang, MacDоnald, 1995), так и посредством Гли–независимого механизма (Paоletti et al., 1995). В определенных условиях Mg2+ также проникает через каналы NMDA рецептора (Antоnоv, Jоhnsоn, 1999; Mayer, Westbrооk, 1987). Поскольку в условиях патологии происходит существенное изменение нормальных ионных градиентов, регуляция эффективности блока наружным Mg2+ может иметь существенное значения для функционирования нейронов и нейрональных сетей.

Часто, активация NMDA рецепторов приводит к деполяризации нейронов, так как открытые каналы рецепторов способные проводить ионы Na+. Более того, каналы NMDA рецепторов обладают проницаемостью для ионов Са2+, которые по электрохимическому градиентувходят в нейрон при активации NMDAрецепторов, что является весьма существенным для функционирования ЦНС в целом (Burnashev et al., 1992). Известно, что канал NMDA рецептора имеет несколько последовательных сайтов связывания для ионов Mg2+, Са2+ и Zn2+, которые являются наиболее значимыми эндогенными регуляторами рецепторов Глу (Antоnоv et al., 1998).

Кроме Mg2+ в регуляции работы NMDA рецепторов также участвуют ионы Zn2+, которые снижают деполяризацию мембраны, вызванную активацией NMDA рецепторов в центральных нейронах (Christine, Chоi, 1990). Одним из отличий в механизмах действия Mg2+ и Zn2+ является расположение точек действия ионов:

точка связывания для Zn2+ находится рядом с участком связывания Глу, во то время как точка связывания Mg2+ находится глубоко внутри канала. Также известно, что синаптические пузырьки глутаматергических нервных окончаний содержат кроме Глу ионы Zn2+, которые высвобождаются вместе с медиатором в синаптическую щель во время передачи нервного импульса.

Если АМПА рецептор и NMDA рецептор колоколизованы, Глу активирует АМПА рецептор, вызывая локальную деполяризацию постсинаптической мембраны, и как следствие приводит к снятию Mg2+ блока каналов NMDA рецептора. Общий возбуждающий постсинаптический ток приобретает более медленный временной ход и сопровождается входом Ca2+ в клетку (Магазаник, 2004). При увеличении поступленя Ca2+ в цитоплазму нейрона может происходить потенциация рецепторов Глу за счет их фосфорилирования. Однако если стимуляция рецепторов будет чрезмерно длительной, то в клетке будут включаться механизмы апоптоза, вызванные увеличением накопления свободного Ca2+, которое способно индуцировать процессы образования активных форм кислорода (АФК).

Таким образом, NMDA рецепторы способны пропускать ток только в результате деполяризации постсинаптической мембраны, которая в физиологических условиях следует за стимуляцией АМПА рецепторов и приводит к разблокированию NMDA канала. Эта уникальная особенность NMDA рецепторов и их высокая проницаемость для Ca2+ позволяют рецепторам Глу NMDA типа играть важную роль в ЦНС, участвуя в таких функциональных процессах, как синаптическая пластичность, обучение, формирование памяти, развитие мозга в эмбриогенезе.

В середине 1980-х, было открыто существование не образующих ионный канал рецепторов Глу – метаботропных рецепторов, которые могут стимулировать продукцию инозитол-1,4,5-трифосфата (Sladeczek et al., 1985;

Sugiyama et al., 1987). Это открытие привело к разделению рецепторов Глу на два типа: ионотропные и метаботропные рецепторы Глу. На данный момент открыто и клонировано 8 подтипов метаботропных рецепторов Глу, которые относятся к С-классу G-белок-связанных рецепторов (GPCR, G-protein coupled receptor).

Подтипы метаботропных рецепторов Глу по фармакологии, по сходствам в механизмах связывания Глу и по гомологии первичных последовательностей подразделяют на три группы: I группа метаботропных рецепторов Глу (mGluR1 и mGluR5 субъединицы), имеет GqPCR, II группа (mGluR2 и mGluR3 субъединицы) и III группа (mGluR4, mGluR6, mGluR7, mGluR8) метаботропных рецепторов Глу имеет Gi/o-белок-связанный рецептором (Conn, Pin, 1997).

Рисунок 1.4.1. Структура метаботропного рецептора глутамата. 7ТМ – семь спиральных трансмембранных доменов (Conn, Pin, 1997; Kunishima et al., 2000).

GPCR рецептор представляет собой интегральный транс-мембранный белок, содержащий 7 спиральных доменов. Он состоит из пяти основных доменов: N-терминальный домен, лиганд связывающий домен, состоящий из двух частей, цистеин-обогощенный внеклеточный домен, семиспиральный трансмембранный (7ТМ) домен, связанный с трипептидом, образующим G-белок и С-терминальный домен (рис. 1.4.1). Результаты кристаллографических исследований показали, что внеклеточная часть метаботрапного рецептора Глу содержит две глобулярные доли, разделенные небольшой щелью, которые образуют ортостерический лиганд-связывающий домен (Kunishima et al., 2000).

Несмотря на то, что Глу является первичным лигандом для данного сайта, важно, что большинство возбуждающих аминокислот нервной ткани также могут взаимодействовать с данным сайтом связывания (Conn, Pin, 1997). Было выявлено, что 7ТМ домен тоже содержит аллостерический сайт связывания лиганда (Kunishima et al., 2000). Вторичная внутриклеточная петля 7ТМ домена обладает избирательностью и может взаимодействовать с G-белком, а третичная петля, имеющая консервативную первичню структуру, играет решающую роль в активации этого G-белка. Взаимодействие между первичной, третичной петлей и С-терминальным доменом регулирует эффективность связывания рецептора с Gбелком. C-терминальный домен играет ключевую роль в трафике метаботропного рецептора Глу и регуляции его работы (Grueter, Winder, 2009).

Метаботропные рецепторы Глу I группы функционально связаны с внутриклеточными сигнальными молекулами, в частности, со скаффолд белками (scaffold proteins) семейства Homer, которые связывают С-терминальный домен рецептора с инозитол-трифосфатным (IP3) рецептором (Nanou et al., 2009;

Sylantiev et al., 2013). В частности, все больше авторов сообщают о возможном регулировании метаботропными рецепторами Глу I группы рецепторов NMDA и АМПА типа через семйество белков Homer, активирующих протеинкиназы С (PKC) (Yu et al., 1997; Alagarsamy et al., 2001; Lea et al., 2002; Nanou et al., 2009;

Auger, Ogden, 2010; Bertaso et al., 2010; Moutin et al., 2012; Sylantiev et al., 2013).

Активация метаботропных рецепторов Глу I группы (mGluR1 и mGluR субъединицы) приводит к активации фосфолипазы С и запуску гидролиза фосфоинозитолов, с последующим выходом Са2+ из внутриклеточных депо за счет активации IP3 рецепторов ЭПР и активации PKC (рис. 1.4.2) (Nanou et al., 2009).

Метаботропные рецепторы Глу II группы (субъединицы mGluR2 и mGluR3), умеренно экспрессированы в таких структурах мозга, как гиппокамп, префронтальная кора и миндалевидная железа, которые ассоциированны с развитием тревожными расстройств. Наиболее часто метаботропные рецепторы Глу II группы функционируют на пресинапсе, регулируя выброс медиатора в синаптическую щель, за счет ингибирования потенциал-зависимых Са2+ каналов (Grueter, Winder, 2009).

Рисунок 1.4.2. Механизм регуляции внутриклеточного Са2+ при активации метаботропных рецепторов глутамата I группы. PLC – фосфолипаза С, PIP2 – фосфатидилинозитол-дифосфат, DAG – диацилглицерол, PKC – протеинкиназа С, IP3 – инозитол-трифосфат, IP3R – инозитолтрифосфатный рецептор.

Как и II группа, III группа метаботропных рецепторов Глу связана с ингибированием продукции цАМФ и модулированием ионных каналов. Однако в отличие от других групп, III группа, в первую очередь, экспрессирована в пресинаптическом окончании и уменьшает выделение нейромедиатора, тем самым снижая эффективность глутаматергической или ГАМК-ергической синаптической передачи (Grueter, Winder, 2009).

Известно, что метаботропные рецепторы Глу экспрессированы во многих тканях ЦНС. Однако результаты последних лет демонстрируют, что данный тип рецепторов Глу также экспрессирован в нейронах ПНС (Turman et al. 2002;

Carlton, Hargett, 2007; Lee, Ro, 2007), где их роль пока остается неясной. Вопрос вовлеченности метаботропных рецепторов Глу в нейрональные механизимы токсичности в клетках ПНС является одной из задач данного исследования.

Несмотря на то, что в Глу является оснвным возбуждающим медиатором ЦНС, в условиях чрезмерной активации его рецепторов могут наблюдаться процессы, приводящие к гибели нейронов. Данный процесс получил название «эксайтотоксичность» (от англ. «excitotoxicity» – токсичность, развивающаяся при возбуждении). Известно, что эксайтотоксичность участвует в патогенезе многих нейродегенеративных расстройствах и связана с накоплением Са2+ в цитозоле нейронов (Choi, 1995). Более того, известно, что образование свободных радикалов, вызванное накоплением способствует усилению нейротоксического действия эндогенного Глу (Stout et al., 1998; Nicholls, Budd, 2000; Vergun et al., 2001).

В условиях нормального функционирования организма гибель нейронов в основном осуществляется по механизму апоптоза. Другой механизм гибели клеток – некроз, который характеризуется быстрым увеличением клетки и нарушением целостности плазматической мембраны. Оба механизма клеточной гибели могут быть вызваны факторами, которые вызывают нарушения в функционировании клеток. Для клеток ЦНС такими факторами являются энергетическая депривация, недостаток кислорода (ишемия) и перевозбуждение (Choi, 1992; Lipton, 1999).

В большинстве случаев, нарушение функционирования синаптической передачи связано со значительным изменением концентрационных ионных градиентов внутри и снаружи нейронов: увеличение концентрации Na+ и существенное снижение концентрации K+ внутри клеток (Choi 1987). Так как направление транспорта переносчиков Глу зависит от содержания ионов Na+ и K+ снаружи и внутри нейронов, вместо захвата медиатора из наружного раствора происходит освобождение Глу за счет реверсии транспорта (Antonov, Magazanik, 1988; Антонов, Магазаник, 1989; Szatkowski et al., 1990). Показано, что данный механизм освобождения Глу задействован в условиях энергетической депривации (Rossi et al., 2000). Подобные нарушения приводят к увеличению свободной концентрации Глу в межклеточном пространстве. К постсинаптическим факторам нейродегенерации относятся: активация рецепторов Глу с последующей деполяризацией мембраны нейронов, нарушение мембранных ионных градиентов и приток Ca2+ в нейроны, который запускает внутриклеточные каскады, приводящие к гибели клетки (Khodorov, 2004). В дальнейшем эти процессы могут привести к нейродегенерации, которая инициирует гибель нейронов по механизму апоптоза и некроза (Mironova et al., 2007; Sibarov et al., 2012).

Огромное количество заболеваний является следствием цитотоксичности Глу. К ним относятся болезни Паркинсона, Альцгеймера, Гентингтона, шизофрения, судорожный синдром, включая эпилепсию, гипоксии различного происхождения (Meldrum, 1993). При гипоксии большой выход Глу за счет реверсии транспорта вызывает повышение его внеклеточной концентрации, и как следствие, генерацию деполяризации с последующей дисфункцией нейронов (Lipton, 1999). Считается, что протекание шизофрении частично связано со снижением эффективности глутаматергической передачи за подавления фенциклидина, блокирующего NMDA рецепторы, приводило к возникновению симптомов этого заболевания. Было показано, что нарушения функции NMDA рецепторов коррелируют с ментальными расстройствами, наблюдаемыми у больных шизофренией (Parsons et al., 1998).

Известно, что нейротоксическому действию Глу наиболее подвержены нейроны лобных долей коры мозга и гиппокампа (Khodorov, 2004). В связи с этим нейроны коры мозга крыс в первичной культуре являются удобным объектом для исследования нейротоксических механизмов, вызванных гиперактивацией рецепторов Глу. Поскольку нарушения функционирования глутаматергичеких систем участвует в патогенезе многих заболеваний ЦНС исследование эксайтотоксичности Глу является актуальной задачей не только для фундаментальной науки, но и для практической медицины.

1.4. Глутамат-индуцированная дисрегуляция кальциевого баланса клетки В настоящее время известно, что токсическое действие Глу приводит к нарушению ионного баланса клетки, который в свою очередь, инициирует митохондриальную дисфункцию, приводящую к гибели нейрона (Khodorov, 2004). Было показано, что активированные рецепторы Глу открывают ассоциированные с ними ионные каналы, через которые в нейрон поступают ионы Na+ и Са2+, а в межклеточное пространство выходят ионы К+. Вход Na+ в нейроны приводит к деполяризации мембраны и Са2+ начинает поступать в клетки через потенциалзависимые Са2+-каналы (Choi, 1985). При активации рецепторов Глу Са2+ поступает в цитоплазму также из эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и митохондрий (DiPolo, Beauge, 1988). Выход Са2+ из ЭПР, в частности, вызывается инозитолтрифосфатом (Sladeczek et al., 1985), который образуется в результате активации фосфоинозитидного обмена под влиянием взаимодействия Глу с метаботропным рецептором пятого типа (мГлуР5) (Rae et al., 2000).

обеспечивающие быстрое и своевременное восстановление [Ca2+]i в условиях кратковременного действия Глу. Они включают в себя 3 этапа (рис.1.5):

• удаление Ca2+ из нейрона Ca2+-АТФазой и Na+/Ca2+-обменником;

• захват Ca2+ митохондриями и ЭПР;

• захват Ca2+ в цитозоле Ca2+-связывающими белками.

Ранее была показана взаимосвязь между токсическим действием возбуждающих аминокислот и накоплением внутриклеточного гиперактивации рецепторов NMDA типа (Hartley et al., 1993; Eimerl, Schramm, 1994). Если в норме концентрация свободного Ca2+ в цитоплазме ниже 0,1 мкМ, то после активации рецепторов Глу нейронов концентрация этого иона может составлять 8–16 мкМ (Brustovetsky, Dubinsky, 2002). Тогда же было выявлено, что нейроны при глутаматной стимуляции накапливают Са2+ в митохондриях (Khodorov 1996; White, Reynolds, 1995). Эти органеллы в присутствии избытка фосфата могут аккумулировать 200 нМ Са2+/мг собственного белка (Nicholls, Scott, 1980). Накопление Са2+ митохондриями зависит от мембранного потенциала этих органелл, что указывает на электрогенный характер транспорта Са2+ в митохондриях. Таким образом, мембранный потенциал митохондрий может рассматриваться как фактор, вносящий вклад в регуляцию концентрации Са2+ в цитоплазме нейрона, что должно наблюдаться и в условиях активации рецепторов Глу.

Рисунок 1.5. Механизмы, поддерживающие ионный баланс Са2+ в нейронах.

Предполагается, что развитие глутаматной токсичности непосредственно связано со способностью митохондрий депонировать Са2+ (Budd, Nicholls, 1996;

Nicholls, Budd, 2000; Stout et al., 1998; Vergun et al., 2001). Учитывая тот факт, что на цитоплазматической стороне NMDA рецептора существуют участки для связывания Са2+ (Bindokas, Miller, 1995), при попадании Са2+ на эти участки происходит инактивация NMDA-каналов. Митохондрии находятся вблизи этих Са2+-связывающих центров и могут активно перехватывать эти ионы, понижая локальную концентрацию Са2+ рядом с местами связывания и, таким образом, предотвращает накопление Са2+ в других участках тела нейрона в условиях активации NMDA-каналов, что ведет к Ca2+ «перегрузке» сначала цитоплазмы, а впоследствии и митохондрий. Считается, что в нормальных физиологических условиях захват Са2+ митохондриями может быть необходимым условием предупреждения преждевременной инактивации NMDA-каналов (Nicholls, Budd, 2000).

Высокая [Ca2+]i является обязательным условием гибели нейронов, вызванной гиперстимуляцией NMDA рецепторов, при наличии электрогенного транспорта Са2+ в митохондриях (Stout et al., 1998). Это указывает на определяющую роль митохондрий в инициации гибели нейронов при глутаматной токсичности. Видимо, именно вызванная кальциевой «перегрузкой» дисфункция митохондрий, требующая функционирования дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования, является ключевым моментом инициации гибели нейронов.

Литературные данные, полученные за последнее десятилетие, позволяют схематично представить предполагаемую последовательность событий при гиперактивации рецепторов Глу, приводящей к нарушению ионного баланса нейронов (рис. 1.6). Первоначально массивный вход Са2+ и Na+ в цитоплазму нейрона вызывает митохондриальную деполяризацию (МД) за счет захвата Са2+ и его депонированием митохондриями. Вторичная МД, или отсроченная кальциевая дисрегуляция (ОКД), наступает тогда, когда уровень концентрации Са2+ в митохондрии достигает критического уровня. Затем происходит падение митохондриального мембраного потенциала (mit) и открытие PT-поры, через которую осуществляется выход AIF (апоптоз индуцирующего фактора).

Постепенно Са2+ накапливается в цитоплазме – происходит вторичное возрастание [Са2+]i, которое совместно с МД, супрессией Са2+/Н+-помпы на митохондриях и ингибированием Na+/Са2+-обменника, приводит к ухудшению удаления Са2+ из клетки. При этом вторичная МД также вызывает дефицит АТФ за счет гидролиза и ингибирования е синтеза. В ответ на повышение [Са 2+]i и [Nа+]i Са2+-помпа и Na+/Са2+-обменник также стимулируют потребление АТФ митохондриальная дисфункция приводят к закислению внутриклеточной среды и образованию АФК, которые индуцируют гибель нейрона (рис. 1.6) (Khodorov, 2004).

Рисунок 1.6. Схематичное представление предполагаемой последовательности событий при гиперактивации рецепторов глутамата, приводящей к нарушению ионного баланса нейронов 1.5. Рецепторы глутамата в периферической нервной системе Общепризнано, что Глу является основным возбуждающим медиатором в ЦНС млекопитающих (Curtis et al., 1956). Однако было показано, что Глу участвует в передаче афферентного сигнала на периферии, тем самым демонстрируя вовлеченность в работу ноцицептивных и других сенсорных проводящих путей (Carozzi et al., 2008; Collingridge et al., 2010; Kung et al., 2013).

Повсеместное распространение Глу в ЦНС и ПНС затрудняет решение вопроса о конкретной функции Глу, функциональной роли его рецепторов и глутаматергической передачи в различных тканях организма. Было показано, что сенсорные нейроны, участвующие в ноцицепции, могут синтезировать Глу и экспрессировать рецептор Глу (Wanaka et al., 1987; Kearst, Stephensen, 2000), и тем самым обеспечивать глутаматергическую передачу в ПНС. Активация этих нейронов приводит к высвобождению Глу в периферические и центральные терминали, тем самым участвуя в механизмах ноцицепции (deGroot et al., 2000;

Basbaum et al., 2009; Kung et al., 2013).

Множество исследований показали, что сома сенсорных нейронов экспрессирует ионотропные и метаботропные рецепторы Глу (Sato et al., 1993;

Carlton, Hargett, 2007; Willcockson, Valtschanoff, 2008). Более того, нейроны сенсорного ганглия обладают такими ферментами, как глутаминаза, глутамин синтетаза (Miller et al., 2002; Ohara et al., 2009), везикулярным транспортером Глу (VGLUT 1, 2 и 3 типа), глутамат-аспартатным транспортером – GLAST и транспортером Глу – GLT1 (Oliveira et al., 2003; Carozzi et al., 2008; Yang et al., 2013), обеспечивающими продукцию, высвобождение и утилизацию Глу клеткой.

Однако поскольку сомы сенсорных нейронов в перферических ганглиях не имеют синапсов, вопрос механизмов действия Глу в сенсорном ганглии пока остается открытым.

амиотрофический склероз и мигрень в первую очередь происходит в тканях ПНС, и связаны с увеличением активности глутаматеригической системы как в ПНС, так и ЦНС. В качестве модели для исследования механизмов нейродегенерации в тканях ПНС наиболее часто используют первичную культуру спиномозгового ганглия и первичную культуры нейронов тригеминального ганглия, обладающую в основном сенсорными нейронами (Malin et al., 2007). Тригеминальный ганглий ассоциирован с V ветвью черепно-мозгового нерва, расположенной в основании черепа, и входит в состав тройничного нерва. В тригеминальном ганглии заложены первые чувствительные нейроны тройничного нерва, дендриты которых образуют сам тройничный нерв, а аксоны идут к телам вторых нейронов, заложенных в мозговом веществе ствола мозга. Нейроны тригеминального ганглия передают болевые ответы от тканей головы, в частности от кожи, слизистых оболочек, пульпы и оболочек головного мозга. Большинство сенсорных нейронов тригеминального ганглия являются пуринергичесими, пептидергическими и модулируются серотонином. В основном, ноцицептивные нейроны экспрессируют P2X3 рецепторы, активируемые АТФ, и капсаицин чувствительные TRPV1 рецепторы (Simonetti et al., 2006). Так же в нейронах тригеминального ганглия были выявлены рецепторы Глу NMDA типа (GluN2A, GluN2B) и метаботропные рецепторы Глу I группы (Turman et al., 2002; Lee, Ro, 2007; Willcockson, Valschanoff, 2008; Lo, Zhao, 2011). Однако роль рецепторов Глу в тканях ПНС, и в частности, в нейронах тригеминального гаглия пока остается неясной и является одним из вопросов данной работы.

1.6. Гомоцистеин, как эндогенный агонист рецепторов глутамата Гомоцистеин (2-амино-4-меркаптобутановая кислота, ГЦ) – аминокислота, в норме принимающая участие в синтезе метионина и цистеина, с последующим образованием глутатиона внутри клетки. Увеличение концентрации ГЦ в плазме гипергомоцистеинемия, и может быть классифицировано как умеренная (16- мкМ), средняя (30-100 мкМ) и сильная (>100 мкМ) гипергомоцистеинемия (Shi et al., 2002). На сегодняшний день известно, что умеренная гипергомоцистеинемия вовлечена в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний (Brattstrom, Wilcken, 2000; Ueland et al., 2000) и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона (Kuhn et al., 2001; Kruman et al., 2002; Sachdev, 2005; Boldyrev, Johnson, 2007), шизофрения (Levine et al., 2002), боковой амилотрофический склероз (Zoccolella et al., 2012). Гипергомоцистеинемия может быть вызвана дефицитом фолиевой кислоты, витаминов группы B (Stabler et al., 1988; Joosten et al., 1993; Sachdev, 2005; Ganapathy et al., 2011) или генетически обусловленным полиморфизмом – точечной мутации, приводящей к замене цитозина (С) на тимин (Т) в нуклеотиде (C677T) гена 5’-10’метилентетрагидрофолат редуктазы (Rozen 1997; Isobe, Terayama, 2010).

Особенно важно, что данный полиморфизм вовлечен в патогенез мигрени с аурой (Lea et al., 2009; Oterino et al., 2010) – комплексного неврологического расстройства, развивающееся в тригеминально-сосудистой системе (ПНС) и в нейротоксический эффект ГЦ интенсивно изучается в нейронах ЦНС (Sachdev, 2005; Poddar, Paul, 2013), однако механизм его действия в ПНС остается неизвестным.

Сейчас общепринято, что мигрень ассоциирована с распространяющейся корковой депрессией (Гиниатуллин, 2011; Moskowitz, 2007). Обычно увеличение возбудимости мозговых тканей при мигрени с аурой обусловлено избытком Глу во внеклеточном пространстве (Pietrobon, Moskowitz, 2013). Глу, активируя деполяризации и потенциально к нейротоксичности. Так наиболее важными в генерации распространяющейся корковой депрессии являются NMDA рецепторы (Chavel et al., 2012). Традиционно принято считать, что NMDA рецепторы экспрессированы в нейронах ЦНС, однако исследования последних десятилетий показали, что данный тип рецепторов может быть экспрессирован и в некоторых типах нейрональных клеток ПНС (Turman et al., 2002; Lee, Ro, 2007; Willcockson, Valschanoff, 2008; Lo, Zhao, 2011). Из числа метаботропных рецепторов Глу, наиболее распространенных в клетках ЦНС считается мГлуР5 рецептор (Lee, Ro, 2007; Parpura, Verkhratsky, последних лет показали важную роль периферических NMDA рецепторов в проведении хронической боли (Zhou, Sheng, 2013). Так, избирательные антагонисты NMDA рецепторов могут применяться для подавления боли, вызванной воспалительной реакцией (Carlton, 2001). С этим также согласуются результаты нескольких исследований, которые обнаружили экспрессию NMDA и мГлуР5 рецепторов в тканях ПНС (Turman et al. 2002; Lee, Ro, 2007). Существует лишь несколько электрофизиологических исследований, показавших взаимодействие ГЦ с Глу-связывающим сайтом NMDA рецептора (Lipton et al., 1997; Ganapathy et al., 2011). В связи с этим данный подтип рецепторов может быть рассмотрен в качестве потенциальной мишени для высоких концентраций ГЦ (Poddar, Paul, 2013). Другие исследования показали, что ГЦ также может взаимодействовать с I группой метаботропных глутаматных рецепторов (Shi et al., 2003; Yeganeh et al., 2013). Так же, возможно, что мГлуР5 могут быть «промотером» активации NMDA рецепторов через фосфорилирование, зависимое от PKC (Sylantyev et al., 2013). Подобное взаимодействие между этими двумя типами рецепторов Глу в клетках ПНС и ЦНС открывает широкий диапазон для исследования механизмов нейродегенеративных и неврологических состояний.

Гиперактивация NMDA рецепторов часто ассоциирована с окислительным стрессом в нейронах (Tenneti et al., 1998; Reyes et al., 2012). С другой стороны, известно, что ГЦ может также инициировать окислительный стресс в некоторых экспериментальных моделях (Matte et al., 2004). Однако в эндотелиальных клетках ГЦ снижает окислительный эффект (Outien et al., 1998), а в некоторых исследованиях ГЦ проявляет восстанавливающие свойства (Perna et al., 2003;

Loureiro et al., 2010). Таким образом, вопрос участия ГЦ в окислительном стрессе остается открытым и является одной из целей данной работы.

РАЗДЕЛ 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДИКИ

2.1. Приготовление первичных культур нейронов С целью обеспечения стерильности во время приготовления нейрональных культур все манипуляции (препарирование, приготовление необходимых растворов, посев клеток и т.д.) осуществлялись в стерильном вертикальном ламинарном шкафу (ВЛ-12, РФ).

Все манипуляции с животными были выполнены в соответствии с международными стандартами и рекомендациями «Объединения специалистов по работе с лабораторными животными» (the Federation for Laboratory Animal Science Associations, Великобритания).

Животных усыпляли с использованием СО2 ингаляции (Ditcher 1978; LiSmerin et al., 1996) в специальной пластиковой камере. Углекислый газ подавался в камеру в течение 1 – 2 минут. Констатация смерти производилась по отсутствию сердцебиения у крыс. После остановки сердца животного ткань продолжает жить в течение нескольких минут, поэтому важно как можно быстрее извлечь необходимые ткани и провести все операции по получению клеток коры головного мозга и клеток тригеминального ганглия крыс, иначе процент погибших нейронов среди выделенных клеток будет очень большим.

Инструменты, используемые в опытах автоклавировали в настольном паровом стерилизаторе (ГК-10, РФ) при 120оС в течение 30 мин. Все среды для культивирования нейронов приготавливали в стерильных условиях. Каждый компонент среды предварительно фильтровали с помощью стерильных фильтров с диаметром поры 0,2 мкм (GyroDisc, Бельгия).

Подсчет клеток производился с использованием камеры Фукса-Розенталя.

Количество живых клеток оценивали с помощью теста на трипановый синий (Биолот, РФ). Раствор трипанового синего, приготовленный на физиологическом растворе, добавляли в суспензию клеток в соотношении 1:1 для получения его конечной концентрации 0,2 %. Исходя из количества живых клеток, производили необходимый подсчет объема среды для получения требуемой плотности культуры.

предварительно обработанные поли-D-лизином (Sigma-Aldrisht, США) в концентрации 0,2 мг/мл. Для выращивания культур использовали СО2-инкубатор (IG150, Jouan, Франция), поддерживающий постоянную температуру (37 оС) и содержание СО2 (5 %). Через каждые два дня ростовую среду в чашках Петри с культурами клеток заменяли на свежую.

2.1.1. Первичная культура нейронов коры головного мозга крыс Для того чтобы приготовить культуру нейронов определенного отдела головного мозга, необходима изоляция этой области на стадии эмбрионального развития, когда структура уже сформирована. Использование ранних стадий эмбрионального развития для приготовления культур нейронов приведет к тому, что культура не будет обладать структурной специфичностью, а также будет представлять собой неоднородную смесь нейронов различной химической специализации. К тому же головной мозг эмбрионов с небольшим сроком развития еще очень мал, что может создать методические трудности для выделения необходимого участка мозга и не обеспечит необходимого количества нейронов для проведения экспериментов. Именно поэтому, для получения первичной культуры нейронов коры головного мозга крыс использовали эмбрионы на 16 – 17 день пренатального развития. К этому сроку кора уже достаточно сформирована и может быть идентифицирована, однако нейроны находятся в процессе дифференцировки и обладают способностью выживать и дифференцироваться в искусственных условиях культивирования. Использование эмбрионов более поздних сроков или же новорожденных крысят сопряжено с дополнительными экспериментальными трудностями, а также с существенным понижением выживаемости клеток при их ферментативной диссоциации и культивировании.

использовали метод вагинальных мазков (Сахаров 1933; Кабак 1968; Эскин 1968).

Лабораторные грызуны (в т.ч. крысы) относятся к полиэстральным животным.

Эстральный цикл у крыс состоит из пяти последовательных стадий: проэструса, эструса, метэструса I, метэструса II и диэструса. Каждой стадии эстрального цикла соответствует определенный клеточный состав влагалищного мазка.

Используя данный метод, из группы крыс линии Вистар, отбирались самки на стадии проэструса – раннего эструса и вечером этого же дня подсаживались к самцам. Утром следующего дня производили анализ микроскопического содержимого вагинальных мазков на наличие сперматозоидов. Процедура повторялась до обнаружения сперматозоидов в мазке, данный день считался первым днем беременности животного (Детлаф 1975). На 16-17 день беременности крыс помещали в специальную пластиковую камеру и усыпляли с использованием СО2 ингаляции.

После извлечения эмбрионы очищали от всех оболочек и помещали в чашку Петри с раствором Хенкса. Выделенный головной мозг очищали от оболочек.

Выделение коры головного мозга эмбрионов производили при низких температурах (чашку Петри с раствором Хенкса ставили на сосуд со льдом) под микроскопом МБС-9 (ЛОМО, РФ) при 10 кратном увеличении. Необходимость использования льда, а также безтеплового источника света (использовались световоды) при выделении коры эмбрионов определяется тем, что низкая температура (около при препаровке обеспечивает максимальную выживаемость нейронов мозга. В ходе препарирования вначале удаляли мозжечок, затем одно полушарие отделялось от другого. После удаления мягкой оболочки головного мозга, хорошо видимую область дифференцирующейся коры отделяли и использовали для культивирования.

использованием трипсина (0,04 мг/мл; Sigma-Aldrich, США) в течение 45 мин.

Для остановки ферментативного процесса и образования конгломератов клеток использовали ингибитор трипсина (0,4 мг/мл; Sigma-Aldrich, США) и ДНКазу (0, мг/мл; Sigma-Aldrich, США). Далее клетки подвергали центрифугированию в течение 5 мин со скоростью 1500 об/мин с использованием низкооборотной центрифуги (В3.11, Jouan, Франция). Надосадочная жидкость, не содержащая клетки, удалялась. Затем клетки промывали чистым раствором Хенкса. Для полной остановки ферментативных процессов и отмывки применяемых препаратов эту операцию производили трижды.

Клетки культивировали в питательной среде (83 % DМЕМ с добавлением % эмбриональной телячьей сыворотки, 2,0 мМ глутамина, 5 % ростовой среды FмМ Hepes; Биолот, РФ) в 35 мм чашках Петри в объме 2 мл при начальной плотности посева 1.3x105 кл/мл. Клетки культивировали не менее дней, через каждые два дня среду в чашках Петри с культурами нейронов заменяли на свежую.

2.1.2. Первичная культура нейронов тригеминального ганглия крыс Для приготовления культуры клеток тригеминального ганглия крыс, необходима изоляция ганглия на 10 день постнатального развития, когда структура уже сформирована. Использование более ранних стадий развития для приготовления данного типа культуры приведет к тому, что культура не будет обладать необходимой структурной специфичностью. Более того, тригеминальный ганглий новорожденных и эмбрионов достаточно мал, что делает невозможным выделение данной ткани. В связи с этим, для получения первичной культуры клеток тригеминального ганглия крыс использовали крысят на 10 день постнатального развития. К этому сроку ганглий сформирован и дифференцирован, при этом клетки обладают достаточной способностью выживать в условиях культивирования. Использование более взрослых крысят сопряжено с дополнительными методическими трудностями, а также с существенным понижением выживаемости клеток при их ферментативной диссоциации и культивировании.

На 10-й день постнатального развития животное помещали в специальную пластиковую камеру и усыпляли с использованием СО2 ингаляции. После извлечения головного мозга тригеминальный ганглий, находящийся ниже основания мозга, очищали от менингиальной оболочки и помещали в чашку Петри с охлажденной бессывороточной ростовой средой F12 (Sigma-Aldrich, США).

Полученный материал подвергали ферментативной обработке трипсином (0,5 мг/мл; Sigma-Aldrich, США), коллагеназой (1,0 мг/мл; Sigma-Aldrich, США) и ДНКазой (0.2 мг/мл; Sigma-Aldrich, США) в течение 20 мин при температуре 37оС с использованием ротацинного термостатируемого шейкера (Termomixer®, Eppendorf, Германия) со скоростью 1100 об/мин. Для остановки ферментативного процесса использовали ингибитор трипсина (2,5 мг/мл; Sigma-Aldrich, США).

Далее клетки подвергали центрифугированию в течение 5 мин со скоростью об/мин с использованием низкооборотной центрифуги (В3.11, Jouan, Франция).

Надосадочная жидкость, не содержащая клетки, удалялась. После подсчета клеток и их рассева, клетки тригеминального ганглия крыс культивировали в течение 3- дней в питательной среде (89 % F-12 (Sigma-Aldrich, США) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 1 % смеси пеницилина-стрептомицина;

Биолот, РФ) в 35 мм чашках Петри в объме 2 мл при начальной плотности посева 1.3x105 кл/мл.

2.2. Идентификация нейронов и глиальных клеток в культурах 2.2.1. Идентификация клеток в первичной культуре коры головного мозга крыс Эксперименты проводили на первичной культуре нейронов, выделенных из коры головного мозга эмбрионов крыс. Это была смешанная культура нейронов, содержащая также глиальные клетки. Для идентификации нейронов использовался в основном морфологический критерий. Большинство изолированных из мозга нейронов были пирамидными клетками коры. Их можно было хорошо визуализировать с помощью метода прижизненной микроскопии с использованием фазового контраста (рис. 2.1). Это были нейроны с пирамидным соматическим участком диаметром 15–20 мкм, с хорошо выраженными отростками, разветвленными и значительно удаленными от тел клеток уже на день культивирования. Кроме того, культура содержала большое количество вставочных нейронов.

Рисунок 2.1. Нейроны (черные стрелки) и глиальные клетки (белые стрелки) в первичной культуре коры мозга крыс методом световой микроскопии (DIV7). Масштабная линия – мкм.

В культуре присутствовали глиальные клетки, которые легко можно было отличить от нейронов по размеру (более 20 мкм) и морфологическим особенностям. Одной из особенностей первичной культуры клеток коры мозга крыс является то, что глиальные клетки лежат ниже слоя нейронов, что хорошо выявляется с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии, когда фокальная плоскость сканирования достаточно узка и в зону интереса попадает лишь слой нейронов. При использовании обычной флуоресцентной микроскопии в зону регистрации попадали как нейроны, так и глиальные клетки. В зависимости от экспериментальных задач в работе были использованы оба типа – конфокальная и флуоресцентная микроскопия.

В процессе развития культуры отмечался рост и ветвление отростков, образование многочисленных нервных пучков и сплетений. Было обнаружено, что к 7 – 10 дню инкубации нейроны формируют полноценную нейрональную сеть, что совпадает с ранее опубликованными данными (Ichikawa et al., 1993).

В связи с этим для экспериментов по изучению нейродегенеративных процессов использовалась культура нейронов коры головного мозга крыс после – 10 дней развития (DIV 7 – 10) в искусственных условиях.

2.2.2. Идентификация клеток в первичной культуре тригеминального ганглия Для идентификации нейронов и глиальных клеток использовался в основном морфологический критерий. Большинство изолированных из тригеминального ганглия нейронов были достаточно крупными клетками (свыше 40 мкм). Их можно было хорошо визуализировать с помощью метода прижизненной микроскопии с использованием фазового контраста (рис. 2.2).

В культуре присутствовали глиальные клетки – сателлитные глиальные клетки, которые легко можно было отличить от нейронов по размеру (меньше мкм) и морфологическим особенностям. В отличие от первичной культуры клеток коры мозга, в культуре клеток тригеминального ганглия крыс сателлитные глиальные клетки лежат на одном уровне с нейронами. Ко 2 дню культивирования нейроны, окруженные мелкими сателлитными глиальными клетками, формируют полноценную нейрональную сеть, что совпадает с ранее опубликованными данными (Ceruti et al., 2008).

Рисунок 2.2. Нейроны (черные стрелки) и сателлитные глиальные клетки (белые стрелки) в первичной культуре клеток тригеминального ганглия крыс (DIV3). Метод световой микроскопии. Масштабная линия – 100 мкм.

В связи со сроками формирования нейронной сети в культуре, для экспериментов по исследованию нейродегенеративных процессов в нейронах ПНС использовали первичную культуру клеток тригеминального ганглия крыс на 3-5 день развития.

2.3. Флуориметрическая регистрация внутриклеточного Ca2+ Визуализацию внутриклеточного Са2+ в клетках первичных культур проводили с использованием флуоресцентного зонда Fluo-3 AM (Invitrogene, США), позволяющего получить относительные значения концентрации [Ca2+]i в микромолярном диапазоне.

Флуорофор вводили в клетки в форме ацетоксиметилового эфира – AM ( мкМ, 45 мин, в темноте, 23 – 25оС). Затем клетки инкубировали в темноте на протяжении 15 мин в физиологическом растворе для деэтерификации с образованием внутри клеток мембранно-непроникающего Fluo-3.

Для проведения флуориметрических экспериментов на инвертированном сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 MP (Leica Microsystems, регистрационную/перфузионную камеру POCmini Chamber System (LaCon, инвертированного конфокального микроскопа.

Для получения регистрации на флуоресцентном микроскопе покровные стекла с культурой клеток переносили в регистрационную/перфузионную камеру, которая помещалась на подвижном предметном столике инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus IX-70 (Olympus, Япония).

Возбуждение Fluo-3 для обоих систем осуществляли светом аргонового лазера с длиной волны 488 нм. Эмиссию флуорохрома регистрировали в спектральном диапазоне 500 – 580 нм с частотой сканирования от 0,03 до кадр/с, в зависимости от времени эксперимента.

Полученное конфокальное изображение оцифровывали при помощи программного обеспечения Leica LAS AF (Leica Microsystems, Германия) (рис.

2.3). Для клеток, отвечающих на воздействие, строили графики зависимости интенсивности свечения от времени с использованием данного программного обеспечения.

Рисунок 2.3. Пример изображений первичной культуры нейронов, полученных на конфокальном микроскопе Leica SP5. а. Изображение в проходящем свете. б. Изображение на пике флуоресценции Fluo-3. Масштабная линия – 100 мкм.

Изображения, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus IX-71, интенсивности свечения от времени с использованием системы TILL Photonics (TILL Photonics, Германия).

2.4. Флуориметрическое определение митохондриального мембранного использовали витальный флуоресцентный краситель родамин 123 (Rho123, Invitrogene, США) (Vergun et al., 2003; Duchen 2012). Флуорофор (5 мкМ) загружался в клетки в течение 30 мин в полной темноте при комнатной температуре (23 – 25оС).

инвертированном сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 MP, покровные стекла с клетками переносили в регистрационную/перфузионную камеру POCmini Chamber System.

Возбуждение Rho123 осуществляли светом аргонового лазера с длиной волны 488 нм. Эмиссию флуорохрома регистрировали в спектральном диапазоне 500 – 560 нм. Частота сканирования составляла 0,03 кадр/с.

В качестве контроля для измерения использовали протонофор carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP, 4 мкМ; Sigma-Aldrich, США), который приводит к полному разобщению дыхательной цепи – падению mit, вызывая тем самым максимум эмиссии Rho123 (Duchen 2012).

оцифровывали при помощи программного обеспечения Leica LAS AF, и строили графики зависимости интенсивности свечения от времени с использованием данного программного обеспечения.

2.5. Регистрация токов нейронов методом локальной фиксации потенциала ( Патч-кламп регистрацию токов проводили в конфигурации «целая клетка»

(Hamill et al., 1981) на нейронах с 10 по 16 день культивирования (10-16 days in vitro, DIV). В опытах использовали внеклеточный перфузионный раствор следующего состава (концентрации указаны в мМ): NaCl, 140; KCl, 2.8; CaCl2, 2.0;

MgCl2, 1.0; HEPES 10, при pH 7.2–7.4. Во всех экспериментах для измерения токов из раствора был исключен Mg2+. Кроме того, в безмагниевом растворе выполнены все эксперименты с использованием блокаторов NMDA рецепторов.

Внутриклеточный раствор для заполнения микроэлектрода имел следующий состав (мМ): 9 NaCl, 17.5 KCl, 121.5 K-глюконат, 1 MgСl2, 10 HEPES, 0.2 EGTA, MgATP, 0.5 NaGTP (Han, Stevens, 2009). Патч-пипетки для регистрации были вытянуты из боросиликатного стекла с внешним диаметром 1,5 мм и внутренним филаментом (Sutter Instrument #BF150-86-10, Sutter Instruments Company, США).

Для регистрации токов применяли усилитель MultiClamp 700B c системой сбора данных Digidata 1440A и программное обеспечение pClamp v10.2 (Molecular Devices, США). Частота дискретизации составляла 20000 изм/с с предварительной аналоговой фильтрацией (эквивалент фильтра Бесселя 8 порядка) с частотой среза 1.4 кГц для удаления высокочастотных шумов. Позиционирование кончика микроэлектрода выполняли микроманипулятором MP-85 (Sutter Instruments Company, США) под визуальным контролем на инвертированном микроскопе Nikon Diaphot TMD (Nikon, Япония). Для аппликации тестовых веществ использовали систему быстрой смены растворов на базе BPS-4 (Ala Scientific Instruments, США).

Регистрацию токов, вызванных агонистами, а также анализ их частоты выполняли в программе Clampfit 10.2, входящей в пакет pClamp.

2.6. Определение апоптотических и некротических клеток путем последовательного окрашивания акрединовым оранжевым и бромистым этидием Для определения погибших нейронов методом конфокальной микроскопии использовались флуорохромы акридиновый оранжевый (АО) (0,001%) и бромистый этидий (БЭ) (0,001%). Поскольку апоптоз может запускаться при нормальном развитии нейронов в культуре, необходимо было учитывать его вклад в сравнении с экспериментально вызванным апоптозом. Полученные статистические данные показали, что процент апоптотических клеток в интактной культуре был незначителен и соответствовал нормальным физиологическим условиям (Simonetti et al., 2006; Mironova et al., 2007), поэтому в дальнейшем его вклад не учитывался.

Для определения соотношения живых, апоптотических и некротических клеток покровные стекла с культурой клеток обрабатывали АО в течение 20 с, после чего АО отмывали физиологическим раствором. После отмывки АО культуру обрабатывали БЭ в течение того же периода времени. Непосредственно перед регистрацией флуоресценции методом конфокальной микроскопии производилась тщательная отмывка препарата физиологическим раствором для предотвращения фоновой флуоресценции за счет остаточной концентрации флуорохромов в растворе.

Для проведения измерения флуоресценции АО и БЭ окрашенные покровные стекла с клетками переносили в регистрационную/перфузионную камеру, которая помещалась на подвижный предметный столик инвертированного конфокального микроскопа Leica TCS SP5 MP. Возбуждение флуорохрома проводили аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Эмиссию АО регистрировали в зеленой области спектра (максимум излучения приходится на 530 нм), а БЭ в красной области (максимум излучения приходится на 620 нм).

Регистрация изображения осуществлялась двумя независимыми каналами конфокального микроскопа. Результирующее изображение получали путем наложения двух изображений, зарегистрированных в разных (зеленой и красной) областях спектра с помощью программного обеспечения Leica LAS AF. Ядра нейронов, у которых имеется деструкция плазматической мембраны, окрашивались БЭ и излучали красный свет. Ядра живых нейронов окрашивались АО и светились зеленым цветом, а ядра апоптотических нейронов светились желто-оранжевым цветом, вследствие закисления внутриклеточной среды и изменения спектра эмиссии АО (Zelenin 1996). Подсчет соотношения количества живых апоптотических и некротических клеток проводили с помощью плагина http://sibarov.ru/index.php?slab (Sibarov et al., (http://rsbweb.nih.gov/ij/), зеленого, желтого и красного цвета с каждого изображения.

Эксперименты на клетках первичной культуры коры мозга крыс, проводили на 7 – 10 день in vitro (DIV). В опытах с нейронами коры мозга использовали физиологический раствор следующего состава: 140 мМ NaCl, 2,8 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, pH = 7.2 – 7.4.

Эксперименты на клетках первичной культуры тригеминального ганглия крыс, проводили на 3 – 5 день in vitro (DIV). В опытах с нейронами тригеминального ганглия использовали физиологический раствор следующего состава: 152 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 10 мМ глюкоза, 2 мМ CaCl 2, мМ Mg Cl2, pH = 7.2 – 7.4. Различия в составах физиологических растворов для первичных культур клеток обусловлены различными физиологическими условиями существования тканей в организме млекопитающих.

После загрузки флуорохромов в клетки покровное стекло с культурой клеток для проведения опытов фиксировали в регистрационной/перфузионной камере, которую помещали на предметный столик сканирующего конфокального микроскопа или на столик флуоресцентного микроскопа. Камеру подключали к системе общей и быстрой локальной перфузии. На протяжении всего эксперимента (10 – 90 мин) клетки перфузировали с помощью общей перфузии физиологическим раствором со скоростью 1 мл/мин. Действующие вещества апплицировались на клетки с помощью быстрой локальной перфузии с аналогичной скоростью. Полное замещение раствора вокруг нейронов происходило менее чем за 1 сек.

Так как в нейронах внеклеточный Mg2+ блокирует каналы NMDA рецептора, в опытах c NMDA использовали физиологический раствор, не содержащий Mg2+.

Для индукции нейротоксического стресса были выбраны насыщающие концентрации агонистов рецепторов Глу, представленные в таблице 2.1. При аппликации NMDA и ГЦ всегда добавляли аминокислоту Гли – ко-агонист NMDA рецепторов в концентрации, присутствующей в ростовой среде (100 мкМ).

Глицин (ко-агонист NMDA рецептора) 30 или Таблица 2.1 Концентрации различных агонистов и антагонистов, используемыеx в экспериментах.

Для анализа долговременного действия высоких концентраций ГЦ клетки в первичной культуре коры мозга и тригеминального ганглия крыс инкубировали в течение 5 или 24 часов в ростовой среде (контрольные условия) или ростовой среде, содержащей 100 или 500 мкМ D,L–ГЦ (важно, что только L-форма ГЦ является биологически активной, поэтому действующая концентрация вещества вдвое меньше апплицируемой) и в комбинации с 50 мкМ L-AP-5 или 10 мкМ MTEP (3-((2-метил-4-тиазолил)этинил)пиридин). Ростовая среда для первичных культур клеток содержит в своем составе 100 мкМ Гли. В связи с этим, в экспериментах по исследованию Са2+ ответов и ГЦ всегда апплицировали совместно с 100 мкМ глицина, как ко-агониста NMDA рецепторов.

конфокального инвертированного микроскопа Leica SP5 MF с иммерсионными объективами HCX APO 20х/0,70 и 63х/1,44 (Leica Microsystems, Германия), оснащенного медленной перфузией, обеспеченной перистальтическим насосом (LongerPump BT100-1L, Loading Longer Precision Pump Co. Ltd, Китай) и быстрой локальной перфузией собственной сборки (ИЭФБ РАН).

Регистрацию флуоресценции на инвертированном микроскопе Olympus IXс объективом 10x/0,30 (Olympus, Япония) и с системой TILL Photonics, проводили с использованием медленной и быстрой локальной перфузионной системы Rapid Solution Changer RSC-200 (BioLogic Science Instruments, Франция).

программного обеспечения Leica LAS AF и Till Photonics, соответственно.

использованием компьютерных программ МS Excel, Origin 6.1, SigmaPlot 8 и GraphPad Prizm 5.

использовали t-критерий Стьюдента и U-критерий Манна-Уитни (ANOVA). На рисунках каждая из точек, отложенных на графике, является средним ± стандартная ошибка, определенная по 4 – 10 опытам.

3.1. Исследование состава рецепторов глутамата, обеспечивающих вход Ca2+ при действии агонистов рецепторов Глу в нейронах первичной культуры 3.1.1. Внутриклеточные Са2+ ответы и токи в нейронах при действии агонистов рецепторов глутамата NMDA и АМПА/KA типа Была проведена серия экспериментов с использованием флуоресцентного зонда Fluo-3 с целью определения динамики внутриклеточного Са2+ сигнала при действии избирательных агонистов рецепторов глутамата: NMDA и КА.

Ранее в экспериментах с использованием рациометрического красителя Fura-2 AM было показано, что концентрация внутриклеточного Са 2+ в нейронах коры мозга в контрольных условиях составляет около 50 нМ (Abushik et al., 2013), что соответствует нормальным физиологическим параметрам. При этом увеличение интенсивности свечения Fura-2 прямопропорционально увеличению интенсивности свечения Fluo-3 (Abushik et al., 2013). В связи с этим, при анализе Са2+ ответов в нейронах с помощью Fluo-3 можно говорить об относительном увеличении внутриклеточной концентрации.

Результат экспериментов представлен на рис. 3.1. Динамики нарастания интенсивности флуоресценции при действии 30 мкМ NMDA и 30 мкМ КА существенно различались. При аппликации NMDA нейроны отвечали резким повышением интенсивности флуоресценции, которое являлось результатом увеличения Достигнув максимума, интенсивность флуоресценции оставалась на стационарном уровне, что вероятно отражало вход свободного Са2+ в нейроны (рис. 3.1.а). В присутствии КА, в отличие от NMDA, динамика роста флуоресцентного Са2+ сигнала значительно варьировала: в отдельных нейронах наблюдалось резкое повышение, сходное по кинетике с NMDA, а в большинстве нейронов происходило медленное градуальное нарастание флуоресценции, достигавшее максимума после 30 мин воздействия КА (рис. 3.1.б).

Очевидно, что внутриклеточный Ca2+ сигнал при активации АМПА/KA рецепторов развивается медленно, но после 30 мин достигает средней величины интенсивности флуоресценции, полученной при активации NMDA рецепторов.

Для обоих агонистов рецепторов Глу после 40 мин проявляется ОКД, которая при использовании Fluo-3 выглядит, как резкое увеличение интенсивности свечения, достигающее насыщения (рис. 3.1.б). Это связано с низкой константой диссоциации Fluo-3 AM для Ca2+ (325 нМ).

Рисунок 3.1. Сопоставление динамики внутриклеточных Ca2+ ответов и токов в нейронах при длительном действии 30 мкМ NMDA и 30 мкМ КА с использованием Fluo-3. (а) Динамика увеличения интенсивности флуоресценции Са2+ в нейронах при действии 30 мкМ NMDA. (б) Динамика увеличения интенсивности флуоресценции Са2+ в нейронах при действии 30 мкМ КА. Для всех частей рисунка ось ординат – относительная интенсивность свечения (за принято свечение в контроле). Каждая из кривых представляет собой зарегистрированный в соме флуоресцентный Са2+ ответ одного нейрона. (в) Ток в нейроне первичной культуры коры мозга крыс, демонстрирующий ответ на 30 мкМ NMDA при мембранном потенциале -70 мВ. (г) Ток, демонстрирующий ответ нейрона на аппликацию 30 мкМ КА при мембранном потенциале -70 мВ. Момент аппликации и длительность действия NMDA и KA показаны линией над графиками. Представлены данные из одного эксперимента. Число опытов 4 – 5.

При регистрации постсинаптических токов методом локальной фиксации потенциала в конфигурации «целая клетка» было выявлено, что время нарастания входящего тока при действии 30 мкм NMDA или 30 мкМ КА быстро достигает своего максимума и остается на неизменном уровне на протяжении всего времени действия агонистов (рис. 3.1.в и рис.3.1.г). Для обоих агонистов время нарастания входящего тока соответствует времени, необходимому агонисту для достижения насыщающей концентрации в регистрационной камере.

3.1.2. Зависимость внутриклеточных Са2+ ответов нейронов Известно, что высокая проницаемость каналов NMDA рецепторов обеспечивает вход Ca2+ снаружи в нейроны и запуск ОКД (Jones, Westbrook, 1996;

Евстратова и др., 2008; Burnashev et al., 1995). Удаление Ca2+ из физиологического раствора до ОКД приводит к исчезновению Ca2+ сигнала даже в присутствии Глу или NMDA (Евстратова и др., 2008; Burnashev et al., 1995; Khodorov 2004). В связи с различием динамики внутриклеточного Ca2+ ответа при действии NMDA и КА возникает вопрос о происхождении Ca2+ (из наружного раствора или из внутриклеточных депо) и путях его доставки в цитозоль нейронов при активации АМПА рецепторов.

В экспериментах с Fluo-3 аппликация NMDA (рис. 3.2.а) и КА (рис. 3.2.б) в бескальциевом физиологическом растворе на время от 25 до 40 мин не сопровождалась увеличением интенсивности флуоресценции в нейронах, а добавление наружного Ca2+ запускало внутриклеточный Ca2+.

Перфузия физиологическим раствором, содержащим 2 мМ Са2+, вызывала резкое повышение [Ca2+]i. Результаты экспериментов демонстрируют, что как и в случае NMDA рецепторов, источником повышения [Ca2+]i в нейронах при активации АМПА/КА рецепторов Глу является внеклеточный Ca2+.

Рисунок 3.2. Зависимость внутриклеточного Ca2+ сигнала в нейронах от наличия Ca2+ в физиологическом растворе при длительном действии 30 мкМ NMDA и 30 мкМ КА, с использованием Fluo-3. (а) Динамика увеличения интенсивности флуоресценции Fluo-3 в нейронах при действии 30 мкМ NMDA в бескальциевом физиологическом растворе и в физиологическом растворе, содержащем 2 мМ Ca2+. (б) Динамика увеличения интенсивности флуоресценции Fluo-3 в нейронах при действии 30 мкМ KA в бескальциевом физиологическом растворе и в физиологическом растворе, содержащем 2 мМ Ca2+. Для всех частей рисунка ось ординат – относительная интенсивность свечения (за 1 принято свечение в контроле). Момент аппликации и длительность действия NMDA, KA и Ca2+ показаны линией над графиками.

Каждая из кривых представляет собой зарегистрированный в соме флуоресцентный Са2+ ответ одного нейрона. Представлены данные из одного эксперимента. Число опытов – 3.

3.1.3. Вклад NMDA рецепторов различного субъединичного состава экспрессированных в нейронах первичной культуры клеток коры мозга крыс, использовали аллостерический ингибитор ифенпродил (10 мкМ), который избирательно связывается с внеклеточным доменом GluN2B субъединицы, снижая вероятность открытия канала NMDA рецептора (Williams 1993;

Whittemore et al., 1997; Traynelis et al., 2010).

Ифенпродил (10 мкМ), апплицированный на фоне действия 30 мкМ NMDA, снижал [Ca2+]i до 10 % от контрольных значений (рис. 3.3.а). В случае, когда блокатор подавался совместно с NMDA, ифенпродил также предотвращал рост внутриклеточного Ca2+ до момента отмывки ингибитора (рис. 3.3.б).

Рисунок 3.3. Блокирование внутриклеточных Са2+ ответов нейронов первичной культуры коры мозга крыс избирательным аллостерическим ингибитором GluN2B субъединицы NMDA рецептора – ифенпродилом при действии 30 мкМ NMDA, с использованием Fluo-3. (а) Динамика интенсивности флуоресценции Fluo-3 в нейронах при действии 30 мкМ NMDA и последующей аппликацией 10 мкМ ифенпродила. (б) Динамика интенсивности флуоресценции Fluo-3 в нейронах при сочетанном действии 30 мкМ NMDA и 10 мкМ ифенпродила с его последующей отмывкой. Для всех частей рисунка ось ординат – относительная интенсивность свечения (за 1 принято свечение в контроле). Момент аппликации и длительность действия NMDA и ифенпродила показаны жирной линией над графиками. Каждая из кривых представляет собой зарегистрированный в соме флуоресцентный Са2+ ответ одного нейрона.

Представлены данные из одного эксперимента. Число опытов – 3.

Оба эксперимента ясно демонстрируют, что большинство нейронов первичной культуры клеток коры мозга крыс экспрессируют NMDA рецепторы GluN1/GluN2B опубликованными данными по анализу мРНК (Kiss et al., 2012).

3.1.4. Вклад АМПА рецепторов различного субъединичного сстава в генерацию внутриклеточного Са2+ сигнала и интегральных токов Известно, что проницаемость каналов АМПА рецепторов для Ca2+ и эффективность блокады каналоблокаторами определяется наличием в их структуре GluA2 – субъединицы (Burnashev et al., 1992). При ее отсутствии канал обладает проницаемостью для Ca2+ и хорошо блокируется. Например, ЕД блокады каналов АМПА рецепторов, не содержащих GluA2, для ИЭМ- составляет примерно 1 мкМ (Magazanik et al., 1997), а для АМПА рецепторов, имеющих в составе GluA2, эта величина на порядки больше (Antonov et al., 1995;

Antonov, Johnson 1996; Magazanik et al., 1997). Мы использовали ИЭМ-1460 для выявления роли Ca2+-проницаемых АМПА рецепторов, в генерации Са2+ ответов при действии КА. Hейроны по типу Са2+ ответов на ИЭМ-1460 разделились на три группы примерно равные группы (рис. 3.4.1):

сочетанная аппликация КА и ИЭМ-1460 вызывала кратковременное повышение [Ca2+]i, которое затем, по-видимому, блокировалось; отмывка ИЭМприводила к значительному увеличению [Ca2+]i (рис. 3.4.1, выделены зеленым цветом);

сочетанная аппликация КА и ИЭМ-1460 вызывала повышение [Ca2+]i, сопровождавшееся Ca2+ осцилляциями; отмывка ИЭМ-1460 не приводила к каким-либо изменениям (рис. 3.1.4.1, выделены синим цветом);

сочетанная аппликация КА и ИЭМ-1460 вызывала повышение [Ca2+]i, сопровождавшееся существенными Ca2+ осцилляциями, отмывка ИЭМ- приводила к значительному увеличению [Ca2+]i (рис. 3.4.1, выделены красным цветом).