«Трансгенез и экспрессия генов у сельскохозяйственной птицы ...»

Государственное научное учреждение

Всероссийский научно-исследовательский и технологический

институт птицеводства

Российской академии сельскохозяйственных наук

(ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии)

На правах рукописи

КОРШУНОВА ЛЮДМИЛА ГЕОРГИЕВНА

Трансгенез и экспрессия генов

у сельскохозяйственной птицы

06.02.07 – разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик Россельхозакадемии Фисинин В.И.

Сергиев Посад

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Современное состояние и перспективы использования трансгенеза в птицеводстве

1.2. Экспрессия вителлогенинового гена и биосинтез вителлогенина в печени кур

1.3. Роль митохондрий в становлении вителлогенной функции печени у кур

2. Материал и методы исследований

2.1. Методы получения и исследования трансгенных перепелов............... 2.2. Методы исследования эстрогениндуцированного вителлогенеза и биогенеза рибосом печени цыплят

2.3. Методы исследования роли митохондрий печени в становлении ее вителлогенной функции

3. Результаты исследований

3.1. Получение и изучение трансгенных перепелов с геном гормона роста быка

3.2. Изучение эстрогениндуцированного вителлогенеза и биогенеза рибосом печени цыплят

3.3. Изучение роли митохондрий в вителлогенезе печени

4. Обсуждение результатов

4.1. Получение трансгенных перепелов, экспрессия и наследование гена гормона роста быка

4.2. Экспрессия вителлогенинового гена и биогенез рибосом печени цыплят

4.3. Роль митохондрий в вителлогенезе печени кур

5. Выводы

6. Сведения о практическом использовании результатов исследований

7. Рекомендации по использованию научных выводов

Список литературы

П р и л о ж е н и я

Введение Актуальность темы. Современная селекция в птицеводстве базируется на отборе лучшего поголовья из высокопродуктивных семей и семейств и требует длительного времени. Одним из нетрадиционных подходов к генетическому улучшению птицы может стать трансгенез – внедрение в их геном инородных генов. Несмотря на методические трудности, работы по созданию трансгенной птицы как актуального направления в отрасли активно ведутся во многих странах, поскольку перспективны с точки зрения экономической выгоды, возможностью достижения эффекта селекции в короткие сроки.

Трансгенез расширяет возможности получения животных с измененными признаками, многие из которых могут быть использованы в селекции, при этом отпадает необходимость длительных обратных скрещиваний для удаления из популяции «ненужных» генов, неизбежно передаваемых при обычной гибридизации. Очевидно, что методами трансгенеза могут быть введены в популяцию совершенно новые фенотипические признаки, кодируемые генами других видов и родов животных.

Дальнейшее развитие селекции и генетики сельскохозяйственной птицы предполагает разработку новых методов и приемов оценки генома, основанных на знаниях механизмов организации и функционирования живых организмов, в частности, механизмов яйцеобразования у кур. Процесс яйцеобразования связан со значительным усилением биосинтетических процессов в печени, где происходит синтез большинства желточных белков. Белки желтка в основном происходят из вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП), синтез которых начинается в печени кур по достижении ими репродуктивного возраста. С наступлением яйценоскости печень курицы приобретает новую вителлогенную функцию без утраты предшествующих. Такая дифференцировка уже специализированной ткани находится под контролем эстрогенов. Синтез вителлогенина и ЛОНП может быть вызван у цыплят введением им эстрадиола. Этот феномен позволяет изучать гормониндуцированную экспрессию «молчащих» генов, то есть последовательность процессов, приводящих к синтезу определенного белкового продукта, не синтезируемого ранее, а также определенные этапы этих процессов. Реализация генетической информации во многом зависит от рибосом, содержание которых определяет интенсивность белкового синтеза.

Активизация биосинтеза в печени связана с дополнительными энергозатратами, что предполагает значительное увеличение энергетической нагрузки на митохондрион печени, обеспечивающий производство необходимого количества макроэргических соединений для анаболических процессов. Наличие в митохондриях собственного генетического материала обуславливает свои особенности во взаимодействии ядерного и митохондриального геномов в процессе развития и специализации органов и тканей.

Новые знания о сопряженности экспрессии вителлогенинового гена с биогенезом рибосом, митохондриальной энергетикой клеток печени и их использование будут способствовать максимальной реализации продуктивного потенциала у кур.

Цель и задачи исследований. Основной целью настоящей работы было изучение воздействия интегрированной генной конструкции, с геном гормона роста быка на биологические и продуктивные признаки генетически модифицированных перепелов, а также изучение гормональной экспрессии генов в печени цыплят.

В связи с указанным были поставлены следующие задачи:

– получить трансгенных перепелов с встроенным геном гормона роста быка;

– провести оценку экспрессии трансгена, биологических и продуктивных показателей трансгенных перепелов в ряду поколений: динамика роста и иммунный статус перепелов, гормональный статус крови, масса перепелиных яиц, их биохимический состав и морфологические показатели, яйценоскость;

– изучить экспрессию генов на модели гормониндуцированного вителлогенеза у цыплят: синтез вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности, биохимические показатели крови и печени, биогенез рибосом после однократного и повторного введения цыплятам 17--эстрадиола и в зависимости от его дозы;

– определить влияние гормональной экспрессии генов, вызванной 17-эстрадиолом, на биогенез и биоэнергетические параметры митохондрий печени цыплят.

Научная новизна работы. Впервые проведена оценка экспрессии трансгена, генетический и фенотипический анализ трансгенных по гену гормона роста быка перепелов, полученных методом микроинъекции экзогенной ДНК в зародышевые диски яйцеклеток, и их потомков в ряду поколений.

Впервые на примере трансгенных перепелов по гену гормона роста быка показана возможность существенного улучшения продуктивности птицы методами трансгенеза.

Впервые изучена сопряженность эстрогениндуцированной экспрессии вителлогенинового гена, выраженной в усилении синтетических процессов в печени и увеличении содержания вителлогенина, ЛОНП и триглицеридов в плазме крови с синтезом РНК и биогенезом рибосом в печени цыплят.

Выявлено, что синтез вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности в печени эстрогенизированных цыплят имеют разные динамики, то есть относительно независимую регуляцию экспрессии соответствующих генов.

Обосновано, что необходимым условием для становления вителлогенной функции печени является синтез мРНК в первые часы после введения 17эстрадиола цыплятам. Биогенез рибосом определяет количественные характеристики ответа печени на гормон. Увеличение числа рибосом в печени после повторного введения эстрадиола цыплятам больше, чем после однократного.

Получены новые данные о том, что различия функционального состояния митохондрий печени кур-несушек и цыплят нивелируются в ходе эстрогениндуцированного вителлогенеза: в митохондриях печени цыплят происходят изменения параметров сопряжения и активного транспорта ионов кальция, которые приближаются к таковым в митохондриях печени курнесушек.

Практическая ценность работы. Перепела опытной группы, потомки трансгенных по гену гормона роста быка, в ряду поколений сохранили превосходство по живой массе на 5–15% и массе яиц на 10–20% по сравнению с обычными, что свидетельствует о возможном практическом использовании трансгенеза в селекционной работе, направленной на повышение продуктивных показателей птицы в короткие сроки. Производственная проверка подтвердила результаты исследований. Разница по массе яиц перепелок трансгенного происхождения и эстонской породы составила 18,7%.

Материалы исследований легли в основу разработанного способа отбора перепелок по массе яиц (Патент РФ № 2402209). Результаты еженедельных взвешиваний яиц перепелок, отличающихся по средним показателям, с 7- до 50- недельного возраста позволили определить целесообразный возраст проведения оценки перепелок по этому признаку (11-12 недель). Именно в этом возрасте масса яйца соответствует средним показателям за весь период яйценоскости.

Выявленные у цыплят различия в динамике индукции синтеза вителлогенина и ЛОНП в ответ на введение 17--эстрадиола являются обоснованием возможности раздельной селекции кур по этим признакам.

Линейная зависимость содержания фосфопротеидного фосфора и общего кальция в крови эстрогенизированных цыплят позволяет использовать каждый из них для ранней оценки яичной продуктивности кур. Использование в качестве показателя общего кальция из соображений методического характера является предпочтительным.

На основании изученных параметров окислительного фосфорилирования и цитохромоксидазной активности митохондрий печени получено экспериментальное подтверждение оптимальным нормам кормления, режимам выращивания и содержания птицы (Фисинин В.И., Коршунова Л.Г., 1988;

Байковская И.П., Коршунова Л.Г., 1989), Методическое руководство для зоотехнических лабораторий (1998).

Основные положения, выносимые на защиту. В результате выполненных исследований и производственной проверки разработаны и выносятся на защиту следующие основные положения:

1. Экспрессии трансгена у перепелов, полученных методом микроинъекции генной конструкции с геном гормона роста быка в зародышевые диски яйцеклеток, и их потомков в ряду поколений.

2. Рост, продуктивность, гормональный статус крови, иммунный статус трансгенных по гену гормона роста быка перепелов и их потомков в ряду поколений.

3. Синтез вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности, показатели крови и печени, биогенез рибосом после однократного и повторного введения цыплятам 17--эстрадиола и в зависимости от его дозы.

4. Интеграция гормональной индукции вителлогенной функции печени цыплят с биогенезом, активностью окислительного фосфорилирования и функциональной специализацией митохондрий.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на Ученых советах ВНИТИП в ежегодных отчетах 1980–2010 г.г.;

на 11 Всесоюзном симпозиуме по биохимии митохондрий, Пущино (1981);

на Всесоюзном симпозиуме по биохимии с.-х. животных, Витебск (1982); на научно–методической комиссии по селекции и генетике птицеводства Отделения животноводства ВАСХНИЛ (1983); на Всесоюзном биохимическом съезде, Киев (1986); на Всесоюзном симпозиуме «Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа», Ташкент (1986); на Всесоюзном симпозиуме «Научные основы витаминного питания с.-х. животных», Юрмала (1987); на Всесоюзной научно-технической конференции «Эффективное использование кормов в птицеводстве», Новосибирск (1990);

на Всесоюзной научной конференции «Использование физических и биологических факторов в ветеринарии и животноводстве», Витебск (1991); на Украинской конференции с международным участием «Актуальные проблемы современного птицеводства», Харьков (1991); на международном симпозиуме «Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с.-х. животных», С.-Петербург, Пушкин (1994); на ежегодных отчетах в отделении зоотехнии и животноводства РАСХН (1995–2005 г.г.); на научных конференциях «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва (1996, 2000 гг.); на II Международной выставке «Инновации-99. Технологии живых систем» Всероссийский выставочный центр, Москва (1999), где был присужден Диплом II степени за разработку «Получение трансгенной птицы»; на конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России». С.Петербург (2008), на XVI конференции Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству «Достижения в современном птицеводстве: Исследования и инновации», Сергиев Посад (2009); а также за рубежом на 10 Европейской конференции по птицеводству, Иерусалим, Израиль (1998); на 6 Конференции Балтийских стран по птицеводству, Вильнюс, Литва (1998), на 8 конференции стран Балтии по птицеводству, Турку, Финляндия (2000); на 21 Международном конгрессе по птицеводству, Монреаль, Канада (2000).

Публикация результатов исследований. Основные результаты исследований опубликованы в трудах ВНИТИП, материалах Россельхозакадемии, республиканских и международных научных конференций, научных и научно-производственных журналах, информационной экспрессинформации. Всего по теме диссертационной работы опубликовано 56 статей, в том числе 14 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, методическое руководство для зоотехнических лабораторий «Оценка качества кормов, органов, тканей, яиц и мяса птицы», 1998, получен патент РФ(2009 г.) на изобретение.

Научные исследования выполнены в соответствии с планом (1980– 2010 гг.) Всесоюзного научно-исследовательского и технологического института птицеводства ныне ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии по темам:

«Разработать методы прогнозирования яйценоскости кур с помощью введения в раннем возрасте экзогенных гормонов», № гос. рег. 81090364; «Разработка переносов генов в геном птиц» № гос. рег. 01980008817, «Разработать новые и усовершенствовать существующие методы получения трансгенной птицы с заданными признаками», № гос. рег. 01200120268; «Разработать методы получения генетически модифицированной птицы с ценными хозяйственными признаками», № гос. рег. 01200602327.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение; обзор литературы; материал и методика исследований; результаты исследований и их обсуждение; выводы; список литературы; приложения. Материал изложен на 305 страницах машинописного текста, иллюстрирован 44 таблицами и 26 рисунками. Список литературы включает 644 библиографических источника, в том числе 205 отечественных и иностранных авторов. Приложение включает дополнительные таблицы и рисунки, иллюстрирующие результаты исследований; Патент РФ на изобретение №2402209 «Способ отбора перепелок по массе яиц», 2009; Акт производственной проверки, 2009; Удостоверение на рационализаторское предложение, 1981; Методическое руководство, 1998.

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит постановка темы диссертации, ее разработка и решение. Экспериментальная часть работы и обработка полученных результатов выполнена непосредственно при личном авторском участии диссертанта, а также совместно с соисполнителями, что нашло отражение в списке публикаций по теме исследований.

Мировое и отечественное птицеводство является наиболее динамично развивающейся отраслью агропромышленного комплекса. За последние лет среднегодовой прирост яиц и мяса птицы в мире превышает 4%. В России производство яиц и мяса птицы возрастает благодаря вводу новых мощностей, повышению продуктивности и сохранности поголовья, уменьшению расхода кормов на единицу продукции, снижению энергетических и ресурсных затрат, глубокой переработке и расширению ассортимента продукции [180].

Повышение продуктивности птицы и увеличение валового производства продуктов птицеводства в значительной степени зависят от качества племенной птицы. Племенная работа – это фундамент, обеспечивающий количественный и качественный подъем промышленного птицеводства в стране.

Каждый этап развития птицеводческой отрасли характеризовался конкретными селекционно-генетическими разработками, направленными на их использование. Так, в период экстенсивного развития отрасли при наличии большого количества пород и породных групп птицы, имевших невысокий уровень продуктивности, учеными была доказана эффективность получения помесной птицы при скрещивании разных пород для повышения продуктивных показателей [89; 114; 145]. В период становления интенсивного развития птицеводства учеными-селекционерами была обоснована целесообразность создания промышленных линий [25; 116; 142]. Современное промышленное птицеводство базируется на основе использования высокопродуктивной гибридной птицы, полученной на основе скрещивания отселекционированных дифференцированных по отдельным признакам сочетающихся линий всех видов: куры [13; 27; 48; 85; 166; 168], цесарки [122], индейки [42], утки и гуси [123].

Селекционная работа всегда была направлена на совершенствование существующих и создание новых методов и приемов [26; 59]. В 50-е годы прошлого столетия исследователями была показана возможность изменения некоторых признаков птицы при многократных, в нескольких поколениях, переливаниях крови и создания «вегетативных гибридов» (гемогибридизация) [18; 31; 41]. Таким методом были созданы ленинградские белые куры – курам породы леггорн переливали кровь австралорпов [148], цесарки – серокрапчатым цесаркам приливали кровь от петухов московской белой породной группы [40]. Исследователи неоднократно обращались к получению межвидовых гибридов. Известны межвидовые гибриды: петух цесарка, курица перепел, курица индейка, курица фазан, курица павлин и др. В промышленном птицеводстве используются межвидовые гибриды – муларды, полученные от скрещивания мускусных селезней с утками домашних пород. Муларды обладают высокой скоростью роста и небольшой ожиренностью тушек, способностью к откорму на жирную печень. Следует отметить невысокий вывод мулардов (30–35%), что явилось сдерживающим фактором их широкого использования в практике. В большинстве случаев межвидовые гибриды бесплодны, поэтому большого практического значения не имеют.

Бесплодие гибридов проявляется в виде утраты плодовитости только одним полом, у птиц бесплодны самки [85; 115; 124]. Разрабатываются методы ортотропной трансплантации, которые позволят получить несушекреципиентов, фертильных благодаря функциям трасплантанта. Таких кур можно будет использовать в качестве искусственных производителей донорского потомства [81; 82; 163; 183].

Не всегда научные разработки быстро находят широкое применение на практике. В этом плане интересен пример использования генов К-к, S-s, описанных А.С. Серебровским еще в 1926 году [133]. И только спустя многие десятилетия особенность оперяемости цыплят, связанная с наличием этих генов, нашла широкое применение. Большинство современных высокопродуктивных кроссов кур являются аутосексными, что позволяет в суточном возрасте разделить их по полу с точностью до 98–99% по развитию перьев крыла или цвету пуха, а не по половым бугоркам [54; 71; 185; 190]. Сексирование цыплят в суточном возрасте по внешним признакам позволяет значительно сократить затраты на их сортировку, не требует специальной длительной подготовки специалистов, не приводит к травмированию молодняка, значительно сокращает ошибки сортировки, обеспечивает значительное повышение продуктивных показателей птицы при ее раздельном по полу выращивании [45; 70]. Многие десятилетия генетикам был известен ген карликовости (dw), определяющий невысокую массу и укороченную длину ноги птицы, описанный Ф.Б. Хаттом [184], и только в последние десятилетия в промышленном птицеводстве нашел широкое применение в материнских родительских формах яичных и мясных кур. Живая масса у кур-носителей гена dw невысокая, что обеспечивает снижение затрат корма на производство племенной и промышленной продукции [47; 49; 58]. И еще не менее интересный пример. Понятие «геногеография» и спектр вопросов входящих в него ввел А.С. Серебровский в 1928 году, а сегодня это направление получило свое развитие: проводится анализ распространения генетических маркеров в популяциях крупных регионов, проводится генотипирование ДНК и классических маркеров: однородительских (митохондриальной ДНК, Y-хромосомы), генетико-биохимических и других систем. Конечной целью таких исследований является сохранение и эффективное использование в селекции того огромного генетического потенциала, который все еще сохраняется у отечественных сельскохозяйственных видов животных [96].

Текущее столетие для птицеводов – это век генетики и селекции. Если на международных конкурсных испытаниях в 1925 году средняя яйценоскость кур 176 яиц оценивалась как высокая, то на конкурсах в 2002–2005 гг.

поставлялась птица белых и коричневых яичных кроссов с продуктивностью 330–340 яиц в год и выходом 21 кг яичной массы, что в 12 раз больше массы их тела. Несомненно, что в ближайшие 15–20 лет на смену «классической»

селекции придут инновационные методы генной инженерии. И в этой связи важно сохранить биологическое разнообразие редких и исчезающих пород домашней птицы, мировой и отечественный генофонд [179; 181; 202].

В эпоху развития промышленного птицеводства резко сократилось количество используемых пород птицы. Специально созданные и отобранные генотипы являются наиболее рентабельными в данных конкретных условиях.

Но стоит возникнуть новым требованиям рынка, сразу же, появится экономическая необходимость в создании новых пород и линий с новыми свойствами. Необходимо привлечение новых генных ресурсов в генетике птицы.

1.1. Современное состояние и перспективы использования трансгенеза в птицеводстве Принципиальные возможности, которыми обладает современная молекулярная генетика, позволяют изменять генотип и фенотип целого организма.

Конечно, человек воздействовал на генотипы растений и животных тысячелетия, с тех пор как он начал заниматься сельским хозяйством. Но новейшая биология дает мощные и специфические средства воздействия на живые организмы. Поскольку не существует видового барьера для интеграции чужеродных генов, могут быть созданы линии трансгенных особей совершенно нового типа. В настоящее время намечены несколько направлений создания трансгенных животных [198; 202]. Самым очевидным и уже реализованном на практике является использование трансгенных животных в качестве «фабрик» по производству определенных белков для медицинских и промышленных целей. Второе направление – получение промышленных линий с наследственной устойчивостью к конкретным инфекционным заболеваниям [197].

Наиболее сложным представляется повышение путем трансгенеза продуктивных качеств с использованием ростовых и прочих количественных признаков, которые, как правило, имеют полигенную основу [19; 21; 203].

Методы трансгенеза обладают большим потенциалом в приложении к практическому птицеводству. Использование трансгенеза для переноса полезного гена даже от одной линии птицы к другой (что достижимо и обычными селекционными методами) может дать большую экономию времени и средств за счет исключения возвратных скрещиваний, необходимых для удаления ненужных генов, передающихся при естественной половой гибридизации. Однако истинные выгоды от применения трансгенеза будут понятны только после создания и полного изучения трансгенной птицы. Получение трансгенной птицы для хозяйственного использования предполагает создание линий. С этой точки зрения птица обладает большим преимуществом перед сельскохозяйственными млекопитающими благодаря быстрому половому созреванию и высокой плодовитости. Использование трансгенеза для передачи полезного гена от одной породы или линии к другой даже у быстроразмножающейся птицы экономило бы многие годы, необходимые на многочисленные скрещивания.

Результаты направленной селекции путем трансгенеза на сегодняшний день достаточно скромны, из-за сложности взаимодействия изменения генотипа и фенотипа. Во ВНИТИП Россельхозакадемии разработан метод получения трансгенной птицы путем микроинъекции чужеродной ДНК в яйцеклетки [62; 65; 172; 173; 192]. Этим методом были получены трансгенные куры с различными генными конструкциями [77–79] и перепела с геном гормона роста крупного рогатого скота. Полученные трансгенные перепела имели некоторые фенотипические особенности в сравнении с обычными перепелами. Самой заметной из особенностей, были сносимые перепелами необычно крупные яйца [66; 176]. Этот признак оказался наследуемым в ряде генераций перепелов [69; 80].

На сегодняшний день совершенно недостаточно изучена динамика изменений фенотипа в ряде поколений уже полученных трансгенных организмов [56; 204]. Применение генетической модификации в животноводстве вообще и в птицеводстве в частности по большей части находится на раннем этапе. Основная часть результатов исследований остается на научном уровне, и пока не настало время активного внедрения разработок в практику. Поэтому научное обоснование применения новых методов и приемов в селекции открывает более эффективный путь развития современного птицеводства.

Методы получения трансгенного организма Трансгеника – это новый раздел биологической науки, посвященный внедрению инородных генов в геном животного или растительного организма.

Трансгеника зародилась в 70-х годах ХХ столетия благодаря успехам молекулярной биологии, генетики, генной инженерии. Были разработаны методы, позволяющие идентифицировать и выделять определенные гены из растительных и животных геномов, «размножать» и «склеивать» их в тех или иных сочетаниях, создавая таким образом генные конструкции. Вследствие единообразия строения двойной цепи ДНК и универсальности генетического кода, в генных конструкциях можно использовать ДНК от различных донорских организмов. Однако следует иметь в виду, что при экспрессии введенного гена могут возникать совершенно новые взаимодействия в зависимости от происхождения ДНК донора и реципиента. Так, например, было замечено, что уровень экспрессии генных конструкций, содержащих прокариотические части, в трансгенном организме млекопитающих заметно снижается. На уровень экспрессии также оказывает влияние строение генной конструкции. Было показано, что содержащие интроны природные гены по сравнению с комплементарными ДНК, полученных обратным синтезом с матричных РНК и поэтому не содержащих интроны, продуцируют в 10–100 раз больше мРНК [247].

Получение трансгенного организма включает три стадии: создание генной конструкции, внедрение ее в геном организма, анализ и селекцию модифицированных организмов. Наиболее разработанной на сегодняшний день является первая стадия этого процесса. Так, если становится известным, что какой-либо признак животного или растения связан с определенным геном, выделить, размножить этот ген и изготовить из него конструкцию для трансгенеза не является сегодня серьезной проблемой.

Сложнее обстоит дело со второй частью работы. Доставку генных конструкций в геном животных осуществляют разными способами, наиболее отработанными из которых являются:

– микроинъекция ДНК в ядро оплодотворенной яйцеклетки;

– применение ретровирусов как средства доставки чужеродной ДНК в геном, поскольку они способны встраиваться в хромосомы клеток;

– получение эмбриональных химер – внедрение в эмбрион генетически трансформированных чужеродной ДНК первичных половых клеток, выделенных из другого эмбриона.

Каждый из этих методов имеет свои достоинства и недостатки.

Микроинъекция ДНК Для получения трансгенных животных чаще всего прибегают к микроинъекции ДНК в яйцеклетки. При этом исследователи стремятся к тому, чтобы трансген содержался во всех клетках животного и обязательно в половых – для передачи потомству. Поэтому перенос генов производят на самых ранних стадиях развития организма. Подходящим временем является пребывание его в состоянии в одной-единственной клетки – зиготы. Классический метод получения трансгенных млекопитающих предусматривает микроинъекцию генной конструкции в одно из ядер свежеоплодотворенной яйцеклетки – до начала ее дробления. Яйцеклетку вымывают из половых путей самки и после микроинъецирования помещают в половые пути другой самки, где она нормально развивается.

Впервые микроинъецирование было произведено в 1974 г. [369]. В то время, до развития технологии рекомбинантных ДНК, единственным источником чистой ДНК служили вирусы. Исследователи вводили в яйцеклетки лабораторных мышей ДНК вируса SV40. Позднее было показано, что инъецированная в яйцеклетки чужеродная ДНК с достаточно высокой вероятностью встраивается в геном и наследуется по законам Менделя [246; 370].

Стало ясно, что не существует никакого видового барьера для интеграции чужеродных генов. Гены можно пересаживать в геном организма другого вида, рода, семейства и т.д. Вскоре было показано, что микроинъекция раствора ДНК в пронуклеус является возможным путем получения трансгенных млекопитающих [327]. После микроинъекции клонированных вирусных ДНК в пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток мыши было доказано их присутствие у части развившихся из таких эмбрионов плодов. Несколько позже было доказано встраивание эукариотических генов в хромосомную ДНК развившихся плодов [610; 612] и взрослых животных, а также передача трансгенов следующей генерации [282; 328; 611].

Первым трансгенным животным с заданными свойствами стала мышь необычно большого размера, содержащая в геноме генную конструкцию с гормоном роста, находящегося под контролем металлотионинового промотора, обеспечивающим экспрессию гена соматотропина [503]. Это явилось мощным толчком для начала работ по применению трансгенеза к сельскохозяйственным животным. Ведь появилась возможность создавать индивидуумы с новыми, необычными свойствами, или с существенно улучшенными привычными признаками.

Сложилась следующая классическая технология получения трансгенеза у млекопитающих:

1. Подготовка доноров и извлечение яйцеклеток.

2. Микроинъекция ДНК в один или оба пронуклеуса яйцеклетки.

3. Пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или, после промежуточного культивирования, в матку синхронизированных реципиентов.

Однако при использовании этой технологии на сельскохозяйственных животных возникли определенные проблемы, связанные с различиями в раннем эмбриональном развитии и морфологии их эмбрионов.

Так, например, при рассмотрении под обычным микроскопом ядерные структуры в эмбрионах крупного рогатого скота и в некоторых случаях в эмбрионах овец и коз неразличимы или просматриваются нечетко из-за темных липидосодержащих гранул. Для визуализации пронуклеусов в эмбрионах овец достаточно использования интерференционной оптики. Для эмбрионов крупного рогатого скота и свиней требуется центрифугирование, в результате которого ядерный материал приближается к клеточной мембране яйцеклетки и становится более различимым.

Таким образом, для успешного выполнения экспериментов по трансгенезу необходимо владеть методами извлечения эмбрионов, их пересадки и ряда прочих манипуляций, а также четко знать время выполнения каждой из операций для каждого вида сельскохозяйственных животных. Несмотря на то, что на сегодняшний день все используемые на практике трансгенные сельскохозяйственные животные получены методом микроинъекций, исследователей не устраивает эффективность этого способа. С наибольшей эффективностью этот метод реализуется на мышах. Эффективность составляет 10%, то есть от 100 животных, взятых в эксперимент можно в среднем получить 10 трансгенных особей. У сельскохозяйственных животных этот показатель по разным данным колеблется от 2–5% [22] до 20,6% (средняя частота интеграции по восьми типам генов) по результатам внедрения чужеродных генов в зиготы кроликов и полученных трансгенных животных [119]. Поэтому, активно ведутся исследования по разработке альтернативных микроинъекции методов трансгенеза у сельскохозяйственных животных [57; 300].

Ретровирусный трансгенез Одним из альтернативных микроинъекционному трансгенезу методов является применение ретровирусов для доставки определенных генов в геном организма-хозяина. Как известно, в процессе своего жизненного цикла, после проникновения в клетку, ретровирус синтезирует со своей РНК обратной транскриптазой, так называемый провирус – ДНК, которая встраивается в хромосому клетки. В дальнейшем трансляция и транскрипция вирусных генов, находящихся в хромосоме клетки-хозяина, дает начало новым вирусным частицам. Таким образом, ретровирусы обладают очень ценным свойством интегрировать в геном клетки и реплицироваться вместе с ним. Если вставить в ретровирусный геном нужные гены и удалить часть вирусных генов для предотвращения размножения вируса, можно получить «самовстраивающуюся» генную конструкцию. Ретровирусные вектора обладают целым рядом положительных особенностей: не ограничено число одновременно обрабатываемых клеток; отсутствует механическое повреждение клеток микроинъекционной пипеткой; все клетки (100%), обработанные таким вектором, будут содержать интегрированную в геном генную конструкцию; трансген интегрируется в геном в одной точке, без образования тандемных последовательностей с большим числом копий трансгена, как это обычно наблюдается при микроинъекционном трансгенезе; интегрированная ДНК точно соответствует провирусному геному, без делеций и вставок. Перечисленные свойства ретровирусных векторов делают их очень перспективными не только для получения трансгенеза у животных, но и для генной терапии, так как имеется возможность обрабатывать такими векторами часть тканей и органов животных или человека.

Одними из первых ретровирусной технологией были получены трансгенные мыши. Из 119 обработанных и пересаженных 8-клеточных эмбрионов мыши было получено 65 особей, 8 из них содержали бактериальный ген neo [363]. Эффективность метода в этом случае составила 7%. Позднее была проведена аналогичная работа, в которой было показано наследование ретровирусных конструкций по закону Менделя, по крайней мере, до третьего поколения [543]. Были получены трансгенные мыши, содержащие экспрессирующий ген -глобина человека [578].

Несмотря на всю перспективность ретровирусной технологии трансгенеза, уровень ее современного развития характеризуется следующими существенными недостатками: клетки и эмбрионы могут быть устойчивы к вирусной инфекции, и в этом случае перенос генов не произойдет; ретровирусы производят инфекционные вирионы, часто онкогенные, возможна активация клеточных онкогенов; теоретически вероятна рекомбинация интегрированного, потерявшего способность размножаться ретровирусного вектора с вирусом дикого типа, с восстановлением способности производить инфекционные вирионы; размер генной конструкции, которая может быть вставлена с использованием ретровирусных векторов, ограничен примерно 8 тысячами пар нуклеотидов [316]. Кроме того, в результате сплайсинга из ретровирусов вырезаются интронные последовательности, которые, как и дистальные или проксимальные элементы, играют важную роль в эффективной экспрессии генов у трансгенных животных [504].

В последнее время в области создания ретровирусных векторов наблюдаются определенные успехи. Создаются ретровирусные вектора, способные интегрировать большое количество чужеродного генетического материала и при этом теоретически утратившие способность к репликации. Разрабатываются многочисленные методы с целью преодоления потенциальной проблемы инфекционной и онкогенной способности ретровирусных векторов, включая получение дефектных вирусов с дефицитом в собственном геноме, приводящем к неспособности синтеза новых вирионов [348; 475]. Благодаря этому достигнуты положительные результаты в получении сельскохозяйственных животных с помощью ретровирусных векторов [200; 266].

Эмбриональные химеры Еще одним методом получения трансгенных животных является использование эмбриональных химер. Суть этого метода в том, что имеется возможность получать и культивировать ранние эмбриональные клетки. Если в дальнейшем подсадить эти клетки в эмбрион, то из такого эмбриона развивается соматическая химера. Часть клеток этого организма имеет культуральное происхождение. Если трансформировать культивируемые эмбриональные клетки до подсадки их в другой эмбрион, то можно получить трансгенную химеру. С определенной степенью вероятности среди потомства такой химеры будут полностью трансгенные особи. Впервые на возможность использования эмбриональных стволовых клеток как векторов для переноса генов показал Mintz [466; 467].

Дальнейшее развитие и совершенствование методов культивирования стволовых эмбриональных клеток сделало возможным получение таким путем трансгенных животных. Были получены трансгенные соматически химерные мыши. Была показана экспрессия генных конструкций в тканях этих мышей. Доля химерных мышей была очень высокой, причем часть из них передавала трансген потомству [534; 587].

Работы по использованию этого метода для получения трансгенных животных активно ведутся. Показана возможность культивировать стволовые эмбриональные клетки свиньи и крупного рогатого скота [487].

Преимущества метода подсадки в эмбрионы трансформированных эмбриональных стволовых клеток для получения сельскохозяйственных животных связаны с тем, что тестирование интеграции и экспрессии трансгена может быть выполнено на клеточных линиях, до получения трансгенного животного; манипуляции с эмбрионами животного выполняются на стадии морулы или бластоцисты, и поэтому могут быть получены без вскрытия брюшной полости животного. Ввиду относительно высокой стоимости отдельного сельскохозяйственного животного, например коровы, – это существенные преимущества.

Прочие методы трансгенеза Использование сперматозоидов в качестве вектора для введения чужеродной ДНК в ооцит, с целью получения трансгенных животных, является одновременно привлекательным, и наиболее противоречивым методом. Способность сперматозоидов связывать чужеродную ДНК впервые была показана в работе Brackett и др. в 1971 г. [243]. В 1989 году Lavitrano с сотрудниками сообщили о получении трансгенных мышей при использовании сперматозоидов в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК в яйцеклетку при ее оплодотворении. Около 30% мышей, полученных из оплодотворенных обработанной спермой яйцеклеток, были трансгенными и передавали трансген потомству [408]. Первые попытки других исследователей воспроизвести этот метод не дали положительных результатов [248]. Позже были опубликованы как положительные, так и отрицательные результаты. С целью тестирования воспроизводимости метода, в экспериментах, выполненных в двух лабораториях, было получено 1755 эмбрионов мышей. Были получены трансгенные особи (п=130, 7%), но они пришлись на 13 экспериментов из проведенных 75. [446]. Проведенные эксперименты доказали, что этим методом трансгенные животные могут быть получены, но атипичное распределение таких животных в экспериментах не поддавалось объяснению. В экспериментах на свиньях проводили отмывку сперматозоидов от семенной жидкости тройным центрифугированием и инкубировали их с генной конструкцией в течение часов. Провели 7 экспериментов. В 4 экспериментах получили отрицательный результат. А по 3 опытам были получены следующие показатели: трансгенных зародышей на стадии бластоцисты выявлено методом ПЦР 18% (48/265), методом блот-гибридизации – 24% (64/265). Среди родившихся поросят в 2-х опытах трансгенных поросят не обнаружили, а в 2-х опытах из поросят трансгенных было 12, т.е. > 50% (по блот-гибридизации). Положительный результат дали пробы ДНК различных органов и тканей: хвост, уши, печень. Экспрессия выявлена в печени у 9 из 12 исследованных поросят. Полученные результаты показали, что перенос гена посредством сперматозоидов может быть успешно применен для получения трансгенных свиней. Однако наблюдалась высокая вариабельность результатов, полученных в разных опытах: от 0% до 62% [410].

Для увеличения эффективности переноса гена с помощью сперматозоидов предложено несколько различных подходов. В лаборатории Sirard [317; 530] было показано, что в результате применения электропорации сперматозоидов осуществлялся перенос гена сперматозоидами, но не было получено точных доказательств об интеграции чужеродного гена в геном полученных эмбрионов.

При использовании моноклональных антител для связывания генной конструкции со сперматозоидами перед хирургическим осеменением свиней около 20% родившихся поросят оказались трансгенными. При этом была подтверждена интеграция чужеродного гена в геном полученных животных, его экспрессия и передача потомкам [269].

Сперматозоиды крупного рогатого скота были трансфецированы липофекцией плазмидной ДНК, содержащей ген GFP (зелёный флуоресцирующий протеин), линеаризованной рестриктазой NotI. С использованием меченой ДНК было показано, что около 80% радиоактивной ДНК находилось в сперматозоидах. Кроме того, было показано, что ген GFP интегрирует в геномную ДНК сперматозоида в сайтах рестрикции NotI. У 30% полученных таким путем эмбрионов показана экспрессия GFP. Было получено 2 трансгенных теленка. В двухмесячном возрасте у 60% лимфоцитов этих телят выявлялось специфическое зеленое свечение. [567].

В дальнейшем на основании изучения механизма взаимодействия сперматозоидов с генными конструкциями была подтверждена возможность использования сперматозоидов в качестве переносчика чужеродного гена в яйцеклетку [446; 581; 644].

ДНК связывается со сперматозоидами не случайным образом, но представляет собой процесс, регулируемый специфическими факторами. Показано, что у большинства видов животных преимущественное место связывания ДНК локализовано в постакросомальной области головки сперматозоида.

Для связывания необходим отрицательный заряд молекулы. Например, отрицательно заряженные молекулы гепарина или протеины с изоэлектрической точкой ниже 7 связываются с этой областью головки сперматозоида аналогично ДНК. Было идентифицировано три больших класса протеинов, связывающих ДНК, как потенциальных субстратов для взаимодействия ДНК с головкой сперматозоида [409; 623].

Эксперименты, проведенные на млекопитающих, ясно показали, что сперматозоиды эякулята не проницаемы для чужеродной ДНК, если не удалена семенная жидкость. Из семенной жидкости млекопитающих выделен фактор ингибирования (IF-I), гликопротеин размером 37 килодальтон (кДа).

В его присутствии ДНК-связывающие протеины на поверхности сперматозоидов теряют способность связывать экзогенную ДНК. На основании этих и других экспериментальных данных предложена модель взаимодействия ДНК со сперматозоидами. Ее суть заключается в том, что при отсутствии естественного ингибитора семенной жидкости чужеродная ДНК связывается на поверхности сперматозоидов с протеинами размером 30–35 кДа. После связывания, интернализация (проникновение) ДНК в ядро происходит в пределах нескольких минут. Посредником этого процесса являются специальные молекулы, присутствующие на мембране сперматозоидов. В комплексе с ДНК они проникают в ядро через поры головки сперматозоида, достигают ядерного матрикса, где ДНК отделяется от комплекса [320]. Ядро сперматозоида не является безопасным местом для экзогенной ДНК, так как ее интернализация активирует метаболические процессы, сходные с апоптозом, который устраняет и ДНК, и сам сперматозоид [445]. Доля экзогенной ДНК, которая связывается с ядром, колеблется от 6 до 29% от общего числа ДНК, связавшейся со сперматозоидом [315]. Имеются данные, что плазмидная ДНК, проникшая в сперматозоиды, тесно связывается с ядерным каркасом, основательно перестраивается и подвергается рекомбинации с ДНК генома сперматозоида [644].

Ввиду большой практической значимости этого метода, он продолжает активно разрабатываться. Успешный перенос экзогенной ДНК с помощью сперматозоидов был показан на нескольких видах животных, включая крупный рогатый скот [567], цыплят [478], свиней [410–412], кроликов [87; 88], различных видов рыб [396]. Однако мало работ, показавших при этом наличие экспрессии чужеродного гена. Более того, если ДНК не проникла в ядро сперматозоида, а только переносится сперматозоидом в цитоплазму яйцеклетки, копии ДНК плазмиды могут быть обнаружены на ранних стадиях развития эмбриона, но не выявляться у взрослых животных.

Таким образом, основываясь на имеющихся литературных данных, можно заключить о перспективности применения сперматозоидов в качестве векторов для генетической трансформации.

Еще одним способом получения трансгенеза у животных является инъекция в многоклеточные эмбрионы животных генных конструкций, упакованных в липосомы. Таким способом были получены трансгенные мыши с геном поверхностного антигена вируса гепатита B [540]. Из 80 инъецированных в этой работе эмбрионов развилось 24 животных, из которых 5 были трансгенными. Также с использованием липосом получены трансгенные куры с геном гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека [157].

Несмотря на очевидные успехи в создании трансгенных организмов и перспективности работ по генной инженерии животных, существует необходимость поиска более эффективных способов трансгенеза. Особенно это актуально в свете имеющихся данных, свидетельствующих о подавлении и сбоях в экспрессии трансгенов [308; 460; 507], что указывает на сложность внутриклеточных механизмов, разрешающих транскрипцию и трансляцию чужеродных последовательностей ДНК. Можно сказать, что в настоящее время так называемая РНК-интерференция представляет собой весьма острую проблему на пути развития трансгенеза. Успех ее решения обещает прорыв в науке и практике современного животноводства [191].

Современные направления использования трансгенеза В настоящее время ведутся активные исследования с трансгенными животными в области роста, новых путей обмена веществ и качества животноводческой продукции, резистентности к болезням, создания «животныхферментеров» и доноров внутренних органов для пересадки человеку [56;

195; 201; 203].

Регуляция роста и обмена веществ С накоплением знаний в области генетической обусловленности и регуляции скорости роста и развития животных, в том числе трансгенных, можно ожидать успехов в этом направлении. Представляется очень перспективной пересадка генных конструкций, связанных с механизмами регулирования обмена веществ животных и важнейших хозяйственно-полезных признаков (удой, рост, шерстность, яйценоскость и др.). Уже накоплен определенный объем научной информации, особенно по пересадке генов так называемого соматотропинового цикла (соматотропин, рилизинг-фактор соматотропина и инсулиноподобный фактор роста).

Важнейшей проблемой животноводства является относительно низкий коэффициент конверсии растительного белка в белок животного происхождения. В процессе селекции и совершенствования систем кормления этот показатель был улучшен, однако он может быть существенно увеличен биотехнологическими методами. Получение трансгенных с.-х. животных с генами соматотропинового цикла позволит резко увеличить эффективность усвоения животными кормового белка. Это показали опыты по влиянию рекомбинантного экзогенного соматотропина на ростовые показатели свиней [159].

Первые трансгенные свиньи с геном соматотропина человека и мышиным металлотиониновым промотором (mMT I-hGH) были получены 1985 году [344]. Они показали более высокую усвояемость корма – до 18%. У потомства трансгенных свиней наблюдались на 16,5% более высокие среднесуточные приросты [525]. Однако не все виды животных одинаково реагируют на повышение уровня соматотропина. Так трансгенные по гену гомона роста овцы не обладали повышенной скоростью роста, но имели более низкое содержание жира [529]. В то же время трансгенные рыбы имели опережающий рост [50]. Методом микроинъекций в ядерный материал зигот была получена крольчиха, полностью трансгенная по гену гормона роста крупного рогатого скота, отличающаяся высокой энергией роста [194].

Другой важнейшей проблемой свиноводства, мясного скотоводства и птицеводства является то, что животные в процессе роста и откорма тратят большое количество питательных веществ на синтез не белка, а жира, расходуя при этом огромное количество энергии корма. Между тем пищевая ценность жира является невысокой. Поэтому перед животноводами встала задача получать животных, в туше которых значительно больше мускульной ткани, а значит и белка, чем жировых отложений. Здесь традиционная селекция также добилась определенных успехов, но по-прежнему огромное количество питательных веществ корма расходуется на синтез жира. Исследования показали, что инъекция соматотропина тормозит процессы синтеза жира.

Следовательно, получение трансгенных животных такого типа может существенно продвинуть селекцию сельскохозяйственных животных в направлении усиления синтеза белка и снижения синтеза жира. Это резко повысит эффективность мясного животноводства и коренным образом улучшит качество продукции. Из опытов по инъекциям гормонов известно, что для ускорения роста необходимо скармливать животным корма с повышенным содержанием протеина (18% сырого протеина) и с дополнительным количеством лизина. У потомства трансгенных свиней, получавшего соответствующий кормовой рацион, наблюдались на 16% более высокие среднесуточные приросты [522; 523]. Также важным изменением у трансгенных по гену гормона роста свиней явилось более чем двукратное уменьшение толщины шпика с 18–20 мм у контрольных свиней, до 7–8 мм у трансгенных [525]. В кормлении сельскохозяйственных животных существует мнение, что генетическая способность в сочетании с существующим стандартом кормления уже себя исчерпала. К этому направлению примыкает и возможность пересадки генов, обусловливающих функционирование регуляторных механизмов воспроизводства животных, создаются предпосылки создания генетически более плодовитых животных. Это повышает интерес к изучению животных – трансгенов. Под руководством академика Россельхозакадемии Л.К. Эрнста во Всероссийском НИИ животноводства (ВИЖ) проводятся исследования по трансгенезу свиней [19–21; 90; 196; 199]. Испытывались различные конструкции, в том числе с геном рилизинг-фактора гормона роста человека. Была проведена оценка ее влияния на биологические и хозяйственные качества в 12 поколениях животных. По мнению автора, полученные результаты позволяют начать работу по созданию нового заводского типа свиней, превосходящего существующие породы по ряду важнейших признаков [204].

Повышение устойчивости к заболеваниям Второе направление – получение промышленных линий животных как с повышенной общей резистенсностью, так и с наследственной устойчивостью к конкретным инфекционным заболеваниям. Добиться этого можно встраиванием в геном животного генов «антисмысловых» вирусных РНК.

Продукт этих генов взаимодействует с матричной РНК вируса, попавшего в организм, мешая его воспроизводству. Реальность такого подхода была продемонстрирована на трансгенных кроликах, устойчивых к аденовирусу [193].

Известно, какой огромный ущерб животноводству наносят болезни, особенно вирусные. При этом следует отметить, что попытки создания устойчивых к болезням популяций животных традиционными методами селекции не дали хороших результатов. Разумеется, еще долгое время главным направлением борьбы с инфекционными заболеваниями животных будет ветеринарная медицина, где генная инженерия также позволяет ускорить получение эффективных методов диагностики, профилактики и лечения болезней.

Но по мере развития генной инженерии сельскохозяйственных животных, часть этих проблем будет решаться созданием генетически устойчивых животных [197].

Примером гена резистентности может служить ген Mx мышей. Мыши, имеющие генотип Mx+ устойчивы к заражению вирусом гриппа А [342; 582;

584]. Этот ген был выделен, клонирован и использован для получения трансгенных животных [583].

Сравнительное изучение иммунного статуса обычных и трансгенных по Мх-гену поросят трехмесячного возраста в норме и при заражении вирусом гриппа свиней, штамм Меротин (Hsw 1N1), включало определение количественных и функциональных параметров, соответствующих первому и второму уровням исследования иммунного статуса человека, принятым в медицинской практике. По большинству параметров обе группы свиней не имели существенных отличий. В группе трансгенных поросят выявлено относительно большее количество Т-лимфоцитов и фагоцитов и меньшее количество В-лимфоцитов. Поросята обеих групп были интраназально заражены вирусом гриппа свиней (титр в РГА 1:1024) в объемной дозе 5 мл. Динамические изменения параметров иммунного статуса у животных обеих групп были практически идентичными и заключались в резком уменьшении фагоцитарной активности нейтрофилов (в группе обычных поросят до нулевых значений), снижении пропорции палочкоядерных нейтрофилов и соответствующем увеличении доли сегментоядерных нейтрофилов. Кроме того, начиная с шестого дня, наблюдали увеличение относительных и абсолютных количеств Т- и В-лимфоцитов, абсолютных количеств Tm- и Tg- клеток. На протяжении всего срока наблюдения у трансгенных поросят было снижено соотношение субпопуляций Т-лимфоцитов, чего не наблюдали у обычных поросят. С другой стороны, количество фагоцитов у трансгенных животных к 13 дню опыта практически восстановилось до исходных значений, у обычных поросят количество фагоцитов к этому сроку оставалось достоверно сниженным относительно исходного значения [104].

Повышение резистентности животных возможно и при создании в организме постоянного фона интерферонов путем пересадки интерфероновых генов с соответствующими промоторами. Были получены трансгенные кролики [17; 188], свиньи [34] и куры [411].

Для сравнительного исследования устойчивости трансгенных и обычных кроликов к вирусу миксоматоза проводили титрование вируса миксоматоза, штамм «B-82». Последовательные десятикратные разведения вируса в четырех повторностях вводили кроликам внутрикожно-подкожно и на протяжении последующих десяти дней учитывали развитие поражений кожи. В качестве активатора МТ-промотора кроликам орально вводили сульфат цинка, который начинали давать в виде 5% раствора в разовых дневных дозах 100, 10 и 1 мг за три дня до введения вируса и в последующие семь дней.

Первые признаки поражение кожи отмечены на 5-е сутки у всех групп кроликов, вне зависимости от генетического статуса и обработки сульфатом цинка. Результаты титрования учитывали ежедневно в течение шести-девяти дней после заражения. Титр вируса рассчитывали по Риду и Менчу. У кроликов, трансгенных по гену -интерферона, при всех трех дозах сульфата цинка титр вируса был на 0,75–1,050/0,1 мл ниже, чем у таких же кроликов, не получавших сульфат цинка, или же у трансгенных по гену -интерферона и обычных кроликов. Вероятно, кролики, трансгенные по гену -интерферона, более устойчивы к миксоматозу по сравнению с обычными и трансгенными по -интерферону [105].

Клиническую и иммунологическую реакцию обычных и трансгенных кроликов на заражение лапинизированным вирусом КЧС исследовали на фоне ежедневного орального введения сульфата цинка (за три дня до введения вируса и в последующие семь дней). После введения вируса КЧС динамика исследуемых показателей (количество лейкоцитов и нейтрофильных фагоцитов, концентрация IgG, бласттрансформация лимфоцитов крови) изменялись одинаково у животных всех групп. Гематологические параметры изменялись на третий день после введения вируса КЧС у всех исследуемых животных, восстанавливались к седьмому дню и оставались без существенных изменений до конца опыта (25 дней). Повышение температуры отмечено у всех обычных и трансгенных по гену -интерферона кроликов, а также у всех трансгенных кроликов, не получавших сульфат цинка. У кроликов, трансгенных по гену -интерферона и получавших сульфат цинка в дозах 100 и 10 мг, температурная реакция отсутствовала или по длительности не превышала одного дня. Таким образом, по клинической реакции трансгенные по гену -интерферона кролики относительно более устойчивы к лапинизированному вирусу КЧС [106].

Принципиально возможно создание и других генных конструкций, которые будут обеспечивать генетическую невосприимчивость животных к определенным болезням [641]. В селекции ближайшего будущего это направление будет занимать все возрастающее место.

Создание «животных-ферментеров»

Одним из направлений трансгенеза является использование животных в качестве продуцентов заданных белков. Уже получены животные с измененным белковым составом молока, синтезирующие в молочной железе чужеродные белки [152; 513].

Развитие этого направления связано с возможностью создания таких генных конструкций, которые при интеграции способны экспрессировать только в определенных органах и тканях, например, в секреторных клетках вымени. Производство биологически-активных веществ уже нашло широкое применение после получения трансгенных микроорганизмов (E.coli, B.subtilis). При наличии таких микроорганизмов в системе микробиологического производства возможно получение большого количества различных биологически-активных веществ, в том числе медицинского назначения. Однако микробиологический синтез невозможен, если производимые белковые молекулы гликозилированы, так как прокариоты лишены механизмов гликозилирования. В этом случае активный продукт может производиться только эукариотическими клетками. Это возможно при использовании культур клеток животных, но эти производства очень сложны и не всегда экономически эффективны. В связи с этим возникла идея создания трансгенных животных, которые с молоком выделяли бы определенные биологически-активные вещества. Генная конструкция из некоторого структурного гена, связанного с промотором гена какого-либо молочного белка (казеина, лактальбумина), в основном должна экспрессировать в клетках молочной железы. В результате синтезированный этим геном пептид будет выделяться в молоко. Подходящим объектом для создания трансгенных форм являются кролики. Эффективность переноса генов у кролика достаточно высока [38; 264].

Использование млекопитающих для производства важных в медицинском и ином отношении белков имеет рад преимуществ по сравнению с микроорганизмами и культурами эукариотических клеток. Так, многие протеины для обретения биологической активности должны претерпеть посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование, карбоксилирование. В микробных рекомбинантных продуктивных системах это, как правило, невозможно. Синтез чужеродного белка в молоко позволяет получать его обычным способом – выдаиванием животного. Синтетическая продуктивность молочной железы очень велика. Концентрация собственных молочных белков в молоке составляет 4–6%, то есть теоретически возможно получать до 60 грамм трансгенного продукта на литр молока. Молоко является чистым и гигиеническим продуктом, поэтому при выделении и очистки из молока чужеродных протеинов не должно возникать неразрешимых проблем. В особенности это касается загрязнения выделенных протеинов прокариотическими остатками и побочными продуктами [22].

Для использования молочной железы в качестве биореактора необходимо наличие соответствующих регуляторных элементов для изготовления генных конструкций [277; 638]. Уже выделены гены и промоторы S1-казеина [458], -казеина, -лактальбумина, -лактоглобулина [569] и других молочных протеинов. Изучение полученных трансгенных животных показано, что у всех животных экспрессия трансгенов происходит тканеспецифически, то есть в молочной железе [216].

Аналогичные работы ведутся на разных видах сельскохозяйственных животных. Получены овцы, в молоке которых содержится фактор свертываемости крови, который необходим для нормального существования больных гемофилией. Расчеты показывают, что десятка таких овец было бы достаточно для обеспечения человечества этим препаратом.

Была произведена трансгенная овца [278], у которой последовательности ДНК кодировали или человеческий фактор IX (FIX) или человеческий 1-антитрипсин (1-AT), вставленные в единицу транскрипции гена -лактоглобулина (белка молока овцы). Человеческий FIX используется при лечении гемофилии; 1-AT используется при лечении эмфиземы. Трансгенная овца, выделяющая биологически активные белки в молоке, была не только получена, но и успешно разводилась. Однако уровни экспрессии этих белков в молоке, были не достаточно высокими для клинического применения.

Для увеличения уровней экспрессии этих генов в молоко на мышах были испытаны разнообразные генные конструкции. Было показано, что сам -глобулиновый ген овцы эффективно и тканеспецифично регулировался в этом удобном экспериментальном виде животных – лабораторных мышах. В частности, исследовалась необходимость наличия интронных последовательностей для эффективной экспрессии, так как ДНК сегменты кодируют разнообразные потенциальные продукты доступные только в форме безинтронных кДНК клонов. Гибридные гены, включающие кодирующие белок последовательности кДНК, присоединенные к 5' и 3' сегментам -глобулинового гена, экспрессировались очень неэффективно в трансгенных мышах. Как оказалось это не было простым требованием сплайсинга, так как включение первого -глобулинового интрона в тестируемую конструкцию не улучшало эффективность экспрессии. По контрасту для 1-AT, гибридный ген, включающий геномный миниген (содержащий три из четырех естественных интронов 1-AT) экспрессировал эффективно в грудной железе. Семь из тринадцати линий мышей экспрессировали этот ген в грудной железе, и четыре из них произвели больше чем 0,5 мг/мл человеческого 1-AT в молоке. Самая высоко экспрессирующая линия производила приблизительно 7 мг/мл человеческого белка. У этой линии белок ясно визуализировался окрашиванием SDSполиакриломидных гелей Кумасси синим, и показал электрофоретическую подвижность, очень близкую к полученному из человеческой плазмы 1-AT.

Биологическая проба, разработанная для измерения трипсин подавляющей активности, показала что 1-AT, полученный из молока мыши, был так же биологически активен как его человеческий аналог, полученный из плазмы.

Затем генная конструкция AATB была введена в овцу. Было получено пять трансгенных животных, четыре из которых были женского пола. Все четыре овцы экспрессировали AATB, и все производили в молоке более чем 1 мг/мл 1-AT. Самое высоко экспрессирующее животное, по кличке Трейси, производило приблизительно 35 мг/мл этого полностью нормального человеческого белка в своем молоке. Полученный белок был биологически активен и соответствующе гликозилирован. Овца может производить свыше 250 литров молока за лактацию, было оценено, что литр молока Трейси стоил приблизительно $ 7000. Это была первая овца в мире стоящая миллионы американских долларов [278].

Есть и другие примеры «живых ферментеров» Например, получены овцы, синтезирующие в молочной железе сычужный фермент химозин, используемый в сыроделии [32; 33; 152]. Получены положительные результаты о возможности использования трансгенных кроликов для получения фармацевтических препаратов. Например, выявленная концентрация человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в молоке трансгенных крольчих составила от 8,80 до 22,3 мг/л, что, по мнению авторов, достаточно для использования этих животных в фармацевтическом производстве [120].

Несмотря на имеющиеся успехи, совершенно очевидно, что процесс получения лекарственных белков и белков технологического направления с молоком животных весьма сложен и трудоемок. К тому же, молочные железы животных зачастую не способны правильно гликозилировать экзогенные белки, что побуждает к поиску других источников получения трансгенных белков.

Для производства лекарственных белков потенциально можно использовать экспрессию трансгенов в других тканях и органах, в таких как семенная жидкость [302; 488], кровь личинок насекомых [452], жировые железы [542], белок птичьего яйца [643]. О направленной экспрессии рекомбинантных белков в определенные ткани или тканевые жидкости, среди которых чаще других используется молоко, написаны обзоры наших ведущих ученых в области создания и изучения трансгенных животных [55; 200].

Трансгенная птица Создание линий трансгенных сельскохозяйственных животных трудоемко из-за достаточно длительного периода их полового созревания, относительно низкой плодовитости и высокой стоимости отдельного животного. С этой точки зрения трансгенная птица обладает большими преимуществами, и многие лаборатории мира работают над проблемой получения трансгенной птицы. Однако особенности ее размножения создают серьезные проблемы для исследователей. Курица образует в сутки одну оплодотворенную яйцеклетку, которая очень велика и нежна для каких-либо манипуляций с ней, как это делается с яйцеклетками млекопитающих при их инъецировании чужеродной ДНК. Для нормального эмбрионального развития птичьей яйцеклетке необходимы третичные оболочки – белковая, подскорлупная и скорлупа.

Дробление куриной яйцеклетки начинается уже в белковом отделе яйцевода, а в свежеснесенном яйце имеется уже 50–60 тысяч клеток. Поэтому первая трансгенная птица была получена с помощью ретровирусных векторов. Ретровирусы были главными претендентами на роль векторов для переноса генов, потому что в нормальных условиях они сами включаются в геномную ДНК хозяина и реплицируются [316]. Поэтому многие исследователи пытались внести чужеродные гены в зародышевую линию, инфицируя эмбрионы как способными к репликации, так и утратившими способность к репликации ретровирусными векторами [241; 286]. Успешное встраивание трансгена в этих опытах составило от 0,8 до 5%. Введение рекомбинантного вектора лейкоза птиц в бластодерму, инкубируемых куриных эмбрионов, дало положительный результат по переносу генетического материала в зародышевую линию [548–550]. С рекомбинантным вирусом были получены полные трансгены [236; 287; 515; 552]. Исследования по дальнейшей разработке технологии использования ретровирусов с целью получения трансгенеза у птиц представляются важными и продолжаются по настоящее время [398; 403; 608].

Существуют два методических подхода получения безвирусного трансгенеза у птиц. Один из них – получение химер подсадкой в эмбрионы чужих клеток. Клетки ранней бластодермы или примордиальные клетки выделяют и инъецируют в их ядра чужеродную ДНК. Затем эти инъецированные клетки имплантируют в эмбрионы, где они приживаются и делятся. Таким путем были получены соматические химеры и химеры зародышевой линии [245;

475; 514]. Полученных химерных особей выращивают и отводят от них потомство. Некоторая часть потомков, происходящих из трансгенных зародышевых клеток, оказываются трансгенными. Главным недостатком этого подхода является малая эффективность клеточных пересадок [245; 514].

Клетки были получены из эмбрионов на стадии X цыплят линии Barred Plymouth Rock (которые имеют черный пигмент в их перьях из-за рецессивного аллеля в I локусе) и введены в подзародышевую полость эмбрионов от имбредной линии Dwarf White Leghorns (которые имеют белые перья из-за доминантного аллеля в I локусе). Из 53 эмбрионов Dwarf White Leghorn, которым были введены бластодермальные клетки Barred Plymouth Rock, 6 эмбрионов (11,3%) были фенотипическими химерами относительно цвета пера и один из них (петушок) дожил до вылупления. Распределение черных перьев в реципиентах было переменно и не ограничивалось какой-либо специфической областью, хотя в одном случае донорское происхождение клетки было выражено на голове. Этот соматически химерный петух был скрещен с несколькими курицами Barred Plymouth Rock, чтобы определить степень, с которой донорские клетки были включены в семенники. Из 719 цыплят, полученных от этих спариваний, два были фенотипически Barred Plymouth Rocks. Это означало, что клетки способные к превращению в клетки зародышевой линии были переданы реципиентам. Фингенпринт (метод генных отпечатков) ДНК из крови и спермы зародышевых химер показал, что обе эти ткани отличаются от тканей имбредной линии Dwarf White Leghorns [514].

Впоследствии было показано, что клетки зародышевой линии могут быть эффективно перенесены и интегрированы в эмбрион [245]. Эти и аналогичные работы других исследователей [305; 557] показывают, что выделение, перенос и внедрение примордиальных зародышевых клеток может иметь применение для получения трансгенов в птицеводстве. Методические приемы применения эмбриональных клеток в качестве переносчиков чужеродной ДНК с целью получения трансгенной птицы продолжает разрабатываться в России [153–155; 158]. Технология получения трансгенных эмбриональных химер активно развивается и в таких странах, как США и Япония, и на сегодняшний день является основным претендентом на создание коммерчески значимых трансгенных линий птицы. Технология эта весьма сложная и дорогостоящая, включает такие стадии, как выделение и культивирование первичных половых клеток, их последующую трансфекцию чужеродной ДНК и подсадку в ранние эмбрионы [418; 476].

Получение трансгенной птицы с использованием искусственного осеменения, традиционно и широко используемого в птицеводстве приема, выглядит очень перспективно. Все большее число птицеводов-селекционеров говорит о грядущем генно-инженерном конструировании новых промышленных линий и кроссов с использованием, в том числе генофонда редких и исчезающих пород птицы. Были проведены исследование по использованию спермиев в качестве вектора переноса чужеродной ДНК в яйцеклетки кур. С использованием меченой ДНК было показано, что около 80% радиоактивной ДНК находилось в сперматозоидах. Кроме того, было показано, что ген GFP (зелёный флуоресцирующий протеин) интегрирует в геномную ДНК сперматозоида в сайтах рестрикции NotI. Как сообщают авторы, при использовании данной технологии на курах, 90% (17/19) цыплят экспрессировали GFP, и 80% (25/30) их потомков проявляли тот же эффект [567].

Липофектин взаимодействует с ДНК, формируя липид-ДНКкомплексы, которые могут слиться с плазматической мембраной клетки, обеспечивая проникновение ДНК внутрь клетки. При использовании липофектина 51,6% сперматозоидов петуха содержали экзогенную ДНК. В результате искусственного осеменения кур семенем, трансфецированным с помощью липофектина, экзогенная ДНК выявлялась в бластодерме 67% оплодотворенных яиц. Однако включение чужеродной ДНК в геном вылупившихся цыплят не наблюдалось, хотя у этих цыплят была отмечена эписомальная интеграция чужеродной ДНК [478].

Для увеличения эффективности переноса гена с помощью сперматозоидов (sperm-mediated gene transfer, SMGT) предложено дополнить метод использованием рестрикционных ферментов (restriction enzyme mediated integration, REMI). Линейная ДНК, вместе с рестриктазой вводится в клеткумишень путем липофекции или электропорации. Предполагается, что рестриктаза затем разрезает геномную ДНК для облегчения интеграции экзогенной ДНК с соответствующими «липкими» концами [346].

Получены трансгенные куры с геном гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека методом искусственного осеменения трансфецированной спермой с применением липосом. Выход полученных трансгенных цыплят составил 33,3% [128].

С использованием сперматозоидов петуха, в качестве вектора трансформации, получены трансгенные куриные эмбрионы с генами -галактозидазы. Эффективность трансформации яйцеклеток составила 23% от числа оплодотворенных яиц [68; 178].

Применение технологии микроинъекций ДНК к птице чрезвычайно затруднительно из-за феноменально большого размера ооцита. Тем не менее некоторые исследовательские коллективы изучали возможность такого подхода. Была предпринята попытка инкубировать in vitro оплодотворенные куриные яйцеклетки, извлеченные из верхней части белкового отдела яйцевода.

На этой стадии куриный эмбрион находится на одноклеточной стадии развития, поэтому существует теоретическая возможность проведения микроинъекции чужеродной ДНК. Было показано, что существует возможность культивировать оплодотворенную куриную яйцеклетку в скорлупе с белком от другой курицы [541].

Эта система культивирования эмбрионов цыпленка была в дальнейшем усовершенствована. Оказалось возможным получить in vitro эмбриональное развитие извлеченной оплодотворенной яйцеклетки курицы вплоть до вылупившихся цыплят [212; 510; 554]. Метод включает три стадии, с учетом различных потребностей эмбриона в течение развития, и предполагает использование яичной скорлупы как сосуда для культивирования. Первоначальный вариант предусматривал культивирование эмбрионов в стеклянных банках в течение первых 24 часов с последующим перемещением яйцеклеток из сосуда в сосуд (скорлупы) для культивирования между стадией I и стадией II и между стадией II и стадией III. Позже метод был упрощен культивированием на первой стадии развития в скорлупе, и поэтому исключена необходимость перемещения эмбриона из стеклянного контейнера в скорлупу. В результате количество вылупившихся жизнеспособных цыплят, полученных из культивированных яйцеклеток, достигло 20%. Такое культивирование может использоваться для различных экспериментальных целей, поскольку обеспечивает доступ к развивающемуся эмбриону от одноклеточной стадии до стадии вылупления. Различные стадии системы культивирования могут использоваться по отдельности, в зависимости от экспериментальных требований.

Была исследована возможность инъекции чужеродной ДНК с последующим культивированием эмбриона, как метод для производства трансгенной птицы. Для инъекций использовали генную конструкцию с репортерным геном -галактозидазы. Экспрессия генной конструкции в течение первых семи дней развития была исследована гистохимическим анализом на -галактозидазную активность в тканях эмбрионов. Окрашенные клетки сначала наблюдались в середине дробления (250–500 клеток) в центре бластодиска. На второй день они были видны в больших долях бластодермы и в более поздних стадиях в пропорционально меньших долях внезародышевых оболочек. В эмбриональных областях -галактозидаза-позитивные клетки были рассеяны около примитивной полосы большинства культур, но после гаструляции они присутствовали в эмбриональной ткани только у 7% выживших эмбрионов. Эти наблюдения свидетельствовали о транскрипциональной активности в течение стадий дробления развития птицы и подтверждали предыдущие результаты этих исследователей о потере экзогенной ДНК в течение раннего развития цыпленка.

Результаты инъекции чужеродной ДНК на стадии единственной клетки, с последующим укороченным культивированием эмбриона, показали, что включение введенной ДНК в хромосомы цыпленка сравнительно редкое событие. Такая интеграция может быть замаскирована присутствием внехромосомных копий введенных плазмид [554].

Этот подход, разработанный в институте Roslin (Шотландия), был успешно использован при создании трансгенной птицы [431; 455; 456]. Метод включает прямую инъекцию генной конструкции в цитоплазму свежеоплодотворенной яйцеклетки курицы, с последующей его инкубацией до вылупления. Яйцеклетки для инъекции извлекали из белковой области яйцевода курицы, где они уже покрыты тонким слоем белка, но без скорлупы. Комплексная система культивирования была усовершенствована, с целью оптимизации выживания извлеченной и инъецированной яйцеклетки. Система попрежнему включает три стадии и основана на использовании яичной скорлупы как сосуда для культивирования, и жидкий белок, разбавленный раствором соли – как питательную среду. На первой стадии культивирования, которая продолжается в течение 24 часов, инъецированная яйцеклетка помещена в скорлупу с окошком, содержащую небольшое количество питательной среды, так, чтобы зародышевый диск не был закрыт. В течение этой стадии, эмбрион развивается на желтке от одной клетки до бластодермы с 60000 клетками, характерной для снесенного яйца. Скорлупа затем заполняется разбавленным белком, чтобы полностью погрузить эмбрион, и окошко в скорлупе закрывается липкой лентой. Вторая стадия продолжается 65 часов и за это время должен развиться эмбрион с функционирующим сердцем и внезародышевым кровообращением. Для третьей и самой длинной стадии, которая продолжается до вылупления, эмбрион с его желтком и питательной средой, перемещают во вторую, бльшую по размеру скорлупу. Это обеспечивает искусственное воздушное пространство, необходимое в течение парафетального периода, когда эмбрион начинает дышать атмосферным воздухом своими легкими и готовится к вылуплению. Когда начинается легочная вентиляция, за 1–2 дня до вылупления, заклеивающая пленка перфорируется для пропуска воздуха в воздушную камеру яйца. В заключение, заклеивающая пленка ослабляется так, чтобы вылупляющийся цыпленок мог выйти из скорлупы.

Яйцеклетка для инъекции должна быть получена сразу после оплодотворения и, следовательно, её движение вниз по яйцеводу прерывается. Инкубация в течение стадии I имеет место как бы в суррогате яйцевода – инкубаторе с 42°C (температура тела птицы), высокой относительной влажностью и высоким уровнем углекислого газа (со связанной гипоксией). В конце первой стадии имеется короткий период при температуре комнаты, чтобы имитировать яйцекладку (снесение яйца). Инкубационные условия в течение стадий II и III, эквивалентные периоду искусственной инкубации нормальных куриных яиц, изменены по сравнению с традиционно используемыми в птицеводстве. Относительная влажность поднята примерно до 75% вплоть до дня инкубации, затем ее уменьшают примерно до 65% до стадии вылупления. Во второй стадии, частота поворотов увеличена, и культуры поворачивают четыре раза в час. В третьей стадии поворачивающийся угол уменьшен, чтобы предотвратить эмбрион от касания липкой пленки, которая закрывает окно в скорлупе.

Производство трансгенных цыплят этим методом – достаточно сложная задача. Только 50% инъецированных яйцеклеток доживает до III стадии, и уровень вылупления низок – в пределах 15%. Однако анализ на трансгенность эмбрионов и цыплят, полученных в этих экспериментах, обнадеживает.

При использовании чувствительной методики – полимеразной цепной реакции (ПЦР) – было показано, что образцы ДНК от почти половины эмбрионов и цыплят, проживших последние 12 дней культивирования, содержат трансген. Двое из вылупившихся цыплят содержали трансген в хориоаллантоисной мембране, крови и пульпе ребра. У одного петушка количество трансгена сохранялось до его половой зрелости. Его сперма также содержала трансген (конструкцию репортерного гена), который был успешно передан к 3,4% его потомства, то есть 14 из 412 полученных от него цыплят. Этим методом были получены трансгенные куры и показано наследование трансгена. Все первичные трансгенные особи были мозаичными. В дальнейшем наследование трансгена происходило в соответствии с законом Менделя. По сообщениям авторов, до стадии вылупления при культивировании достигало около 60% эмбрионов. Однако, при воспроизведении этой методики в других лабораториях, этот показатель не превышал 3–10% [304].

Другой вариант микроинъекций ДНК в яйцеклетки птиц, разработанный во ВНИТИП, предусматривает образование третичных оболочек яйцеклетки естественным образом, в половых путях птицы. В основе метода лежит хирургическая операция, которая обеспечивает доступ к яйцеклетке, проведение в нее инъекции ДНК, и имплантацию обратно в яйцевод для формирования полноценного инкубационного яйца [62; 63; 172; 173; 192].

Дальнейшее совершенствование этого методического подхода позволило проводить инъекции ДНК в яйцеклетки без их извлечения из половых путей птицы, вследствие чего существенно возросла эффективность метода [67; 77;

310; 388]. Этим методом были получены трансгенные куры с геном гормона роста человека [65], геном -галактозадазы [64], геном человеческого -интерферона [79] и перепела, трансгенные по гену гормона роста быка [66;

76; 176]. Основное достоинство этого метода заключается в отсутствии необходимости использования сложной аппаратуры и сред для культивирования эмбрионов in vitro, выделения и пересадки бластодермальных или примордиальных клеток.

Таким образом, основываясь на литературных данных, показано, что трансгенная птица может быть получена без помощи ретровирусов и что создание трансгенных популяций является выполнимой задачей.

Для достижения успеха и практического использования, трансгенная птица должна иметь фенотип, который превосходил бы уровень, уже достигнутый в птицеводстве. Например, увеличением скорости роста, улучшением конверсии корма, яйценоскостью, уменьшением ожиренности тушки, увеличением устойчивости к заболеваниям и т.д.

Трансгенная птица с генами, обеспечивающими производство полезных фармацевтических белков, накапливающихся в яйце, также может иметь широкое практическое использование [156; 347; 365; 366; 421; 422; 551]. Что касается птицеводства, то использование трансгенеза для переноса полезного гена даже от одной линии птицы к другой (что достижимо обычными селекционными методами) дает минимум 7–8 летний выигрыш и возможно экономию денежных средств за счет исключения возвратных скрещиваний, необходимых для удаления ненужных генов, передающихся при естественной половой гибридизации. Однако истинные выгоды от переноса генов будут понятны со временем после создания и полного изучения полученной трансгенной птицы [202–204; 348; 553; 631].

1.2. Экспрессия вителлогенинового гена и биосинтез вителлогенина в печени кур Экспрессия гена – это процесс реализации информации, закодированной в структуре ДНК, на уровне РНК и белков. В настоящее время в понятие гена кроме кодирующей области ДНК входят также сигнальные и регуляторные последовательности ДНК, обеспечивающие экспрессию. Знание регулирующей и кодирующей области гена, отвечающей за определенную биологическую функцию, позволит сократить время, трудовые и материальные ресурсы для достижения экономического результата селекционной работы.

В последние годы одним из ведущих направлений в науке о наследственности стала молекулярная генетика. Чем глубже удается ученым изучить организм, тем больше выявляется глубоких причинных связей, лежащих в основе всех признаков жизнедеятельности организма. Это открывает новые горизонты перед селекционерами: объектом отбора становится не конечный продукт онтогенеза (признак), а те или другие промежуточные звенья метаболизма, от которых зависит формирование конкретного признака. В настоящее время накоплен большой объем знаний об отдельных аспектах регуляции активности генома, что открывает возможности для уточнения, расширения и приложения научных данных к конкретным задачам научного птицеводства.

Одним из факторов регуляции активности генома у высших эукариотов являются стероидные гормоны. С наступлением яйцекладки в печени кур, играющей доминирующую роль в липидном обмене, значительно усиливается функциональная активность, в частности начинается синтез белковых и липидных компонентов желтка, которые поступают в кровь и затем поглощаются желточными фолликулами. Регуляция этих процессов находится под контролем эстрогенов, следовательно, имеется возможность их моделирования введением эстрогенов цыплятам. Ввиду отсутствия у цыплят фолликулов белковые и липидные предшественники будут накапливаться в крови, и их концентрация позволит судить об изменении синтетической активности печени, связанной со становлением ее вителлогенной функции. С использованием экзогенного эстрогена диэтилстильбэстрола была проведена функциональная оценка репродуктивной системы кур в раннем возрасте [127; 169], что определило научный интерес детального изучения эстрогениндуцированного вителлогенеза печени у цыплят на уровне макромолекул.

Становление вителлогенной функции в печени цыплят под влиянием экзогенного эстрогена сопровождается значительным усилением биосинтетических процессов. Происходит экспрессия до этого «молчащих» генов. В реализации генетической информации ведущее значение принадлежит рибосомам, так как на них осуществляется перевод заложенной в генах информации в аминокислотные последовательности синтезируемых белков. Содержание рибосом в клетках определяет потенциальный уровень белкового синтеза, поэтому одной из задач исследований было выявить связь биогенеза рибосом с рядом других факторов, лежащих в основе становления вителлогенной функции печени кур.

Эстрогениндуцированный вителлогенез как модель для изучения экспрессии генов Гормональная индукция является очень удобным приемом в молекулярной биологии для анализа различных молекулярных механизмов регулировки экспрессии генов. Главной проблемой большинства гормониндуцированных систем является сложность ответа ткани-мишени после гормональной стимуляции. Например, такая система как индуцированный тироксином метаморфоз у амфибий, трудна для изучения непосредственно молекулярных механизмов действия гормона на уровне генома, так как в ней имеет место клеточная пролиферация, гибель клеток, индукция и ингибирование многочисленных биохимических параметров. В отличие от множества гормониндуцируемых систем эстрогенстимулированный вителлогенез обладает целым рядом преимуществ:

1. Вителлогенин представляет собой довольно уникальный по своим свойствам белок, что способствует его легкой идентификации и количественному определению. Эстроген вызывает синтез большого количества вителлогенина и поэтому есть возможность выделения вителлогениновой мРНК с высокой чистотой и большим выходом.

2. Индукцию синтеза вителлогенина вызывает 17--эстрадиол (или его синтетические аналоги), хорошо изученная молекула, регулирующая экспрессию генов, поэтому этот гормон может быть использован для выделения и характеристики рецептора, участвующего в регуляции генома.

3. Тканью-мишенью эстрадиола является печень – относительно гомогенная популяция клеток, которая не пролиферирует после обработки гормоном [378]. К тому же все гепатоциты одинаково реагируют на гормон. Это отличает данную модель от других гормониндуцируемых систем, где значительная клеточная пролиферация предшествует синтезу специфического продукта в большом количестве. Особенно это относится к хорошо известной овальбуминовой системе, где экстенсивная клеточная пролиферация и дифференцировка эпителиальной ткани после первичной стимуляции эстрогеном предшествует синтезу овальбумина.

4. Индукция синтеза вителлогенина происходит также и у самцов, которые в норме не продуцируют этот белок. Эстрадиол активирует гены, которые полностью «безмолвны» при нормальном развитии гепатоцитов самцов. Эта необычная особенность отсутствует у большинства других изученных гормониндуцируемых систем.

5. Гормональная индукция полностью обратима, то есть синтез вителлогенина прекращается после удаления гормона, в то время как гепатоциты остаются способными к последующим индукциям.

6. Индукция эстрогеном синтеза вителлогенина может происходить в органных культурах печени [262; 296]. Модель in vitro особенно удобна для изучения раннего эффекта действия гормона, так как позволяет метить макромолекулы с высокой удельной активностью.

Местом синтеза большинства желточных белков у яйцекладущих позвоночных является печень. Белки желтка в основном происходят из вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП), синтез которых начинается в печени самок по достижении ими репродуктивного периода.

Вителлогенез наиболее изучен у африканской шпорцевой лягушки ксенопуса и у кур.

С наступлением яйценоскости печень курицы приобретает новую репродуктивную функцию без утраты предсуществующих. Эта дальнейшая дифференцировка уже специализированной ткани находится под контролем эстрогенов. Синтез вителлогенина может быть вызван также у самцов и неполовозрелых животных введением им эстрадиола. Этот феномен позволяет изучать гормониндуцированную экспрессию до этого «молчащих» генов.

Действие эстрадиола на печень, приводящее к включению определенных генов, заключается в том, что эстрадиол в комплексе с цитоплазматическим рецептором переносится на хроматин, где он и действует на генном уровне.

Печень цыпленка приобретает способность отвечать синтезом вителлогенина на введение гормона, начиная с 18–20 дня эмбриогенеза [378]. После введения гормона в течение первых 48 часов отмечается увеличение массы печени, содержания ДНК, РНК и печеночного белка в ней [52]. Печень приобретает бледный оттенок и «ожиревший» вид, клетки увеличиваются в объеме, гипертрофируется эндоплазматический ретикулум, увеличивается содержание мембранных компонентов, гипертрофируются ядрышки гепатоцитов [420]. Значительно увеличивается в печени общее содержание липидов, особенно триглицеридов. После эстрогенизации цыплят и петухов, их печень начинает секретировать не только вителлогенин, но и значительное количество липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП). У цыплят они представлены в основном двумя видами: ЛОНП I и ЛОНП II. Апопротеин ЛОНП I представляет собой полипептидную цепь массой около 350000 дальтон [637]. ЛОНП II представляет собой субъединицу белка массой 12000. После синтеза и секреции ЛОНП I и ЛОНП II находится в крови в виде сложной структуры с очень низкой плавучей плотностью, содержащей другие белки, триглицериды, фосфолипиды и холестерин. Липиды составляют до 90% массы этого комплекса [267; 270; 637]. Также как и вителлогенин, эта сложная структура поступает в желток и служит питанием для развивающегося эмбриона.

После индукции эстрадиолом в печени цыплят появляются полисомы, синтезирующие вителлогенин, число которых в течение трех дней увеличивается линейно. На максимуме ответа вителлогениновые полисомы составляют 10% от общих и 17% от мембраносвязанных полисом [240]. Наряду с вителлогениновыми имеются полисомы большего размера, которые, повидимому, синтезируют полипептид с массой значительно больше вителлогенина [537]. Индукция вителлогенина увеличивает содержание рибосом в печени, содержание которых на максимуме ответа примерно в два раза превышает начальный уровень [443]. Увеличение содержания рибосом коррелирует с изменением активности ядрышковой РНК полимеразы, которая через 24 часа после эстрогенизации увеличивается в 2,5–4 раза [226; 233; 624]. После эстрогенизации изменяется рибонуклеазная активность в печени. Было показано, что рибонуклеазная активность печени эстрогенизированных цыплят составляет 60% от контрольного уровня на четвертые сутки после эстрогенизации [624]. Такое падение активности рибонуклеаз связывают с появлением в печени эндогенного ингибитора рибонуклеаз, синтез которого также индуцируется эстрадиолом. Использование п-хлормеркурибензоата показало, что этот ингибитор содержит SH-группы, подобно ингибитору рибонуклеаз печени крыс. Печень эстрогенизированных петухов содержит избыток ингибитора, который локализуется в растворимой фракции цитоплазмы, и добавление цитозольной фракции печени эстрогенизированных цыплят предотвращает распад РНК эндогенными нуклеазами в гомогенатах печени контрольных петухов. Следует отметить, что ингибитор из печени крыс в этих условиях эффективен лишь частично; это показывает определенную степень видовой специфичности ингибитора [297]. Изменение активности рибонуклеаз является важным фактором внутриклеточного метаболизма РНК. Снижение рибонуклеазной активности в цитоплазме приводит к увеличению жизни полисом, и, следовательно, к увеличению эффективности использования тРНК, мРНК и рибосом при биосинтезе белка. Эстрогенизация приводит также к изменению эндонуклеазной активности в ядрах печени. Было отмечено изменение отдельных стадий процессинга рибосом. Так, у неэстрогенизированных петухов пул 3,6106 пре-рРНК составляет 25% от пула 1, пре-рРНК, а через 26 часов после эстрогенизации это значение составляет 40% [227].

Эстрогенизация вызывает изменения активности некоторых ферментов липогенеза. После эстрогенизации неполовозрелых цыплят в их печени увеличивается активность АТФ-цитрат лиазы на 30%-40% и малатдегидрогеназы на 10–20%. Было также показано, что эстрадиол не влияет на активность ферментов гликолиза, глюконеогенеза и метаболизма аминокислот. Эти результаты говорят о том, что индуцируемое эстрадиолом увеличение липогенеза в печени является результатом специфического действия, а не только общего увеличения метаболизма в печени [509]. Эстрогенизация приводит к изменению синтеза некоторых белков печенью петухов. Введение эстрадиола снижает синтез сывороточного альбумина, что обусловлено уменьшением содержания альбуминовой мРНК в печени. Если у контрольных петухов активность альбуминовой мРНК составляет 10% от общей матричной активности, то после эстрогенизации содержание ее падает и на 12 день составляет 5% [636].

Интерес представляют изменения в метаболизме транспортных РНК, вызываемые эстрадиолом. Печень петухов обладает способностью деаминоацилировать определенную часть сериновых тРНК. После введения гормона эта способность модифицируется и лишь очень небольшая часть сериновых тРНК подвергается деаминоацилированию [335]. Отмечены изменения во времени жизни некоторых видов сериновых тРНК. После эстрогенизации время жизни сериновых тРНК с кодоном АГУ(Ц) увеличивается с 3,1 суток до 6,2; а тРНК с кодоном УЦУ(Ц, А) не изменяется (2,6 суток). Деградация тРНК, по-видимому, связана с частотой их использования при белковом синтезе. Изменения времени жизни тРНК помогают понять, каким образом популяция тРНК адаптируется к аминокислотному составу синтезируемого белка [387]. Кроме того, изменения времени жизни отдельных тРНК может играть регуляторную роль в синтезе белка на уровне трансляции. Возможно, что более эффективное «использование» вителлогениновой мРНК на поздних этапах эстрогенстимулированного вителлогенеза [238; 546] обусловлено также адаптацией по составу пула тРНК к аминокислотному составу вителлогенина.

Все имеющиеся данные показывают, что индукция синтеза вителлогенина основывается на накоплении вителлогениновой мРНК в цитоплазме.

Это означает, что действие эстрадиола на печень является действием его на ядра клеток печени; эстрадиол включает или ускоряет транскрипцию генов.

Первым подходом к изучению действия эстрадиола на транскрипционном уровне было изучение активности ферментов, участвующих в синтезе РНК.