«Абрамова Людмила Юрьевна Особенности гриппа у разных видов птиц в экспериментальных условиях и эффективность методов выявления возбудителя 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с ...»

Федеральное государственное учреждение

«Федеральный центр охраны здоровья животных»

На правах рукописи

Абрамова Людмила Юрьевна

Особенности гриппа у разных видов птиц

в экспериментальных условиях

и эффективность методов выявления возбудителя

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, лауреат премий Ленинского Комсомола и Правительства РФ в области науки и техники Власов Николай Анатольевич Владимир –

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………. 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………….. 1.1. Классификация и номенклатура вируса гриппа птиц

1.2. Состав и морфология вируса гриппа

1.3. Репродукция вирусов гриппа А

1.4. Устойчивость вируса к физико-химическим факторам

1.5. Биологические свойства вируса гриппа

1.6. Источники и пути передачи инфекции

1.7. Восприимчивые животные

1.8. Особенности инфекции у разных видов птиц

1.9. Наиболее значимые эпизоотии гриппа А среди птиц

1.10. Эпизоотия азиатского вируса подтипа H5N1

1.11. Профилактика и мероприятия по ликвидации эпизоотических очагов

1.12. Лабораторная диагностика гриппа птиц

1.13. Заключение по обзору литературы

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………………………… 2.1. Материалы

2.2. Методы

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.3.1. Особенности гриппа птиц

2.3.1.1. Особенности гриппа A/H5N1 у цыплят

2.3.1.2. Особенности гриппа птиц А/H5N1 у мускусных утят......... 2.3.1.3. Особенности гриппа А/H5N1 у крякв

2.3.1.4. Особенности гриппа А/H5N1 у серых гусят

2.3.1.5. Особенности гриппа A/H7N1 у цыплят

2.3.2. Применение экспресс-тестов для обнаружения вируса гриппа А в пробах биоматериала………………………………………………………….. 2.3.3. Разработка «Набора для выявления антител к вирусам ньюкаслской болезни и гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 в реакции торможения гемагглютинации»………………………………………………. 2.3.3.1. Получение расплодок вирусов

2.3.3.2. Получение антигенов вирусов

2.3.3.3. Получение гипериммунных и нормальной сывороток крови кур ………………………………………………………………. 2.3.3.4. Применение диагностического набора для исследования сывороток крови птиц в РТГА

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ…...……………… 4. ВЫВОДЫ…………………………………………………………………… 5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ…………………………………….. 6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ………………………. ПРИЛОЖЕНИЯ………………………………………………………………..

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЭЭИ – амноэтиленамин БПЛ – бета-пропиолактон ВГП – вирус гриппа А птиц ВНБ – вирус ньюкаслской болезни ГАЕ – гемагглютинирующая единица ГЛА – гидролизат лактальбумина ГП – грипп Аптиц ИФА – иммуноферментный анализ КЭ – куриный эмбрион МГ – микоплазма галлисептикум НБ – ньюкаслская болезнь РГА – реакция гемагглютинации РДП – реакция диффузной преципитации РНК – рибонуклеиновая кислота РТГА – реакция торможения гемагглютинации РТНА – реакция торможения нейраминидазной активности СПФ – свободный от патогенных факторов ССЯ-76 – синдром снижения яйценоскости – ФБР – фосфатно-буферный раствор ЭИД50/СМ3 - 50%-ная эмбриональная инфицирующая доза ЭЭЖ – экстраэмбриональная жидкость НА – гемагглютинин IVPI – индекс патогенности при внутривенном способе заражения IZSve - Институт зоопрофилактики, Италия lg – логарифм с основанием десять log2 – логарифм с основанием два NA – нейраминидаза NVSL – Национальная ветеринарная лаборатория, г. Эймс, США

ВВЕДЕНИЕ

Вирус гриппа птиц относится к роду Influenzavirus А семейства Orthomyxoviridae. Различные штаммы могут существенно различаться по вирулентности, биологические свойства вируса гриппа А разнообразны. Высоковирулентные штаммы способны вызвать острую контагиозную болезнь, сопровождаемую системным поражением различных тканей и органов, причем смертность может достигать 100%. Высокопатогенный грипп птиц включен в перечень карантинных и особо опасных болезней животных и способен к эпизоотическому распространению (8, 146, 147, 208).

Низковирулентные штаммы, как правило, не вызывают клинически выраженных признаков болезни и патологических изменений в органах, однако могут существенно изменять свои вирулентные свойства в зависимости от целого ряда факторов (209, 226).

За последнее десятилетие эпизоотическая ситуация по высокопатогенному гриппу птиц в мире значительно изменилась (10, 54, 56, 63, 71, 90).

Прежде всего, повышенное внимание сотрудников ветеринарных служб вызвано распространением вируса гриппа А/H5N1, сформировавшегося в странах Азии и вызвавшего эпизоотию среди диких и сельскохозяйственных птиц (54, 62, 75, 109). Первые случаи заболевания на территории Российской Федерации были зарегистрированы в июне 2005 г. в Западной Сибири, и затем очаги болезни возникали с различной периодичностью в Сибирском, Уральском, Южном, Центральном и Дальневосточном федеральных округах на протяжении 2005 – 2010гг. Следует отметить, что в нескольких регионах, кроме диких птиц, пострадало птицепоголовье в населенных пунктах и промышленных птицеводческих предприятиях (3, 10, 16, 25, 26, 27, 31, 40, 50).

Начиная с 2005г. вспышки болезни, вызванные высокопатогенным вирусом А/H5N1, регистрировали в странах Азии, Европы и Африки, причем в некоторых регионах болезнь стала эндемичной (54, 65, 89, 97). Особое беспокойство вызывают случаи распространения за пределы стран Азии генетически отличных форм вируса и их вероятная эволюция в новых экосистемах (49, 115).

Существенную угрозу для птицеводства Российской Федерации представляет вирус высокопатогенного гриппа подтипа Н7, за последнее десятилетие вызвавший вспышки болезни в странах Европы (Италия, 1999-2000гг., Голландия, Бельгия и Германия, 2003г., Англия, 2008г.), Азии (Корея, 2005г.), а также в Чили (2002г.) и Канаде (2003 и 2007гг.). Всего погибло и было уничтожено примерно 60 миллионов сельскохозяйственных птиц, а также нанесен значимый урон популяциям диких птиц (54, 63, 64, 94, 95, 131, 232). Возможный занос и распространение вируса может причинить значимый экономический ущерб птицеводческой отрасли Российской Федерации.

Своевременная постановка диагноза является залогом успешного выполнения последующих ветеринарно-санитарных мероприятий и позволяет значительно снизить возможный ущерб. В комплексе диагностических мероприятий решающее значение имеет лабораторная диагностика гриппа птиц.

Однако, существенное влияние на результаты лабораторных исследований может оказать качество и скорость выполнения преаналитических (долабораторных) мероприятий, которые, как правило, осуществляются в полевых условиях и менее всего стандартизированы. Факторы, влияющие на проведение данного этапа работ, весьма разнообразны и включают клиническое состояние животного на момент обследования (вид и возраст животного, диагностические и лечебные мероприятия, иммунный статус, наличие ассоциированных заболеваний и др.), условия отбора проб биоматериала и др. По различным оценкам до 80% ошибок приходится на преаналитический этап лабораторных исследований (20), причем наиболее распространенные ошибки связаны с процедурой сбора, хранения и транспортировкой проб биоматериала. Учитывая разнообразие клинических признаков и патологоанатомических изменений при гриппе птиц, определенные трудности возникают и при постановке предварительного диагноза, что препятствует своевременному проведению ветеринарно-санитарных мероприятий и ликвидации очага болезни.

Таким образом, очевидна необходимость изучения особенностей течения высокопатогенного и низкопатогенного гриппа птиц, вызванного современными эпизоотическими штаммами вируса, а также выбор органов различных видов птиц, содержащих наибольшее количество вируса и пригодных для дальнейших лабораторных исследований. Описание клинических признаков и патологоанатомических изменений у различных видов птиц также является актуальной задачей для ветеринарной практики.

Цель и задачи исследований. Цель работы - изучить особенности гриппа, вызванного эпизоотическими изолятами вируса у разных видов птиц, и оптимизировать преаналитические мероприятия для постановки предварительного диагноза в полевых условиях.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Описать особенности высокопатогенного гриппа A/H5N1 при заражении цыплят различными эпизоотическими изолятами вируса.

2. Изучить особенности высокопатогенного и низкопатогенного гриппа A/H7N1 при заражении цыплят.

3. Воспроизвести и изучить особенности гриппа у разных видов диких и сельскохозяйственных водоплавающих птиц (разновозрастные мускусные утки, кряквы, серые гуси), вызванного высоковирулентным вирусом A/H5N1.

4. Оценить возможность применения коммерческих экспресс-тестов для выявления вируса гриппа птиц в пробах биоматериала.

5. Разработать набор для выявления антител к вирусам ньюкаслской болезни и гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 в реакции торможения гемагглютинации.

Научная новизна. Впервые представлены экспериментальные данные по изучению особенностей высококопатогенного гриппа A/H5N1 у разных видов диких и сельскохозяйственных птиц.

Впервые воспроизведена и изучена инфекция гриппа A/H7N1 у цыплят, вызванная высоко- и низковирулентными штаммами вируса.

Впервые проведено сравнительное изучение разрешенных к применению в Российской Федерации коммерческих экспресс-тестов для обнаружения вируса гриппа в пробах биоматериала: Flu Detect, AIV Ag, Н5 AIV Ag, H7 AIV Ag, H9 AIV Ag.

Разработан «Набор для выявления антител к вирусам ньюкаслской болезни и гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 в реакции торможения гемагглютинации».

Практическая значимость. На основании проведенных исследований разработаны и утверждены ФГУ «ВНИИЗЖ»: «Методические рекомендации по определению индекса патогенности штаммов вируса гриппа А птиц», «Методические рекомендации по определению нейраминидазного подтипа вируса ГП и антител к вирусу ГП в реакции ингибиции нейраминидазной активности», «Методические рекомендации по идентификации вируса гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации».

Разработаны и утверждены Россельхознадзором «Методические рекомендации по отбору, хранению и транспортировке биологического материала при подозрении на грипп А птиц».

Материалы исследований вошли в СТО ФГУ «ВНИИЗЖ» 00495527Набор для выявления антител к вирусам ньюкаслской болезни и гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 в реакции торможения гемагглютинации».

Основные положения, выносимые на защиту:

- особенности гриппа A/H5N1 у разных видов диких и сельскохозяйственных птиц;

- особенности гриппа у цыплят, вызванного высоко- и низковирулентными штаммами вируса А/H7N1;

- выявление вируса гриппа птиц в пробах биоматериала с применением коммерческих экспресс-тестов;

- «Набор для выявления антител к вирусам ньюкаслской болезни и гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 в реакции торможения гемагглютинации».

Апробация результатов. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на Международной научной конференции «Грипп птиц 2009: Грипп птиц и здоровье человека» (Великобритания, Оксфорд, 2009), Международной научно-практической конференции «Современные системы биобезопасности и биозащиты в ветеринарной медицине»

(Феодосия, Украина, 2010), Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященной 30-летию создания СМУ ФГУ «ВНИИЗЖ» (Россия, Владимир, 2010) и на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2008гг.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с сотрудниками ФГУ «ВНИИЗЖ» Чвала И.А., Бабиным Ю.Ю., Циванюк М.А., Сарбасовым А.Б., за что автор выражает им искреннюю благодарность.

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 7 работ опубликовано в изданиях, включенных в Перечень ведущих периодических изданий ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 185 листах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, список использованной литературы (232 источника, в том числе 182 зарубежных автора), приложения.

Работа иллюстрирована 29 таблицами и 37 рисунками.

1.1. Классификация и номенклатура вируса гриппа птиц Вирус гриппа птиц – РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Orthomyxoviridae, роду Influenzavirus, типу А. Кроме типа А, род включает еще два типа (В и С) вирусов гриппа, которые обычно выявляют у млекопитающих (138, 154).

Принятый в настоящее время порядок обозначения штаммов вирусов гриппа включает несколько определителей:

- однобуквенное указание рода ортомиксовируса (А, В или С), - обозначение вида или рода животного (у штаммов вируса, выделенных от человека, этот определитель опускают), от которого данный штамм выделен, - обозначение места выделения штамма, - серийный номер штамма, - год выделения штамма, - обозначение подтипов гемагглютинина и нейраминидазы вируса.

Определители разделяются наклонными чертами, вместе составляя систематическое название вируса, например A/goose/Guangdong/1/96/H5N (53, 138).

В целях классификации вирусов гриппа А используется ряд его биологических свойств, позволяющий разделять многочисленные штаммы этих вирусов на группы.

Одним из таких свойств являются антигенные свойства вируса. Вирусы гриппа А обладают весьма высокой степенью антигенной гетерогенности, ответственными за которую являются поверхностные гликопротеиды – гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA). В настоящее время известны подтипов гемагглютинина и 9 подтипов нейраминидазы, что теоретически дает 144 разновидности вируса (58, 59, 74, 102, 148).

Другим важным биологическим свойством вирусов гриппа А является патогенность для определенного вида животного. Патогенность определенного штамма для разных видов хозяина может различаться полярно: от полного отсутствия патогенности и полной неспособности вируса репродуцироваться в одном виде – хозяине, до крайне высокой патогенности для другого вида. При этом, как правило, очень высокая степень патогенности ассоциирована со способностью вируса вызывать системную инфекцию. Последнее, в свою очередь, зависит от способности вируса проходить одну из стадий созревания – образование зрелой формы гемагглютинина под воздействием тканевых протеолитических ферментов, которые менее активны, чем протеазы желудочно-кишечного тракта, являющегося местом репродукции низкопатогенных штаммов (1, 90, 202, 226).

Для вирусов с определенным подтипом гемагглютинина характерна склонность к инфицированию определенного вида (одного или нескольких) хозяина. Внутри одного подтипа по гемагглютинину патогенность штаммов для конкретного вида хозяина также сильно различается: от полного ее отсутствия до очень высокой. Обычно используется две градации вирусов по степени патогенности: высоковирулентные и низковирулентные. Иногда различные авторы выделяют еще две градации: апатогенные и промежуточной патогенности (12, 53, 54, 55, 56).

Для птиц подавляющее большинство штаммов с высокой вирулентностью (highly pathogenic, HPAI) относится к подтипам Н5 и Н7, но, как отмечено выше, не все штаммы этих подтипов вирулентны для птиц. В отношении диких птиц ситуация с патогенностью различных штаммов еще более осложнена тропизмом вируса, зависящим от особенностей питания видахозяина и иммунного фона в его популяции. По это причине использование определения «высокопатогенный грипп птиц», как правило, означает, что штамм вируса высоковирулентен для домашней птицы, обычно – кур и индеек (85, 90, 102, 122).

Для того, чтобы систематизировать отнесение того или иного вируса к группе высоковирулентных было избрано несколько критериев. Высокопатогенный грипп вызывает любой штамм вируса гриппа:

- вызывающий болезнь с 75% летальностью или более для 4-8- недельных цыплят в течение десяти суток после внутривенного введения вируссодержащей аллантоисной жидкости в разведении 1:10;

- имеющий значение индекса патогенности 1,2 или более после внутривенного введения вируссодержащей аллантоисной жидкости с титром НА не менее 1:16 в разведении 1:10 десяти 6-недельным цыплятам в течение десяти суток.

Поскольку отмечено, что у высокопатогенных вирусов гриппа А подтипов H5 и H7 в сайте расщепления гемагглютинина имеется характерная последовательность аминокислот, то высоковирулентным также считается любой штамм вируса гриппа подтипов H5 или H7, если он имеет сходную со структурой других вирулентных штаммов аминокислотную последовательность в сайте нарезания.

Учитывая высокую значимость вирусов гриппа А в патологии человека, изучению его ультраструктуры, генома и состава посвящено множество исследований (14, 82, 119, 130, 135, 138, 140, 141, 154, 170, 194, 196, 197, 203, 212, 221). По своему строению вирион вируса гриппа А является не крупным, сферообразным (80 – 120 нм) оболочечным РНК-содержащим организмом.

Внешняя – суперкапсидная оболочка вирусов гриппа А является «потомком»

плазмалеммы – клеточной мембраны, модифицированной вирусными гликопротеидами – гемагглютинином и нейраминидазой. В ее составе липиды имеют клеточное происхождение. Ядро вириона составляет сегментированный нуклеокапсид спиральной симметрии, состоящий из нуклеопротеида, РНК и внутренних белков. Взаимосвязь этих двух элементов вириона поддерживается слоем М-белка, заключенного между ними.

Гемагглютинин и нейраминидаза являются трансмембранными гликопротеинами, приобретающими в липидном бислое клетки перед почкованием вирионов агрегированную форму за счет сродства их молекул друг к другу.

Эта агрегированная форма, соотношение в которой количества молекул гемагглютинина к количеству молекул нейраминидазы составляет примерно 8:1, порождает выросты на поверхности плазмалеммы, которые затем остаются и на поверхности вириона, благодаря чему она при негативном контрастировании выглядит неровной, содержащей выросты длиной 10-12 нм.

Вирионы вируса гриппа А отделяются от зараженной клетки путем почкования. При этом обычная форма вириона близка к сферической. Однако связанная как с многослойностью вириона, так и с сегментированностью генома вариантность процесса почкования порождает весьма выраженный полиморфизм вирионов. В некоторых случаях форма вирионов может варьировать от весьма близкой к сферической до нитевидной.

По химическому составу вирионы состоят из 70-75% белка, 20-24% липидов, локализованных в суперкапсидной оболочке, 0,8-1,1% РНК и 5-8% углеводов, часть из которых содержится в структуре РНК, а другая часть – в составе гликопротеидов суперкапсидной оболочки (141, 154, 194). Основными гликозильными радикалами последней, имеющими, также как и липиды, клеточное происхождение, являются галактоза, манноза, фруктоза и глюкозамин (141, 212).

Ферментативный аппарат синтеза вирусной РНК включает три крупных белковых молекулы (PB2, PB1, PA-белки), кодируемые тремя самыми крупными фрагментами вирусной РНК. Эти белки представлены в нуклеокапсидах гораздо меньшим числом молекул, чем рибонуклеопротеин, кодируемый еще одним фрагментом РНК.

Репродукция вируса гриппа А подробно описана в ряде работ (4, 7, 14, 68, 113, 138, 141, 196, 225). В среднем, цикл репликации вирусов гриппа А продолжается около 6 часов.

Первой стадией инфекционного цикла является адсорбция вирионов на поверхности чувствительных клеток. Она происходит за счет связывания гемагглютинина вируса с вирусспецифическим рецептором клетки-хозяина. В установлении этой связи важнейшее значение играет сиаловая кислота, входящая в состав рецептора. У вирусов гриппа, имеющих разные подтипы гемагглютинина, аффинитет к сиаловой кислоте, связанной с последующим в гликозильной цепочке углеводом, различается в зависимости от характера этой связи. Этим, в частности, обусловливается способность вирусов инфицировать клетки того или иного животного: инфицированными при обычных условиях могут быть только клетки, экспрессирующие на своей поверхности соответствующие гликозильные цепочки. Например, на человеческих клетках экспрессированы цепочки, где сиаловая кислота связана с последующей в гликозильной цепочке галактозой 2-6 связью, на птичьих клетках 2-3 связью, а на свиных клетках и 2-6 и 2-3 связью. По этой причине птичьи вирусы при обычных условиях не инфицируют человеческие клетки, но инфицируют птичьи и свиные клетки, а человеческие вирусы не инфицируют клетки птиц, но инфицируют человеческие и свиные (35, 104, 116, 125, 139, 151, 181, 182, 195).

Однако, эти закономерности не являются абсолютными. Так, было доказано, что клетки кишечного респираторного тракта перепелок экспрессируют оба эти типа рецепторов для вирусов гриппа. Это означает, что организм перепелки, как и организм свиньи, может быть «местом» рекомбинации человеческих, птичьих и свиных вирусов гриппа А, т.е. источником новых эпидемически и эпизоотически значимых вирусов гриппа А (164, 187, 195, 224).

Второй стадией инфекционного цикла является эндоцитоз вирионов, адсорбированных на поверхности чувствительных клеток. Вирионы вирусов гриппа А эндоцитируются путем рецептор-зависимого пиноцитоза. Инициирует пиноцитоз выраженное сродство вирусных гликопротеидов и вирусспецифических рецепторов, экспрессированных на поверхности клетки, которое порождает отрицательную кривизну плазмалеммы в месте контакта. Она включает механизм образования пиноцитозной вакуоли. Внутри пиноцитозной вакуоли происходит понижение рН, которое индуцирует конформационные изменения в молекуле гемагглютинина (203). Они вызывают слияние клеточной плазмалеммы и суперкапсидной оболочки. В результате происходит частичная депротеинизация РНП, который попадает в цитоплазму клетки.

Следующей стадией инфекционного цикла является транспорт РНП в клеточное ядро, в процессе которого происходит освобождение комплекса РНК с тремя белками полимеразного комплекса (PB2, PB1, PA) от нуклеопротеида.

Далее в ядре клетки происходит транскрипция вирусной РНК. Основная роль в транскрипции принадлежит ферментам полимеразного комплекса.

На матрице вирусной РНК происходит образование мРНК, подобных клеточным мРНК. При синтезе вирусных мРНК используются затравочные фрагменты, происходящие от клеточных мРНК, которые появляются в результате отщепления от последних кэп - структур и 10-13 прилегающих к нему нуклеотидов белка PB2. Вирусные мРНК при помощи обычных клеточных механизмов транспортируются в цитоплазму, где инициируют синтез соответствующего белка на рибосомах.

Транскрипция вирусных генов имеет механизмы регуляции, что проявляется в преимущественном синтезе на ранней стадии транскрипции мРНК, кодирующих внутренние белки вириона.

Биосинтез вирусных белков является следующей стадией. Он происходит в цитоплазме клетки, при синтезе используются обычные клеточные механизмы посттрансляционного созревания, включая гликозилирование, и транспорта продуктов трансляции. Гликозилированные в процессе синтеза молекулы гемагглютинина и нейраминидазы транспортируются на мембраны эндоплазматического ретикулума, откуда они мигрируют на плазмалемму. М белок, имеющий аффинитет к цитоплазматическим «хвостам» вирусных гликопротеидов, мигрирует к внутренней поверхности плазматической мембраны. Нуклеокапсидный белок транспортируется в клеточное ядро, где он образует комплекс с фрагментами вирусной РНК, который покидает клеточное ядро.

Сборка оболочки вируса начинается на мембране эндоплазматического ретикулума, модифицированной вирусными гликопротеидами. На внутренней стороне таких участков происходит агрегация М-белка, в результате чего внутренняя поверхность модифицированных участков плазмалеммы приобретает сродство к вирусному нуклеопротеиду. Его фрагменты связываются со слоем М-белка, в результате создающаяся связь выгибает плазмалемму, создавая почку. По завершению процесса почка отшнуровывается от плазмалеммы.

Завершающей стадией инфекционного цикла является постэкзоцитозное созревание вириона. Эта стадия может быть сопряжена с предыдущей, а может зависеть от структуры сайта расщепления гемагглютинина и ткани, в которой происходит репродукция вируса. Центральным звеном постэкзоцитозного созревания является протеолиз сайта расщепления гемагглютинина.

В его результате предшественник гемагглютинина, не способный связываться с клеточным рецептором, превращается в зрелую форму гемагглютинина, приобретающую сродство к клеточному рецептору. В результате этого процесса вирион приобретает инфекционность: вирионы, не содержащие зрелого гемагглютинина не способны инфицировать новые чувствительные клетки.

Синтез вирусных белков и почкование вирионов вызывают гибель инфицированной клетки, опосредованную механизмом апоптоза (14, 177).

Реальная картина инфекционного цикла, конечно же, сложнее и зависит от конкретных условий инфицирования, типа инфицированной клетки, ткани, где происходит репродукция вируса, наличия других вирусов и, в частности – других вирусов гриппа в этой ткани.

Сборка вирионов идет не идеально, с некоторой, зависящей от свойств конкретного штамма, частотой формируются вирионы, несущие неполный набор вирусных генов и не способные к самостоятельной продуктивной инфекции. Возможно формирование гетероплоидных в отношении некоторых фрагментов РНК вирионов.

Почкование может проходить как через плазмалемму, так и через другие части мембранного аппарата клетки. Почкование может идти через «неправильно» модифицированные участки мембран, благодаря чему состав вирионов несколько отличается по количественному содержанию белков. Упаковка РНП в вирион также может происходить нетипично, в результате, в частности, формируются палочковидные формы вирионов.

Как при заражении одной клетки двумя (или более) вирионами одного штамма, так и при заражении одной клетки двумя вирионами двух разных штаммов (они могут относиться и к разным подтипам вируса), вирионы – потомство будут «гибридными» - одни фрагменты РНК будут происходить от одного родительского вириона, другие – от другого. Причем их комбинации будут образовываться практически по случайному механизму. Это явление называется реассортацией. Реассортация является важнейшим эволюционным механизмом для вируса гриппа.

Конечно же, у вирусов гриппа имеются все механизмы изменчивости, присущие другим вирусам, другим организмам, такие как гомологичная рекомбинация (у вирусов с фрагментированным геномом – внутрисегментная) – обмен значительными по протяженности участками одних и тех же генов по механизму кроссинговера. Возможны отдельные точечные мутации, которые могут являться не значимыми (не приводящими к замене аминокислоты) или выражающимися в инактивации гена, если внутри него появляется стоп кодон, либо в аминокислотной замене, вставки и делеции, возникающие при ошибках полимеразного комплекса. Имеются и ошибки по механизму смены матрицы, когда происходит преждевременное отделение репликативного комплекса от родительской молекулы РНК с последующим возобновлением синтеза на другой молекуле РНК. Благодаря этому механизму возникают делеционные мутанты и вставки в гене. Причиной тому является возможность, что синтез дочерней РНК на второй молекуле РНК может продолжиться не с точно той же позиции, на которой он прервался на первичной РНК - матрице, а до или после нее.

Однако все эти классические механизмы изменчивости являются медленными в эволюционном смысле. Медленными, поскольку ген - их продукт либо не отличается от исходного вообще (такое наиболее часто бывает при гомологичной рекомбинации) или отличается, но это отличие не выражается в отличиях структуры продуктов гена (молчащие замены при точечной мутации) (83). Либо (при делециях и вставках) ген перестает кодировать какойлибо белок (такое наиболее часто случается при вставках и делециях в начале гена) или кодирует укороченный полипептид, не обладающий функциями исходного белка. Такие вирусы, как правило, не способны самостоятельно репродуцироваться. Однако, при наличии вируса – помощника, обычно гомологичного, поставляющего продукт инактивированного гена мутантному вирусу, последний все же может репродуцироваться, но это статистически редкое явление (14, 160, 163, 184).

При реассортации рекомбинантный вирус получает полный набор жизнеспособных генов, а комбинация их не такая, как у родительских вирионов.

Эволюционная перспектива таких вирионов почти не отличается от таковой родительских вирионов в случае, если нет селективного давления на вирусную популяцию (вируснейтрализующие антитела, отсутствие специфических рецепторов в клетках животного и др.). Если оно есть, то способность рекомбинантов к репродукции в данных условия может быть существенно выше, чем у любого из родительских вариантов вируса.

Для того, чтобы подчеркнуть качественное различие этих механизмов мутационной изменчивости вирусов гриппа, были введены два понятия – антигенного дрейфа – для классических вариантов мутационной изменчивости генов и, соответственно кодируемых ими вирусных белков (в первую очередь иммунодоминантных антигенов – гемагглютинина и нейраминидазы) и антигенного шифта – для реассортации.

Повышенная результативность реассортации в плане появления эволюционно – значимого вирусного потомства по сравнению с таковой у классической рекомбинации несомненно играет главную роль в высоком уровне изменчивости вирусов гриппа (180, 225). Известно, например, что все пандемически – значимые штаммы вируса гриппа являлись реассортантами человеческих и птичьих вирусов, а некоторые и тройными реассортантами – птичьего, свиного и человеческого вирусов (69). Этим же, вероятно, объясняется многообразие комбинаций антигенных подтипов вирусов гриппа А, выделенных у диких водоплавающих птиц (131).

1.4. Устойчивость вируса к физико-химическим факторам Несмотря на свое строение, вирус хорошо сохраняется в воде. Имеются данные о том, что в естественных условиях вирус остается инфекционным в озерной воде до четырех суток при 220С, более 30 суток при 00С, а в северных широтах вирус может сохраняться в замерзающих водоемах всю зиму до следующего сезона (123, 132, 168). Экспериментально установлено, что при высоких исходных концентрациях вируса в воде, инфекционность последней может сохраняться и в течение значительно большего времени – до более чем 100 суток (169). Это не удивительно, учитывая, что процесс инактивации вирионов – процесс стохастический. Очевидно, эта способность вируса весьма важна для параметров паразитоценоза, характерного для миграционных стоянок перелетной водоплавающей птицы и мест их гнездования.

Учитывая, что репродукция низковирулентного вируса в организме зараженных птиц происходит в эпителии желудочно-кишечного и респираторного трактов, а основным путем передачи является фекально-оральный, вирус хорошо приспособлен к сохранению жизнеспособности в фекалиях, где он сохраняется в зависимости от температуры от 4 суток при 250С до более чем месяца при 40С (75).

Вирус остается инфекционным в трупах зараженных животных, в контаминированном биологическом материале, сохраняясь в них при температурах близких к нулю градусов в течение нескольких недель или месяцев. Устойчивость вируса к термоинактивации варьирует в широких пределах, причем она до некоторой степени штаммоспецифична, и, конечно же, зависит от свойств окружающей среды (4). Вирус инактивируется полностью при 550С в течение 1 ч., при 600С – в течение 10 мин., при 65-700С – за 2-5 мин, при температурах более 800С – практически мгновенно. Повышенное содержание белка и нейтральная среда способствуют его более длительному сохранению (55, 90).

Вирус чувствителен к воздействию солнечного света, прямые солнечные лучи обезвреживают вирус за 2 суток, а рассеянный свет – примерно за недели, причем этот эффект зависит от температуры и состава вещества, в котором вирус находится (8, 12).

Вместе с тем, вирус высокочувствителен к воздействию конвенциальных дезинфектантов, таких как щелочи, кислоты, окислители (кислород, хлор, перманганат), альдегиды. Как и другие вирусы, имеющие суперкапсидную оболочку, вирусы гриппа чувствительны к воздействию липидорастворителей (8, 93, 176). Различные инактивирующие факторы действуют на вирус по разным механизмам. Например, липидорастворители оставляют интактным вирусный геном, но разрушают суперкапсидную оболочку, а некоторые дезинфектанты, например формальдегид или бета-пропиолактон, наоборот разрушают генетический материал, оставляя слабо поврежденными или интактными поверхностные антигены, что широко используется при производстве инактивированных препаратов вируса, в том числе – вакцин.

1.5. Биологические свойства вируса гриппа Вирус гриппа А, как и другие вирусы, изучается, прежде всего, как паразитический болезнетворный микроорганизм. По этой причине основное количество исследований посвящено тем из биологических свойств, которые важны в эпидемическом и эпизоотическом аспектах. Основное внимание уделяется при этом патогенности, инфекционности, антигенности и их молекулярным основам.

Патогенность вируса видоспецифична в отношении хозяина и является полигенным признаком. В проявлении патогенности важен также вид и возраст хозяина, в котором происходит заражение даже в том случае, если хозяин совершенно не иммунен к данному вирусу. Это связано с различной степенью зрелости защитных механизмов хозяина, в первую очередь – его иммунной системы. В основе патогенности – способность вируса интенсивно репродуцироваться в организме вида – хозяина. Чем интенсивнее репродукция, тем существеннее повреждение ткани (тканей), в которых она происходит. Вид тканей, повреждаемых в ходе вирусной репродукции, зависит от тропизма вируса. Чем более критична повреждаемая ткань для выживания хозяина и поддержания его гомеостаза, тем выше патогенность вируса для данного хозяина. Очевидно, что жизнеспособность организма – хозяина зависит от множества факторов, которые, таким образом, опосредованно влияют на патогенность, точнее ее проявление в конкретных условиях (52, 57, 66, 72, 79).

В модельных условиях патогенность – весьма сложное понятие для характеристики вируса, связанное не только с индивидуальным взаимодействием вирус – организм, а с взаимодействием вирусная популяция – популяция хозяина. Если вирус высокопатогенен для одного вида животных, это вовсе не означает, что он патогенен для другого вида. Из этого следует, что патогенность – это не столько свойство вируса, сколько проявление некой суммы его свойств в конкретных условиях, в определенной популяции хозяина (54, 76, 158, 161, 166, 167, 185, 193, 206).

Говоря о популяционных взаимоотношениях вируса гриппа А птиц и его естественных хозяев, нельзя не отметить, что подавляющее большинство вирусных штаммов апатогенны или низкопатогенны для хозяев и, при этом – высокоинфекционны. Например, вирусы гриппа А подтипов Н5 или Н7 наиболее склонны к образованию высоковирулентных форм, однако и среди них большинство слабопатогенны или апатогенны (76, 156, 200, 208).

Молекулярные основы патогенности вируса гриппа А птиц изучены весьма подробно, но явно не достаточно. Как уже отмечено, патогенность для данного хозяина – полигенный признак и она связана со способностью эффективно репродуцироваться в различных органах и тканях организма, в первую очередь – за пределами кишечного и респираторного тракта. Обладающие таким свойством вирусы способны вызывать системную инфекцию, сопровождаемую выраженной патологией в различных органах и тканях, причем тяжелые нарушения гомеостаза могут стать причиной гибели животного. По этой причине ведущим фактором патогенности является именно способность вируса репродуцироваться вне желудочно-кишечного и респираторного трактов. Молекулярные основы связаны с уже упоминавшейся выше деталью цикла репродукции вируса – «созреванием» гемагглютинина.

Созревание гемагглютинина - это превращение из предшественника HA в зрелую форму гемагглютинина. Без этого отпочковавшийся вирион останется не инфекционным, не способным связываться с рецептором на поверхности следующей чувствительной клетки (85, 118, 129). Расщепление происходит при воздействии протеаз организма – хозяина. Установлено, что:

- чем больше эффективность последних, что зависит как от видахозяина, так и от ткани организма, в которой идет репродукция вируса, - чем больше чувствительность самого сайта нарезания, которая задается первичной последовательностью аминокислот в сайте разрезания, - чем больше физическая пространственная доступность сайта разрезания для молекул протеаз, задаваемая степенью гликозилирования близлежащих частей молекулы гемагглютинина, тем более эффективно идет созревание.

Молекула предшественника гемагглютинина - НАо низкопатогенных вирусов гриппа содержит в сайте расщепления некоторые основные аминокислоты (85, 102, 163, 202, 205, 220), и такая аминокислотная последовательность слабо чувствительна к действию трипсиноподобных протеаз. Вирусные штаммы, имеющие такую аминокислотную последовательность сайта расщепления, способны созревать в тех тканях, где относительно высока активность таких ферментов, а это пищеварительный и, в меньшей степени – респираторный тракт. И их репродукция не идет эффективно в тканях с низкой протеолитической активностью.

Молекула предшественника гемагглютинина - НАо высокопатогенных вирусов гриппа содержит в сайте расщепления обогащенную аргинином и лизином последовательность аминокислот (118, 163, 223). Такие штаммы созревают и при относительной низкой протеолитической активности в ткани, где происходит репродукция. Иными словами, они способны размножаться практически в любой ткани организма. Это и делает их пантропными и наносящими особо тяжкий вред здоровью зараженных животных. Вызванная ими болезнь носит генерализованный характер, протекает с поражением множества жизненно важных органов и тканей и с высокой частотой вызывает смерь заболевших. Роль именно последовательности аминокислот в сайте разрезания в реализации данного механизма экспериментально доказана (179).

Из этих данных по роли сайта разрезания гемагглютинина следует, что мутационный процесс в данном сайте способен давать низкопатогенные варианты из высокопатогенного родительского штамма и наоборот: из низкопатогенного родительского штамма может образоваться высокопатогенный.

Причем, в основе этих превращений могут лежать как замены триплетов, так и их вставки. И то и другое происходит с довольно высокой частотой вследствие ошибок полимеразного комплекса, весьма обычных для РНКзависимых РНК-полимераз (131, 158, 184). Кроме того, при рекомбинации может происходить появление новых вариантов вируса, приобретших в сайте разрезания нуклеотидную последовательность высокопатогенного типа по типу кроссинговера или инсерции. Причем штаммы последнего типа были зарегистрированы в природе. Они вызвали вспышки болезни, например, в Чили в 2002 году и Канаде в 2004 году. Оба штамма были инсерционными мутантами: чилийский штамм приобрел 11, а канадский 7 основных аминокислот в сайте разрезания (54, 90, 124, 184).

В образовании высокопатогенных штаммов из низкопатогенных и наоборот большое значение имеют свойства паразитоценоза, в котором циркулирует вирус. В том случае, если вирус попадает в очень обширную и плотную популяцию иммунонегативного, что очень важно, хозяина, создается селективное давление в сторону образования наиболее агрессивных вариантов вируса. Тех вариантов, которые накапливаются в организме быстрее, чем вирусные варианты – конкуренты и выделяются из организма. В этих условиях высокопатогенные штаммы приобретают существенное конкурентное преимущество. Чем сильнее иммунный фон в такой популяции, тем слабее выражено данное селективное преимущество, а равновесие сдвигается в сторону образования штаммов, способных вызывать латентные формы инфекции с длительным выделением вируса во внешнюю среду, а это характеристика низкопатогенных штаммов.

Вышесказанное имеет ряд экспериментальных подтверждений на разных уровнях: на уровне экспериментальном in vitro и in vivo (108, 124, 145, 152, 223) и на уровне филогенетического анализа, показывающего, что высокопатогенные вирусы не располагаются в отдельных филогенетических группах, а входят в состав групп с низкопатогенными вирусами, из которых они образовались (72, 88, 122, 171).

В последнее время все значимые эпизоотии гриппа среди птиц довольно подробно изучаются на уровне генетического анализа и прослеживания филогенетических связей вирусов, циркулирующих в данной зоне. В частности, довольно подробно была изучена история возникновения вируса, вызвавшего эпизоотию гриппа подтипа H7N1 в 1999-2000 гг. в Италии. Было установлено, что в популяции птиц первоначально циркулировали низкопатогенные штаммы. Затем в их геноме шло постепенное накопление мутаций, которое и привело к образованию высокопатогенного штамма внутри той же филогенетической ветви. Иными словами, данный штамм появился не в результате рекомбинации, а в результате обычного мутационного процесса, эффект которого, тем не менее, был весьма впечатляющим. В ходе этой эпизоотии пало или было уничтожено более четырнадцати миллионов птиц (64, 71, 79, 107, 117).

Таким образом, в основе механизма вирусной вирулентности лежит высокая чувствительность сайта расщепления гемагглютинина, но, наличия высокочувствительного к протеазам сайта расщепления гемагглютинина не достаточно для того, чтобы вирусный штамм обладал патогенностью. В природе существуют вирусные штаммы, которые обладают сайтом расщепления гемагглютинина, характерным для высокопатогенных штаммов, но таковыми не являющиеся. Такой вирус подтипа H5N2, в частности, был выделен в году в Техасе (144). Нет сомнений, что хозяинная специфичность вирусов гриппа обусловливается целым рядом механизмов, например температурными оптимумами вирусных ферментов (58, 59, 90, 114). Hарезание сайта расщепления гемагглютинина далеко не единственное свойство этого вирусного гликопротеида, важное для репродукции вируса в той или иной системе, в организме того или иного хозяина.

Наиболее четко это прослеживается при серотипировании вирусных изолятов, выделяемых от млекопитающих. Так, например, в человеческой популяции несомненным селективным преимуществом обладают вирусы гриппа А с гемагглютининами Н1, Н2 и Н3, в популяции лошадей – вирусы с гемагглютининами Н3 и Н7, в популяции свиней – вирусы с гемагглютининами Н1 и Н3 (54, 87, 102, 103, 112, 134, 150, 192). Возможно, однако, что эта избирательность не отражает глобальных закономерностей, а просто является следствием достаточно длительных эпизоотических и эволюционных циклов. Ответ на этот вопрос может дать только время, причем весьма длительный его период, поскольку ретроспективные данные нам практически не доступны уже начиная с первой четверти 20-го века.

Однако, в определении хозяинной специфичности гемагглютинин несомненно играет свою роль, реализующуюся на первой стадии цикла репродукции – адсорбции вируса на поверхности зараженной клетки.

Выше уже говорилось, что сиаловая кислота весьма важна в структуре сайта связывания гемагглютинином клеточного рецептора для вирусов гриппа А. От характера ее связи с соседними гликозильными остатками зависит конформация центра связывания рецептора для вирусного гемагглютинина (1, 104). В свою очередь, молекулы гемагглютининов разных вирусов имеют различное сродство к тем или иным его конформациям. Вирусы гриппа А птиц и лошадей имеют высокий аффинитет к альфа-2-3 связи (Sia2-3Gal) сиаловой кислоты рецепторов эпителиальных клеток птиц и лошадей. Человеческие вирусы - к альфа-2-6 связи (Sia2-6Gal) рецепторов эпителиальных клеток органов дыхания человека (1, 104, 125, 139, 151, 181, 182, 186, 207).

Такое различие создает межвидовой барьер, предотвращающий прямую передачу вируса от птиц к человеку (68, 186, 195). Если вирус попадает в клеточную систему, в которой экспрессированы оба типа рецепторов, то селективное преимущество получают те вирусы, которые имеют выраженный аффинитет к обоим типам рецепторов. Если вирус пассировать в непермиссивной в плане рецептора среде, то постепенно в вирусной популяции будут накапливаться варианты, обладающие сродством к этому рецептору.

Это было установлено при пассировании человеческих и свиных вирусов в куриных эмбрионах (105, 108, 186).

Условия, при которых может происходить переадаптация вируса к другому типу рецептора, в естественной среде не так редки, как могло бы показаться. Например, в трахее человека присутствует относительно небольшое количество эпителиальных клеток, несущих на поверхности рецепторы с альфа-2-3 связью сиаловой кислоты, характерные для птичьих клеток. Аналогично, в клетках респираторного и пищеварительного трактов кур имеется небольшое количество специфичных для вируса гриппа человека рецепторов с альфа-2-6 связью (68). Рецепторы эпителиальных клеток свиней и перепелов содержат одновременно Sia2-3Gal и Sia2-6Gal связи, что позволяет предположить высокое значение этих видов в формировании рекомбинантов птичьих, свиных и человеческих вирусов (81, 174, 189, 195).

Молекулярные механизмы влияния нейраминидазы на патогенность вируса менее изучены, чем таковые гемагглютинина, но, несомненно, имеют место. Имеются прямые экспериментальные данные, что мутации в гене нейраминидазы могут изменить такие биологические свойства вируса, как патогенность и способность к формированию бляшек в культурах клеток (67, 155, 190). Имеются косвенные данные о том, что подтип нейраминидазы влияет на специфичность вируса в отношении организма – хозяина. Так, например, подтипы N1 и N2 наиболее часто выделяются от человека и свиней, а подтипы N7 и N8 – от лошадей. Причины такой избирательности не известны (103, 136, 137).

Имеются косвенные данные о том, что подтип нейраминидазы в сочетании с подтипом гемагглютинина также важны в отношении хозяинной специфичности вируса, поскольку некоторые сочетания подтипов этих двух гликопротеидов встречаются чаще других, причем у хозяев разных видов.

Причины такой избирательности также не известны.

Роль продуктов других генов в формировании суммы или конкретных биологических свойств вируса еще менее изучены, чем для нейраминидазы.

В какой-то степени это, вероятно, также связано с методологией, поскольку продукты генов PB2, PB1, PA, NP, M, NS не столь важны для формирования иммунитета. Тем не менее, очевидно, что структура этих белков также не может не влиять на биологические свойства вируса. В частности, ферменты полимеразного комплекса, как и иные ферменты, конечно же, имеют свои температурные оптимумы, которые влияют на эффективность репродукции вируса в различных организмах, в условиях лихорадки или переохлаждения, в различных органах. То, что ферменты полимеразного комплекса взаимодействуют, предопределяет, что одни комбинации генов будут более эффективные, чем другие (102, 188).

Установлено, что эффективность полимеразного комплекса зависит в целом и от того, в клетке какого вида реализуется их активность, поскольку вирусные ферменты опосредованно взаимодействуют с клеточным полимеразным комплексом и другими ферментами клеточного ядра. Этому тоже есть экспериментальные доказательства. В частности, замена в геноме человеческого штамма вируса гриппа PB1-гена на PB1-ген птичьего вируса привела к снижению эффективности репродукции вируса в культуре клеток млекопитающих, причем эффективность его репродукции в культуре куриных клеток не изменилась. Также показано влияние NS-гена на хозяинную специфичность PB2 (57, 211).

Нет сомнений в том, что в зависимости от микроокружения, в частности, ферментативной активности, характерной для организма - хозяина, эффективность того или иного вирусного белка может различаться. Показано, что фосфорилирование NP ферментами хозяина может прекратить процесс репродукции вируса гриппа, сделать его организм непермиссивным для данного штамма (140, 170, 213). В целом для всех белков вируса можно утверждать, что в природе имеются их филогенетические линии, избирательно связанные с тем или иным организмом – хозяином, вероятно определяющие сродство именно к этому хозяину.

Круг хозяев и хозяинная специфичность также является биологическим свойством вируса, но она настолько важна для эпидемиологии, эпизоотологии и экологии вирусов гриппа А, что ее логичнее рассматривать в отдельном разделе.

Как уже отмечалось выше, основным источником инфекции являются зараженные животные. Поскольку вирус устойчив во внешней среде, контаминированные вирусом объекты внешней среды также могут служить источником инфекции. Однако, учитывая, что в популяциях животных основным путем заражения, особенно заражения низкопатогенными штаммами, является фекально – оральный путь, значимость того или иного источника инфекции существенно зависит от типа питания данного вида животных и от структуры его популяции. Кроме этого очевидного влияния организма – хозяина, имеется также не менее очевидное влияние и такого свойства вируса, как его способность длительно и в больших количествах экскретироваться с фекалиями. Вирусы, вызывающие сверхострые формы болезни, выделяются с фекалиями в течение малого периода, так как животное слишком быстро погибает после заражения. Для домашних птиц – кур и индеек это установлено в полевых условиях и экспериментально (54, 76, 79, 90).

Низковирулентные штаммы выделяются в течение более длительного периода, но, как правило, в малых количествах. Вероятность успешного инфицирования других особей такими вирусами также не велика и существенно зависит от вида, возраста и даже минимального иммунного фона хозяина (76, 94, 227). Таким образом, для того, чтобы эволюционно закрепиться в популяции животных, вирус должен обладать свойством выделяться из организма зараженного хозяина длительное время и в достаточно больших количествах, что предполагает латентное течение инфекции. В частности, показано, что вирусы гриппа А могут выделяться из организма клинически здоровых уток в весьма значительных концентрациях (до 108 - 109ЭИД50/СМ3), причем весьма важную роль играет передача вируса от взрослых птиц птенцам (102).

Как уже отмечалось, вирус достаточно хорошо сохраняется в воде (123). Учитывая особенности питания целого ряда видов гусей, уток и других птиц водного и околоводного комплекса, вода может служить источником инфекции, причем в высоких широтах – круглогодичным, межсезонным - в местах летовок. (168).

В том случае если вирус является высокопатогенным, то его репродукция в респираторном тракте может служить основой для реализации в популяциях животных аэрозольно – капельного пути заражения, который является ведущим у пандемически значимых – человеческих вирусов. В частности, у вируса гриппа птиц подтипа H5N1 отмечен респираторный путь заражения, более важный для наземных птиц, особенно для некоторых видов домашних птиц, таких как перепелки и фазаны, при этом показана возможность заражения этим путем млекопитающих и человека непосредственно от птиц (164).

В настоящее время, очевидно, важны оба пути передачи вируса, но их значение различается на отдельных стадиях эпизоотического цикла. Современное состояние птицеводства таково, что в целом ряде регионов популяции домашней птицы имеют огромную плотность и, в то же время, не защищены ни от прямого, ни от опосредованного контакта с дикими перелетными птицами. Состояние ветеринарного обслуживания и мониторинговых программ в данной популяции, применяемых в конкретной стране, меры при обнаружении инфицированных низкопатогенными вирусами стад домашней птицы также разнятся чрезвычайно сильно. Все это дает очень пеструю картину, но в ней видны следующие закономерности.

Вдоль миграционных путей водных птиц регулярно отмечается повышенная превалентность заболевания среди домашних птиц, хотя ввиду колебания выделения вируса в регионах, где имеются миграционные стоянки, это выражено в наибольшей степени (53, 54, 102, 216, 229).

Установлена более высокая превалентность инфекции у домашних птиц, содержащихся в незащищенных от контакта с дикой птицей условиях:

индейки при выгульном содержании, утки на откормочных озерах и полях и т.д., в условиях России – птица на частных подворьях (54, 90, 112, 128, 143).

В высоких широтах, там, где нет мест зимовок перелетной птицы, наблюдается сезонная цикличность выявления вируса в регионах, через территории которых проходят миграционные пути диких птиц (98, 216). В местах, где имеются гнездовья дикой перелетной птицы, максимальная превалентность у домашней птицы наблюдается после того, как птенцы дикой птицы покидают гнезда.

Экспериментально показано, что случаи низкопатогенного гриппа у домашних птиц связаны с теми же подтипами вируса, которые циркулируют среди водоплавающих птиц в этом регионе (191). В тех случаях, когда удавалось получить значительное количество вирусных изолятов с мест, где имели место случаи возникновения низкопатогенного гриппа А среди домашней птицы, было показано, что они вызваны именно теми штаммами вируса, которые выделялись от дикой перелетной птицы в данной местности.

В условиях ферм с низким уровнем биологической защиты для инфицирования домашней птицы прямой контакт с дикими животными не обязателен, поскольку на ферму вирус может быть занесен механически человеком с контаминированными фекалиями предметами, обувью, одеждой. Если на фермах для поения птицы используется вода из естественных открытых водоемов, то она также может стать источником инфекции (64, 71, 97).

В последние десятилетия значительно изменилась роль антропогенного вмешательства в биоценозы. Концентрация птицепоголовья, технологические особенности выращивания птиц, создание обширных сельскохозяйственных угодий и др. факторы внесли изменения в жизненный цикл диких птиц (периоды и места миграции, гнездования, линьки и др.). Учитывая, что в самых разных частях планеты для подсобных и фермерских хозяйств характерна многопрофильность, в частности – содержание в одном хозяйстве нескольких видов животных и птиц, видов, которые в дикой природе практически не пересекаются, человек создал еще и альтернативный путь передачи вирусов от вида к виду. Это, как отмечалось выше, значительно увеличивает вероятность образования рекомбинантных вирусов. В частности, показано опосредованное человеком (обслуживающий персонал) инфицирование вирусом гриппа А/H1N1 индеек от инфицированных свиней (214).

Особенности региональной торговли и перевозок показывают пример формирования антропогенных циклов циркуляции вируса. Примером тому могут служить вспышки низкопатогенного гриппа подтипа А/H7N2 в США.

Этот вирус длительное время циркулировал на рынках живой птицы в восточной части США, где он впервые был выявлен в начале 90-х годов и до сих пор не ликвидирован. Было зарегистрировано не менее восьми вспышек, вызванных этим вирусом. Стоимость этих вспышек - миллионы голов утилизированной (в основном – вынужденно убитой) птицы (90).

Очень важна в настоящее время степень информированности и ответственности владельцев птицы. Это не подлежит никаким сомнениям, поскольку главным ресурсом вторичного распространения вируса для домашних птиц является человек. Обслуживающий персонал птицехозяйств, ветеринарные врачи, транспорт и водители, перевозящие птиц или поставляющие корма, перемещающие бывший в употреблении инвентарь и предметы ухода, тару, могут распространять вирус как внутри, так и между хозяйствами. В частности, именно такую природу распространения предполагают почти все исследователи, изучавшие опустошительную эпизоотию в Пенсильвании, США, в 1983-1984 годах (217).

При рассмотрении эпизоотии в Италии в 1999-2000 годах статистический анализ рисков распространения вируса от фермы к ферме показал следующие наиболее значимые аспекты:

- наличие других ферм в радиусе 1 км от инфицированных хозяйств (26,2%), - использование общего транспорта для доставки кормов, подстилки или вывоза продукции (21,3%), - передвижение транспорта, перевозящего птиц на бойню (8,5%), - прочие непрямые контакты при участии персонала и оборудования (9,4%) - распространение вируса между фермами: перемещение инфицированных стад (0,1%), (107, 149).

Роль аэрогенного пути инфицирования домашней птицы может быть весьма заметной не только при распространении инфекции внутри фермы, но и между фермами, если фермы расположены вблизи друг к другу, как это имело место в Гелдерской долине, в Голландии в 2003 году. В некоторых условиях может сыграть роль и механический перенос насекомыми и грызунами, если для защиты птицеводческих помещений от них не применяется действенных мер (142).

Еще одним практически важным путем распространения низкопатогенных вирусов является их перенос от фермы к ферме с куриными эмбрионами, причем вирус может содержаться как на поверхности яиц (если они не обрабатываются для дезинфекции), так и внутри. При уже упоминавшейся вспышке гриппа в Пенсильвании вирус А/H5N2 выделяли из яиц. После экспериментального инфицирования кур вирусом А/H5N2, выделенного в Пенсильвании, он содержался почти во всех яйцах, снесенных спустя три и четыре дня после инокуляции. Аналогичная ситуация имела место в России, когда низкопатогенный вирус с птицефабрики Курганской области был занесен с эмбрионами в семь птицефабрик Новосибирской области. К счастью, это удалось вовремя обнаружить и инфицированные эмбрионы были утилизированы.

Если считать все вирусы гриппа А одним видом микроорганизма, то, вероятно, не будет преувеличением сказать, что круг его хозяев – это теплокровные животные.

Если говорить о географическом ареале распространения вируса гриппа А как одного вида микроорганизма, то, очевидно, не будет преувеличением сказать, что он распространен на планете повсеместно – от Арктики до Антарктики, включая океанические бассейны, сушу на всех высотах и воздух.

В отношении чувствительности тех или иных видов птиц к вирусам гриппа А имеется множество экспериментальных данных, приводящих к мысли о том, что все без исключения виды птиц, а по отношению к представителям 26 семейств это установлено в результате мониторинговых мероприятий, чувствительны к ряду штаммов и подтипов вируса гриппа А. От птиц выделены все описанные на сегодня подтипы вируса (22, 23, 70, 112, 153, 173, 216). Вместе с тем известно, что роль различных видов птиц в поддержании глобальной циркуляции вирусов гриппа А не одинакова. Дикие птицы отрядов Anseriformes (различные виды уток, гусей и лебедей) и Charadriiformes (Ржанкообразные) являются основным природным резервуаром вируса гриппа А (54, 112, 128, 208).

Распространенность вирусов гриппа А в различных локальных популяциях птиц весьма сильно варьирует. Причем, поскольку проведение таких экспериментальных работ, которые дали бы более-менее надежные результаты для статистического анализа, чрезвычайно трудоемко, и работ такого типа проводится мало, то возможно, что эти вариации отражают не столько распространенность вируса в различных локальных популяциях, сколько цикличность процесса его распространения в этих популяциях. Так или иначе, имеются экспериментальные данные, показывающие, что в каждый конкретный момент времени в некоторых локальных популяциях вирус выделяется более, чем у 10% птиц.

Например, в весьма репрезентативном исследовании Stallknecht и Shane (201), из 21 318 проб от птиц разных видов было выделено 2 317 изолятов вируса гриппа А (один изолят из девяти проб). При этом 14 303 пробы из 318 были отобраны от птиц отряда Гусеобразных. Из этих 14 303 проб было выделено 2 173 изолятов, что составило 94% общего количества изолятов ( изолят из 6,6 проб). От птиц других отрядов было выделено 144 изолята из 015 проб (1 изолят из 49 проб).

В другом исследовании Munster и др. (216) были получены существенно отличающиеся по частоте выделения вируса данные. В результате исследования более чем 27000 проб смывыов и смывов, в большинстве своем отобранных в Нидерландах и Швеции от более чем 250 видов птиц, вирус гриппа был выявлен всего в 2,1% (1:50) от общего количества проб. Такое расхождение в цифрах, по мнению исследователей, зависит от географической локализации мест отбора проб, видов исследуемых птиц, сезона и удаленности от основных миграционных путей.

Исходя из имеющихся экспериментальных данных распространенность вирусов гриппа А различных подтипов в различных локальных популяциях птиц также сильно варьирует. Однако, необходимо учитывать, что и эти данные могут отражать «временной срез» состояния паразитоценоза. Так, результаты исследований (230) показали, что отдельные подтипы вируса наиболее часто встречаются в определенных популяциях. При этом, возможно, видовые характеристики данной популяции важны для этой избирательности в отношении подтипов вируса. В частности, популяции птиц прибрежного комплекса отличались от популяции уток по подтипам выделяющихся от них вирусов гриппа А (134). Было установлено, что в популяции диких уток доминируют подтипы Н3 и Н6, а сравнительно редко встречающиеся среди уток подтипы Н4, Н9, Н11, Н13 доминируют в популяции чаек и других птиц околоводного комплекса. В этих двух популяциях также отличались и подтипы нейраминидазы: у уток доминировали подтипы N2, N6 и N8, у птиц околоводного комплекса доминировали подтипы N6 и N9 (102, 112, 216).

Как уже отмечалось, вспышки высокопатогенного гриппа регистрируют чаще всего среди сельскохозяйственных птиц – кур, индеек и страусов, разводимых на фермах (64, 71, 120). До недавнего времени, высоковирулентные штаммы почти не выделяли от диких птиц. Первый такой штамм был выделен от крачки в 1961 году (А/крачка/Ю.Африка/61 H5N3) (54). К таким штаммам относился и вирус H5N1, вызвавший эпизоотию 1997-2010 годов среди многочисленных видов диких птиц, в том числе водоплавающих (30, 42, 62, 65, 75, 122, 199).

Весьма важным является вопрос об основных направлениях эволюции вируса, с чем связано формирование новых его вариантов. Очевидно, что как и с другими микро- и макроорганизмами, для образования новой эволюционной ветви вируса гриппа необходимо формирование сравнительно изолированного паразитоценоза со своеобразными селективными условиями. Для вируса со столь широким кругом хозяев и столь обширным ареалом обитания, видимо, возможно влияние как географических факторов, ограничивающих физические пределы биоценоза, так и видового состава последнего.

При этом понятно, что наиболее маловероятно формирование малых замкнутых популяций птиц, учитывая то, что кормовые и сезонные перелеты хотя бы части видов данной популяции неизбежны. В этой связи можно ожидать эффективного влияния разделенности Старого и Нового Света в формировании новых, изолированных друг от друга, эволюционных ветвей. Эти соображения имеют свое экспериментальное подтверждение. В частности, вирус подтипа Н7 подразделяется на линии американского и евразийского происхождения, с выделением группы австралийских изолятов. Примерно так же выглядят и филогенетические группы вируса подтипа Н5 и Н9 (171, 172, 215). Вместе с тем, попадание вируса в популяцию других животных также может дать обособленную эволюционную ветвь. Вероятно, такой процесс произошел с вирусом подтипа Н7, циркулирующим среди лошадей (171).

Причем имеются экспериментальные свидетельства того, что птичьи вирусы гриппа А, попадая в достаточно плотные популяции лошадей, могут там циркулировать и независимо эволюционировать, в частности в 1989-1990 годах при вспышках респираторного заболевания среди лошадей в Китае был выделен вирус гриппа подтипа H3N8, имевший птичье происхождение (73).

Вирусы гриппа А были выделены от множества видов млекопитающих, включая морских (45, 54, 61, 68, 77, 81, 102, 114). От тюленей выделяли вирус гриппа подтипов H7N7, H4N5, H4N6 и H3N3, которые были антигенно и генетически схожи с вирусами гриппа, циркулировавшими в тех же географических регионах у птиц (61, 210). От китов был выделен изолят подтипа H1N3, антигенно родственный птичьему вирусу, и изоляты подтипов H13N и H13N9, генетически идентичные штаммам, выделенным в этом же регионе от чаек (77). Приведенные данные указывают, что вирусы гриппа А, морские птицы и морские млекопитающие образуют единый паразитоценоз, но, в силу ограниченности данных и их не пригодности для статистического анализа, приходится говорить лишь о случайном заносе птичьего вируса гриппа А в популяцию морских млекопитающих, которая самостоятельно не поддерживает циркуляцию данных подтипов.

При анализе вероятных путей формирования новых вариантов вируса нельзя обойти вниманием два вида домашних млекопитающих – свиней и норок, поскольку они содержатся в виде очень больших, сверхплотных локальных популяций. Как уже упоминалось, свиньи восприимчивы к заражению широким кругом вирусов (102, 114). Причем инфицируются они повсеместно, на всех континентах, причем различными подтипами, в том числе не типичными для свиней, например в Китае и Канаде у свиней выделяли вирусы подтипов H4N6 и H9N2 (96, 114). У свиней неоднократно выделяли реассортанты человеческих и птичьих вирусов, как это было, например, в Голландии и Италии (110, 127). Эти данные, хотя и косвенно, еще раз указывают на важную роль свиней как вида в формировании новых пандемических штаммов вируса. У норок также выделяли новые вирусные штаммы, например в Швеции в 1984 году был выделен вирус подтипа H10N4 (80).

1.8. Особенности инфекции у разных видов птиц Инкубационный период при гриппе длится, как правило, несколько суток, но может достигать 21 дня. Продолжительность инкубационного периода зависит от свойств штамма, дозы и пути заражения, вида и возраста птицы, условий содержания и/или условий окружающей среды.

Клинические признаки и патологоанатомические изменения болезни весьма разнообразны, и их конкретное проявление также зависит от множества факторов, подробно описанных рядом исследователей (3, 5, 51, 79, 94, 95, 156, 166, 206, 232).

Тяжесть клинических признаков и патологанатомических изменений при инфицировании низкопатогенным вирусом варьирует от практически полного отсутствия до болезни средней тяжести. Часто наблюдается падение продуктивности, взъерошенность оперения, легкий респираторный симптомокомплекс. Некоторые штаммы, как например, адаптировавшаяся к домашним птицам азиатская линия вируса А/H9N2, могут вызывать более яркие признаки и сопровождаться значительной смертностью (66).

Заражение домашних кур и индеек высокопатогенными вирусами вызывает острые формы болезни, проявляющиеся внезапным появлением тяжелых симптомов, поражением нервной системы, смертность может достигать 100% в течение 48 ч. (3, 54, 79, 106).

Распространение болезни внутри пораженного стада зависит от способа содержания птиц. На фермах с напольным содержанием распространение болезни происходит быстрее, чем на фермах с клеточным содержанием.

Многие птицы погибают от сверхострой формы болезни без каких-либо характерных симптомов. В таких случаях начало вспышки иногда принимают за отравление. Для заражения всего стада на фермах требуется несколько суток (64, 117).

У различных видов птиц даже внутри одной общей популяции некоторые высокопатогенные штаммы могут вызывать тяжелую болезнь у одного вида птиц, и при этом быть низко- или авирулентными для другого. Например, при эпизоотии на рынках живой птицы в Гонконге в 1997 году 20% цыплят и всего 2,5% уток и гусей были носителями вируса H5N1. Клинические признаки регистрировали только у цыплят (75).

В условиях промышленного птицеводства первым признаком начавшегося заражения стада высокопатогенным вирусом является снижение потребления воды и корма, падение продуктивности (привесов и яйценоскости). Затем наступает угнетение и у отдельных особей проявляются другие клинические признаки. В числе последних отек, видимый на бесперьевых участках головы, цианоз гребня, бородки и лап, диарея, затрудненное дыхание (94, 95).

У уток и гусей, преобладают нервные явления, включая тремор, нарушение координации движений, птицы принимают необычные позы. Часто отмечается хождение или плавание по кругу (30, 95, 226).

Патологоанатомическая картина зависит от патогенности вируса, вида, возраста и иммунного фона хозяина. У кур и индеек описаны синуситы, трахеиты и аэросаккулиты. При достаточно продолжительном течении болезни вторичные инфекции осложняют течение болезни, изменяют картину поражения в органах и тканях, делая ее менее характерной. У индеек отмечают панкреатиты. У цыплят часто описывают поражения респираторного тракта.

У кур-несушек обнаруживают различные поражения в репродуктивных органах: воспалительные процессы в яичниках и яйцеводах, желточные перитониты.

Данные патологоанатомического вскрытия при высокопатогенном гриппе кореллируют с клинической картиной. Условно, можно выделить четыре степени тяжести патологических изменений (166).

При сверхостром и остром течении болезни, когда гибель наступает в течение 24-36 часов после инфицирования, характерные для гриппа А патологоанатомические изменения, как правило, отсутствуют. В отдельных случаях отмечены геморрагические поражения внутренних органов, гидроперикардиты, запустение пищеварительного тракта и петехиальные кровоизлияния в брыжейке и перикарде, отек легких и скопление серозного экссудата в полостях тела. Гистопатологические поражения с той или иной частотой выявляются в различных органах, причем начинаются они с эпителиальных клеток, затем охватывают другие ткани, включая миокард и мозг.

При длительном течении болезни отмечают, в основном, признаки поражения нервной системы. При вскрытии обнаруживают воспалительные поражения мозга (30, 122). У кур-несушек отмечают воспалительные процессы в яичниках и яйцеводах, и, после разрыва фолликулов, желточные перитониты. Вирус присутствует практически во всех тканях и органах, на вскрытии часто выявляют геморрагии во всех тканях. При заражении азиатской линией высокопатогенного вируса гриппа А/H5N1 такое течение болезни наиболее часто встречается у гусей, уток, страусов и некоторых других видов птиц.

При субклинической форме болезни имеет место ограниченная репродукция вируса в организме уток, чаек, ворон и домашних воробьев. Она сопровождается легкой интерстициальной пневмонией, аэросаккулитами и иногда воспалительными процессами в миокарде (51, 167). Вместе с тем, в тяжелых условиях существования, при ограниченности в пище, колебаниях температурного режима, болезнь у этих видов может протекать более тяжело, вплоть до смертельных исходов.

При хронической асимтоматической форме болезни, вызванной экспериментальным заражением или естественным инфицированием птиц, клинические и патологоанатомические признаки у большинства особей отсутствуют, а если имеются, то выражаются в виде умеренных поражений внутренних органов.

Как видно из изложенного выше, патогномонические признаки у гриппа А птиц отсутствуют, а имеющиеся клинические признаки, равно как и патологоанатомические изменения, варьируют в широких пределах. По этой причине в системе диагностических мероприятий ведущая роль принадлежит лабораторной диагностике и генетическим методам идентификации вируса.

1.9. Наиболее значимые эпизоотии гриппа А среди птиц Первая из эпизоотий высокопатогенного гриппа А среди птиц была зарегистрирована в 1959 году, хотя и нет ни каких сомнений, что они имели место и ранее. Подбор информации, сделанный по данным ряда авторов (10, 54, 63, 64, 71, 90, 97, 160) о зарегистрированных вспышках высокопатогенного гриппа А среди птиц, показывает в виде тенденции, что количество таких вспышек нарастает, а экономические потери от них увеличиваются. За первые 10 лет (1959-1969 гг.) имело место 3 эпизоотии: в Шотландии в 1959 году, в Англии в 1963 году и в Канаде в 1966 году. Общее количество потерь составило четыре стада численностью не более 50 тыс. голов. За следующие 10 лет (1969-1979 гг.) имело место также три эпизоотии: в Австралии в году, в Германии в 1979 году и в Англии в 1979 году. Общее количество потерь составило восемь стад птиц численностью не менее 800 тыс. голов. За третье десятилетие (1979-1989 гг.) произошло три больших эпизоотии: в США в 1983-1985 годах, в Ирландии в 1983 году, в Австралии в 1985 году.

Общее количество потерь составило 460 стад птиц численностью около млн. голов. За следующие 10 лет (1989-1999 гг.) произошло 11 эпизоотий: в Англии в 1991 году, в Австралии в 1992 году, в Мексике в 1994-1995 годах, в Пакистане в 1994 году, в Китае в 1997 году, в Австралии в 1997 году, в Италии в 1997 году. Общие потери птицы составили более 50 миллионов голов.

В период с 1999 по 2009гг. зарегистрировано не менее семи эпизоотий, общие потери птицы превысили 214 миллионов голов.

Какое количество эпизоотий, вызванных низкопатогенными вирусами, произошло за это же время, не поддается даже тому приблизительному учету, который налажен для эпизоотий, вызываемых высокопатогенными вирусами. Однако, нет ни каких сомнений, что они не менее широко распространены в природе и на домашней птице. В некоторых случаях низкопатогенные вирусы становились эндемичными для достаточно больших географических регионов. Таким был вирус А/H9N2, получивший распространение в середине 1990-х годов. Вызванные им вспышки болезни регистрировались среди практически всех видов сельскохозяйственной птицы в целом ряде стран: в Германии, Италии, Ирландии, ЮАР, США, Южной Корее, Иране, Саудовской Аравии, Пакистане, Китае, ОАЭ, Израиле, Иордании, Кувейте, Ливане, Ливии и Ираке (171, 172, 226).

1.10. Эпизоотия азиатского вируса подтипа H5N Связанные с чрезвычайно широко распространившимся вирусом H5N события, по-видимому, начались в середине 90-х годов в Китае. Первый вирус был выделен от гуся в провинции Guangdong в Китае в 1996 году (109).

Дивергентная эволюция вируса, по всей вероятности, происходила в популяциях домашних птиц, и его различающиеся штаммы циркулировали среди птиц в южном Китае, не выходя, однако за пределы региона. Причиной эндемичности, вероятно, была не способность вируса эффективно распространяться дикими перелетными птицами.

Эпизоотическая ситуация резко изменилась в 2003 году, когда вирус повысил уровень вирулентности и приобрел способность переноситься дикими водоплавающими птицами. За короткое время эпизоотия распространилась по 8 азиатским странам. В 2004 году вирус появился в Малазии, которая стала девятой пораженной эпизоотией страной, и стал эндемичным в регионе. Способ содержания и торговли живой птицей (рынки живой птицы), обычные в данном регионе стали причиной его устойчивой эндемичности (54, 97).

Среди дикой птицы вирус регистрировался с 2002 года на территории Китая, в 2005 году он появился среди диких уток в Монголии. После локальной эпизоотии среди мигрирующих птиц на озере Qinghai (Куингхай, Кукунор) в Западном Китае его распространение в западном и северном направлении стало практически неизбежным, так как это один из важнейших миграционных путей дикой водоплавающей птицы. В 2005 году вирус появился в местах гнездования водоплавающей перелетной птицы в Западной Сибири.

Характерной особенностью данного региона является то, что места летовки и миграционные станции разделяют водоплавающие птицы, мигрирующие в разных миграционных потоках, что предопределяло очень широкое его распространение. В течение 2005 – 2006 годов вирус был зарегистрирован в Сибирском, Уральском, Южном и Центральном федеральных округах Российской Федерации, но, принятый комплекс мер (вакцинация, санитарные меры, повышение уровня биобезопасности в птицехозяйствах) позволил избежать значительных потерь (9, 10, 16, 25, 26,27, 31, 36, 40, 45, 50).

Проникновение вируса сразу в четыре крупных миграционных потока привело к его распространению в Европу, на Ближний Восток и в Африку. В первом полугодии 2006 года вирус был зарегистрирован более чем в 30 странах (54). Кроме распространения вируса дикими перелетными птицами, были зарегистрированы также случаи его вывоза человеком за пределы зараженных стран. Например, в аэропорту Брюсселя была конфискована партия провозимых контрабандой орлов из Таиланда. Птицы были заражены эпизоотическим вирусом А/H5N1, генетически родственным изолятам из Тайланда.

В 2007 году вирус распространился практически по всей Европе, проник в Турцию, страны нильского бассейна и центральной Африки. В данном случае, вероятно, вирус распространялся во время массовых миграций птиц (54). В 2008-2010 году напряженность эпизоотической обстановки начала снижаться, что, вероятно, связано с изменением биологических свойств вируса.

1.11. Профилактика и мероприятия по ликвидации В подходах к профилактике гриппа птиц в комплексе противоэпизоотических мероприятий постоянно присутствуют два причинных компонента. Первый связан с огромным экономическим значением болезни для птицеводства, второй – с тем, что распространение вируса гриппа А среди птиц является причиной формирования новых вариантов вируса, патогенных для других животных и человека. Этим обусловлено постоянно повышенное внимание к данной проблеме со стороны ветеринарных и медицинских служб, научной общественности, населения и средств массовой информации (6, 162). Эти две опасности, связанные с распространением вирусов гриппа А птиц диктуют и логику противоэпизоотических мероприятий и технологию «эшелонированной» обороны против его распространения.

Первым уровнем защиты, исходя из понимания того, что реальные возможности контролировать распространение вируса в дикой природе пока отсутствуют, является предотвращение его заноса в популяцию домашней птицы, особенно в промышленное птицеводство. Этот уровень защиты требует планирования средств защиты промышленных птицеводческих хозяйств и необходимого уровня биологической защиты на уровне государства. Предотвращение заноса вируса в популяцию домашней птицы может быть достигнуто всего лишь тремя путями.

Первый - это изоляция популяции птицеферм от внешней среды. Она достигается комплексом технических мероприятий (исключение выгула птицы, защита кормовой цепи, защита птицеводческих помещений от проникновения дикой птицы, включая синантропную и т.п.) и направлена на предотвращение контакта (прямого или опосредованного) с дикой птицей.

Второй – это изоляция дикой птицы от птицеферм (ликвидация прудов, болот, других водных бассейнов вблизи птицеферм, ликвидация условий для гнездования птиц на территории птицеферм, распугивание и т.п.). Она также достигается комплексом технических мероприятий и направлена на предотвращение контакта (прямого или опосредованного) с дикой птицей.

Третий – снижение восприимчивости домашней птицы к заражению, достигаемое путем вакцинации.

Сочетание этих трех подходов зависит от эпизоотической ситуации в регионе. Эпизоотическая ситуация критическим образом зависит от того, какова роль региона в экологии дикой перелетной водоплавающей птицы и экологии птицы околоводного комплекса. Экология птицы околоводного комплекса относительно постоянна и это легко учитывается при проектировании птицеферм, их расположении.

Иное дело – мигрирующая водоплавающая птица. Путями ее миграции перекрываются огромные пространства, исключение расположения птицеводческих хозяйств на которых не реально. Сами регионы могут принадлежать к экологически различным зонам: какие-то из них посещаются перелетной птицей сезонно, какие-то являются регионами летовок и репродукции, какие-то – местом зимовок, какие-то - зонами миграционных станций и т.д.

Самыми опасными являются те, что являются местом летовок для одних видов (или субпопуляций одного вида) перелетной водоплавающей птицы и местами зимовок для других видов (или субпопуляций одного вида). Этими особенностями регионов в некоторой степени обусловлено и то, что различные страны избирают различающиеся подходы для реализации комплекса противоэпизоотических мероприятий. При анализе этих подходов необходимо понимать, что они могут различаться не только в зависимости от эпизоотической ситуации в регионе, но и от степени управляемости сектора со стороны государства.

Например, высокая степень упорядоченности экономической деятельности сельскохозяйственного сектора Европейского союза, достигаемая многообразными экономическими рычагами и стимулами, позволяет поддерживать систему, основанную на стемпинг-ауте и запрещении вакцинации. Эта система является достаточно дорогой и не является эффективной в регионах, где высока плотность мелких птицеводческих хозяйств.

Весьма важным для планирования и эффективности той или иной стратегии превентивных мер является соотношение в данном регионе или данной стране плотностей птицы в наименее защищенном секторе – так называемой птице частных подворий – и в промышленном секторе. Чем выше концентрация и экономическое значение для населения первого сектора, тем более доводов в пользу использования вакцинации в данном регионе.

Очевидно, что в реальной ситуации 100%-но надежной защиты от проникновения инфекции нет. Поэтому в комплексе мер обязательно присутствует элемент ликвидации возникших очагов инфекции, которая должна осуществляться быстро и эффективно. В любом случае, для осуществления реально направленной на недопущение возникновения и распространения болезни стратегии противоэпизоотических мероприятий необходимым элементом является ликвидация инфицированного поголовья. Своевременная ликвидация невозможна без своевременного обнаружения очага, а, следовательно, в отсутствии эффективной системы мониторинга распространения болезни. Учитывая наличие инкубационного периода болезни, при условии высокой плотности птицеводческих хозяйств в данном регионе необходимы мероприятия по депопуляции в угрожаемой зоне восприимчивого поголовья домашней птицы. Этот подход реализуется не всегда, так как при низкой концентрации ферм и населенных пунктов, когда они разделены расстояниями 20 и более км, он не является необходимым.

Самой ликвидации инфицированного поголовья совершенно не достаточно, нужна еще элиминация вируса в зараженной местности, зданиях, сооружениях, инвентаре и т.п. На время проведения этих мероприятий принимаются меры карантинно-ограничительного характера, направленные на недопущение проникновения или распространения вируса за пределы инфицированной зоны.

Необходимо отметить, что в случае обнаружения низкопатогенного вируса только подтипов Н5 и Н7, а в зависимости от страны, иногда еще и подтипов Н4 и Н9, также проводится уничтожение инфицированных и подозрительных стад птицы. Причиной убоя птицепоголовья является высокая вероятность мутирования вируса в высоковирулентную форму (54, 90).

Наиболее сложно дело обстоит в странах и регионах, где имеется высокая плотность населения и населенных пунктов, домашней птицы на маленьких фермах и частных подворьях, где птица содержится в условиях свободного выгула и имеет важное значение для питания населения (63). В таких местностях высока вероятность заражения домашней птицы, быстрого распространения инфекции, образования эндемичных очагов. Для искоренения очага необходимо уничтожение всего поголовья птиц в радиусе до 3-5 км от инфицированных хозяйств. Пример вспышки гриппа птиц в таких условиях имел место в Италии в 1999-2000 годах. Для ее ликвидации была уничтожена вся птица на фермах и подворьях в радиусе 1 км от выявленных очагов инфекции. Такая малая зона депопуляции, вероятно, была связана с относительно жарким климатом и обильной инсоляцией. Вследствие запоздалого выявления это вылилось в конечном итоге в уничтожение 14 - 16 млн. птиц, которое длилось четыре месяца (64, 71).

В 1997 г. в Гонконге в течение трех суток было уничтожено около 1, млн. птиц. Однако, проведение подобных мероприятий затруднительно в случае с частными подворьями при выгульном содержании животных, где возможен прямой контакт домашних и диких птиц. В случае совместного содержания домашних уток и гусей, высоко вероятно образование эндемичного очага инфекции, что неоднократно наблюдалось в Юго-Восточной Азии (65, 75, 89, 96).

В относительно бедных странах и регионах в таких условиях применяется вакцинация. Она, конечно, не исключает возможность распространения инфекции, хотя и снижает ее вероятность, но весьма экономически эффективна в таких условиях. Вакцинация против гриппа А птиц живыми аттенуированными вакцинами крайне опасна, поскольку создает условия для образования рекомбинантных вирусов, а вакцинация стандартными инактивированными вакцинами предохраняет птицу от болезни и гибели, существенно снижает экскрецию вируса в окружающую среду инфицированными животными, но не предотвращает заражение птиц (6, 91, 92, 157).

Наиболее эффективны вакцины, содержащие в своем составе вирус, гомологичный полевым изолятам по гену гемагглютинина, иначе эффект ингибирования выделения патогенного вируса из организма вакцинированной и впоследствии заразившейся птицы будет минимальным. По-возможности, следует использовать вакцину, содержащую вирус с гетерологичной нейраминидазой (DIVA-стратегия), что позволит провести дифференциацию иммунизированных от зараженных птиц на иммунном фоне стада (204).

Вакцинация птицы против гриппа А инактивированными вакцинами, наряду с несомненными преимуществами – в первую очередь - безопасностью, имеет целый ряд серьезнейших недостатков. Первый из них – обязательный парентеральный путь введения вакцины, предопределяющий высокую трудоемкость, стоимость и отрицательное влияние человеческого фактора (нарушения технологии применения, стрессовое состояние птиц и т.п.).

Более эффективным представляется создание для использования в составе вакцины рекомбинанта, полученного лабораторным путем - маркированной инактивированной вакцины. Сейчас можно создать любую комбинацию вирусных генов. Такие вакцины уже использовались на практике в Мексике, Пакистане и Италии. DIVA-стратегия реализуется в таких случаях сравнительно легко, эффективность вакцины практически не снижается. Существенным недостатком является сама технология изготовления такого рекомбинантного вируса – длительная и дорогая (175).

Наиболее эффективными представляются живые генно-инженерные вакцины против гриппа птиц. Рекомбинантный вирус содержит ген гемагглютинина вируса гриппа А птиц, встроенный в геном вирусов, обладающих способностью инфицировать птиц. Такие вакцины уже реализованы с использованием вируса оспы птиц, вирусoв инфекционного ларинготрахеита и Ньюкаслской болезни, аденовируса (19, 178, 183, 218). Такие вакцины были применены на практике в Мексике, технология их приготовления совершенствуется и, видимо, за ними будущее.

1.12. Лабораторная диагностика гриппа птиц Как уже отмечено выше, грипп А птиц не имеет патогномонических признаков, и в полевых условиях возможна лишь постановка предварительного диагноза, что предполагает дальнейшее проведение лабораторных исследований. Поскольку вирус гриппа имеет выраженный антигенный и генетический плюралитет, диагностика проводится с использованием комплекса методов, включающих выделение вируса, обнаружение его РНК или антигенов, антител к нему, а также типирование по подтипам гемагглютинина и нейраминидазы, определение нуклеотидной (аминокислотной) последовательности генов и генотипирование, филогенетический анализ (78, 121, 159, 209).

Для выявления или выделения вируса отбирают пробы из органов, потенциально содержащих наибольшее количество вируса. В качестве последних используют патологический материал (пробы головного мозга, селезёнки, сердца, кишечника, трахее и легких), смывы (клоакальный и трахеальный), пробы помета. При отборе проб патологического материала, пробы внутренних органов (печени, селезенки, почек, сердца и др.) и пробы кишечника, трахеи и легких отбирают в отдельные емкости, транспортируют и исследуют отдельно, поскольку наличие вируса в первых предполагает его высоковирулентные свойства.

Учитывая особенности накопления вируса в различных органах и тканях, пробы отбирают от 5-10 больных или павших птиц из стада (популяции) в первые дни болезни. Отобранные пробы заключают в содержащую высокие концентрации антибиотиков «транспортную» среду, используемую для консервации материала при его перемещении в лабораторию.

Если пробы доставляются в лабораторию в течение не более чем 48 часов, то их перевозят на льду, в охлажденном виде. Если доставка предполагает более длительный период, то пробы замораживают с использованием сухого льда или жидкого азота (209). Пробы крови обычно отбирают из подкрыльцовой вены у 25-30 птиц одного стада.

Вирус гриппа птиц выделяют с помощью инокуляции 9-11 суточных развивающихся эмбрионов СПФ-кур. Инокулированные эмбрионы ежедневно овоскопируют. Если вирус высоковирулентный, то эмбрионы обычно погибают за 1-3 суток (209, 121).

После гибели эмбрионов или через 5 суток инкубации в экстраэмбриональной жидкости проверяют наличие гемагглютинирующего вируса с помощью РГА с эритроцитами кур. При отрицательном результате выделения вируса на первом пассаже проводят еще 2-5 последовательных пассажей. Для выделения вируса применяют также и различные культуры клеток, но их чувствительность значительно ниже (121). Специфичность результатов РГА подтверждают в РТГА со специфическими к разным подтипам вируса сыворотками. Подтип нейраминидазы устанавливают в РТНА также с использованием подтипо-специфических сывороток.

Если удалось выделить изолят вируса гриппа птиц, то его обычно подвергают типированию по уровню патогенности, что наиболее часто делается с вирусами подтипов Н5 и Н7, учитывая, что именно они обладают наиболее широким спектром патогенности для птиц. Для этого определяют их индекс патогенности (18, 36, 121, 209).

Наличие антигенов вируса гриппа А в исследуемом материале можно установить в РДП с сыворотками к NP или М-белкам, общим для всех подтипов вируса. Используется также и широкий спектр иных серологических методов, включая различные варианты ИФА, в том числе и с использованием моноклональных антител к нуклеопротеину или матриксному белку, РТГА и др. (32, 36, 37, 121, 209).

Как и в случае целого ряда иных болезней, положительный результат лабораторного исследования получают обычно сравнительно быстро – за 3- суток, а полностью исключить наличие вируса в исследуемом материале ранее, чем за 2-3 недели, не удается.

Обилие диагностических техник, использование типирования предполагает повышенные требования к квалификации персонала лаборатории, где проводятся диагностические исследования на грипп птиц. Повышенная опасность патогенных штаммов вируса предполагает достаточно высокие требования к обеспечению уровня обеспечения биобезопасности работы диагностической лаборатории.

Для лабораторной диагностики гриппа А птиц широко используются методы молекулярно-генетического анализа, среди которых имеются как экспресс-тесты, так и тесты, исполняемые в течение длительного периода.

Для выявления в исследуемом материале генома вируса гриппа А используют различные варианты обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), в том числе ПЦР реального времени, выявляющие наиболее консервативные вирусные гены – гены М и NP (13, 48, 146, 208, 209, 219, 226).

При положительном результате экспресс-теста применяют ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к различным частям гена геммагглютинина и к различным подтипам гемагглютининов. Как правило, в этом случае результатом является выявление или исключение наличия в материале вируса с пятым или седьмым подтипами гемагглютинина (27, 34, 39, 219). Аналогичным образом применяется и ОТ-ПЦР с геном нейраминидазы.

При положительном результате теста на выявление гена гемагглютинина проводят наработку фрагментов ДНК, комплементарным вариабельным частям гена гемагглютинина, и последующее их секвенирование, что позволяет провести предварительную идентификацию происхождения вируса. Такие подходы были использованы и в случае диагностических исследований с азиатским вирусом подтипа H5N1 (17, 24, 27, 45).

При современном развитии технологий генетического анализа в современной лаборатории можно провести обширный комплекс молекулярнодиагностических исследований в течение 3 суток, особенно если использовать ОТ-ПЦР в реальном времени (146, 208, 209, 219). Исключить же наличие вируса в исследуемых пробах можно в течение еще более краткого срока – в течение одних суток.

Основным моментом, в некоторой степени сдерживающим распространение этой методологии лабораторной диагностики, является необходимость создания современных лабораторий, причем критичным является не только высокая стоимость оборудования и расходуемых материалов, но также и требования к самой лаборатории, к квалификации персонала.

Исходя из указанных выше причин, методы молекулярной диагностики находят все более широкое применение, поскольку по специфичности, чувствительности и информативности они превосходят лабораторные методы выявления вирусных антигенов (иммунофлуоресценция, ИФА, ее варианты с применением моноклональных антител и т.п.) (11, 13, 21, 33, 37, 39, 146).