На правах рукописи

АНТОНЫЧЕВА Марина Владимировна

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА НА

ОСНОВЕ СУХОГО АВТОЛИЗАТА ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ, ПОЛУЧЕННОГО ПО

УСОВЕРШЕНСТВОВАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Саратов – 2012

Работа выполнена в ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

Кандидат медицинских наук, доцент Никифоров Алексей Константинович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, доцент ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», заведующий отделом образовательных программ и подготовки специалистов Бойко Андрей Витальевич кандидат медицинских наук, доцент ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского»

Минздравсоцразвития Российской Федерации, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Пронина Елена Александровна Ведущее учреждение: ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита диссертации состоится «_»_2012 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Автореферат разослан «_»2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Возбудитель чумы Yersinia pestis по-прежнему представляет реальную опасность и угрозу жизни людей в связи с существованием активных природных очагов чумы во всем мире (Евразии, Африке, Северной и Южной Америке) и высоким уровнем миграции населения. Недостаточный объем мониторинга в природных очагах обуславливает возможность возникновения вспышечных заболеваний. В настоящее время (1990– гг.) отмечают растущий уровень заболеваемости на о. Мадагаскар, с регистрацией в 2010–2011 гг. значительного числа случаев легочной чумы [Кутырев В.В. и соавт., 2011; WER, 2010]. Кроме того, необходимо учитывать возможность использования возбудителя чумы в целях биотерроризма [Онищенко Г.Г. и соавт., 2003].

Для успешного мониторинга природных очагов чумы необходимо решение комплекса задач, связанных с разработкой и внедрением новых диагностических и профилактических средств (Приказы Роспотребнадзора № 774 от 17.11.2005 г. и № 152 от 08.05.2008 г.).

Питательные среды, относящиеся к средствам диагностики, при проведении эпидемиологического надзора в природных очагах чумы на территории Российской Федерации должны соответствовать нормативным требованиям [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006; Стандарты качества лекарственных средств. № 91500.05.001, 2000].

При производстве МИБП1 к питательным средам предъявляют дополнительные требования. Они должны быть эффективными по выходу целевого продукта, а полученные с их применением лекарственные средства – безопасными для человека. Кроме того, производство питательных сред должно быть также экономичным и конкурентоспособным [Онищенко Г.Г., Меджидов М.М., 2001].

В производстве МИБП наибольшее распространение получили среды, приготовленные из мясных и казеиновых гидролизатов. Однако это сырье является пищевым или технически ценным, к тому же может содержать в своем составе термоустойчивые антибиотики, прионы и другие «неконтролируемые факторы» [Телишевская Л.Я., 2000;

Раевский К.К., 2007; Himedia, 2003]. В связи с этим, фирмы-производители микробиологических питательных сред, расширили ассортимент сред на основе растительного и дрожжевого белка [Himedia, 2003].

Таким образом, при производстве микробиологических сред актуальными задачами остаются как поиск сырья для белковых основ, не уступающих мясным по питательной ценности и удовлетворяющих требованиям стандартности и безопасности, так и разработка способов его эффективной переработки.

В обзорных работах, посвященных питательным средам, дрожжевая биомасса выделена как перспективный вид сырья для приготовления белковых основ [Равилов А.З. и соавт. 1999; Телишевская Л.Я., 2000]. Работы по получению питательных основ МИБП – медицинские иммунобиологические препараты (диагностические и профилактические) из биомассы, в основном кормовых дрожжей, и конструированию из них микробиологических сред были развернуты в 70 - 80-е годы ХХ века. Полученные экстракты и автолизаты применяли в составе питательных сред как пептидные и витаминные добавки, а после более глубокого автолиза или гидролиза – в качестве белковых основ питательных сред для культивирования различных микроорганизмов, в том числе и чумного микроба [Борисенко Е.Г.,1967; Bridson Е., Brecker А., 1970; Бендас Л.Г., 1971; Шеремет О.В.,1979, 1991; Бобрышев В.И. и соавт. 1980; Милютин В.Н. и соавт., 1982; Раскин Б.М., 1985]. Однако на III съезде Общества биотехнологов (2005 г.), было отмечено, что в нашей стране прекращено промышленное производство кормовых дрожжей, и доступным сырьем остаются пекарские и пивные дрожжи. По своему составу наиболее близки к мясу говядины пекарские дрожжи, содержащие протеины до 52–56%. Автолизат пекарских дрожжей по физико-химическому составу близок к триптическому перевару по Хоттингеру [Козлов Ю.А., 1950; Биргер М.О., 1982].

Способность дрожжевой клетки к автолизу предопределяет выбор экономичного способа биоконверсии этого белкового сырья. Известно, что создание определенных условий индуцирует и ускоряет течение этого процесса [Шкляр Б.Х., 1977; Эль-Регистан Г.И., Бабаян Т.Л., 1987; Кислухина О.В. и соавт., 1990; Белоусова Н.И. и соавт., 1995;

Плакунов В.К., 2001].

На основе автолизатов пекарских или пивных дрожжей сконструированы среды для культивирования широкого круга микроорганизмов [Альпер-Юльчевская Б.Я., 1940;

Козлов Ю.А., 1950; Дятлов И.А. и соавт., 1998; Тимербаева Р.Х. и соавт., 2000; Иванова Н. Г. и соавт. 2001]. В литературе, кроме пилотной работы сотрудников РосНИПЧИ «Микроб», использовавших для получения автолизата способ индукции процесса натрием хлорида [Авдеева Н.Г. и соавт., 2000], нами не найдено данных об использовании для культивирования чумного микроба питательных сред, сконструированных из автолизата пекарских дрожжей, в качестве единственного источника аминокислот. Однако известны работы по применению сред из панкреатического перевара пекарских дрожжей для диагностики возбудителей чумы и холеры [Мазрухо А.Б. и соавт., 2004; 2005; 2009;

2011]. Таким образом, конструирование питательных сред на основе дрожжевого автолизата для культивирования чумного микроба остается актуальной задачей.

Цель работы – конструирование новых микробиологических сред для культивирования чумного микроба на основе сухого автолизата пекарских дрожжей, полученного усовершенствованным способом.

Задачи исследования:

Изучить возможность индукции автолиза пекарских дрожжей химическими веществами и ферментными препаратами. Определить оптимальный комплекс методов контроля эффективности процесса автолиза.

Усовершенствовать технологию аппаратного способа получения сухого дрожжевого автолизата при масштабировании процесса.

Провести анализ химического состава и физико-химических свойств сухого автолизата пекарских дрожжей в соответствии с требованиями, предъявляемыми к качеству белковой основы микробиологических сред.

Сконструировать оптимальные по составу плотные и жидкие питательные среды для культивирования чумного микроба на монооснове – сухом автолизате пекарских дрожжей и оценить свойства сконструированных сред по биологическим показателям.

Испытать среды на основе сухого дрожжевого автолизата при экспериментально-производственном культивировании чумного микроба.

Обосновать экономическую целесообразность использования питательных сред на основе дрожжевого автолизата.

Научная новизна Впервые для культивирования чумного микроба сконструированы питательные среды на монооснове – сухом автолизате пекарских дрожжей, сохраняющие стабильными культурально-морфологические, биохимические свойства микроорганизма и его чувствительность к бактериофагу Л-413С.

Сконструированные экономичные жидкие и плотные питательные среды впервые использованы в производстве экспериментальных серий бактериофага диагностического чумного Л-413С.

Процесс изготовления автолизата оптимизирован применением индукторов ферментной природы в условиях направленного изменения рН гидролизуемой среды. В качестве индуктора автолиза дрожжевых клеток был впервые использован новый комплексный ферментный препарат микробного происхождения – протеовибрин, выделенный ранее из ультрафильтрата культуральной жидкости производственного штамма Vibrio cholerae М 41 серовара Огава [Кузьмиченко И.А. и соавт., 2002; 2003; 2010]. Приоритетность выполненных исследований по стимулированию автолитической активности дрожжей протеовибрином с целью получения эффективной и экономически выгодной питательной основы, пригодной для микробиологических целей, подтверждена патентом «Способ получения питательной основы и питательная среда для культивирования микроорганизмов» (№ 2360962, приоритет от 15.02.2007).

Предложен комплексный подход в выборе методов контроля эффективности автолиза и впервые для этих целей рекомендовано использовать метод кондуктометрии.

Практическая значимость Сконструированы жидкая и плотная питательные среды для культивирования чумного микроба и его бактериофагов, отвечающие требованиям контроля по биологическим и физико-химическим показателям. Питательные среды, приготовленные на основе сухого автолизата пекарских дрожжей для культивирования чумного микроба, использованы в производстве экспериментальных серий бактериофага диагностического чумного Л-413С. Доказана экономическая целесообразность внедрения этих сред в производство МИБП.

Предложен новый способ получения белковой основы питательных сред автолизата пекарских дрожжей, отличающийся от аналогов тем, что в качестве индуктора в процессе автолиза использован ферментный препарат протеовибрин и оптимизирована рецептура питательных сред для культивирования чумного микроба. Методические рекомендации «Приготовление автолизата пекарских дрожжей и конструирование на его основе питательных сред для культивирования чумного микроба» одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 5 от 24.11.09 г.) и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Определен комплекс методов, позволяющий определить эффективность процесса автолиза. Методические рекомендации «Оценка эффективности автолиза пекарских дрожжей комплексом физико-химических методов» также одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 7 от 27.06.06 г.) и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Автолиз пекарских дрожжей, индуцированный протеолитическим ферментом в условиях щелочной среды, эффективнее способа, основанного на применении натрия хлорида.

2. Усовершенствованный технологический процесс производства автолизата пекарских дрожжей позволяет получить полноценную сухую питательную основу для микробиологических сред, соответствующую требованиям НД по физико-химическим свойствам и составу.

3. Сконструированные питательные среды на основе сухого автолизата пекарских дрожжей обеспечивают питательные потребности чумного микроба с сохранением стабильными его культурально-морфологических, биохимических свойств, чувствительности к бактериофагу Л-413С и соответствуют требованиям НД, предъявляемым к питательным средам.

4. Сконструированные питательные среды на основе сухого автолизата пекарских дрожжей для культивирования чумного микроба по эффективности не уступают средам, приготовленным из мясного сырья, и пригодны для масштабированного культивирования штаммов чумного микроба.

Апробация работы Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ «Микроб» (2005–2011 гг.). В виде тезисных работ материалы были представлены на: VI Межгосударственной научнопрактической конференции «Санитарная охрана территории государств-участников содружества независимых государств: Проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» в НИИЭМ им. Пастера (Санкт-Петербург, 2006); научнопрактической конференции ГИСК им. Тарасевича «Вакцинология 2006». Совершенствование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); совещании и проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2008); международной научно-практической конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития», посвященной 50-летию НИИ проблем биобезопасности НЦБ МОН РК (Алматы, 2008); V международной конференции «Проблемы обращения с отходами лечебно-профилактических учреждений» (Москва, 2009); международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» в ФГУН НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора (Санкт-Петербург, 2010).

По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 6 статей, 4 из них в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России для публикации основных научных результатов, представляемых на соискание искомой ученой степени, и одно изобретение (Пат. 2360962 РФ МПК С12N1/20).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 152 страницах компьютерного текста, состоит из введения, одной главы обзора литературы, шести глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения и списка литературы. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 15 рисунками. Список литературы содержит 279 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Штаммы микроорганизмов. При конструировании сред для культивирования чумного микроба использованы тест-штаммы, рекомендуемые для контроля качества сред по биологическим показателям [МУ 3.3.2.2124, 2006]: Yersinia pestis ЕV НИИЭГ, полученный из лаборатории препаратов против чумы и других особо опасных инфекций ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377, Y.

pseudotuberculosis И-199 и Y. pestis КМ 277 (ЕV 11М pFSK 3) (рFra- pCad- pPst- pFSK-3;

Kmr), полученные из Госколлекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб».

Микробиологические методы: тинкториальный метод [Шкляр Б.Х., 1977; Коваковская С.С., 1978]; культуральный метод [ГФ РФ ХII, 2008]; определение чувствительности и скорости роста на питательной среде [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006]; определение эффективности питательной среды по накоплению биомассы [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006; Дятлов И.А. и соавт., МР, 1991]; определение эффективности питательной среды по биосинтезу капсульного антигена методы РНГА2 и РНГА – реакция непрямой гемагглютинации ИФА3 [МУ 3.3.2.2124, 2006; Наумов А.В., Самойлова Л.В., 1992], РИД4 [Зильбер Л.А., 1968]; определение показателя прорастания [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006];

определение показателя стабильности основных биологических свойств микроорганизмов [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006]; метод Грация [ТУ 9386-020-01898109Биохимические методы: определение протеолитической активности на плотных тест-средах [Шкляр Б.Х., 1977]; определение наличия низкомолекулярной фракции белка [МУК 4.2.2316, 2008]; определение пептидов [МУК 4.2.2316, 2008]; колориметрический метод определения белка по Лоури [ГФ РФ ХII, 2008]; фенол-сернокислый метод определения содержания углеводов [Dubois М. et al, 1956]; метод ВЖЭХ [ГФ РФ ХII, 2008].

Химические методы: метод формольного титрования [МУК 4.2.2316, 2008]; определение сульфатной золы [Ф РФ ХII, 2008]; определение общего азота [МУК 4.2.2316, 2008]; аргентометрическое определение хлоридов [МУК 4.2.2316, 2008]; колориметрическое определение общего фосфора в присутствии восстановителя [Фердман Д.Л., Сопин Е.Ф., 1957]; метод Фиске-Суббароу [Фердман Д.Л., Сопин Е.Ф., 1957]; метод де Ваарда [Неменова Ю.М., 1972]; метод Гадиента [Петрунькина А.М., 1961]; метод колориметрии с роданистыми солями для определения железа [Фердман Д.Л., Сопин Е.Ф., 1957]; качественное определение наличия тяжёлых металлов [ГФ РФ ХII, 2008].

Физические методы: потенциометрическое определение активности ионов водорода [МУК 4.2.2316, 2008];турбидиметрический метод [Кислухина О.В., и соавт., 1990];

кондуктометрическое определение удельной электропроводимости [МР, Иркутск, 2003];

колориметрическое определение цветности [ГФ РФ ХII, 2008]; колориметрическое определение количества тирозина по стандартной кривой [Алексеенко Л.П., 1968]; ареометрическое измерение относительной плотности автолизата [Азевич З.Ф. и соавт., 1990]; определение массовой доли влаги [МУК 4.2.2316, 2008]; метод визуального определения прозрачности и цветности [МУК 4.2.2316, 2008]; определение растворимости [МУК 4.2.2316, 2008].

Обработку результатов проводили с применением методов вариационной статистики [Ашмарин И.П., Воробьёв А.А., 1962; Лакин Г.Ф., 1990] и рассчитывали: среднее арифметическое (М); среднее квадратическое отклонение (); среднюю ошибку среднего арифметического (m); степень достоверности различий по Стьюденту (p).

Все исследования проведены самостоятельно или при активном участии автора, за исключением работы по определению содержания аминокислот в сухих сериях автолизата, выполненной по договору о научно-исследовательском сотрудничестве в ИБФРМ РАН (г. Саратов) с использованием метода ВЭЖХ на хроматографе Knauer Smartline 5000.

ИФА – иммуноферментный анализ РИД-реакция иммунодиффузии Материалы и оборудование для приготовления сухого автолизата пекарских дрожжей. Оптимизацию процесса автолиза проводили в условиях лабораторного эксперимента и масштабированного производства. При приготовлении сухого автолизата пекарских дрожжей (САПД5) –основы микробиологических сред – использовали дрожжи хлебопекарские прессованные (ГОСТ 171-81) в виде водной суспензии.

Для протеолитического воздействия на дрожжевые клетки применяли коммерческие препараты: трипсин (Serva), проназу (Serva), пепсин (Spofa) и экспериментальный ферментный комплекс – протеовибрин с известной активностью ферментов [Кузьмиченко И.А. и соавт. 2002, 2003, 2010]. Шестичасовой автолизат пекарских дрожжей использовали как самостоятельный полиферментный препарат, внося его в дозе 1, 3 и 5% к объему исходной дрожжевой взвеси. В лабораторных условиях автолиз проводили в объеме до 10,0 л при периодическом перемешивании и температуре (49+1) оС. В качестве бактериостатического и плазмолизирующего вещества использовали хлороформ (до 1–2%). Через 4 ч после приготовления взвеси дрожжей и инициации процесса автолиза проводили коррекцию рН среды (8,0+0,5) натрием двууглекислым, натрия гидроокисью или аммонием углекислым. Длительность процесса составляла 18–30 ч. Пробы отбирали через каждые 2 ч. Ферментативный процесс останавливали прогреванием биомассы при режиме 110 оС (0,5 кгс/см2) в течение 30 мин. После отстаивания взвеси в течение 1 сут, надосадочную жидкость декантировали, фильтровали и сушили на сублимационной установке (LZ 9 W Frigera). Лабораторным способом получено 79 серий автолизата пекарских дрожжей, из них 23 серии в лиофилизированной форме.

Для масштабирования процесса автолиза (объем дрожжевой взвеси 500 л) и производства экспериментальных серий САПД реакторным способом использовано оборудование и технологическая линия, состоящая из реактора (РЗРЯ-100), сепаратора (АСЭБ 3000), аппарата для фильтрации (ЭПВ.СЦ-300/080), вакуум-выпарной установки (УВВемкостей для сбора супернатанта (РЗРЯ 600 и РЗРЯ-100), а также установки для высушивания препарата (КЯУЛ 101325.002).

По оптимизированной технологической схеме произведено 5 серий САПД. При анализе физико-химических свойств и определении химического состава использован САПД, приготовленный по предложенной ранее [Дятлов И.А. и соавт., 1998] исходной технологической схеме реакторным способом с индукцией автолиза натрием хлористым. Препаратом сравнения был экстракт автолизированных пекарских дрожжей Autolizate Yeast exract, «SERVA» (Германия), также была использована экспериментальная серия автолизата пивных дрожжей «Авимин», ООО «БИТРА», Москва).

Материалы и оборудование для приготовления питательных сред и диагностические препараты. Плотные и жидкие питательные среды на основе серий САПД, полученных реакторным и лабораторным способом, готовили по общепринятой методике [Биргер М.О., 1982]. В качестве контрольных питательных сред были использовасухой автолизат пекарских дрожжей;

ны среды лабораторного изготовления для культивирования чумного микроба на основе гидролизата по Хоттингеру, предварительно прошедшие контроль. Среды, используемые для культивирования Y. pestis Р-1680, дополнительно содержали тиамин (0, мг/л), для культивирования Y. pestis КМ 277 – канамицин (20 мкг/мл).

Диагностические препараты: Для определения стабильности культуральноморфологических свойств чумного микроба применяли «Бактериофаг чумной диагностический Л-413С» (РосНИПЧИ «Микроб», Россия). Для определения капсульного антигена использовали «Диагностикум чумной эритроцитарный антительный» (Казахский научный центр карантийных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева, Казахстан), «Диагностикум чумной эритроцитарный иммуноглобулиновый» (ФГУ ЦНИИ МО РФ, Киров) и для РИД по Оухтерлони - специфические чумные сыворотки экспериментальных серий (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Оптимизация индуцированного автолиза пекарских дрожжей. В ходе экспериментов изучены условия автолиза пекарских дрожжей и возможность индукции этого процесса химическими веществами и ферментными препаратами. Для оценки автолитической активности дрожжей использованы методики, основанные на различных принципах действия: турбидиметрический метод, ориентированный на изменение оптической плотности автолизируемого субстрата; метод определения конечных продуктов автолиза (аминного азота или тирозина); потенциометрический метод регистрации изменения реакции среды и метод кондуктометрического измерения удельной электропроводимости среды.

На основании проведенных исследований, был выбран оптимальный комплекс методов контроля эффективности процесса. Для определения качества сырья – оценки эффективности автолиза пекарских дрожжей, впервые был применен метод кондуктометрии. В качестве контрольных параметров I стадии процесса предложено применять комплекс методов до стабилизации показателей: турбидиметрическое определение степени лизиса дрожжевых клеток по изменению экстинкции взвеси после инкубации и формольное титрование для определения аминного азота. Методы доступные, простые в исполнении и позволяют оперативно оценить эффективность автолиза.

На этом этапе исследований был определён гидромодуль – оптимальное соотношение разводящей жидкости (воды) и биомассы дрожжей в реакционной смеси. Анализ результатов, полученных в каждом объёмно-весовом соотношении, свидетельствует об увеличении степени лизиса клеток, росте содержания низкомолекулярных азотсодержащих веществ с разбавлением суспензии дрожжевых клеток и подтверждает данные литературы [Белоусова Н.И. и соавт., 1995]. Однако значительное разбавление суспензии, на наш взгляд, создает дополнительные трудности при концентрировании супернатанта и приводит к увеличению энергозатрат при масштабировании процесса. Таким образом, экспериментально доказано, оптимальным соотношением дрожжей и воды является 1:4.

При обосновании способа индукции процесса автолиза было изучено действие протеолитических ферментных препаратов (трипсина, пепсина, проназы, протеовибрина и собственно автолизата пекарских дрожжей). Предварительно определяли активность ферментов при температуре (37+1) оС на плотной тест-среде с обезжиренным молоком и дозы, выравнивали по активности (табл. 1).

Таблица 1 – Влияние ферментов различного происхождения на показатели автолиза пекарских дрожжей через 24 ч инкубации Трипсин 16000 усл.ед./л, n=10 0,182+0,01 62,5+1,5 49+0, Трипсин 80000 усл.ед./л, n=14 0,186+0,01 66,2+1,4 50,99+0, Протеовибрин 16000 усл.ед./л, n=10 0,180+0,01 60,7+1,6 51+0, Протеовибрин 80000 усл.ед./л, n=14 0,196+0,01 75,4+1,5 52,63+0, Пепсин 80000 усл.ед./л, n=10 0,130+0,0015 40+4 49,30+0, Проназа 80000 усл.ед./л, n=10 0,168+0,0035 60+2 45,16+0, *Уровень аминного азота в контроле условно приняли за 100%; разница с контролем