На правах рукописи

Жуков Николай Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ

СОЛЕВОГО СТРЕССА У ТРИТИКАЛЕ НА РАННИХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА

03.01.05 – физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого» на факультете естественных наук доктор биологических наук,

Научный руководитель:

старший научный сотрудник Иванищев Виктор Васильевич

Официальные оппоненты:

Иванов Борис Николаевич, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, заведующий лабораторией фотосинтетического электронного транспорта Гинс Мурат Сабирович, доктор биологических наук, профессор, Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур Российской сельскохозяйственной академии, заведующий лабораторией физиологии и биохимии растений Федеральное государственное

Ведущая организация:

бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Орловский государственный университет»

Защита диссертации состоится «18» декабря 2013 г. в 13-30 часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН) по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., Институтская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФПБ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Институтская ул., 2.

Автореферат разослан «15» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Назарова Галина Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема адаптации растений к меняющимся условиям среды находится в центре внимания современной физиологии и биохимии. Одним из негативных факторов среды является засоление почв – важная проблема, приводящая к снижению биоразнообразия и продуктивности растений. По данным Минсельхоза РФ на 2010 год засоленные почвы составляли 7-13% площадей сельскохозяйственный угодий нашей страны, а солонцовые – 11-13%. По прогнозам к 2050 г значительному засолению могут подвергнуться более 50% возделываемых территорий (Кошкин, 2010).

Большинство растений чувствительны к засолению (Балнокин и др., 2005). В условиях повышенной концентрации ионов Na+ и Cl- в корнеобитаемом слое ингибируется рост и развитие растений, нарушается их водный статус, ионный гомеостаз и т.д. (Flowers, 2004). Изменение активности ряда физиологических процессов, проявляющееся в условиях засоления, сопровождается структурнофункциональными изменениями фотосинтетического аппарата, дыхательного газообмена (Meneguzzo, 1999).

На протяжении долгого времени адаптацию растений к засолению рассматривали через призму регуляторных механизмов поддержания ионного и осмотического гомеостаза и др., В метаболизме клеток, (Веселов 2007).

подверженных действию стрессора, изменяется работа ионно-транспортных систем, происходит накопление осмолитов и осмопротекторов: пролина, аланина, бетаина, маннитола и др. (Балнокин, 2005). Повышенная концентрация NaCl в среде приводит к окислительному стрессу, сопряженному с избыточной генерацией активных форм кислорода (АФК), в том числе наиболее стабильного и способного диффундировать от места образования - пероксида водорода (Mittler, 2002). В результате активной генерации АФК в клетках может произойти окисление белков, липидов, углеводов, повреждения ДНК и РНК, дезорганизация цитоскелета (Finkel, Holbrook, 2000;

Scandalios, 2002; Колупаев, 2007). Окислительный стресс рассматривают как нарушение внутриклеточного баланса между про/антиоксидантными системами, а устойчивость к окислительному стрессу - в качестве компонента солеустойчивости (Ху, Лиу, 2008).

Чувствительность растений к засолению обусловливает актуальность исследований физиолого-биохимических механизмов проявлений солевого стресса и противодействия ему. В последнее десятилетие значительно выросло число публикаций, касающихся выяснения механизмов адаптации растительных организмов, позволяющих им выживать в условиях засоленной среды (Балнокин и др., 2004; Балнокин и др., 2005; Мохамед и др., 2006; Орлова и др., 2009). При этом в научной литературе недостаточно сведений о комплексе NaCl-индуцированных физиологических процессов, определяющих продуктивность гликофитных растений (фотосинтез, водный обмен, про/антиоксидантная система и некоторые другие), а имеющиеся сведения разрознены и неоднозначны (Костюк и др., 1994; Леонова и др., 2005).

Выбор тритикале (Triticosecale Wittm. & A. Camus) в качестве объекта неблагоприятным факторам внешней среды, в том числе к условиям засоленных и засушливых земель.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение особенностей развития солевого стресса и индукции защитных реакций растений тритикале на ранних этапах онтогенеза в условиях натрий-хлоридного засоления.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

• исследовать динамику показателей водного обмена и особенности накопления неорганических ионов и пролина в тканях тритикале при засолении;

• изучить функциональное состояние фотосинтетического аппарата тритикале в условиях натрий-хлоридного засоления;

• исследовать динамику NaCl-индуцированного образования пероксида водорода и интенсивности перекисного окисления липидов в органах тритикале;

пероксидаза, каталаза) в органах тритикале в условиях солевого стресса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Механизмы регуляции устьичной транспирации способствуют поддержанию относительно стабильного уровня оводненности тканей и предотвращению активного транспорта токсичных ионов (Na+ и Cl-) внутрь растения с транспирационным током до 48 часов экспозиции тритикале на солесодержащей среде.

2. Аккумуляция неорганических ионов и пролина после 48 часов экспозиции в среде с повышенным содержанием NaCl происходит преимущественно в тканях побега.

3. Повышенное содержание ионов Na+ и Cl- в среде приводит к изменению интенсивности фотосинтеза, количества и соотношения фотосинтетических пигментов (хлорофиллов и каротиноидов), изменению скорости восстановления ДХФИФ, временная динамика величин которых отражает двухфазный характер ответа растений на действие солевого стресса.

4. Присутствие хлорида натрия в среде инициирует развитие в корнях и побегах тритикале окислительного стресса, выражающегося в:

генерации избыточных количеств пероксида водорода;

интенсификации процессов перекисного окисления;

изменении активности антиоксидантных ферментов (аскорбатпероксидаза, гваяколовая пероксидаза, каталаза).

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование физиологобиохимических механизмов проявлений солевого стресса и ответных реакций у тритикале на ранних этапах онтогенеза. Поступление и накопление неорганических ионов, а также синтез пролина в условиях хлоридного засоления происходят преимущественно в тканях побегов в фазу адаптации. Показано, что в побегах и корнях тритикале происходят NaCl-индуцированные изменения уровня пероксида водорода, интенсивности процессов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантных ферментов (аскорбатпероксидазы, гваяколовой пероксидазы и каталазы). Показано, что стрессовый ответ тритикале на продолжающееся засоление носит двухфазный характер, включающий фазу стресс-реакции (до 12-24 часа) и фазу адаптации (48-72 часа).

дополняют и расширяют современное понимание механизмов, лежащих в основе устойчивости живых организмов. В частности, полученные данные могут быть использованы при разработке агротехнических, селекционно-генетических методов повышения устойчивости растений к солевому стрессу с использованием новых фундаментальных знаний о механизмах солеустойчивости.

Практическая значимость. Полученные результаты важны для понимания принципов регуляции водного обмена, фотосинтеза и функционирования про/антиоксидантной системы, взаимодействия этих процессов в обеспечении жизнедеятельности растений в условиях солевого стресса. Изученные характеристики (содержание компоненты антиоксидантной системы, показатели водного обмена и фотосинтеза) могут быть использованы при определении устойчивости других видов и сортов сельскохозяйственных растений в условиях хлоридного засоления.

Представленные в диссертационной работе результаты используются в учебном процессе дисциплин факультета естественных наук ФГБОУ ВПО «Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого» в курсах лекций:

«Физиология растений», «Экология растений», «Биохимия и основы биорегуляции организмов».

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Результаты работы докладывались на международных, всероссийских и региональных конференциях: III международной научно-практической конференции «Достижения молодых учёных в развитии инновационных процессов в экономике, науке, образовании» (Брянск, г.); V региональной научно-практической конференции аспирантов, соискателей и молодых ученых «Исследовательский потенциал молодых ученых: взгляд в будущее»

(Тула,2011 г.); Международной научно-практической конференции «Современная наука: тенденции развития» (Краснодар, 2012); III Международной научнопрактической конференции «Проблемы современной биологии» (Москва, 2012);

Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых. «Биология – конференции аспирантов, соискателей и молодых ученых «Исследовательский потенциал молодых ученых: взгляд в будущее» (Тула, 2012); Международной летней экологической школе MOSES-2012 (Москва, 2012).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на страницах и содержат 2 таблицы и 9 рисунков. Список цитируемой литературы включает 239 наименований в т.ч. 135 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Проведенный в рамках исследования обзор литературных источников по теме окислительного стресса, возникающего в растениях под действием различных факторов, в том числе засоления; о влиянии засоления на физиологические процессы компартментации неорганических ионов в клетках, основных причин токсичности ионов Na+ и Cl-, состоянии проблемы натрий-хлоридного засоления (Scandalios, 1993;

Blinda et al., 1997; Karpinski et al., 1997; Leipner et al., 1999; Prasad et al., 1999; Fang, Kao, 2000; Smirnoff, 2000; Aroca et al., 2001; Kitao et al., 2003; Мао et al., 2004; Деви, Прасад, 2005; Foyer, Noctor, 2005; Колупаев, 2007), и функционирования антиоксидантной системы растений в стрессовых условиях (Меньшикова, Зенков, 1993; Скулачев, 1996; Siess, Stahl, 1997; Asada et al., 1999; Dat et al., 2000; Лукаткин, 2002; Mittler, 2002; Blokhina et al., 2003; Рогожин, 2004; Васильева, 2005; Бараненко, 2006; Cheeseman, 2007; Полесская, 2007).

Растительный материал и условия выращивания. Объектами исследования являлись побеги и корни тритикале озимого (сорт «Дон). Семена предварительно фильтровальной бумаге в присутствии 1/10 среды Кнопа с микроэлементами по Хогланду. Десятидневные проростки помещали в вегетационные сосуды и выращивали в виде аэрируемой водной культуры на полной питательной среде.

Растения выращивали при 12-часовом световом периоде, температуре воздуха 23±1/15±1°С (день/ночь), относительной влажности воздуха – 55/75% (день/ночь) и интенсивности света 35 Вт/м2. При достижении проростками фазы кущения, их помещали на питательный раствор, содержавший 120 мМ NaCl. Побеги и корни после 12, 24, 48, 72 и 96 часов экспозиции на растворе NaCl исследовали непосредственно, а при необходимости фиксировали и хранили при температуре -18 °С.

Определение содержания неорганических ионов. Содержание ионов Na+ определяли на пламенном фотометре ПФА 354 («SPECTRON-INTER», Великобритания). Определение ионов Cl- – потенциометрическим методом с помощью титратора АТ500N-1 («Kyoto», Япония), снабженного комбинированным электродом 100-С171.

Показатели водного обмена и фотосинтеза. Определение содержания воды проводили гравиметрическим методом. Величину осмотического потенциала растительных тканей определяли с помощью рефрактометра с подсветкой марки ИРФ-454 Б2М (Россия) (Грязнов, 2006). Измерение интенсивности фотосинтеза, транспирации и устьичной проводимости осуществляли с помощью инфракрасного газоанализатора LCPro фирмы АДС BioScientific Ltd (Великобритания), соединенного с листовой камерой-прищепкой. Определение скорости восстановления ДХФИФ проводили спектрофотометрическим методом (Гавриленко, Жигалова, 2003).

Биохимические эксперименты. Определение содержания пероксида водорода проводили по методу, основанному на образовании окрашенного комплекса пероксида титана (Kumar, Knowles, 1993). Оценка степени перекисного окисления липидов (ПОЛ) была проведена по методу, основанному на определении количества ТБК-реагирующих соединений в пересчете на малоновый диальдегид (МДА) (Heath, Packer, 1968). Содержание фотосинтетических пигментов (хлорофиллов a, b и каротиноидов) определяли спектрофотометрически в этанольных экстрактах (Lichtentaller, Welburn, 1983). Содержание свободного пролина в листьях определяли методом Bates et al. (1973). Определение активности каталазы проводили в фосфатно-буферных экстрактах манометрическим методом с использованием модифицированного аппарата Варбурга (Гавриленко, Жигалова, 2003). Активность гваяколовой пероксидазы спектрофотометрическим методом с пирогаллолом (Иванищев, 2002). Активность аскорбатпероксидазы определяли титриметрическим методом с 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ) по количеству окисленной аскорбиновой кислоты (Чупахина, 2000).

Статистическая обработка результатов. Каждый опыт проводили в трех-пяти биологических и трех-пяти аналитических повторностях. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета прикладных компьютерных программ MS Excel 2003 и SigmaStat 3.1. В таблицах и на рисунках представлены средние арифметические значения определяемых величин и их стандартные ошибки (Р >0,95).

К полученным данным применен стандартный однофакторный дисперсионный анализ с использованием для оценки достоверности при множественном сравнении фактического значения q-критерия Ньюмена-Кейлся.

Глава III. Водный обмен и его регуляция у тритикале 3.1. Содержание воды и показатели водного обмена В течение первых двух суток воздействия 120 мМ NaCl содержание воды в побегах тритикале не изменялось и в среднем находилось на уровне 80%. При этом в корнях наблюдали тенденцию к снижению содержания воды. Дальнейшая экспозиция растений на засоленной среде приводила к снижению содержания воды на 12% в побегах и на 16% в корнях (табл.1).

Показатели водного обмена в побегах тритикале в условиях солевого стресса экспозиции, час воды, % ± потенциал, МПа ± Динамика изменения осмотического потенциала тканей тритикале в условиях засоления носила органоспецифичный характер. В тканях побегов осмотический потенциал снижался на протяжении всего эксперимента, достигая величины -2,1 МПа через четверо суток, что примерно вдвое выше, чем в контроле. Осмотический потенциал тканей корня на протяжении первых 3-х суток эксперимента оставался практически на одном уровне (-1,5 ± 0,1 МПа), после чего снижался на 20%.

Анализ результатов исследования динамики осмотического потенциала позволил отметить несколько важных аспектов регуляции водного обмена растений тритикале. Во-первых, клетки побега и корня сохраняли высокую водоудерживающую способность в условиях низкой доступности воды в почве. Вовторых, величина осмотического потенциала тканей побега значительно превосходила таковой показатель в корне, что, по-видимому, было связано с преимущественной аккумуляцией осмолитов в тканях побега. Данная особенность позволяла сохранять градиент водного потенциала на уровне целого растения (корень-побег), что сопоставимо с результатами других исследователей для солеустойчивых сортов Brassica napus (Мохамед и др., 2006), галоксерофита Artemisia lerchiana (Орлова и др., 2009), галофита Suaeda altissima (Балнокин и др., 2004) и некоторых других растений (Балнокин и др., 2005). Для тритикале, являющегося представителем группы гликофитов, эта особенность отмечена впервые.

Скорость транспирации в первые сутки засоления снижалась в 1,5 раза по сравнению с контролем, после чего стабилизировалась на уровне 0,26 ммоль H2O/м2*с вплоть до 48 часов. Уменьшение скорости транспирации тритикале в этот период может быть связано с потребностью поддержания физиологически необходимой оводнённости тканей в условиях снижения ее доступности из-за уменьшения водного потенциала почвенного раствора. При этом снижение интенсивности транспирации тритикале происходило, по-видимому, из-за закрытия устьиц. На протяжении следующих двух суток (до 96 часов) наблюдали увеличение скорости транспирации (на 50% по сравнению с контролем) до 0,70 ммоль H2O/м2*с.

3.2. Содержание ионов натрия, хлора и пролина в органах тритикале озимого Повышение содержания ионов Na+ в побегах в 2,5 раза относительно контроля наблюдали только на вторые сутки засоления, когда их содержание достигало величины 86 мкмоль/г сырой массы (рис. 1). С увеличением времени экспозиции на растворе с NaCl в побегах наблюдали ещё более существенное повышение содержания Na+, достигавшее уровня в 502 мкмоль/г сырой массы через 96 часов засоления.

мкмоль/г сырой массы Содержание Na+, Рис. 1 Динамика содержания ионов Na+ и Cl- в побегах и корнях тритикале Динамика содержания ионов Cl- в побегах соответствовала результатам, полученным для ионов Na+. Максимальная концентрация Cl- была зафиксирована в побегах через 96 часов засоления и составляла 802 мкмоль/г сырой массы. В отличие от побегов ткани корня практически не накапливали ионы Na+ и Cl-. В частности, на протяжении всего эксперимента уровень Na+ оставался в пределах 37 мкмоль/г сырой массы, а Cl- - 40 мкмоль/г сырой массы.

позволяют сделать ряд выводов. Во-первых, снижение осмотического потенциала клеток и, тем самым, сохранение обычного уровня оводненности, что было показано выше, было достигнуто за счет интенсивной аккумуляции неорганических ионов в клетках. Во-вторых, высокая скорость транспирационного потока после 48 часов перераспределение ионов натрия и хлора между побегом и корнем способствовало сохранению градиента водного потенциала на уровне целого растения, что было показано для соленакапливающих галофитов (Балнокин и др., 2004, 2005). Для тритикале, относимого к группе гликофитов, данная особенность не была ранее показана.

Выращивание растений тритикале на среде, содержавшей 120 мМ NaCl, сопровождалось постепенным повышением уровня пролина в побегах, достигавшем к концу эксперимента (96 часов) 0,44 мг/г сырой массы, что в 3 раза больше, чем в начале эксперимента (рис. 2). Наблюдаемое нами накопление пролина в побегах при засолении соответствует данным, отмеченным для Sorghum bicolor (Colmer et. al, 1996), Geum urbanum (Радюкина и др., 2007), Triticum aestivum (Кафи и др., 2003) и некоторых других. При этом в корнях уровень пролина оставался практически на постоянном уровне (0,25 мг/г сырой массы) и даже несколько снижался к концу эксперимента.

Рис. 2 Содержание пролина в побегах и корнях тритикале Динамика содержания пролина в тканях побега и корня была тесно связана с динамикой накопления неорганических ионов, что, по-видимому, определяется необходимостью поддержания внутриклеточного осмотического баланса.

Поскольку основные изменения наблюдали в тканях побегов тритикале, представлялось необходимым исследовать влияние условий эксперимента на главный физиологический процесс растений – фотосинтез.

Глава IV. Исследование параметров фотосинтеза в условиях засоления 4.1. Функциональное состояние фотосинтетического аппарата тритикале Характер изменения скорости фотосинтеза был неоднозначен. Интенсивность фотосинтеза снижалась в течение первых суток экспозиции на среде, содержавшей 120 мМ NaCl, на 30% вплоть до уровня 7,72 мкмоль CO2/м2*с. После этого происходило увеличение скорости фотосинтеза в последующие сутки в 2 раза, и снижение к 96 часам до уровня 10,96 мкмоль CO2/м2*с, соответствующего первоначальному (рис. 3).

Устьичная проводимость, Рис. 3. Динамика интенсивности фотосинтеза, устьичной проводимости и скорости восстановления ДХФИФ в побегах тритикале под действием 120 мМ NaCl Присутствие в корнеобитаемой среде хлорида натрия также приводило к изменению величины устьичной проводимости. В течение первых 24 часов засоления она снижалась на 35% и оставалась на уровне 13,8 ммоль/м2*с до 48 часов. Кроме экономии воды, закрытие устьиц при засолении могло иметь приспособительное значение, заключающееся в ограничении проникновения в растения токсичных ионов с транспирационным потоком. Это предположение подтверждается анализом динамики накопления ионов натрия и хлора, продемонстрированной ранее (рис. 1).

После 48 часов устьичная проводимость увеличивалась вплоть до 96 часов, достигая значения 68,3 ммоль/м2*с.

Уменьшение устьичной проводимости в первые сутки экспозиции тритикале на солесодержащем растворе сопровождалось повышением светоиндуцированного восстановления ДХФИФ в 1,5 раза относительно исходной величины (рис. 3). В последующем (48-96 ч) происходило снижение скорости восстановления ДХФИФ до величины, составлявшей 75% от начального значения. Такая картина на фоне снижения устьичной проводимости и интенсивности фотосинтеза могла приводить к накоплению восстановительных эквивалентов (АТФ и НАДФН) и, следовательно, недостатку конечного акцептора электронов (НАДФ+) в ЭТЦ и, как следствие, – переносу электронов на кислород (Мубаракшина и др., 2006), что запускает цепь реакций образования различных активных форм кислорода (АФК). При этом различные стрессовые факторы, в том числе повышение в среде выращивания концентрации NaCl, могут усиливать продукцию АФК.

4.2. Изменение содержания фотосинтетических пигментов в побегах тритикале Сравнительный анализ содержания фотосинтетических пигментов в листьях тритикале в условиях солевого стресса показывает, что реакцией растений на стресс является снижение количества пигментов в течение первых суток засоления (рис.4).

Рис.4. Содержание фотосинтетических пигментов в листьях тритикале в Показано, что содержание хлорофилла a в листьях растений снижалось до часов в 4,5 раза, хлорофилла b и каротиноидов – в 5 раз. После 24 часов засоления происходило постепенное повышение количества фотосинтетических пигментов. К 96 часам экспозиции растений на солесодержащей среде содержание пигментов достигало значений, зафиксированных в начале эксперимента. Это способствовало восстановлению процесса фотосинтеза в растениях тритикале при росте газообмена (устьичной проводимости, рис. 3). Восстановление содержания пигментов можно (разрушающих пигменты и, особенно, каротиноиды, рис. 5) за счёт эффективной работы антиоксидантных ферментов (Гарифзянов, Жуков, 2012).

Глава V. Состояние про/антиоксидантной системы тритикале 5.1. Содержание пероксида водорода (H2O2) и интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в условиях солевого стресса В результате проведенного исследования было показано, что выращивание растений тритикале на солесодержащей среде приводит к развитию в клетках окислительного стресса, сопряженного с избыточной генерацией АФК (рис.5).

Рис. 5. Динамика содержания пероксида водорода и интенсивность перекисного окисления липидов в органах тритикале под действием 120 мМ NaCl В частности, в 1 сутки засоления происходило резкое (в 2,5 раза) увеличение содержания H2O2, достигая максимального значения через 12 часов в корнях и часа в побегах. Содержание МДА, представляющего собой основной продукт перекисного окисления липидов, возрастало к 12 часам засоления в побегах и корнях в 3 раза и в 2 раза соответственно. Увеличение ПОЛ в первые 12 часов засоления, как отражение повреждения мембран, могло быть результатом избыточной генерации коэффициентами корреляции (r) между образованием H2O2 и МДА: для побегов коэффициент оказался равным 0,83, для корней – 0,80.

После 24 часов уровень H2O2 в побегах и корнях стабилизировался, оставаясь повышенным относительно начала эксперимента. Количество МДА в побегах также снижалось, и к 96 ч становилось ниже, чем в начале эксперимента на 34%.

Содержание МДА в корнях после 12 ч засоления уменьшалось вплоть до 48 часов, после чего вновь возрастало к 72 ч. К концу эксперимента (96 ч) уровень МДА в корнях был также ниже начального на 40%.

5.2 Исследование активности ферментов антиоксидантной системы Стабилизация количества H2O2 и интенсивности ПОЛ после 24 часов, повидимому, было связано с активизацией компонентов АОС. Специфическими агентами, дезактивирующими АФК, являются антиоксидантные ферменты.

5.2.1. Динамика активности аскорбатпероксидазы в органах тритикале под действием хлоридного засоления Проведенное исследование показало, что активность аскорбатпероксидазы в побегах и корнях в начале эксперимента были близкими (табл. 2).

Активность антиоксидантных ферментов в органах тритикале В течение первых 12 часов экспозиции на NaCl-содержащей среде активность фермента в побегах повышалась в 1,4 раза. Далее она снижалась в 2,5 раза от достигнутого максимума, составляя величину в 57% от исходного значения, и оставалась на данном уровне до 48 часов. После этого активность АПО увеличивалась, достигая к концу эксперимента максимальной величины.

В корнях наблюдали гораздо меньшую вариацию исследуемого показателя. В первые 12 часов эксперимента наблюдали незначительное увеличение активности фермента. Далее к 24 часам происходило её снижение до первоначального уровня с постепенным увеличением активности фермента к 96 часам до максимального значения, равного 0,41 мкмоль/мин*г.

5.2.2. Динамика активности пероксидазы в органах тритикале Проведенное исследование показало, что активность пероксидазы в корнях была в 2,4 раза выше, чем в побегах (табл.2).

В течение первых 2-х суток в побегах (до 48 ч) и 3-х суток в корнях (до 72 ч) активность снижалась на 65% и 94% соответственно. После 48 ч в побегах тритикале озимого уровень активности фермента увеличивался на 32%. В корнях активность пероксидазы также увеличивалась после 72 ч в 2 раза. Снижение активности в течение первых 2-3 суток засоления может быть связано с истощением ее конститутивного пула, происходящим в результате детоксикации нарастающего количества H2O2 или в связи с участием пероксидазы в процессах лигнификации и суберинизации, обеспечивающих защиту клеток растений (в первую очередь, корня) от токсического влияния проникающих в растение ионов соли.

5.2.3 Активность каталазы в органах тритикале Активность каталазы на протяжении всего эксперимента была значительно выше в побегах, чем в корнях (табл.2). Анализ динамики активности каталазы показал, что в течение первых суток засоления происходило 3-кратное повышение активности фермента в побегах и 7-кратное в корнях, после чего активность каталазы снижалась вплоть до конца эксперимента. Таким образом, можно предположить, что увеличение активности фермента в первые сутки засоления является фактором, лимитирующим развитие жестких последствий окислительного стресса, за счет детоксикации избыточно образующихся количеств H2O2 в побегах и корнях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рассматривая физиолого-биохимические аспекты адаптации тритикале в условиях солевого стресса можно предложить следующую схему механизмов, обеспечивающих формирование солевого стресса и приспособление растений тритикале к нему (табл. 3).

Сопоставляя полученные результаты экспериментов, можно говорить о двухфазном характере стрессового ответа растений, обосновываемом некоторыми исследователями (Радюкина с соавт, 2008). В течение первых суток засоления (стресс-фаза) с целью поддержания достаточного уровня оводненности в условиях низкой доступности воды в прикорневом растворе происходило закрытие устьиц, что обусловливало дисбаланс между фотохимическими и биохимическими реакциями фотосинтеза, в результате чего увеличивалась генерация активных форм кислорода, в том числе пероксида водорода. Они оказывают прямое и/или опосредованное влияние, как на биохимические, так и физиологические процессы. Одним из них являлась активизация ферментативной антиоксидантной системы.

Двухфазный стрессовый ответ у тритикале в условиях NaCl-засоления Накопление осмолитов Про/антиоксидантная активность После 24 часов (фаза адаптации) с целью нормализации газообмена и фотосинтеза происходило открытие устьиц, приводящее к накоплению ионов натрия и хлора в побегах и опосредованное этим накопление пролина. Радюкина с соавт.

(2008) считают, что функционирующие на протяжении фазы стресс-реакции неспецифические защитные пути инициируют включение специфических адаптационных механизмов. В исследованном растении тритикале это проявлялось в резком росте интенсивности транспирации, восстановлении пигментной системы, изменениях активности гваяколовой пероксидазы.

Таким образом, в фазу стресс-реакции (до 24 часов эксперимента) наблюдали ответные физиолого-биохимические реакции тритикале, а в фазу адаптации (после часов) происходило восстановление гомеостаза, обеспечиваемого 24- установлением нового баланса физиологических и биохимических параметров тритикале.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что осмотические эффекты влияния хлорида натрия на состояние проростков тритикале были обусловлены снижением интенсивности транспирации и устьичной проводимости, что приводило к возрастанию осмотического давления. Уменьшение содержания воды в растениях наблюдали только после резкого роста поступления ионов соли из питательной среды, что сопровождалось и увеличением содержания пролина.

2. Установлено, что токсические эффекты повышенного уровня активных форм кислорода у проростков тритикале в наибольшей степени проявлялись в возрастании величины ПОЛ и снижении содержания фотосинтетических пигментов. При этом наиболее значительное противодействие токсическому эффекту проявлялось в росте уровня активности каталазы.

3. Обнаружено, что адаптационные эффекты в функционировании фотосинтетического аппарата тритикале проявлялись в восстановлении интенсивности фотосинтеза на фоне увеличения устьичной проводимости и восстановления содержания фотосинтетических пигментов.

4. Показано, что в побегах происходили значительные изменения на уровне физиологических процессов и биохимических реакций, в то время как в корнях подобной тенденции не наблюдали, кроме роста активности каталазы в первые сутки засоления и показателей окислительного стресса.

5. Установлено, что ответные механизмы проростков тритикале на присутствие в среде 120 мМ NaCl носили двухфазный характер, включающий фазу стрессреакции (до 12-24 часа) и фазу адаптации (48-72 часа), которые проявлялись в изменениях показателей водного обмена, фотосинтеза, и функционирования про/антиоксидантной системы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ РАБОТ

Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации физиологические реакции активных форм кислорода в клетках растений // Современные проблемы науки и образования. – № 2. – 2011.; URL:

www.science-education.ru/96-4584 (дата обращения: 27.07.2011).

2. Гарифзянов А.Р., Жуков Н.Н., Пантюхин Ю.О., Иванищев В.В. Особенности NaCl-индуцированного окислительного стресса и динамики активности антиоксидантных ферментов в органах тритикале озимого // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2012. № 2. С. 9-12.

Гарифзянов А.Р., Иванищев В.В. Динамика активности 3. Жуков Н.Н., антиоксидантных ферментов в органах Triticosecale на фоне NaСl-засоления // Известия Тульского госуниверситета. Естественные науки. 2012. Вып. 2. С.

285-291.

4. Гарифзянов А.Р., Жуков Н.Н. Влияние натрий-хлоридного засоления на содержание компонентов аскорбат-глутатионового цикла в органах тритикале // Известия Тульского госуниверситета. Естественные науки. 2012. Вып. 3. С.

165-176.

Материалы конференций и прочие публикации:

5. Гарифзянов А.Р., Жуков Н.Н., Иванищев В.В., Кособрюхов А.А. Регуляция водного обмена у тритикале озимого в условиях NaCl-засоления // Вестник Харьковского нац. аграр. ун-та. Сер. Биология. 2013. Выпуск 1. С. 34-43.

6. Жуков Н. Н., Гарифзянов А. Р., Пантюхин Ю.О., Иванищев В.В. Влияние натрий-хлоридного засоления на содержание фотосинтетических пигментов в листьях тритикале озимого на ранних этапах онтогенеза // Достижения молодых учёных в развитии инновационных процессов в экономике, науке, образовании: Матер. докладов III междунар. научно-практ. конф. (г. Брянск, 10октября 2011 г.). – Брянск, 2011, с. 292-293.

7. Жуков Н. Н., Иванищев В. В. К проблеме устойчивости растений в условиях солевого стресса // Сборник матер. V региональной научно-практ. конф.

аспирантов, соискателей и молодых ученых «Исследовательский потенциал молодых ученых: взгляд в будущее» / Отв. Ред. О.Г.Вронский. – Тула: Изд-во ТГПУ им. Л.Н.Толстого, 2011. – 418 с. – С. 96-97.

8. Гарифзянов А.Р., Жуков Н.Н., Иванищев В.В., Пантюхин Ю.О. Аккумуляция осмолитов в органах Triticosecale в условиях солевого стресса. Современная наука: тенденции развития // Материалы Междунар. научно-практ. конф. января 2012: Сб. науч. трудов.- Краснодар, 2012.- 314с. – С.195- 9. Гарифзянов А.Р., Жуков Н.Н., Пантюхин Ю.О. NaCl-индуцированного окислительного стресса и динамики активности антиоксидантных ферментов Triticosecale. Проблемы современной биологии: Материалы III Междунар.

научно-практ. конф. (Москва, 19 января 2012) – Изд-во «Спутник+», 2012. – С.

26- 10. Гарифзянов А.Р., Жуков Н.Н., Пантюхин Ю.О. Характеристики водного обмена тритикале в условиях засоления. // Биология – наука 21 века:

Пущинская школа-конференция молодых ученых. 16-21 апреля 2012: Сборник научных трудов.- Пущино, 2012. - С. 457-458.

11. Жуков Н.Н., Гарифзянов А.Р. Проявления окислительного стресса тритикале в условиях хлоридного засоления // Биология – наука 21 века: Пущинская школа-конференция молодых ученых. 16-21 апреля 2012: Сборник научных трудов.- Пущино, 2012. - с.459- 12. Жуков Н.Н., Гарифзянов А.Р. Окислительный стресс в органах Triticosecale на фоне NaСl-засоления. // Сборник матер. VIII Всерос. научно-практ. конф.

аспирантов, соискателей и молодых ученых «Исследовательский потенциал молодых ученых: взгляд в будущее» – Тула: Изд-во ТГПУ им. Л.Н.Толстого, 2012. – 214 с. – С. 62-63.

13. Жуков Н.Н., Гарифзянов А.Р. Активность каталазы в органах Triticosecale в условиях солевого стресса // Сборник матер. VIII Всерос. научно-практ. конф.

аспирантов, соискателей и молодых ученых «Исследовательский потенциал молодых ученых: взгляд в будущее» – Тула: Изд-во ТГПУ им. Л.Н.Толстого, 2012. – 214 с. – С. 63.