На правах рукописи

СУРИНА ЕЛИЗАВЕТА РАФАЭЛЕВНА

ДНК-аптамеры, специфичные к фибриллярной форме белка

Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae

03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва 2013

Работа выполнена в лаборатории оптимизации экспрессии генов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Беневоленский Сергей Владимирович ИНБИ РАН, г. Москва

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, ЗАО «АГРИ», г. Москва Машко Сергей Владимирович доктор биологических наук, профессор, ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения» Свешников Пётр Георгиевич

Ведущая организация: ФГБУ НИИ вирусологии им.

Д.И. Ивановского

Защита диссертации состоится « » 2013 года в « » часов на заседании Диссертационного совета Д217.013.01 при ФГУП «Государственный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

(ФГУП «ГосНИИГенетика») по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ФГУП «ГосНИИГенетика».

Реферат разослан « » 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

Прионы – это особый класс инфекционных агентов, вызывающих неизлечимые заболевания центральной нервной системы человека и животных. Их отличие от всех других патогенов состоит в отсутствии генома, состоящего из нуклеиновой кислоты. Их инфекционные свойства связаны с белком PrP, открытым С. Прузинером в 80-х годах прошлого века. Этот гидрофобный, асоциированный с мембраной белок может существовать в двух различных конформационных формах: инфекционной (PrPSc) и неинфекционной (PrPC), причем PrPSc способна катализировать превращение PrPC в PrPSc посредством белок-белковых взаимодействий. Белок PrP в инфекционной изоформе проявляет склонность к агрегации; кроме того, PrPSc отличается от PrPC повышенным содержанием -слоев и устойчивостью к действию детергентов и протеаз.

Белковые агрегаты могут образовываться не только при прионных заболеваниях. По своей природе прионы очень напоминают другой широко распространенный феномен – амилоиды. Амилоиды – это нерастворимые фибриллярные отложения белков, накапливающиеся при некоторых болезнях человека, называемых амилоидозами.

Несмотря на разницу в структуре и функции амилоидогенных белков, все они формируют похожие по свойствам фибриллы В 90-х годах прошлого века прионы были найдены у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а также у мицелиального гриба Podospora anserina и некоторых других эукариот. В отличие от человека и млекопитающих, подверженных нейродегенеративным прионным заболеваниям, низшие эукариоты при переходе белков в автокаталитически поддерживаемое прионное состояние приобретают нехромосомно наследуемые признаки, зачастую эволюционно прогрессивные.

Нехромосомно наследуемый детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae является фенотипическим отражением прионного состояния белка Sup35p – члена семейства факторов терминации трансляции eRF3. Среди прионных детерминант низших эукариот [PSI+] является наиболее хорошо изученным.

Как известно, дрожжи – это классический модельный объект генетических и молекулярно-биологических исследований. Поскольку прионы дрожжей не передаются человеку, изучение прионного феномена на дрожжевых моделях представляется безопасным и перспективным подходом к разработке систем диагностики и лечения прионных заболеваний.

Аптамеры (лат. aptus - подходящий) – это молекулы однонитевой РНК или ДНК, которые связывают избранную мишень с высокой аффинностью и специфичностью за счёт своей вторичной и третичной структуры. Именно вторичная структура аптамера позволяет ему образовывать с мишенью гидрофобные, водородные и электростатические контакты. Известно, что основными элементами вторичной структуры аптамеров являются короткие двуцепочечные участки, образованные за счет комплементарного спаривания оснований, и одноцечочечные петли. При этом одноцепочечные участки аптамера отвечают за специфичность взаимодействия аптамера с мишенью, а двухцепочечные стабилизируют структуру аптамера и обеспечивают правильное расположение функциональных групп для узнавания аптамером мишени [Кульбачинский, 2006].

Аптамеры по сути являются аналогами моноклональных антител. Соответственно, основные области применения аптамеров и антител совпадают – аптамеры могут использоваться как в протеомике, для изучения пространственных структур и функциональных свойств белков, так и в медицине, для диагностики и лечения ряда заболеваний.

Явление прионного перехода мономер -> полимер до сих пор до конца не изучено, и использование аптамеров является перспективным подходом к исследованию прионного феномена и лечению прионных болезней. На данный момент получены аптамеры как к белкам PrP различных млекопитающих, так и к некоторым амилоидным белкам человека.

';

Поскольку прионные и амилоидные фибриллы, образованные не родственными по первичной последовательности белками, сходны между собой, структурночувствительные аптамеры, полученные к фибриллярной форме дрожжевого прионного белка Sup35p, могут иметь сродство к прионным и амилоидным полимерам других белков. Такие аптамеры могут послужить основой для разработки инструмента диагностики известных и неизвестных прионов.

Цели работы:

1) Получение аптамеров, распознающих фибриллярные формы белка Sup35p, но не имеющие сродства к его растворимой форме.

2) Характеристика полученных аптамеров; проверка их сродства к другим прионным Экспериментальные задачи:

1) Выделить рекомбинантный фрагмент NM белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae в препаративных количествах из клеток Escherichia coli.

2) Полимеризовать препарат мономера Sup35NM и охарактеризовать полученные фибриллы. Составить мишень для SELEX из полимеров белка Sup35NM.

3) Отобрать аптамеры к фибриллярной форме рекомбинантного белка Sup35NM.

4) Охарактеризовать полученные аптамеры: проанализировать первичные последовательности для химического синтеза. Отследить возможные особенности вторичной структуры избранных аптамеров при помощи компьютерных программ.

5) Подтвердить специфичность избранных аптамеров к фибриллярной форме фибриллярный Sup35NM] для избранных аптамеров.

6) Проверить специфичность охарактеризованных аптамеров к не растворимым в Saccharomyces cerevisiae. Определить сродство аптамеров к не растворимым в детергентах агрегатам ряда других амилоидогенных белков, выделенным из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Научная новизна:

1) Впервые получены аптамеры к белку Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Эти аптамеры распознают фибриллярные формы белка Sup35p, но не имеют сродства к его растворимой форме.

2) Доказано, что химический синтез избранных аптамеров с 5’-биотином не препятствует специфическому связыванию их с мишенями. Таким образом, стрептавидин-биотиновая система применима для детекции специфического связывания аптамеров с мишенями в любом из протоколов.

3) Изучены особенности первичной последовательности и вторичной структуры ряда полученных аптамеров.

4) Впервые проведён масштабный анализ выборки аптамеров с итоговым разбиением их на группы по кросс-специфичности к различным прионным и амилоидным белкам.

5) Впервые в одной выборке получены и охарактеризованы аптамеры как с широким, так и с узким спектром специфичности. Впервые получена выборка аптамеров, распознающих альтернативную мишень (агрегаты PrP) с той же специфичностью, что и собственную (полимеры Sup35NM).

Структура диссертации:

Диссертация включает: 1) Введение, 2) Обзор литературы, 3) Материалы и методы, 4) Результаты, 5) Обсуждение, 6) Выводы, 7) Список литературы.

Работа изложена на 122 страницах, иллюстрирована 17 рисунками и 20 таблицами.

Список цитируемой литературы содержит 157 ссылок.

Апробация работы и публикации:

Результаты работы были представлены на международных конференциях:

«Биотехнологии будущего», Санкт-Петербург, Россия, 2006; 34-м Конгрессе FEBS "Life’s Molecular Interactions", Прага, Чехия, 2009; Международной научной школы-конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, Москва-Пущино, 2009;

а также на совместном заседании межлабораторного семинара Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и Секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 24 апреля 2013 года.

По основным результатам диссертации опубликовано 2 статьи, подана 1 заявка на патент РФ, также имеются материалы в сборниках 3 конференций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae 5V-H19 [PSI+]s [PIN+] (штамм с «сильным» прионным фенотипом, выделение прионных агрегатов Sup35p), 5V-H [PSI+]w [PIN+] (штамм со «слабым» прионным фенотипом, выделение прионных агрегатов Sup35p), 74-D694 [psi-] [PIN+] (гиперпродуцент Sup35p, в клетках содержатся амилоидные агрегаты Sup35p), 74-D694 [psi-] [PIN+] (агрегаты прионного белка Rnq1), 74-D694RNQ1 [psi-] (продуцент PrP90-231), 74-D694S35 [pin-] (гиперпродукция 103QGFP), 74-D694 [psi-] [pin-] (отрицательный контроль), любезно предоставил д.б.н. чл.корр. РАН М. Д. Тер-Аванесян. Клетки S. cerevisiae выращивали при 30оС в полной (среда YPD: 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы) или синтетической среде с селективными добавками (Среда SC: 0,67% YNB (Difco), 2% глюкозы, необходимые аминокислоты).

Основные буферы, использованные в работе:

А - 5mM Na2HPO4, 150mM NaCl, азид натрия 0,01%, 200mM мочевины, 2mM MgCl2, pH 7,4.

P - 5mM Na2HPO4, 150mM NaCl, азид натрия 0,01%, pH 7,4.

PSU - 5mM Na2HPO4, 150mM NaCl, 0,2 mM мочевина, pH 6.

Аптамеры получили на основе библиотеки (libS) следующего состава: 5’GGGTACCTGAAGCACTAATCTATGC-40N-ACCTTATGTTGTAGCATCTGCAGCC-3’, где N – любой нуклеотид. Для амплификации использовали праймеры dirS 5’-GGGTACCTGAAGCACTAATCTATGC-3’ и revS 5’-GGCTGCAGATGCTACAACATAAGGT -3’.

Для анализа последовательностей аптамеров использовали пакеты программ DNASUN (ГосНИИ «Генетика») и Vector NTI (Invitrogen). Для расчёта значений констант диссоциации комплекса аптамер-фибриллярный Sup35NM использовали ENZFITTER (version 1.05(CGA)). Для поиска последовательностей предположительных G-квартетов в последовательностях аптамеров использовали онлайн-программу QGRS Mapper (http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analyze.php). Для предсказания вторичных структур аптамеров использовали онлайн-программу OligoAnalyzer 3.1 фирмы Integrated DNA Technologies (http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/).

В ИФА-подобном протоколе в 96-луночные иммунологические планшеты (“Linbro”, Великобритания) вносили аликвоты препаратов белка Sup35NM в мономерной или полимерной форме в буфере А. Далее следовала сорбция, затем - этапы промывки и блокировки неспецифического связывания. На стадии специфического связывания антитела заменили аптамерами, меченными биотином, в концентрации 15 нМ. После отмывки в лунки вносили коньюгат пероксидазы хрена со стрептавидином (“ИМТЕК”, Москва). Цветную реакцию проявляли о-фенилендиамином (“Sigma”). Считывание на планшетном ридере Multiscan проводили при длине волны 490нм.

Выделение не растворимых в детергентах агрегатов различных белков из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и электрофорез в полуденатурирующих условиях в агарозном геле проводили согласно ранее описанной методике [Kushnirov et al., 2006].

Специфическое окрашивание белков на нитроцеллюлозных мембранах производили растворами биотинилированных аптамеров в концентрации 12 нМ в буфере PSU.

Окрашивание проявляли при помощи диаминобензидина или флюоресцентного реагента ECL (ThermoScientific, США) согласно инструкции производителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Saccharomyces cerevisiae.

Штамм E. coli BL21(DE3) («Invitrogen») трансформировали экспрессионной плазмидой pET30a-Sup35NM-His6 (любезно предоставлена д.б.н. чл.-корр. РАН М.Д. ТерАванесяном). Полученные трансформанты выращивали при 37оС на ротационной качалке на питательной среде, содержащей канамицин, до достижения ОП600=0,8-1,0, затем вносили индуктор изопропилтиогалактозид и инкубировали в течение 3 часов. Клеточный осадок ресуспендировали в равном объеме лизирующего буфера, и клетки разрушали в ультразвуковой ванне. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием, супернатант наносили на колонку Ni-CAMTM (Sigma), аффинную к белкам, содержащим 6гистидиновую метку. После промывки буфером для лизиса сорбированный Sup35NM смывали градиентом концентрации имидазола согласно инструкции производителя.

Для очистки от низкомолекулярных полигистидин-содержащих фрагментов Sup35NM “Pharmacia”) уравновешивали буфером с 8M мочевиной, и наносили Sup35NMсодержащий элюат с Ni-CAM колонки. Колонку промывали до достижения базового значения оптической плотности, измеренного при помощи проточного УФспектрофотометра. Элюцию производили градиентом NaCl. На рис. 1 приведен результат сравнительного электрофореза образцов после Ni-CAM и CM-хроматографии.

Таким образом, в результате двух последовательных хроматографий целевой мономер оказался очищенным от различных примесей примерно на 95%. Процедура обеспечила выделение примерно 1 мг белка из 20 мл осветленного лизата. Концентрация конечного продукта, оцененная по электрофорезу (см. рис. 1), составляет примерно 3 мг/мл 2. Полимеризация рекомбинантного белка Sup35NM in vitro.

После получения мономера белка Sup35NM перед нами встала задача его полимеризации, то есть получения фибрилл – непосредственной мишени SELEX. При этом, фибриллы-мишени по возможности должны были быть гетерогенными, чтобы в результате SELEX получились аптамеры широкого спектра специфичности. В рамках этой задачи мы провели ряд опытов по подбору условий полимеризации и отделения полимеров Sup35NM. Мы варьировали состав буфера, температуру полимеризации;

подобрали условия разделения полимеров и мономеров; выяснили, что оптимальным методом разделения служит центрифугирование на микроцентрифуге. Также мы оценили влияние ультразвуковой обработки и заморозки на картины электрофоретического разделения полимеров.

Для оценки полимеризации мы использовали тест, основанный на том, что прионные фибриллы устойчивы к обработке додецилсульфатом натрия, и разлагаются до мономеров только при высоких температурах в присутствии денатурирующих агентов, в отличие от неспецифических агрегатов мономеров [Kryndushkin et al., 2003].

После того, как все условия были подобраны, мы получили и охарактеризовали большой объем фибрилл - мишеней SELEX. Для этого мы центрифугировали 2 мл (6 мг) мономера Sup35NM в течение 20 минут при 16000 g с целью очистки от возможных преформированных агрегатов, супернатанты перенесли в чистые микроцентрифужные пробирки и разбавили буфером P в 33 раза. Половину объёма пробы инкубировали в холодильнике при 80С на шейкере для иммуноферментного анализа в течение 63,5 часов, вторую половину инкубировали при 370С на ротационной качалке в течение 63,5 часов. В таблице 1 приведен результат измерения белка в полученных пробах до и после центрифугирования. На рис. 2 приведён результат контрольного электрофореза в полиакриламидном геле.

Таблица 1. Измерение концентрации белка по методу Брэдфорд в образцах, полимеризованных при 8оС и 37оС, до и после центрифугирования Рисунок 2. Оценка полимеризации Sup35NM при 80С и 370С. Электрофорез белков в полиакриламидном геле, окраска Кумасси. Дорожки: 1,2 – супернатант (80С), 3,4 осадок (80С), 5,6 – осадок (370С), 7 - супернатант (370С). Дорожки 1,3,5,7 - пробы инкубировали с додецилсульфатом натрия при 37оС, дорожки 2,4,6,8 - пробы кипятили с додецилсульфатом натрия.

Мишень для SELEX решено было составить таким образом, чтобы приблизительно уравнять количества фибрилл, полученных при разных температурах. Исходя из данных по концентрациям белка, подкреплённых разной интенсивностью окрашивания белковых полос (рис. 2, дорожки 3-6), на 1 объем образца, полимеризованного при 37оС, брали объёма образца, инкубировавшегося при 8оС, и смешивали их. Количество белка в осадке в смешанном образце оценивается в 25 мкг/мл.

Прямым доказательством образования фибрилл служит электронная микроскопия. Мы провели электронно-микроскопическое исследование белковых препаратов (Рис. 3) Рисунок 3. Электронные микрофотографии препаратов белка Sup35NM; А – раствор мономера Sup35NM в 10mM Tris, 450mM имидазола, 6-7М мочевины, 100mM NaCl Б – Полимер Sup35NM в буфере 5mM Na2HPO4, 150mM NaCl, pH 7,4, азид натрия 0,01%, 200mM мочевины (результат смешивания полимеров, сформированных при температуре 8оС и 37оС в течение 63,5 часов). Полоска имеет относительную длину 100 нм.

Судя по электронным микрофотографиям, нам удалось получить фибриллы Sup35NM в результате выбранной последовательности процедур. Полученные фибриллы Sup35NM имеют примерно 10нм в диаметре, что соответствует опубликованным данным.

Небольшая длина полученных фибрилл, по сравнению с опубликованными данными, как и меньшее количество фибрилл в поле зрения, является следствием более низкой концентрации белка в полимеризуемом препарате.

3. Получение аптамеров к фибриллярной форме рекомбинантного белка SELEX проводили по следующей обобщённой методике (рис. 4):

1. Библиотеку 90-звенных олигонуклеотидов с 40-нуклеотидной рандомизированной сердцевиной (4,5 нМ) разводили буфером А с 200mM мочевины, 2mM MgCl2. В целях унификации структур одноцепочечных олигонуклеотидов проводили 5минутную денатурацию олигонуклеотидов на кипящей водяной бане с последующей медленной ренатурацией при естественном остывании бани до 25оС (рис. 4, п. 1).

2. В микроцентрифужных пробирках готовили рабочую смесь для SELEX: к 4,5нМ олигонуклеотида добавляли 0,45нМ размороженных фибрилл (молярное соотношение ДНК:мишень=10:1) (рис. 4, п. 3) 3. Связывание олигонуклеотидов с мишенью проводили в течение 1 часа при комнатной температуре, при перемешивании (300 об/мин).

4. Комплексы мишень-олигонуклеотид отделяли от мономеров и несвязавшихся олигонуклеотидов центрифугированием (рис.4, п. 4).

5. Осадок дважды промывали буфером А.

6. К осадку добавляли 10 мкл бидистиллированной воды и кипятили 2 мин. При этом связавшиеся олигонуклеотиды денатурируют и выходят в раствор. Жидкость переносили в чистую микроцентрифужную пробирку и использовали как матрицу для полимеразных цепных реакций.

амплифицировали двухцепочечную форму олигонуклеотидов, связавшихся с мишенью. В реакционную смесь добавляли равное количество праймеров dirS и revS. Продукт реакции, по размеру соответствующий контрольному (полученному в результате «дцПЦР» на матрице libS), элюировали с геля и использовали в качестве матрицы для следующей ПЦР.

8. Вторая полимеразная цепная реакция («оцПЦР»), проводимая в 10-кратном избытке одного праймера dirS, служила для наработки ДНК-материала для следующего цикла SELEX. Продукт реакции, по размеру соответствующий контрольному (libS), элюировали с геля и использовали для следующего цикла SELEX (рис. 4, п. 5).

Рисунок 4. Схема SELEX. 1. Библиотека одноцепочечных олигонуклеотидов, 2.

Фибриллы Sup35NM, 3. Смешивание, инкубация, 4. Разделение центрифугированием, 5.

Полимеразная цепная реакция, 6. Оценка связывания олигонуклеотидов с мишенью при помощи радиоавтографии, 7. Повторение цикла, 8. Клонирование, секвенирование.

Мы оценивали эффективность связывания ДНК-материала с мишенью после циклов 3,6,7,8,9 (рис. 4, п. 6). Радиоактивно меченную одноцепочечную ДНК, синтезируемую после соответствующего цикла, смешивали с мишенью в молярном соотношении 1:10 (в отличие от SELEX, белок брали в 10-кратном избытке). После гибридизации и центрифугирования верхнюю половину объёма пробы переносили в чистую пробирку, и измеряли удельную радиоактивность обеих фракций (Aосад и Аводн) на сцинтилляторе. Для расчёта эффективности связывания в % пользовались формулой:

[(Aосад -Аводн)/(Aосад +Аводн)]*100%. Погрешности рассчитывали по формуле стандартного отклонения. Результаты оценки сродства аптамеров к мишени представлены в табл. 2.

Таблица 2. Эффективность связывания олигонуклеотидов с мишенью.

Эффективность связывания олигонуклеотид-мишень, % 1±0,9 12±4 20±1,5 29±5 40± По достижении 40% эффективности связывания олигонуклеотидов с мишенью SELEX остановили, чтобы сохранить возможное разнообразие аптамеров (рис. 4, п. 8).

Двухцепочечную ДНК, синтезированную на основе материала, полученного после цикла SELEX, клонировали в вектор pUC19 (ВКПМ ГосНИИ «Генетика»). Полученным ДНК-материалом трансформировали клетки E. coli штамма TG1, трансформантов дискриминировали по цвету при выращивании на среде LB (1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl, 2% агар-агара) при 37оС c добавлением 5-бром-4-хлор-3индолил-бета-D-галактопиранозида и изопропилтиогалактозида. Из трансформантов выделили ДНК плазмид и оценили размер вставки при помощи рестрикции. Плазмиды, содержащие вставки расчётного размера (90 или 180 пар нуклеотидов), секвенировали. В результате получили последовательности 43 аптамеров.

Мы предприняли гомологический поиск по полученной выборке, при этом все последовательности сравнивали попарно. Хотя поиск не выявил консенсусных последовательностей, некоторые олигонуклеотиды имели участки, сходные между собой.

Для химического синтеза и последующей индивидуальной характеристики было гомологического поиска: старались охватить наиболее широкий спектр аптамеров.

последовательности (S6, см. табл. 3). Нуклеотидные последовательности, выбранные для индивидуального синтеза, получили названия S1-S10 (табл. 3).

Таблица 3. Обозначения и последовательности аптамеров, полученных после 9 цикла Название Нуклеотидная последовательность 5’-bio-AGCACTAATCTATGC-40(A,T,G,C)-ACCTTATGTTGTAGC 5’-bio-AGCACTAATCTATGCccgacgctagcgacctatcccataaacgagacacgggtccACCTTATGTTGTAGC 5’-bio-AGCACTAATCTATGCccgaccaacgttgttaccttccctataacaacaggagccgACCTTATGTTGTAGC 5’-bio-AGCACTAATCTATGCcccactgcacacgtctctaaacacacgccccgtcatccggACCTTATGTTGTAGC 5’-bio-AGCACTAATCTATGCccccgggaaccaccctataacgtaccgctaagtacgcgcgACCTTATGTTGTAGC 5’-bio-AGCACTAATCTATGCccaccctgagctccgtagacatttatcgctctacccgcccACCTTATGTTGTAGC 5’-bio-AGCACTAATCTATGCcgcgggagggggaggggaagagcctgggggagacggcaggACCTTATGTTGTAGC 5’-bio-AGCACTAATCTATGCcccgacaaccaacggctttagggtgcagccaacccgcctgACCTTATGTTGTAGC 5’-bio-AGCACTAATCTATGCcccgactttccggtatacgcattccacaacactgtcctggACCTTATGTTGTAGC 5’-bio-AGCACTAATCTATGCccaccagtgataacggaaggaaсcagtagaaсatccgtccgACCTTATGTTGTAGC 5’-bio-GCACTAATCTATGCcggcaccgaacgccccacaggaaacagcgtctgcgcgcgACCTTATGTTGTAGC Первоначально мы синтезировали шесть 90-нуклеотидных последовательностей аптамеров, включающих полноразмерные праймеры. К 5’-концу каждого аптамера добавляли биотин. В качестве контрольного олигонуклеотида в первых опытах использовали праймер dirS, помеченный биотином с 5’-конца.

В результате серии опытов по гибридизации аптамеров с мономерной и полимерной формами Sup35NM в ИФА-подобном протоколе нам удалось выяснить, что все аптамеры связываются с полимером Sup35NM в различной эффективностью (данные не приведены).

Для повышения эффективности химического синтеза решено было убрать по концевых нуклеотидов с каждой стороны у каждого аптамера. Кроме того, мы решили попытаться полностью удалить праймеры у аптамера S5, показавшего наиболее воспроизводимое связывание с полимером Sup35NM в серии предварительных опытов.

90- и 70-нуклеотидные аптамеры сравнили в ИФА-подобном протоколе и выяснили, что 70-членные аптамеры связываются с полимером Sup35NM с той же эффективностью, что и 90-членные. При проверке укороченного до 40 нуклеотидов варианта аптамера S5 оказалось, что данный олигонуклеотид теряет сродство к Sup35NM (данные не приведены).

4. Описание аптамеров с помощью ИФА-подобной методики, определение Кd.

Для выборки аптамеров, приведённой в таблице 3, были определены константы диссоциации комплекса аптамер-мишень. Делали допущение о наличии у каждой молекулы в составе полимера одного участка связывания с аптамером. Эксперимент проводили в трёх повторностях, стандартное отклонение не превышало 10%.

Экспериментальные данные обрабатывали при помощи программы ENZFITTER (version 1.05(CGA)). В табл. 4 представлены полученные результаты.

Таблица 4. Константы диссоциации (Kd) комплексов ДНК-аптамеров с фибриллами Sup35NM.

Kd, мкМ 0,38 0,62 0,3 0,24 0,38 0,83 1,19 0,83 0, Согласно полученным данным, почти все (кроме S3, для которого значение Kd слишком велико, либо каждая молекула белка в составе полимера имеет более одного участка связывания с олигонуклеотидом) аптамеры взаимодействуют с фибриллярной формой белка Sup35NM. Порядок измеренных Kd (0,2-1,0 мкМ) согласуется с результатами других авторов. В ряде случаев полученные другими исследователями аптамеры связывались с амилоид-формирующими мишенями с большей аффинностью: Kd на 1-2 порядка меньше измеренных нами. Для сравнения, известные Kd комплекса [антиген-антитело] для PrpС составляют 0,1-10 нМ, для PrpSc – 10 мкМ [Antonyuk et al., 2009].

Целью SELEX было получение аптамеров, связывающихся с полимерной формой белка Sup35NM, и не связывающихся с его мономерной формой. Cпецифичность связывания химически синтезированных аптамеров тестировали по ИФА-подобной методике с полимером и мономером Sup35NM в качестве субстрата. Погрешности в трёх повторностях не превышали 10%. Результаты представлены в виде диаграммы на рис. 5.

Рисунок 5. Сродство ДНК-аптамеров к белку Sup35NM, находящемуся в мономерной (черные столбцы) и полимерной (белые столбцы) форме.

Согласно полученным данным, все исследуемые аптамеры связываются с полимерной формой Sup35NM в 5-10 раз эффективнее, чем с мономерной. Некоторое сродство аптамеров к мономеру, возможно, объясняется полимеризацией препарата мономера, начинающейся в лунках планшета при сорбции. Таким образом, цель проведённого SELEX достигнута.

5. Проведение дополнительного цикла SELEX.

Полученные нами после 9го цикла SELEX аптамеры имеют разнообразные нуклеотидные последовательности. При этом, почти все они удовлетворяют цели проведённого SELEX, а именно связываются с фибриллами Sup35NM, и не связываются с мономером того же белка. Таким образом, проведение 10го цикла SELEX не грозило потерей разнообразия нуклеотидных последовательностей аптамеров, но могло бы помочь фибриллярной формой Sup35NM.

10й цикл SELEX был проведён аналогично 9ти предыдущим. В результате было получено 33 новых нуклеотидных последовательности аптамеров.

гомологический поиск с попарным сравнением всех последовательностей. Кроме того, аптамеры первого отбора (S1-S10) попарно сравнивали с аптамерами второго отбора (A1A39). Согласно всем полученным данным, мы сделали вывод о том, что две выборки аптамеров дивергируют не слишком сильно.

Из второй группы последовательностей 11 были выбраны для индивидуального синтеза. При отборе руководствовались следующими принципами: а) сходство с наибольшим количеством последовательностей внутри группы (A) и между группами (A и S) (A8, A18, A26, A31) б) наличие протяженных гомологичных участков (A2, A18, A22, A36, A37) в) своеобразие нуклеотидной последовательности (A5, A21, A24). В таблице приведены полные нуклеотидные последовательности выборки аптамеров, синтезированных после 10 цикла SELEX.

Таблица 5. Обозначения и последовательности аптамеров, синтезированных после цикла SELEX. Вариабельные части последовательностей выделены жирным шрифтом.

Последовательность Назв ание

5’-bio-AGCACTAATCTATGCCCCTGGGGTTCCAGAGACGAGTAGTAGAACGCATTCCCGGACCTTATGTTGTAGC

5’-bio-AGCACTAATCTATGCCCCCTCAACAGCGTGTTGCACCCAATCAGTACCTGCCGTGACCTTATGTTGTAGC

5’-bio-AGCACTAATCTATGCCCATGGAGACCCGCGCGTATTTGTAGTGTTTATGCCCGCGACCTTATGTTGTAGC

5’-bio-AGCACTAATCTATGCCGCCCGTGAATAAGCTACCATCCAGAACGACGCCTGGCACCTTATGTTGTAGC

A

5’-bio-AGCACTAATCTATGCCCGGGACAGCGTATTGAAGCTATGAGGCGGCCCTTCCCCAACCTTATGTTGTAGC

A

5’-bio-AGCACTAATCTATGCCGACCGTGAAAAGCTAGGTAATCTTACCCATTCCGCGCGCGCACCTTATGTTGTAGC

A

5’-bio-AGCACTAATCTATGCCGACCCAGTCAAGTTGTAGCTATTGTAACGCCCAAACCGCACCTTATGTTGTAGC

A

5’-bio-AGCACTAATCTATGCCCGCAGCCGACTAGGGCGGAGGATTCAGACCCCGACGCGACCTTATGTTGTAGC

A

5’-bio-AGCACTAATCTATGCCCCCGACGCCGTGGACTAGGTAACACCCTATCTTACTGCACCTTATGTTGTAGC

A

5’-bio-AGCACTAATCTATGCCCAGGCGCCAGAGCCGCGTGTTCGTTTCCTCACGCTTTGCACCTTATGTTGTAGC

A

5’-bio-AGCACTAATCTATGCCCCGGGGCGCCAGAGACGAGTAGGTGCAGCGGTTGTCATTGGGACCTTATGTTGTAGC

A Таким образом, после 9 и 10 циклов SELEX мы синтезировали 21 аптамер, меченный биотином. Каждый аптамер содержал вариабельную часть (40 нуклеотидов±2 нуклеотида, за счёт ошибок, допускаемых Taq ДНК полимеразой в ходе полимеразной цепной реакции) и по 15 нуклеотидов от праймеров dirS и revS с каждой стороны, согласно данным, ранее полученным при оптимизации последовательностей аптамеров (группы Данные по связыванию аптамеров группы «А» с мишенью – агрегатами полимеров белка Sup35p, выделенными из клеток дрожжей, - приведены ниже, см. пункт 7.

6. Структурные особенности аптамеров Известно, что вторичная структура аптамеров определяет их специфичность. Шпилька – это самый распространённый структурный мотив, встречающийся в аптамерах.

Шпилька – это структура, содержащая двухнитевой стебель и однонитевую петлю. Для ДНК-аптамеров характерны также квадруплексы четырёхнитевые структуры, (G-квартетом) [Решетников с соавт., 2010]. Мы анализировали вторичную структуру полученных аптамеров с помощью компьютерных программ.

Среди последовательностей аптамеров, потенциально содержащих квадруплексы, S выделяется содержанием триплетов гуанина, то есть предположительный квадруплекс сформирован тремя G-квартетами (а не двумя, как у всех остальных аптамеров). Несмотря на своеобразие, данный аптамер имеет средний показатель Kd комплекса [аптамерфибриллы Sup35NM] (см. табл. 4). Следовательно, в данном случае такой структурный элемент, как квадруплекс, не является определяющим в специфическом взаимодействии аптамеров с полимером Sup35NM.

Вторичные структуры аптамеров были рассчитаны при концентрации ДНК=15нМ, рассматривалась единственная из возможных конформаций, расчётная температура плавления (Tm) которой оказалась максимальной, а показатель изменения свободной энергии (G) - минимальным. Выяснилось, что в целом рассматриваемая выборка аптамеров определяется структурным полиморфизмом, что согласуется с полиморфизмом их первичных последовательностей, но у 17 аптамеров первая шпилька, соответствующая праймерному участку, одинакова. Исключениями являются аптамеры S3, S9, A8 и A26.

По термодинамическим показателям - G и Tm, - выборка вторичных структур аптамеров может быть подразделена следующим образом: аптамеры с очень низкими показателями (A24), аптамеры с показателями ниже среднего (A18, A31), аптамеры со средними показателями (S1-S8, S10, A2, A5, A8, A21, A22, A26), аптамеры с показателями выше среднего (S9, A36, A37). В этом подразделении отражена жёсткость вторичной структуры; так, аптамер A24, имеющий минимальный показатель Tm и максимальный G, не формирует вторичную структуру при заданных условиях (либо структура крайне нестабильна). Далее, с возрастанием Tm и уменьшением G, возрастает и жёсткость вторичной структуры аптамеров.

В одной из опубликованных работ авторы сочетали химические и компьютерные методы исследования структуры РНК-аптамеров [Sayer et al., 2004]. Мы ввели нуклеотидную последовательность аптамера SAF-93(1-60) в программу OligoAnalyzer 3.1 и выяснили, что при условиях, заданных нами при анализе выборки, G вторичной структуры аптамера SAF-93(1-60), эмпирически подтверждённой авторами, составляет -4, ккал/моль, а Tm составляет 43,7оС. Оба эти показателя соответствуют полученным нами порядкам значений G и Tm для аптамеров со средними термодинамическими показателями.

Вероятность образования гомодимеров была оценена по длине палиндромов, содержащихся в нуклеотидной последовательности, и по показателю изменения свободной энергии (G). В результате аптамеры были условно разделены на две группы.

К первой группе были отнесены аптамеры S1, S2, S4, S6, S10, A8, A21, A22, A36 и A37.

Эти аптамеры имеют высокий показатель G гомодимера (менее -14 ккал/моль); их палиндромная часть состоит как минимум из шести нуклеотидов, и содержит преимущественно гуанин и цитозин. Ко второй принадлежали все остальные аптамеры, а именно S3, S5, S7, S8, S9, A2, A5, A18, A24, A26 и A31. Показатели G гомодимера в данной группе больше -14 ккал/моль; палиндромы состоят из 6 и менее нуклеотидов и включают тимин и аденин.

Очевидно, что в случае димеризации вторичные структуры, предсказанные для мономеров, претерпевают критические изменения: палиндромные области пересекаются как минимум с одной шпилькой в структуре каждого аптамера.

С учётом большого количества интерферирующих факторов, компьютерный анализ не может дать нам чётких ответов на вопросы о структуре аптамеров. Часто барьер между оптимальной и субоптимальной структурой, рассчитанной по алгоритмам, условен, и выбирать приходится между 4 непохожими конформациями. Показательным является тот факт, при при повышении температуры расчёта вторичных структур до 37 оС у аптамеров S4, S10, A2, A5, A8, A18, A24, A26, A31 и A36 появляются новые конфигурации, не отображаемые при 25оС. Однако, данный анализ сужает поле поиска реальных вторичных структур, и позволяет выделить несколько условных групп аптамеров по признакам димеризации и структурообразования.

7. Характеристика связывания аптамеров с не растворимыми в детергентах прионными и неприонными агрегатами Sup35p и некоторых других белков, выделенных из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Аптамеры были испытаны на различных мишенях – агрегатах белка Sup35p, сформированных in vivo, а также на других прионных белках.

Прежде всего, нам было необходимо убедиться в том, что аптамеры, полученные к фибриллам, сформированным in vitro, имеют сродство к нативным фибриллам. Из клеток дрожжей штамма 5V-H19 с фенотипом [PSI+]s [PIN+] выделили не растворимые в додецилсульфате натрия агрегаты, и провели скрининг при помощи дот-блот. В качестве отрицательного контроля использовали материал, выделенный из клеток с фенотипом [psipin-] штамма – производного5V-H19. Результат представлен на рис. 6.

сопряженными с нестабильностью вторичной структуры. Аптамер A37 также отличается от других аптамеров; в своём составе он содержит 10-нуклеотидный палиндром, и показатель G димера у данного аптамера минимален. Возможно, димеризация в данном случае влечёт за собой потерю аффинности.

Исходя из положения о структурном сходстве прионных и амилоидных фибрилл, сформированных неродственными по первичной последовательности белками, мы предположили, что аптамеры, полученные к прионным формам белка Sup35NM, могут узнавать полимеры других прионных и амилоидных белков. С другой стороны, штаммовое разнообразие приона [PSI+], как известно, основано на структурных различиях фибрилл, формируемых белком Sup35p. Мы предположили, что имеются аптамеры, способные избирательно связывать полимеры Sup35p в зависимости от штамма приона, из которого эти полимеры были выделены.

При помощи дот-блот-методики мы проверили связывание аптамеров с прионными и амилоидными агрегатами Sup35p, агрегатами прионнного белка Rnq1p, агрегатами рекомбинантного белка мыши PrP90-231, а также с агрегатами 103Q-GFP (синтетический аналог хантингтина человека), выделенными из клеток дрожжей. Все аптамеры специфически взаимодействуют с прионными агрегатами Sup35p, выделенными из клеток штамма с «сильным» прионным фенотипом (5V-H19 [PSI+]s [PIN+]), а также с агрегатами Prp90-231. Ни один аптамер не связывается с фракцией, соответствующей агрегатам, выделенной из клеток штамма 74-D694 [psi-] [pin-], то есть с отрицательным контролем.

По сродству к остальным субстратам нам удалось разделить 18 аптамеров на классов. В табл. 8 представлено разделение аптамеров на классы специфичности. На рис.

представлены примеры реакции аптамеров-представителей каждого класса с различными субстратами в дот-блот и при переносе белков с агарозного геля.

Таким образом, аптамеры, полученные к фибриллам, сформированным рекомбинантным белком Sup35NM in vitro, способны распознавать устойчивые к детергентам агрегаты различных неродственных амилоидных белков, выделенные из клеток дрожжей. Разные аптамеры при этом обладают различной специфичностью.

Таблица 6. Взаимодействие аптамеров с различными прионными и неприонными агрегатами

I II III IV V

«сильные» ([PSI+]s) «слабые» ([PSI+]w) и прионные агрегаты Rnq1p ([PIN+]) штамм 5V-H19 штамм 74-D694 [psi-] [PIN+] (гиперпродуцент Sup35p; неприонные агрегаты Sup35p, прионные агрегаты Rnq1p) штамм74-D694 [psi-] [PIN+] (прионные агрегаты Rnq1p) штамм 74-D694S35 [pin-] (гиперпродуцент 103Q-GFP) штамм 74D694RNQ1 [psi-] (агрегаты Prp90-231) штамм 74-D694 [psi-] [pin-] (отрицательный контроль) Рисунок 7. Взаимодействие аптамеров – представителей разных классов с агрегатами различных прионных и амилоидных белков, выделенными из клеток дрожжей А) Дотблот; образцы белка представлены в трёх серийных разведениях (1х, 2х, 4х) Б) SDD-AGE;

представлены только мишени, различно окрашиваемые разными классами аптамеров.

Белки-мишени выделены из следующих штаммов: PrP - штамм 74-D694RNQ1 [psi-], 103Q - штамм 74-D694S35 [pin-], [PIN+] - штамм74-D694 [psi-] [PIN+], неприонные агрегаты Sup35p - штамм 74-D694 [psi-] [PIN+], [PSI+]w и [PSI+]s – соответствующие производные штамма 5V-H19. Отрицательные контроли: [psi-] и все образцы с пометкой «моно», получены при кипячении соответствующих агрегатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате первой части нашей работы, посвященной получению ДНК-аптамеров, связывающихся с полимерной формой белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и не связывающихся с его мономерной формой, мы секвенировали 82 аптамера, клонированных после 9 и 10 цикла SELEX. Характерной чертой аптамеров является отсутствие значимой гомологии в их нуклеотидных последовательностях, что соответствует данным других авторов, получавших аптамеры к прионным и амилоидформирующим белкам [Bunka et al., 2007, Ogasawara et al., 2007].

В рамках характеризации полученных аптамеров, составляющей вторую часть нашей работы, были определены величины Kd комплекса [аптамер-фибриллы Sup35NM] для аптамеров, полученных после 9 цикла SELEX. В основном, порядок измеренных величин Kd (0,2-1,0 мкМ) согласуется с результатами других авторов [Ogasawara et al., 2007].

Далее, была проведена проверка связывания аптамеров с агрегатами различных прионных и амилоидных белков. Оказалось, что многие аптамеры проявляют сродство к полимерам белков Rnq1p, polyQ, и все аптамеры имеют сродство к агрегатам фрагмента PrP90-231 мыши, выделенным из клеток дрожжей. По совокупности данных мы сделали вывод о том, что полученные нами аптамеры действительно являются конформационночувствительными; они обладают сродством к амилоидным структурам.

При предсказании вторичных структур аптамеров мы воспользовались алгоритмом UNAfold. При сравнении термодинамических показателей с опубликованными данными выяснилось, что для большей части аптамеров показатели совпадают с таковыми для эпмирически проверенной структуры [Sayer et al., 2004]. В случае, когда теоретически предсказанная структура отличилась низкими термодинамическими показателями, олигонуклеотид оказался неспецифичным (А24). Таким образом, несмотря на отсутствие явных общих черт, полученные аптамеры взаимодействуют с мишенями за счёт своих вторичных структур.

Полученные аптамеры могут служить инструментом для детекции амилоидных агрегатов в сравнительно агрессивных условиях, в частности непосредственно в клеточных лизатах [Mitkevich et al., 2012]. Сродство аптамеров к агрегатам белка PrP делает их перспективной основой для разработки диагностикума для прионных болезней человека и животных.

ВЫВОДЫ

1. Методом SELEX получены ДНК-аптамеры к фибриллярной форме прионного белка дрожжей Saccharomyces cerevisiae Sup35p.

Популяция полученных аптамеров является гетерогенной по первичной последовательности и не группируется по гомологии.

3. Аптамеры разделены на 5 классов по специфичности взаимодействия с различными мишенями.

4. Аптамеры могут обладать различной аффинностью к полимерным формам белка Sup35p, в зависимости от штамма приона.

5. Некоторые аптамеры связываются с амилоидными белками, не родственными Sup35p по первичной последовательности.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Сурина Е. Р., Морозкина Е. В., Марченко А. Н., Антипин А. А., Митькевич О. В., Кушниров В. В., Беневоленский С. В., Тер-Аванесян М. Д. Селекция ДНКаптамеров, специфически взаимодействующих с фибриллярной формой белка Sup35 дрожжей. Молекулярная биология - 2009, 43(4), 682-688.

2) Mitkevich O.V., Kochneva-Pervukhova N.V., Surina E.R., Benevolensky S.V., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. DNA aptamers detecting generic amyloid epitopes. Prion - 2012. 6(4):400-6.

3) Антипин А.А., Надточей Г.А., Тер-Аванесян М.Д., Митькевич О.В., Кушниров В.В., Сурина Е.Р., Беневоленский С.В., Марченко А.Н., Морозкина Е.В.

Олигонуклеотид и его конъюгат для детекции белков в амилоидном состоянии и способ детекции белков в амилоидном состоянии. Заявка на патент РФ № 2010125875 от 24.06.2010.

4) Surina E.R., Morozkina E.V., Marchenko A.N., Antipin A.A., Mitkevich O.V., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Benevolensky S.V. Selection of DNA aptamers, specifically interacting with fibrillar form of the yeast Sup35 protein. 34rd FEBS Congress "Life’s Molecular Interactions", 4-9 July 2009, Prague, Czech Republic. FEBS Journal, v.276, suppl.1, p.328-329.

5) Морозкина Е. В., Сурина Е. Р., Марченко А. Н., Антипин А. А., Митькевич О. В., Кушниров В. В., Тер-Аванесян М. Д., Беневоленский С. В. Селекция ДНКаптамеров, специфически взаимодействующих с фибриллярной формой белка биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. 28 сентября – 1 октября, 2009, Москва-Пущино. Материалы конференции, том 2, стр. 157-160.

6) Сурина Е.Р., Митькевич О.В. Характеристика ДНК-аптамеров, полученных к полимерным формам NM-фрагмента белка Sup35p. Международная школаконференция «Биотехнология будущего», 5-9 июня, 2006, Санкт-Петербург, сборник статей стр. 89-90.