На правах рукописи

ВОЛКОВА Дарья Анатольевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ

НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПЕРЕСТРОЕК В КОРЕ БОЛЬШИХ

ПОЛУШАРИЙ КРЫС ПРИ ФОКАЛЬНОЙ ИШЕМИИ РАЗНОЙ

СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ

03.03.01 – «физиология»

03.03.04 – «клеточная биология, цитология, гистология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2012

Работа выполнена в лаборатории функциональной нейроцитологии (заведующий лабораторией – кандидат биологических наук Михаил Михайлович Свинов) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор – член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Павел Милославович Балабан).

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Николай Степанович Косицын кандидат биологических наук, Михаил Михайлович Свинов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, заведующий лабораторией нейробиологии сна и бодрствования Института Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН, Владимир Борисович Дорохов доктор биологических наук, заведующая лабораторией экспериментальной нейробиологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Мария Анатольевна Александрова

Ведущая организация: Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, кафедра Высшей нервной деятельности.

Защита состоится «19» декабря 2012г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.044.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН по адресу:117485, Москва, ул. Бутлерова, 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

Автореферат разослан «» ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук В.Н. Иерусалимский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

Нейродегенеративные процессы включают в себя процессы нарушения структуры и функции нервной ткани, а также гибель нейронов. Механизмы нейродегенеративных процессов еще до конца не изучены (Pereira C. et al., 2012). Задачей нашего исследования было проследить морфологические и функциональные перестройки при нейродегенерации на примере ишемии различной степени тяжести. В нашей работе мы уделили особое внимание нейронам коры головного мозга больших полушарий крыс, в частности верхним слоям коры больших полушарий головного мозга крыс. I слой коры больших полушарий представляет собой нейропиль, состоящий в основном из дистальных дендритов пирамидных нейронов II-III слоев и части пирамид V слоя и оканчивающихся на них синапсов. Известно, что поверхностные слои коры страдают при неврологических и некоторых психических заболеваниях(Rita R. Romito-DiGiacomo et al., 2007; Jennifer I.

Luebke et al., 2010). В предыдущих исследованиях было показано, что гипоксическое состояние мозга, вызванное передозировкой общих анестетиков, приводило к функциональному «выключению» коры, связанному с набуханием дистальных дендритов и формированием «пористого» нейропиля в I слое коры. (Свинов, Косицын, 1990, 1991).

Однако такое общее воздействие глубокого наркоза могло приводить к отключению и других систем мозга, в частности, главной системы, осуществляющей неспецифическую активацию всего мозга, - ретикулярной формации. Поэтому в данной работе мы локально и обратимо выключали исследуемую область коры больших полушарий головного мозга с целью исследования коррелятов между ЭЭГ-изменениями и как прогрессирующими патологическими, так и обратимыми морфологическими изменениями, происходящими в коре больших полушарий.

Нейродегенеративные процессы являются ключевыми в развитии ряда заболеваний, в частности, инсульта (ишемического и геморрагического), болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и др. Следует отметить, что в структуре общей статистики заболеваемости в Российской Федерации заболевания, связанные с нейродегенеративными перестройками в ЦНС, занимают около 10% («Заболеваемость населения России в году.» Статистические материалы.

Их особая социальная значимость http://www.minzdravsoc.ru/docs/mzsr/stat/118).

определяется высокой степенью инвалидизации трудоспособного населения, а используемое в настоящее время лечение является весьма дорогостоящим (например, в США на лечение болезни Альцгеймера ежегодно тратится более 50 миллиардов долларов) и малоэффективным (Centers for Disease Control and Prevention (2010). CDC Features:

Alzheimer’s disease. http://www.cdc.gov/Features/Alzheimers/). Важным аспектом является ранняя диагностика нейродегенеративных заболеваний. Учитывая тот факт, что нейродегенерация по ее морфологическим проявлениям начинается с дистальных отделов отростков нейронов, в нашем исследовании мы уделили особое внимание электрофизиологическим коррелятам при данной морфологической перестройке.

Цель исследования:

Структурно-функциональный анализ нейродегенеративных перестроек в коре больших полушарий при действии фокальной ишемии разной степени тяжести.

Задачи исследования:

1. Разработать методы, позволяющие локально и обратимо выключать различные структуры коры больших полушарий головного мозга.

2. Проанализировать динамику структурных изменений, происходящих в коре больших полушарий головного мозга крыс при ишемии разной степени тяжести.

3. Проследить взаимосвязь структурных изменений в коре больших полушарий головного мозга крыс после ишемического воздействия разной степени тяжести и электрофизиологических показателей: электрокортикограммы (ЭКоГ) и вызванных потенциалов (ВП).

Положения, выносимые на защиту:

1. При слабой локальной ишемии через 4 часа наблюдался отек поверхностных слоев коры (I-III), и особенно дистальных дендритов I слоя, который сохранялся в течение первых суток, а через 48 часов после ишемического воздействия обнаруживался лишь отек дистальных дендритов I слоя, что говорит об фотохимичесого тромбирования приводит к изменению дельта-колебаний в ЭКоГ, что выражается в усилении мощности в области дельта ритма, особенно его нижнего диапазона (0,5 -1 Гц) и в более раннем появлении дельтаколебаний в ЭКоГ, после введения общего анестетика, по сравнению с интактными областями коры. При этом амплитуда вызванного потенциала не претерпевала значительных изменений.

3. При усилении ишемического воздействия появляются темные нейроны, что коррелирует с прогрессивным снижением амплитуды ВП и снижением мощности ЭКоГ по всем частотам.

Научная новизна работы:

Был разработан метод локального фотохимического тромбирования, который позволяет обратимо выключать различные области коры больших полушарий головного мозга крыс. Впервые было показано, что обратимые эдематозные изменения в верхних слоях коры, вызываемые слабым ишемическим воздействием, не сопровождаются выраженными морфологическими перестройками тел нейронов. Вышеописанные изменения в верхних слоях коры не вызывают значительных изменений амплитуды ВП и мощности частот ЭКоГ, кроме дельта ритма, в особенности его нижнего диапазона (0,5- Гц), мощность которого наоборот увеличивалась. Также было показано, что при локальной ишемии поверхностных слоев коры появление низкочастотной активности в ЭКоГ, вызванное введением общего анестетика, происходит раньше, чем в симметричной области коры контралатерального повреждению полушария мозга.

Практическая значимость работы.

Результаты нашей работы могут быть применены как в ранней медицинской диагностике нейродегенеративных заболеваний (при помощи методов регистрации ЭЭГ и ВП), так и в понимании значения данных структурных перестроек в поверхностных слоях головного мозга при патологии (гипоксии, ишемии). Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедры высшей нервной деятельности МГУ и факультета психологии Международного славянского института.

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008); Пятом междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии», школасеминар «Инновационные технологии в диагностике и лечении заболеваний нервной системы» (Судак, Украина, 2008); Межвузовской студенческой научной конференции «Инновационные технологии в научно-исследовательской деятельности» (Москва, 2008);

XV международной конференции по нейрокибернетике. (Ростов-на-Дону, 2009); XVI международной конференции по нейрокибернетике. (Ростов-на-Дону, 2012); V международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Павла Дмитриевича Харченко и 65-летию НИИ физиологии имени академика Петра Богача «Психофизиологические и висцеральные функции в норме и патологии»

(Украина, Киев, 2010); XXI съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Калуга, 2010); Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2010»

(Москва, 2010) и на научных конференциях молодых ученых Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН в 2008, 2009, 2010, и 2011 гг.

Диссертация апробирована на совместном заседании Лаборатории функциональной нейроцитологии и Лаборатории нейробиологии сна и бодрствования Института 27 июня 2012 года.

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура работы:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка, 2 таблицы и 1 схему. Список цитируемой литературы включает источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Эксперименты проводили на 47 крысах-самцах линии Вистар массой 250-300 г.

Эксперименты осуществляли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского Сообщества (86/609/ЕС) и одобренных Комитетом по медицинской этике в соответствии с положением Института ВНД и НФ РАН о работе с экспериментальными животными.

Были проведены следующие серии экспериментов:

1. В первой серии экспериментов регистрировали и анализировали ЭЭГ и ВП до и через 4 часа после слабого ишемического воздействия. Далее производился морфологический анализ состояния неокортекса в области воздействия. ( животных);

2. Во второй серии экспериментов регистрировали и анализировали ЭЭГ и ВП до и через 4 часа после сильного ишемического воздействия. Далее производился морфологический анализ состояния неокортекса в области воздействия. ( животных);

3. В третьей серии экспериментов гистологически и электронномикроскопически исследовали динамику эдематозных изменений в коре больших полушарий крыс через 4, 24 и 48 часов после слабого ишемического воздействия (25 животных);

4. В четвертой серии экспериментов анализировали динамику ЭЭГ при наркотическом засыпании через 24 часа после слабого фотохимического тромбирования. Животных анестезировали золетилом (50 мг/кг) (5 животных).

Эксперимент с забором материала для морфологических исследований и с регистрацией электрофизиологических показателей (1, 2 серии экспериментов) проводился в несколько этапов:

1. День 1: Трепанация черепа над областью воздействия под уретановым наркозом (1,2 г/кг) и постановка электродов крысе;

• Регистрация ЭКоГ, регистрация ВП в сенсомоторной коре в области представительства передней конечности на электрокожное раздражение передней конечности (контроль);

• Фотохимическое тромбирование (длина волны – 535 нм, диаметр области мм, мощность светового потока для создания ишемического очага в поверхностных слоях - 0,6 мВт/мм и 1,5 мВт/мм для создания ишемического очага во всех слоях коры, длительность воздействия 75 секунд);

• Регистрация ЭКоГ, регистрация ВП в сенсомоторной коре в области представительства передней конечности на электрокожное раздражение передней конечности (опыт);

• Перфузия через 4 часа после фотохимического тромбирования.

3. День 3: Проводка экспериментального материала для исследования в световом и электронном микроскопе;

4. День 4: Его окрашивание (метод Ниссля для окрашивания пластиковых срезов, метод Гольджи).

Схема третьей серии экспериментов:

1. День 1: Трепанация черепа над областью воздействия под золетиловым наркозом 2. День 2:

• Фотохимическое тромбирование (длина волны – 535 нм, диаметр области – 2 мм, мощность светового потока для создания ишемического очага в поверхностных слоях - 0,6 мВт/мм, длительность воздействия 75 секунд);

• Перфузия через 4 часа после фотохимического тромбирования;

3. День 3: Перфузия через 24 часа после фотохимического тромбирования.

4. День 4: Перфузия через 48 часов после фотохимического тромбирования.

5. День 5: Проводка экспериментальных участков коры для микроскопических исследований.

6. День 6: Окрашивание (метод Ниссля для окрашивания пластиковых срезов).

Четвертая серия экспериментов проводилась по следующей схеме:

Трепанация черепа над областью воздействия под золетиловым наркозом Фотохимическое тромбирование (длина волны – 535 нм, диаметр области – 2 мм, мощность светового потока для создания ишемического очага в поверхностных слоях - 0,6 мВт/мм, длительность воздействия 75 секунд).

Запись ЭКоГ производилась после внутрибрюшинного введения золетила Перфузия через 21 час после фотохимического тромбирования.

3. День 3: Проводка экспериментальных участков коры для микроскопических В случае острого эксперимента в первый день эксперимента животные анестезировались уретаном (уретан, 1,2 г/кг). В случае хронического эксперимента использовался золетиловый наркоз 50 мг/кг. Крысы крепились в стереотаксическом приборе. Над черепом кожа рассекалась, мышцы сепарировались от кости, костную ткань очищали от крови, поверхность черепа отшлифовывали и выравнивали. После этого производилась трепанация черепа над сенсомоторной областью (представительство передней лапы) экспериментальной области коры больших полушарий лапы (координаты:

L=3 мм, A=1 мм от брегмы по атласу Paxinos G. et al). Диаметр трепанационного отверстия – 3 мм. В правом полушарии трепанационное отверстие располагалось симметрично. Затем устанавливались имплантанты из плексигласа со встроенными фотохимического тромбирования. После наложения имплантантов с электродами они были зафиксированы с помощью протакрила. Края скальпа подрезались, и накладывался шов.

Фотохимическое тромбирование проводили на второй день эксперимента, т.е.

после установки имплантантов, регистрировали ЭКоГ и ВП. Фотохимическое тромбирование производили в сенсомоторной коре в области представительства передней лапы (координаты: L=3 мм, A=1 мм от брегмы по атласу Paxinos G. et al., 1998).

регистрация ЭкоГ, затем над областью предполагаемого поражения регистрировали ВП в ответ на электрокожное раздражение конечности, а также в отдалении от зоны ишемического воздействия и в симметричных точках контралатерального полушария.

Далее животному внутривенно (через бедренную вену) вводился светочувствительный краситель бенгаловый розовый из расчёта 7,5 мг/кг. После этого к имплантанту крепился пластиковый световод, пропускающий свет зеленого лазера диаметром 2 мм. Через минуты после введения бенгалового розового производилась засветка лазером (длина волны – 535 нм, диаметр области – 2 мм, мощность светового потока для создания ишемического очага в поверхностных слоях - 0,6 мВт/мм2 и 1,5 мВт/мм2 для создания ишемического очага во всех (слоях коры) длительностью 75 секунд.

Регистрация ЭКоГ проводилась во второй день эксперимента до фотохимического тромбирования (контроль), а также через 4 часа после фотохимического тромбирования. С Схема 1. Расположение регистрирующих электродов на поверхности черепа крысы.

ны с компьютером. Запись проводилась по 4 соматосенсорная каналам: первый канал – левое полушарие (область FL – передняя лапа, T – туловище.

воздействия) с координатами 0,5 мм от брегмы и область в правом полушарии, расположенная симметрично первому (Рис. 1). Третий и четвертый каналы были отставлены каудально симметрично от первых двух каналов на 4 мм (Схема 1.).

При помощи программы EEGlab анализировали спектры мощности ЭЭГ, затем логарифмированные значения потенциировали и проводили подсчет мощности ЭЭГ с шагом 1 Гц. Полученные данные по каждому полушарию сравнивали до и после ишемического воздействия, а затем данные по экспериментальному и контрольному полушариям сравнивали между собой. Анализировали отрезки ЭЭГ длительностью 9 минут.

Статистическая обработка результатов производилась в среде Statistica 6.0 для Windows по методу ANOVA с post-hoc анализом по U-критерию Манна-Уитни. Сравнение полученных результатов до и после воздействия производилось по критерию Вилкоксона для непараметрических данных, разброс данных на рисунках – стандартное отклонение.

Запись производилась во второй день эксперимента до фотохимического тромбирования (контроль), а также через 4 часа после фотохимического тромбирования в условиях уретанового наркоза. В качестве стимулирующих электродов использовались четыре хлорсеребряных электрода шириной 0,3мм и длина 1мм, соединённые с аналоговым изолятором стимула Linear Isolator DL360 (NBLab, Россия). Такие электроды устанавливались подкожно на обеих передних лапах предварительно наркотизированного уретаном (1,2 г/кг) животного. Соматосенсорные ВП регистрировались по 4 каналам, по которым записывалась ЭКоГ. С помощью кабеля регистрирующие электроды были подключены к двухканальной системе сбора данных (усилитель с аналого-цифровым преобразователем) для биологических исследований NBL140. Во время регистрации животное находилось в экранированной камере.

После усиления и фильтрации (фильтр нижних частот – 0,1 Гц) электрическая активность мозга подавалась на аналого-цифровой преобразователь. После аналогоцифрового преобразования с частотой 10 кГц сигнал в цифровом виде записывался на персональный компьютер. Сбор данных и анализ ВП производился с помощью программного обеспечения DigiScope и AxoScope 9.0.

ВП регистрировались в ответ на стимуляцию правой и левой лап попеременно, прямоугольными импульсами тока силой 0,6 мА, длительностью 0,03мс с частотой 1 Гц.

Минимальное (как правило от 300-400 мкВ) и максимальное напряжение тока подбиралось индивидуально.

Для анализа ВП, регистрируемых от сенсомоторной коры, было произведено усреднение 50 предъявлений стимула. Далее были подсчитаны латентные периоды и амплитуда компонентов.

Статистическая обработка результатов производилась в среде Statistica 6.0 для Windows по методу ANOVA с post-hoc анализом по U-критерию Манна-Уитни. Сравнение полученных результатов до и после воздействия производилось по критерию Вилкоксона для непараметрических данных, разброс данных на рисунках – стандартное отклонение.

Оценку силы инсультного повреждения, динамику нейродегенеративных процессов производили на фронтальных срезах мозга. Для этого после регистрации ЭКоГ и ВП наркотизированных животных (уретан, 1,2 г/кг) перфузировали растворами для электронной микроскопии: 1,5% глутаральдегида и 1% формалина на 0,1 М фосфатном буфере (рН=7,4) и для световой микроскопии: 4% раствором параформальдегида на 0,1М фосфатном буфере (рН=7,4). Далее мозг крыс обезвоживали и заливали в аралдит.

Полутонкие срезы получали на ультратоме LKB-IV (Швеция) толщиной 1 мкм, окрашивали их по методу Ниссля для последующего анализа состояния нейронов и нейропиля всех слоев коры в световом микроскопе, и для точного выхода на нужный слой коры для электронномикроскопического исследования. Окрашивание полутонких пластиковых срезов производили на предметных стеклах в капле раствора 0,5% метиленовой сини и 1% буры. Также производили окрашивание по методу Гольджи.

Для электронной микроскопии мозг обезвоживали, заключали в аралдит.

Затем затачивали пирамиду на уровне 1-го слоя коры, делали ультратонкие срезы толщиной 40-80 нм. Контрастирование полученных срезов проводилось растворами уранилацетата и лимоннокислого свинца, приготовленного по Рейнольдсу. Затем они были проанализированы в электронном микроскопе JEM-100B (Япония).

6. Методы статистического анализа морфологических данных Полученные морфологические данные были сведены в электронные таблицы Excel, статистический анализ проводили с использованием программ “Microsoft office Excell 2003” и “Statistica 6.0”. Все значения даны в виде: m±SEM (средн.знач.+ст.ош.средн).

Сравнение между группами (сильное и слабое ишемическое воздействие) при