На правах рукописи

СТРЕЛЬЦОВА Ольга Сергеевна

ПРОФИЛАКТИКА И ЛЕЧЕНИЕ

ПОВЕРХНОСТНОГО РАКА

МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ

14.01.23 – урология

14.01.12 – онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации

на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва - 2013 2

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Крупин Валентин Николаевич Доктор медицинских наук Загайнова Елена Вадимовна

Официальные оппоненты:

Матвеев Всеволод Борисович, доктор медицинских наук, профессор федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Российской академии медицинских наук, заведующий клиникой урологии Теодорович Олег Валентинович, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования», заведующий кафедрой эндоскопической урологии Алексеев Борис Яковлевич, доктор медицинских наук, профессор, федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский Научноисследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена» Минздрава Российской Федерации, заведующий отделением онкоурологии

Ведущая организация: государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области «Московский областной научно – исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

Министерства здравоохранения Московской области, 129110, Москва, ул.Щепкина, дом 61/

Защита состоится «17 » сентября 2013г. в «13 » часов на заседании диссертационного совета Д 208.056.01 при ФГБУ «НИИ урологии» Минздрава России по адресу: 105425, г. Москва, 3-я Парковая улица, д.51.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ урологии» по адресу: 105425, г. Москва, 3-я Парковая улица, д.

Автореферат разослан «_»_2013 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 208.056. Доктор медицинских наук, профессор Т.С. Перепанова Общая характеристика диссертации Актуальность темы Заболеваемость опухолями мочевыделительной системы в мире составляет по данным разных авторов от 260 000 до 330 тысяч новых случаев в год (J.N. Eble, 2004; Е.М. Аксель, 2005; К.М. Пожарисский, 2006) В России в 2007г. на учете состояло 70544 больных раком мочевого пузыря, а в 2010г. уже 79959 (М.И.Давыдов, 2008,2009). Динамика заболеваемости раком мочевого пузыря в России с 1991 года свидетельствует о приросте показателей с 9, человек на 100 тысяч населения до 12,6 в 2007 году. Так в 2010 году под наблюдением находилось 56,4 человек на 100 тысяч населения по сравнению с 36,7 в 2000 году (Е.М.Аксель, 2008; В.И. Чиссов с соавт., 2011).

Выявление рака на ранних стадиях развития под действием адекватного лечения ведёт к выздоровлению больного, позволяет производить органосохраняющее лечение.

Рак - болезнь не одного года, процесс перерождения нормальной ткани в опухолевую, зависящий от внешних и внутренних факторов, занимает от 3 до лет (М.А. Пальцев с соавт., 2009). Основой для развития онкологической патологии могут быть заболевания, морфологически проявляющиеся дистрофиями, атрофиями, склерозом, гиперплазией уротелия, метаплазией и дисплазией эпителия. Кроме того, очаги гиперплазии и метаплазии с дисплазией рассматривают как собственно предопухолевые (А.И. Струков, В.В. Серов, 1995; Б.П. Матвеев, 2006, 2011). В фазах морфогенеза рака выделяют предраковые условия (облигатный предрак), предраковые состояния (факультативный предрак), прединвазивный рак, ранний инвазивный рак сопровождающиеся дистрофиями, атрофиями, метаплазией с возникновением очаговых пролифератов, среди которых могут возникнуть очаги неоплазии, требуют пристального контроля. Роль дисплазии в возникновении опухолей мочевого пузыря изучается и обсуждается многими исследователями (А.Ф.

Возианов, 1994; Д.Л. Мак-Каллах, 1997; L.Cheng, 1999). Так дисплазию тяжелой степени рассматривают как облигатный предрак – стадия ранней онкологической патологии, которая рано или поздно трансформируется в рак.

Особая настороженность к раку in situ объясняется высоким риском развития инвазивных форм и прогрессирования заболевания - от 20 до 83%. (M.A.Hudson, H.W. Herr, 1995, О.Б. Лоран, 2010). Тяжелую дисплазию и рак in situ относят к ранним стадиям/формам неоплазии (В.И.Чиссов, В.В. Старинский и др., 2002).Однако подобные ситуации могут возникать на фоне предшествующих изменений эпителия мочевого пузыря различного генеза. Практическая медицина отстает в возможности выявления ранних этапов малигнизации мочевого пузыря, несмотря на достижения теоретической онкобиологии. Одна из главных причин развития онкопроцесса - несвоевременная диагностика и лечение, недостаточно высокая эффективность методов уточняющей диагностики, несовершенство первичной и вторичной профилактики злокачественных новообразований (Р. И. Якубовская, 2000).

В 80-х гг. двадцатого века с появлением фемтосекундных лазеров и суперлюминесцентных полупроводниковых диодов зародился новый метод диагностики, позволяющий визуализировать внутреннюю структуру рассеивающих сред - оптическая когерентная томография (ОКТ). Оптическая когерентная томография наиболее информативна для анализа тканей, имеющих слоистую структуру. В начале 90-х гг. нижегородская исследовательская группа впервые применила данный метод в клинической практике (A.M.Sergeev, 1997).

С 1997 года оптическая когерентная томография применяется в урологии, как метод визуализации состояния слизистой оболочки мочевого пузыря (В.Н.

Крупин, 2001). В основе метода лежит использование низкоинтенсивного света ближнего инфракрасного диапазона в качестве зондирующего излучения.

Традиционная оптическая когерентная томография не специализирована для визуализации соединительнотканных структур, в частности коллагена. Новая модификация ОКТ – кросс - поляризационная оптическая когерентная томография разработана и внедрена нами в клинику урологии, как метод оптической диагностики предопухолевых состояний и раннего рака мочевого пузыря. В связи с вышеизложенным, тема является актуальной.

Цель работы: у л у ч ш е н и е ранней диагностики и лечения неоплазии мочевого пузыря.

Задачи исследования 1. Проанализировать частоту плоских поражений эпителия мочевого пузыря, предопухолевых изменений и раннего рака мочевого пузыря у больных с поверхностным раком и подозрением на рак мочевого пузыря.

2. Изучить возможности нового метода кросс-поляризационной оптической когерентной томографии в диагностике воспалительных и неопластических заболеваний слизистой оболочки мочевого пузыря.

3. Обосновать эффективность метода комбинированной диагностики предрака и раннего рака мочевого пузыря на основе одновременного использования флуоресцентной цистоскопии и кросс-поляризационной оптической когерентной томографии с последующим иммуногистохимическим контролем.

4. Провести сравнительный анализ микроциркуляторного русла слизистой оболочки мочевого пузыря при хронических воспалительных процессах и при неоплазии.

5. Изучить динамику показателей иммунитета в процессе лечения у пациентов, страдающих хроническими воспалительными заболеваниями мочевого пузыря.

6. Обосновать необходимость включения иммуномодуляторов и препаратов, влияющих на микроциркуляторные процессы в патогенетическую терапию хронических воспалительных заболеваний слизистой оболочки мочевого пузыря у пациентов групп риска.

7. Разработать алгоритм диагностики и мониторинга предопухолевых заболеваний мочевого пузыря.

Научная новизна 1. Разработанный метод визуализирующей диагностики - кроссполяризационная оптическая когерентная томография может быть максимально эффективен в дифференциальной диагностике раннего рака, предопухолевых и фоновых заболеваний мочевого пузыря.

2. Метод эндоскопической диагностики предопухолевых состояний и раннего рака мочевого пузыря на основе комбинированного использования флуоресцентной цистоскопии и кросс-поляризационной оптической когерентной томографии позволяет объективно дифференцировать ранний рак, предрак и фоновые состояния слизистой оболочки мочевого пузыря, исключить необоснованные биопсии в 82,9% случаев.

3. Создана модель для изучения патогенетических изменений в развитии пренеоплазии в мочевом пузыре – лучевой цистит, при которой на тканевом уровне возможно динамически проследить развитие воспалительных изменений в мочевом пузыре от ранних до поздних.

4. Включение иммуномодулирующих препаратов в лечение хронических циститов является обязательным, что позволяет увеличить показатель фагоцитарного микроорганизмов из мочи по сравнению с пациентами, не получавшими иммуномодулятор.

Практическая значимость 1.Внедренный в урологическую практику метод визуализирующей диагностики – кросс - поляризационная оптическая когерентная томография позволяет в реальном времени объективно дифференцировать ранний рак, предопухолевые и фоновые заболеваний мочевого пузыря, выполнять прицельные биопсии.

2. Включение кросс-поляризационной оптической когерентной томографии в диагностический процесс позволило корректировать лечение пациентов групп риска и ранее оперированных по поводу рака мочевого пузыря на амбулаторном этапе и исключить необоснованные повторные госпитализации.

3. Внедрена в клиническую практику методика интраоперационного кроссполяризационного контроля полноты удаления опухоли, что позволило свести к минимуму количество рецидивов в области послеоперационного рубца (до 0).

4. Внедрение кросс-поляризационной оптической когерентной томографии в диагностику послеоперационного состояния слизистой оболочки мочевого пузыря позволило ограничить выполнение повторных трансуретральных резекций (ре-ТУР) через 4-8 недель после первой операции по поводу рака из послеоперационной зоны в 78,2 % случаев.

5. Разработанный алгоритм диагностики для больных с дизурией, алгоритм мониторинга раннего послеоперационного ведения больных с поверхностным раком мочевого пузыря способствовал увеличению выявляемости поверхностных форм рака мочевого пузыря. По статистическим данным онкологического диспансера Нижегородской области выявляемость I-II стадий рака в 2010 году возросла до 50,4% % по сравнению с 39,2% в 2007 году.

Положения диссертации, выносимые на защиту 1. Необходимость выявления плоских поражений эпителия мочевого пузыря у пациентов с гематурией неясной этиологии, дизурией, у ранее леченных по поводу рака, как предшественников неоплазии. Диагностика изменений в мочевом пузыре на тканевом уровне может явиться «маркером»

предопухолевых состояний.

2. Новый метод оптической диагностики - кросс-поляризационная оптическая когерентная томография позволяет в реальном времени дифференцировать структурные изменения слизистой оболочки мочевого пузыря и с высокой точностью верифицировать ранний рак, предопухолевые и доброкачественные процессы.

3. Новый метод комбинированной эндоскопической диагностики кроссполяризационной оптической когерентной томографии и флуоресцентная диагностика с иммуногистохимическим контролем с высокой специфичностью позволяет дифференцировать зоны облигатного предрака.

4. Анализ микроциркуляции в слизистой оболочке мочевого пузыря свидетельствует о застойном типе кровообращения, как при воспалительных заболеваниях, так и при наличии опухоли.

5. Лечение хронических воспалительных заболеваний мочевого пузыря должно включать иммуномодулирующие препараты, препараты, влияющих на микроциркуляторные процессы в слизистой оболочке. Мониторинг и лечение по предложенным алгоритмам позволяет уменьшить развитие предопухолевых изменений уротелия и минимизировать количество рецидивов при раке мочевого пузыря.

Внедрение результатов исследования Результаты исследования внедрены в работу поликлинического урологаонколога ГБУЗ «Нижегородский областной онкологический диспансер»; в работу радиологического отделения ГБУЗ «Нижегородский областной онкологический диспансер» при лучевом лечении больных с опухолями органов малого таза; в работу урологических отделений ГБУЗ «Нижегородская областная клиническая больница им. Н.А.Семашко»; в учебный процесс кафедры урологии им. Е.В. Шахова Нижегородской государственной медицинской академии при чтении лекций и проведении семинаров с врачамикурсантами факультета повышения квалификации, клиническими ординаторами, студентами.

Апробация и внедрение результатов исследования Материалы диссертации доложены и обсуждались в рамках Европейской биооптической недели Bios '2000, (Amsterdam, 4-8.07.2000); на конференции по лазерным технологиям “LAT 2002” 22-27.06.2002; на международном биомедицинском оптическом cимпозиуме BiOS '2003, (San Jose, California USA, 21 - 26.01. 2003); на 75 конференции BIOS' 2004 (San Jose, California USA, 24 на научно - практических конференциях "Лазерные и информационные технологии в медицине XXI века", Санкт-Петербург (21 и "Диагностика и комбинированное лечение больных раком мочевого пузыря", Москва (4 - 5.12.2002); в рамках «Proceedings of ASCO meeting», Новый Орлеан, 2004; на 3-х международных симпозиумах «Topical рroblems оf biophotonics»- (4-11.08.2007, Нижний Новгород – Москва – Нижний Новгород; 19-24.07. 2009, Нижний Новгород – Самара – Нижний Новгород; 16Санкт-Петербург-Нижний Новгород); на трех научно – практических конференциях: "Диагностика и лечение рака мочевого пузыря", Нижний Новгород, 2005; «Инновации в медицине» Саров, 2006; «Современный взгляд на новые медицинские технологии в урологии и гинекологии» Ростов–на–Дону, 22на ХIV научно-практической региональной с международным участием конференции урологов «Достижения и перспективы в онкоурологии»

Харьков, 25-26.05.2006; на VIII Российской школе оперативной урологии, Ростов-на-Дону, 1-3.11.2006; на III Всероссийской научно – практической конференции «Актуальные вопросы урологии. Заболевания предстательной железы. Новые технологии в урологии», Абзаково, 19-21.04.2007; на ХI съезде урологов России, Москва, 6-8.11.2007; на V Всероссийской школе-симпозиуме «Динамика и структура в химии и биологии», Москва, 16-18.04.2007г.; на III Конгрессе Российского общества урологов, Москва, 2-3.10.008; на Международном междисциплинарном симпозиуме «Хроническая тазовая боль», Нижний Новгород, 16-17.10.2008; на 27 конференции Европейского общества радиационной онкологии ESTRO, Швеция, Гетеборг, 14-18 сентября 2008; на Международной конференции «Туберкулез мочеполовой системы и другие урологические заболевания, резистентные к стандартной терапии», Новосибирск, 27-28.08.2008; на экспертном Совете по проблемам заболевания предстательной железы, Ницца, Франция, 21-26.04.2008; на международном форуме компании «Bionorica» «Phytoneering research & experience summit (PRES)»18-19.11.2008, Киев; на Всероссийской конференции «Рациональная Международной научной конференции «Сексуальное здоровье», Ереван, 7на IV конгрессе Российского общества онкоурологов, Москва, 1на международном онкологическом научно-образовательном форуме Онкохирургия-2010 «В будущее через новые технологии», Москва, 31.05 – 02.06.2010; на IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Нижний Новгород, 18-19.05.2010г.; на региональной конференции с международным участием «Нарушение мочеиспускания у мужчин и женщин», Новосибирск, 12.04.2012; на VII Конгресс Российского общества онкоурологов, Москва, 03-05.10.2012; на 5 заседаниях Нижегородского научного общества урологов (13.11.2005, протокол №7; 21.03.2008, протокол №3; 06.11.2008, протокол №8; 25.11.2010, протокол №7; 22.03.2012, протокол №1); на совместном заседании кафедры урологии НижГМА и врачей урологических отделений Областной клинической больницы им. Н.А. Семашко (протокол № от 26.09.2012), а также на заседании Научно - координационного совета ФГБУ «НИИ урологии» Минздрава России (от 18.12.2012, протокол №6).

Связь с планом научно-исследовательских работ Диссертация выполнена в соответствии с планом научно – исследовательских работ государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия»

Министерства здравоохранения Российской Федерации: регистрационный номер 01201158967.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 75 работ, из них 13 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, учебное пособие, 2 патента на изобретение.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит 61 таблицу и 136 рисунков.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, описывающей материалы и методы исследований, 5 глав собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 180 отечественных и 98 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

В работу вошли данные обследования 2230 пациентов, получавших лечение с 2000 по 2011 г. в клинике урологии Нижегородской медицинской академии, на базах областной клинической больницы им. Н.А. Семашко и Нижегородского областного онкологического диспансера. Из них 1160 пациентов - группа ретроспективного анализа частоты выявления предраковых изменений и раннего рака мочевого пузыря по результатам гистологических исследований:

799 ТУР мочевого пузыря и 662 ТУ – биопсий – всего 1461 случаев исследования (5760 препаратов).

Основу работы составили клинические наблюдения за 1070 пациентами (2004-2012г.), которые были обследованы методами оптической диагностики и лазерной доплеровской флоуметрии. 745 получали лечение по поводу рака мочевого пузыря или обследовались в связи с подозрением на рецидив рака мочевого пузыря: группа Р- (n-733), 12 мочевых пузырей изучены ex vivo после экстирпации. У 561 пациента имел место мышечно-неинвазивный рак мочевого пузыря - рТа, Т1. После ТУР мочевого пузыря изменение градации Т1 на рТ произошло у 172 пациентов. Мужчин - 589, женщин 144, соотношение м:ж – 4,1:1. В связи с временны'м интервалом изучения материала, в исследование вошли заключения патологоанатомов, базирующиеся на классификации рака мочевого пузыря ВОЗ как 1973, так и 2004 года.

Анализ роли фоновых заболеваний, которые морфологически могут проявляться дистрофиями, атрофиями, склерозом, гиперплазией уротелия, метаплазией и дисплазией, в развитии опухолей мочевого пузыря проведен на основании изучения состояния слизистой оболочки мочевого пузыря у женщин с хроническими воспалительными заболеваниями (группа ХЦ).

Максимальная длительность наблюдения за состоянием мочевого пузыря у этой группы пациентов составила 5 лет.

Моделью развития патологических процессов в слизистой оболочке мочевого пузыря, динамику которых можно проследить от ранних до поздних, принят мочевой пузырь на фоне лучевого лечения органов малого таза.

Сформирована группа пациенток с лучевыми изменениями мочевого пузыря после гамма терапии по поводу рака шейки матки и тела матки (группа Л, nУ 35 пациентов, которые получали лечение по поводу камней верхних мочевых путей, мочевой пузырь принят нормальным (группа Н). Перед обследованием все пациенты подписывали протокол информированного согласия. В результате сформировано 4 группы пациентов для изучения: Р, ХЦ, Л, Н. Всем больным произведено клинико-лабораторное обследование, включая посевы мочи на флору, стандартное клиническое обследование:

ультрасонография, диагностическая цистоскопия, при необходимости экскреторная урография для исключения поражения верхних мочевых путей.

Компьютерную или магнитно-резонансную томографию выполняли по показаниям.

В работе использованы уникальные и новейшие методы исследования мочевого пузыря: оптическая когерентная и кросс-поляризационная томография. Кросс - поляризационные исследования выполняли ex vivo (на послеоперационных образцах) и in vivo в процессе цистоскопии и операций. На основе разработанного нами алгоритма диагностики предопухолевых заболеваний проведен мониторинг состояния слизистой оболочки мочевого пузыря у пациентов изучаемых групп на фоне лечения и без такового.

Стандартная оптическая когерентная томография не специализирована для исследования изменений соединительнотканной стромы. Именно высокая организация коллагена обеспечивает его способность изменять поляризацию света, проходящего через биоткань. В институте прикладной физики Нижнего Новгорода разработан метод кросс-поляризационной ОКТ (КП ОКТ), основанный на изменении поляризации света при прохождении через биологическую ткань, позволяющий исследовать изменения соединительной ткани. В работе использовали двухканальный компактный переносной прибор «ОКТ 1300-У». Параметры прибора: мощность- 1Мвт, длина волны 1270 нм, пространственное разрешение 10-15 мкм, глубина сканирования 1-2 мм, время получения двумерного изображения 1,5-2 сек. Внедрение нового метода оптической визуализации – КП ОКТ в урологическую практику предполагало экспериментальный и клинический этапы исследования.

Экспериментальный этап: проведена неповреждающая верификация коллагенсодержащих структур методом кросс-поляризационной оптической когерентной томографии в слизистой оболочке мочевого пузыря при его заболеваниях с использованием в качестве «ориентира» хирургической нити;

выполнено сравнение диагностических возможностей традиционного метода оптической когерентной томографии и нового метода кросс-поляризационной оптической когерентной томографии в диагностике заболеваний мочевого пузыря, в выявлении раннего рака мочевого пузыря и предопухолевых изменений. Выполнены сопоставления КП ОКТ изображений (n-252) и гистологических препаратов (n-84), окрашенных по ван-Гизон и пикросириусом - красным, дифференцирующих волокна соединительной и мышечной ткани. Для минимизации изменений образцы ткани мочевого пузыря исследовались в первый час после эксцизии. Совпадение участков КП ОКТ сканирования и гистологического исследования достигалось путем прошивания хирургической нитью определенного диаметра (от 100 до 300 мкм) на разной соединительнотканном и мышечном слоях). КП ОКТ сканирование проводили над местом прохождения нити в центре между местом входа и выхода нити.

При трансвезикальных операциях (n - 30) зонд фиксировался непосредственно на интересующем участке рукой исследователя. Таким образом, на данном этапе выполнено 165 сопоставлений соответствия КП ОКТ изображений in vivo и морфологических препаратов после биопсии мочевого пузыря.

При сравнительном анализе гистологических данных и КП ОКТ изображений в прямой и ортогональной поляризациях, опирались на общие закономерности формирования изображений и разработанные нами признаки характеристики КП ОКТ изображений.

Клинический этап исследования. Изучены данные состояний мочевого пузыря 265 пациентов, которым выполняли ОКТ исследования (получено изображений) до 2005 г. и 777 пациентов, которые обследованы методом КП ОКТ (8151 изображение). Всего получено и проанализировано изображений. В среднем при каждом исследовании получали информацию из - 15 интересующих нас зон. Для исследования выполняли «прицельную»

трансуретральную биопсию стенки мочевого пузыря, что позволяло выполнить след-отпечаток от зонда томографа. На клиническом этапе изучение оптических изображений выполнено параллельно 212 морфогистологическим препаратам из соответствующих зон, которые были подвергнуты компьютерной обработке и с них получено 435 изображений. Материал для гистологического исследования фиксировался в 10% забуференном водном растворе нейтрального формалина, проводился по спиртам восходящей концентрации, заливался в парафин. Препараты окрашивали гематоксилином с докрашиванием эозином, для визуализации коллагена применяли пикросириус – красный (ПСК) и окраску по ван - Гизон. Окрашенный ПСК образец биоткани оценивали в поляризационной микроскопии. Пациенткам группы лучевого цистита в течение курса облучения мониторинг состояния стенки мочевого пузыря проводился 1 раз в неделю, начиная с первого дня. В первый день КП ОКТ исследование совмещали с цистоскопией. Далее КП ОКТ выполняли без цистоскопа. На начальных этапах исследования положение зонда контролировали методом УЗИ с помощью вагинального датчика аппарата PHILIPS HD 11 XE, что позволяло выполнять исследование интересующих нас зон мочевого пузыря. В качестве стандартных зон сканирования были выбраны области, попадающие у всех пациенток в зону облучения - на задней, боковых стенках и в треугольнике Льето. Получали по 2-3 изображения из каждой зоны.

Для анализа изображений на экспериментальном и раннем клиническом этапе, а также у пациенток группы лучевых изменений мочевого пузыря, применили количественное измерение контраста КП ОКТ изображений показателя обратного рассеяния, что способствовало повышению возможностей метода в идентификации патологических процессов. В КП ОКТ величина контраста изображения зависит от способности тканей по-разному отражать свет. Численный анализ проводился полуавтоматическим способом с помощью программы Image J. Полученное значение пересчитывалось в децибелы (дБ) с учетом физических характеристик томографа. Численный анализ КП ОКТ изображений проведен у 96 пациентов с плоскими подозрительными зонами в мочевом пузыре, у которых на КП ОКТ изображениях в прямой поляризации контраст слоев визуально был снижен, что затрудняло диагностику. Численный анализ КП ОКТ изображений различных состояний слизистой мочевого пузыря позволил показать универсальность метода КП ОКТ.

Повысить диагностические возможности по выявлению ранних форм неоплазии мочевого пузыря позволила комбинация метода КП ОКТ и флуоресцентной цистоскопии у 54 пациентов. За 2 часа до исследования в мочевой пузырь через катетер вводили 5-аминолевулиновую кислоту Аласенс» 3% раствор. Во время исследований выполняли видеозапись, описывались все флуоресцирующие зоны. Из каждой флуоресцирующей зоны получали 1-2 КП ОКТ изображения. Для морфологической оценки изменений слизистой оболочки проводилась ТУ-биопсия флуоресцирующих участков мочевого пузыря.

Изучена зависимость выраженности патологических процессов от гистологических и иммуногистохимических признаков 45 флуоресцентных плоских зон и 73 КП ОКТ данных из них же (от 18 пациентов). Использованы антитела к антигенам человека: Ki-67, p-53 и p-63 - (Diagnostic BioSystems), CDv6 (Novocastra), к цитокератину 20 (Diagnostic BioSystems), к T-антигену (Abcam), к ABO(Н) (Abcam). В качестве детекционной использована система «Peroxidase Detection System» («Novocastra»).

Для изучения микроциркуляторного русла слизистой оболочки мочевого пузыря в исследуемых группах, а так же при проведении лечения мочевого пузыря химиопрепаратами и иммунопрепаратами, мы использовали лазерную допплеровскую флоуметрию (ЛДФ). Применяли лазерный анализатор капиллярного кровообращения «ЛАКК-01» (у 72 пациентов) и «ЛАКК-02» (у 134 пациентов) (НПП «ЛАЗМА», Россия).

Иммунный статус изучен у 118 больных хроническим рецидивирующим циститом. Им определяли уровень иммуноглобулинов, интерферонов крови ( и ), субпопуляции иммунокомпетентных клеток, а так же показатели фагоцитарной активности нейтрофилов. Обсервационная норма уровня интерферонов получена у 20 здоровых сотрудников больницы. Определение ИНФ, ИНФ выполняли, используя твердофазный иммуноферментный метод с применением пероксидазы хрена (ООО «Протеиновый контур» С-Петербург).

Уровень измерения выражается в пикограммах в 1 мл (пг/мл) сыворотки крови.

Определение иммуноглобулинов А, М, G осуществляли методом радиальной иммунодиффузии в агаре по Манчини. Субпопуляции иммунокомпетентных клеток определены с помощью мембранной иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител (ООО «Сорбент» г. Москва).

Показатель фагоцитарной активности нейтрофилов оценивали по НСТ – тесту тесту восстановления нитросинего тетразолия.

Для представления полученной информации (видео- и фотоизображений, КПОКТ изображений и цифровых изображений гистологических слайдов) использована оригинальная программа для работы с оптическим томографом – «Presto 32» и ее модификации, а так же программы «Studio version 9» для работы с микроскопом и видеокамерой и оцифровки эндоскопических изображений. Статистическая обработка материала выполнена в программе «MEDCULC» (версия 7.3).Статистическая обработка числовых данных в работе проводилась так же с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.0.

Уровень статистической значимости был принят равным 0,05.

Анализ частоты предраковых изменений и раннего рака мочевого пузыря по результатам гистологических исследований По ретроспективному анализу 1326 результатов гистологических исследований из визуально подозрительных зон, а также из околоопухолевых зон мочевого пузыря получено 646 случаев рака и 680 случаев доброкачественных состояний.

Анализ доброкачественных состояний мочевого пузыря с сохраненным эпителием (n-613) показал, что плоские поражения эпителия мочевого пузыря, в том числе и предраковые изменения, составили 28,7% (n-176). Состояний эпителия, относящихся к фоновым заболеваниям, зафиксировано 71,3% (n-437).

Изменения воспалительного характера - лимфолейкоцитарная инфильтрация тканей - были выявлены в 82% биоптатов при доброкачественных процессах в мочевом пузыре, при наличии опухоли в перифокальных зонах – 43%. По данным F.K. Mostofi (1997) подобная гистологическая картина неизмененных зон в мочевом пузыре с опухолью - маркер вероятности неполного удаления неопластической или пренеопластической слизистой из краевых зон.

Исследование показало, что у больных раком мочевого пузыря, пациентов с гематурией неясной этиологии и дизурией визуально измененная слизистая оболочка в 33,5% случаях является следствием плоских поражений эпителия мочевого пузыря, включая ранний рак (4,8%). Таким образом, своевременное выявление изменений в мочевом пузыре на тканевом уровне может явиться «маркером» предопухолевых состояний.

Характеристика исследуемых групп пациентов Выяснено, что все пациенты исследуемых групп Р, ХЦ, Л, имели сопутствующие болезни - важное патогенетическое звено в процессах гомеостаза, иммунитета, иннервации. Сравнение групп свидетельствует о возрастании количества сопутствующей патологии у онкологических пациентов. Так в гр. Р в среднем на одного пациента приходилось 2, заболевание; в гр. Л-1,9; в гр. ХЦ -1,7. В гр. Р преобладали пациенты от 60 до 69 лет (44,8%), в гр. ХЦ - женщины периода менопаузы - после 50 лет (41,4%).

Средний возраст гр. ХЦ - 44,3 года, что согласуется с данными литературы о патогенезе развития мочевой инфекции, определяющейся недостатком эстрогенов, а также снижением иммунитета с возрастом. Больные с онкопатологией органов малого таза (гр. Л)- в возрасте 50-59 лет составили 54,7%. Таким образом, определена ведущая роль фактора возраста, сниженного гормонального статуса у всех групп пациентов.

Заболевания, влияющие на микроциркуляторные процессы в малом тазу ИБС, гипертоническая болезнь, сахарный диабет,- выявлены у 87,8% (n-644) пациентов гр. Р, у 61,3% (n-46) гр. Л и у 30,75% (n-66) гр. ХЦ. Важно, что 62,7 % (n-135) пациенток гр. ХЦ имели сопутствующую гинекологическую патологию; патология желудочно-кишечного тракта у них же выявлена в 50,2% (n-108) случаев - причины, ведущие к иммунным нарушениям. На нарушения иннервации органов малого таза могли оказывать влияние сопутствующие процессы у 32% пациенток гр. Л, у 19,7% гр. Р и у 17,3% гр. ХЦ.

Гематурия наблюдалась у 55,4% пациентов гр.Р. В группах ХЦ и Л микрогематурия при отсутствии жалоб зафиксирована в 21,9% и 38,7% соответственно. Дизурия беспокоила 100% пациентов при обострении хронического рецидивирующего цистита. При раке мочевого пузыря этот симптом появлялся в случае локализации опухоли в зонах устий или в области шейки мочевого пузыря, а также на фоне инфравезикальной обструкции и при вторичных поражениях мочевого пузыря - в 15,5%. Поллакиурия явилась характерным симптомом у пациенток с лучевыми поражениями мочевого пузыря в 58,7%. Сочетание дизурии и гематурии зафиксировано в 12% (у пациентов).

Выявлено, что опухоли чаще возникали в нижней гемисфере - зоне наибольшего раздражения мочой, зоне обильно иннервируемой, на границе слияния зародышевых листков, формирующих мочевой пузырь. Наиболее частой локализацией опухолей являлись боковые стенки – 54,5%, чаще с локализацией ближе к устьям.

Цистоскопическое исследование пациентов всех групп показало, что компонентом визуальных изменений слизистой оболочки мочевого пузыря является система микроциркуляции, которая внесла свой вклад в формирование цистоскопической картины. Усиление сосудистого рисунка при опухоли рТ выявлено в 86,9% (n-472); редкие же изменения, такие как буллезные изменения или отек в перифокальных зонах, выявлялись в 16,9% (n-92) случаев.

В гр. ХЦ выраженное усиление сосудистого рисунка наблюдалось в 58,1% (nотек и гиперемия в зоне треугольника Льето на фоне усиления сосудистого рисунка были зафиксированы в 24,2% (n-52), а картина метаплазии в 47,4% (n-102).Бессимптомное течение опухолевого заболевания мочевого пузыря на начальной стадии отмечено в 34,2% случаев(n- 250).

Таким образом, при хронических воспалительных заболеваниях мочевого пузыря и при опухолевом поражении прослеживаются общие факторы, влияющие на патогенез заболеваний слизистой оболочки мочевого пузыря – возраст пациентов, обусловливающий гормональные нарушения, наличие сопутствующей патологии, влияющей на иммунитет и состояние микроциркуляторного русла.

Кросс - поляризационная оптическая когерентная томография в диагностике заболеваний мочевого пузыря Экспериментальный этап изучения возможностей кросс – поляризационной оптической когерентной томографии в исследовании мочевого пузыря Основной признак неоплазии, который регистрируется на традиционном ОКТ изображении, это нарушение контраста системы уротелий – соединительная ткань. Однако в некоторых случаях традиционные ОКТ изображения доброкачественных зон распознаются как ложноположительные злокачественные изображения, что снижает специфичность метода. Известно, что при развитии раковой опухоли происходят изменения в структуре белков внеклеточного матрикса слизистой оболочки мочевого пузыря, что, несомненно, влияет на оптические (в большей мере поляризационные) свойства ткани. Нами было сделано предположение, что новая модификация ОКТ – кросс-поляризационная ОКТ (КП ОКТ) может стать высоко эффективным методом диагностики изменений слизистой оболочки мочевого пузыря.

Первые исследования выполняли на 12 мочевых пузырях после его экстирпации (ex vivo) и при трансвезикальных операциях/резекциях мочевого пузыря (n-30) путем сопоставления КП ОКТ – изображений (n-252) и гистологических препаратов (n-84), окрашенных по ван-Гизон и пикросуриусом - красным (ПСК), дифференцирующих волокна соединительной и мышечной ткани (рисунок 1в). Выполнен анализ соотношения размеров структур в слизистой оболочке мочевого пузыря, на КП ОКТ изображениях и гистологических препаратах (рисунок 1).

Рисунок 1-Послеоперационный препарат стенки мочевого пузыря а - КП ОКТ исследование визуально неизмененного участка, (б) пример вшивания для маркировки хирургической нити «Safil» диаметром 150 мкм (нить прозрачна для КПОКТ зондирующего излучения); гистологический препарат, окраска ПСК в поляризационном свете (в), размер кадра – 1.7х1 мм. В центре - канал нити. (г) хронический цистит с клеточной инфильтрацией стромы - КП ОКТ изображение в прямой (снизу) и в ортогональной поляризации (сверху).

Установлено, что наличие сигнала в ортогональной поляризации при КП ОКТ исследовании коррелирует с уровнем организованного и хорошо структурированного коллагена I типа, который обладает выраженным свойством деполяризации и двулучепреломления. Это позволяет считать метод КП ОКТ прижизненным методом оценки состояния коллагена в биотканях.

Выявлено, что уровень сигнала в ортогональной поляризации при КП ОКТ исследовании коррелирует с яркостью свечения коллагена I типа, окрашенного ПСК при его оценке в поляризационной микроскопии. При этом коллаген III типа дает слабый сигнал в ортогональную поляризацию, что связано с его низкой способностью к деполяризации. Была выполнена неповреждающая поляризационным характеристикам в слизистой оболочке мочевого пузыря. В результате получены типы КП ОКТ изображений, отражающих основные патологические процессы мочевого пузыря. На рисунке 2 приведено изображение КП ОКТ и гистологических препаратов стенки мочевого пузыря в дифференцируются три оптических слоя - верхний слой (первый) со средним а - КП ОКТ изображение в прямой (нижнее) и ортогональной (верхнее) поляризации (У уротелий, П – собственная пластинка слизистой оболочки и подслизистый слой, М мышечный слой. Сосуды обозначены стрелкой. С – подэпителиальные соединительнотканные структуры); б - гистологический препарат, окраска гематоксилин и эозин, х100, в – гистологический препарат, окраска пикросириусом - красным в поляризованном свете, х 100.

а - «доброкачественный» тип (пример хронического цистита); б – «подозрительный» тип (пример инвертированной папилломы - участок, покрытый переходным эпителием с акантозом и очаговой дисплазией 2 ст.); в – «злокачественный» тип (пример уротелиальной опухоли без мышечно-инвазивного роста).

уровнем сигнала зондирующего излучения, соответствующий уротелию;

соединительнотканным структурам (собственной пластинке слизистой оболочки и подслизистому слоям) и нижний слой со средним уровнем интенсивности сигнала, соответствующий наблюдаемой части мышечного слоя; граница между контрастными верхним и вторым слоем непрерывная;

верхний слой равномерной толщины; второй (подуротелиальный) слой имеет продольную/(горизонтальную) упорядоченность соединительнотканных структур; содержит включения низкой интенсивности сигнала (кровеносные сосуды); глубина изображения на весь кадр. В ортогональной поляризации сигнал средней интенсивности от коллагеновых волокон, находящихся в собственной пластинке и подслизистом слоях. Отчетливо определяется продольная упорядоченность структур. Верхний слой (уротелиальный) не имеет видимого ОКТ сигнала, поскольку переходный эпителий не поляризует зондирующее излучение. При окрашивании ПСК коллагеновые волокна в высокоорганизованные волокна I типа (рисунок 2 в). Выявлено, что всё множество получаемых КП ОКТ изображений можно отнести к одному из (преимущественно воспалительные процессы слизистой оболочки без предраковой перестройки эпителия - гиперплазии, дисплазии, метаплазии), злокачественные (уротелиальная карцинома) и подозрительные на новообразование состояния мочевого пузыря (рисунок 3). Сформулированы признаки, характеризующие типы КП ОКТ изображений.

Признаки «доброкачественного» типа КП ОКТ изображений: в прямой поляризации слоистая организация ОКТ изображений с продольной (горизонтальной) упорядоченностью подуротелиальных структур и контрастными слоями, где интенсивность сигнала верхнего слоя меньше, чем нижележащего (второго). В ортогональной поляризации наличие равномерного сигнала без очагов ослабления, который может иметь структуру контрастных тканевых слоев и продольную (горизонтальную) упорядоченность.

Признаки «злокачественного» типа КП ОКТ изображений: В прямой поляризации отсутствие (или слабое проявление) слоистой организации ОКТ изображений без горизонтальной упорядоченности подуротелиальных структур. Если слои прослеживаются, то интенсивность сигнала верхнего слоя приближается к интенсивности сигнала второго слоя; сигнал при этом неравномерный. В ортогональной поляризации сигнал отсутствует, если присутствует, то слабый с очаговым исчезновением; возможна вертикальная ориентация участков с сигналом.

Признаки «подозрительного» типа КП ОКТ изображений содержат злокачественного) в разной их комбинации. В прямой поляризации тканевые слои присутствуют, чаще дифференцируются с трудом; четкость границы верхнего и нижележащего (второго) слоев снижена, граница неконтрастная, может быть прерывистой; толщина и интенсивность сигнала верхнего слоя неравномерная; продольная упорядоченность подуротелиальных структур чаще отсутствует, как и включения низкой интенсивности сигнала; глубина изображения на весь кадр. В ортогональной поляризации сигнал на изображении присутствует, но неравномерный, с очаговым исчезновением.

Исследования позволяют утверждать, что наполнение мочевого пузыря, а также степень прижатия зонда к исследуемой области не оказывают исследуемой зоны, в отличие от УЗИ, фотодинамической диагностики и компьютерной томографии. В работе рассмотрены наиболее часто встречающиеся патологические процессы в мочевом пузыре.

В результате, впервые в урологической практике применен метод визуализирующей диагностики - КП ОКТ, который позволил решить задачу по выявлению раннего рака и предопухолевых состояний мочевого пузыря.

Выработанные нами критерии дают возможность точно определить характер КП ОКТ - изменений в прямой и ортогональной поляризации при дисплазии уротелия и раке in situ в плоских подозрительных зонах мочевого пузыря. КП ОКТ за счет оценки состояния коллагена может стать верифицирующим методом для диагностики неэкзофитных подозрительных зон в мочевом пузыре, которые не могут быть идентифицированы при помощи традиционной ОКТ и цистоскопии.

Сравнительный анализ возможностей КП ОКТ и ОКТ в диагностике Доказано, что КП ОКТ в отличие от традиционной ОКT способна разрешить рядом проблем, которые включают дифференциальную диагностику рубца/рака;

рака/язвы; плоскоклеточной метаплазии/метаплазии с кератинизацией (лейкоплакии), простой гиперплазии/гиперплазии с дисплазией II-III. При сравнительной оценке диагностической эффективности кросс-поляризационной и традиционной ОКТ по выявлению раннего рака мочевого пузыря методом «слепого» статистического исследования установлено, что КП ОКТ имеет высокие общие диагностические показатели в определении раннего рака:

чувствительность метода 93,7%; специфичность 84%; диагностическая точность 85,3%. КП ОКТ имеет достоверно более высокие диагностические показатели в определении ранней малигнизации (р 0.01), чем традиционная ОКТ. Таким образом, метод КП ОКТ, обладающий пространственным разрешением порядка 10-20 мкм, способен обнаруживать патологические процессы различной природы, изменяющие оптические свойства в стенке мочевого пузыря. На сегодняшний день это единственный метод прижизненной диагностики состояния коллагена в слизистой оболочке мочевого пузыря.

Вышеизложенное позволяет считать метод КП ОКТ универсальным для диагностики различных заболеваний нижних мочевых путей.

Для исключения элементов субъективности в возможностях метода КП ОКТ верифицировать различные состояния слизистой оболочки мочевого пузыря в качестве дополнительного инструмента оценки КП ОКТ изображений был применен численный анализ. Вычислялся контраст между эпителием и соединительнотканной стромой в прямой поляризации или интенсивность сигнала (ИС) от стромы в ортогональном изображении с помощью программы Image J. Установлены значения низкой, средней и высокой интенсивности сигнала в дБ для прямой и ортогональной поляризаций. Выявлено, что интенсивность сигнала от подслизистого слоя в ортогональном изображении в диапазоне 2,5-3,0 дБ является диагностической для выявления неоплазии -