На правах рукописи
ШАСКОЛЬСКИЙ Борис Леонидович
КОМПОЗИТНЫЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ С
ЧАСТИЦАМИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ, ВКЛЮЧЁННЫХ В
МАТРИЦУ КРИОГЕЛЯ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА.
03.00.23 – биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Москва – 2009
Работа выполнена в Лаборатории криохимии (био)полимеров Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН
Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Лозинский Владимир Иосифович
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович, кандидат технических наук, доцент Ефременко Елена Николаевна
Ведущая организация Центр “Биоинженерия” РАН
Защита состоится “20” октября 2009 г. в 10 часов 30 минут на заседании объединённого диссертационного совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д. И. Менделеева (125047 г. Москва, Миусская пл., д. 9) в аудитории 443 (конференц зал)
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.
Автореферат диссертации разослан сентября 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204. кандидат технических наук Шакир И.В
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Одним из наиболее эффективных подходов к стабилизации ферментов является их иммобилизация с использованием нерастворимых носителей. Кроме того, такие системы обладают возможностью технически несложного отделения от реагентов, что позволяет применять их многократно и получать незагрязнённый ферментом продукт.
В качестве носителей для иммобилизации ферментов широко используют как органические (природные и синтетические) полимеры, так и неорганические материалы. К носителям предъявляются определённые требования: они должны быть нерастворимы в реакционной среде, обладать химической, биологической стойкостью, механической прочностью, не вызывать неспецифической адсорбции и сильных конформационных изменений молекулы белка, легко гранулироваться и активироваться.
Перспективными носителями для иммобилизованных ферментов являются криогели поливинилового спирта – макропористые вязкоупругие полимерные гелевые материалы, получаемые в результате криогенной обработки, то есть после замораживания - выдерживания в замороженном состоянии – оттаивания водных растворов данного полимера. Полимерными криогелями называются гелевые материалы, сформированные в неглубоко замороженных растворах полимерных или мономерных предшественников. Неглубоко (умеренно) замороженными считаются системы при температурах не ниже, чем несколько десятков градусов от точки замерзания чистого растворителя. Подобные системы, как правило, являются двухфазными, они содержат поликристаллы твердой фазы, которые выполняют роль порогенов, и небольшой объем остающегося еще жидким раствора – так называемую незамерзшую жидкую микрофазу, где концентрируются растворенные вещества и происходит формирование криогелевой матрицы. Образующиеся криогели обычно имеют макропористую (от 0,1 до 10 мкм) или сверхмакропористую структуры (от 10 до 1000 мкм) с взаимосвязанными порами, что придает таким материалам уникальный набор физико-химических свойств, а также позволяет использовать их для решения ряда биомедицинских и биотехнологических задач.
Наиболее изученными представителями криогелей с макропористой структурой являются криогели поливинилового спирта (КГПВС). Поливиниловый спирт (ПВС) доступен, является продуктом крупнотоннажного синтеза, каждая его марка стандартизована. Благодаря высокой прочности, выраженной пористости, биосовместимости и стабильности в биологических средах КГПВС нашли широкое применение в различных областях биотехнологии. В частности, криогели ПВС были использованы в качестве носителей для ковалентного присоединения белков и ферментов при получении макропористых иммуносорбентов и ряда иммобилизованных биокатализаторов, предназначенных для ферментолиза очень высокомолекулярных субстратов или для работы в маловодных средах. В этом случае емкость криогеля ПВС как носителя, то есть содержание фермента в расчете на единицу массы или объема, составляет порядка 1-10 мг/г(мл), что характерно для крупнопористых матриц, существенная часть объёма которых приходится на поры, а количество реакционноспособных группировок полимера, расположенных в стенках этих макропор, относительно невелико. В этой связи представляют интерес иммобилизованные системы, в которых биокаталитическое действующее начало (в рассматриваемом случае – препарат фермента) включено в матрицу макропористого криогеля ПВС в виде частиц дисперсного наполнителя, распределенного по всему объёму носителя, что позволило бы значительно повысить содержание фермента в соответствующем иммобилизованном биокатализаторе. При этом важным условием является сохранение хороших физико-механических свойств композитного геля, несмотря на включение в него механически непрочного ферментного наполнителя и отсутствие препятствий в технически несложной методике получения гранулированных гелевых препаратов на основе водных растворов ПВС.
Целью работы являлось изучение возможности получения композитных биокатализаторов с матрицей из криогеля поливинилового спирта и включённым в неё биокатализатором в виде частиц мелкодисперсного наполнителя. В связи с заявленной целью решались следующие задачи:
1. Исследование физико-химических свойств криогеля поливинилового спирта (морфологических, теплофизических и физико-механических) при разных условиях получения.
2. Изучение разных вариантов формирования дисперсных ферментосодержащих наполнителей, подходящих для включения в матрицу криогеля ПВС. Оценка каталитических свойств наполнителей.
3. Изучение физико-механических свойств и ферментативной активности композитных биокатализаторов.
Научная новизна и практическая значимость полученных результатов. В диссертационной работе показана взаимосвязь между концентрацией ПСВ в растворе и морфологией получившегося в результате криогенной обработки криогеля поливинилового спирта. Впервые показана возможность получения композитных биокатализаторов, состоящих из мелкодисперсных частиц ферментативноактивного наполнителя, включённых в матрицу криогеля поливинилового спирта.
Показано, что включениё наполнителя в матрицу КГПВС не приводит к ухудшению физико-механических характеристик криогеля поливинилового спирта.
Апробация работы. Основные результаты диссертации изложены в 5 печатных работах, в том числе 2 статьях в научных журналах, 3 – сборниках статей и материалах конференций. Работа была награждена дипломом за лучшее стендовое сообщение на VII научной конференции молодых учёных, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета. “Материалы и технологии XXI века”.
Личный вклад автора в работах, выполненных в соавторстве и включённых в диссертацию, состоял в проведение экспериментальных исследований, обработке, интерпретации и обобщении полученных результатов.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 136 страницах печатного текста, содержит 17 рисунков, 9 таблиц и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (213 наименований) Работа выполнена в лаборатории криохимии биополимеров ИНЭОС РАН и явилась продолжением и частью исследований, направленных на создание эффективных носителей биотехнологического назначения в рамках проектов по грантам РФФИ 05-04-08018_офи_а, РФФИ 07-04-12132_офи_а и РФФИ 07-03-96682-РА_а.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Некоторые физико-химические свойства криогелей поливинилового спирта, используемых в качестве носителей для иммобилизации ферментов.
С целью выяснения характера изменений свойств криогеля ПВС при разных условиях получения и для обеспечения возможности выбора условий, приводящих к формирования матриц данного типа с наиболее подходящими характеристиками для последующего использования в качестве носителя композитного биокатализатора, были проведены исследования влияния концентрации ПВС на свойства криогелей, образующихся в результате криотропного гелеобразования. Было показано, что с повышением концентрации гелеобразующего полимера в исходном растворе возрастали жесткость и теплостойкость получающихся криогелей (коэффициенты корреляции параметров условно-мгновенного модуля сдвига (G0) и температуры плавления геля (Tf) в диапазоне концентраций полимера 80-120 г/л оказались равными 0.99, т.е. взаимосвязь жесткости и теплостойкости таких КГПВС была очень тесной). В частности повышение начальной концентрации ПВС с 80 до 120 г/л в подвергаемом криогенной обработке растворе полимера приводило к возрастанию сдвигового модуля соответствующих криогелей от 2.6 до 10 кПа, а температура плавления КГВПС повышалась на 5.1оС (таблица 1).
Характерной особенностью строения криогелей ПВС является наличие протяженных пор со средним сечением 0.18-0.26 мкм. Следствием того, что макропоры формируются на месте расплавленных кристаллов порообразователя (льда), взаимно соприкасающихся и ограничивающих размер друг друга, является взаимосвязанность пор между собой, а также примерно одинаковый размер пор в получаемом геля. Вышеперечисленные особенности морфологии криогеля ПВС приводят к тому, что полученная таким образом матрица не создаёт дополнительных диффузионных затруднений для растворимых соединений. Исследование особенностей структуры КГПВС с помощью световой микроскопии выявило (таблица 2) некоторые различия в морфологии криогелей, сформированных из растворов с разной концентрацией полимера.
Таблица 1. Физико-механические свойства КГПВС, сформированных*) из растворов с различной концентрацией поливинилового спирта.
*) Температура замораживания-выдерживания: –20С, время выдерживания в замороженном состоянии: 24 ч, скорость оттаивания: 0.3С/мин.
*) Математическая обработка и анализ изображений выполнены И.И. Курочкиным (Институт системного анализа РАН) и д.х.н. И.Н. Курочкиным (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет).
При этом наблюдалась тенденция к утолщению элементов гелевой фазы при повышении концентрации ПВС в исходном растворе, подвергаемом криообработке. Кроме того, нами было обнаружено, что с повышением содержания полимера в системе имеют место изменения общей морфологии препаратов, главным образом, в отношении регулярности их пористой структуры (рис. 1).
Таким образом, проведённые исследования позволяют говорить о наличии взаимосвязи между структурой криогеля ПВС и его физико-механическими свойствами при изменении концентрации ПВС. Применение такого подхода, как повыа Б в Рисунок 1. Микрофотографии тонких срезов криогелей ПВС, полученных из раствора с концентрацией полимера 80 г/л – а), 100 г/л – б), 120 г/л – в).
шение концентрации исходного полимера, позволяет относительно просто улучшить механические характеристики получаемого криогеля, что важно для успешного использования иммобилизованных биокатализаторов с матрицей из криогеля ПВС.
Ферментативно-активные наполнители Для изучения разных вариантов дисперсных ферменто-содержащих наполнителей, подходящих для включения в матрицу криогеля ПВС, и оценки биокаталиических свойств наполнителей были получены наполнители трёх типов.
Первый тип наполнителей – препараты фермента, сшитого в растворе совместно с полимером, обычно синтезируют при добавлении буфункционального сшивающего агента к совместному раствору фермента и полимера, содержащего необходимые химические группировки.
Второй тип наполнителей – это поперечно-сшитые ферментные агрегаты (ПСФА). Такие препараты получают при воздействии на раствор фермента бифункциональных сшивающих агентов и осадителей, в качестве которых обычно применяются неорганические соли, органические растворители или растворы полимеров.
Третий тип наполнителей представляет собой какой-либо мелкодисперсный носитель с пришитым ферментом; далее частицы подобного иммобилизованного препарата могут быть включены в матрицу криогеля ПВС.
В качестве наполнителя первого типа в нашей работе были получены и использованы сшитые глутаровым альдегидом (ГА) гели трипсина с хитозаном. После определения критической концентрации гелеобразования для соответствующей системы «хитозан – глутаровый альдегид» (таблица 3) были получены ферментосодержащие дисперсные препараты.
Таблица 3. Зависимость времени образования гелевого препарата хитозана от концентрации глутарового альдегида в реакционной смеси.
Концентрация ГА в Концентрация хитоза- Время образования При этом было найдено, что активность трипсина, используемого нами в качестве модельного фермента, сохраняется в тем большей степени, чем выше концентрация хитозана в реакционной смеси (таблица 4). Этот результат объясняется тем, что при добавлении в систему хитозана и сохранении концентраций трипсина и глутарового альдегида (неблагоприятно влияющего на активность ферментов) возрастает общая концентрация аминогрупп, а доля аминогрупп, приходящихся на фермент, уменьшается пропорционально повышению содержания хитозана в смеси.
Второй тип наполнителя это поперечно-сшитые ферментные агрегаты (ПСФА). Было исследовано влияние режимов сшивки и осаждения трипсина на выход ПСФА и их ферментативную активность. Было найдено, что если первоначальное воздействие ГА на раствор трипсина длилось 5 минут и более, то получить поперечно-сшитые ферментные агрегаты не удавалось. Такой результат можно объяснить тем, что ГА успевал прореагировать с большинством доступных аминогрупп белка в растворе, в результате чего образование межмолекулярных связей внутри частиц коагулята, осажденного под действием ацетона или изопропанола, оказывалось невозможным. При первоначальном осаждении фермента изопропанолом или ацетоном, а так же при одновременном прибавлении к водному раствору фермента раствора ГА в осадителе, выход ПСФА был тем больше, чем выше была концентрация ГА в системе. Поэтому были выбраны условия, обеспечивающие количественный выход ПСФА – прибавление к раствору фермента 0,4 М раствора ГА в ацетоне или изопропаноле с последующей инкубацией реакционной системы на ледяной бане в течение 4 ч с перемешиванием.
Таблица 4. Ферментативная активность трипсина Концентрация Концентрация Концентрация Активность ПСФА, оцененная по кинетике гидролиза N--бензоил-Lаргинин-4-нитроанилида (БАНА), не зависела от типа осадителя и была примерно одинаковой у препаратов, полученных с использованием ацетона и изопропанола.
Результаты, полученные при скоростях прибавления осадителя от 13,3 мл/с до 0, мл/с (в пересчёте на исходный объёма раствора фермента 4 мл) и температурах осадителя -10°С, или 0°С, или +22°С, приведены в таблице 5.
Выход ПСФА достигал количественного уровня при скорости разбавления от 13 до 0,4 мл/с. Если же добавление осадителя происходило ещё медленнее, то образования ПСФА не наблюдалось. Это объясняется тем, что после взаимодействия ГА с большинством аминогрупп растворимого фермента не остаётся аминогрупп, с которыми может провзаимодействовать свободная альдегидная группа глутарового альдегида, связанная одним концом молекулы с белком. Описанный выше феномен подобен близкому к нулю выходу, который имел место при таком методе получения ПСФА, когда после длительной инкубации раствора фермента с ГА к системе добавляли осадитель.
от скорости разбавления и температуры осадителя.
Температура Время прибавле- Скорость прибавления Средняя активность осадителя ния осадителя осадителя к раствору ПСФА (ед.акт. на 1 мг Активность ПСФА максимальна при наибольшей скорости добавления осадителя с температурой 0°С. Температура 0°С обеспечивала наиболее мягкое протекание реакции, и, как следствие этого, более высокое сохранение ферментативной активности по сравнению с другими температурами.
Так как ферментативная активность трипсина при образовании ПСФА заметно падала, и, учитывая обнаруженное “защитное” влияние добавок хитозана при ковалентной иммобилизации ферментов, данный полиаминосахарид был также дополнительно введен в тот раствор фермента, из которого затем получали комплексные ПСФА на основе трипсина с добавками хитозана. Иными словами, фермент соосаждался изопропанолом совместно с хитозаном, а присутствующий в системе ГА химически сшивал такой двухкомпонентный коагулят. Данные рис. 2 показывают, что как и в случае формирования сшитых комплексных гелей трипсин/хитозан, увеличение количества добавленного в исходный раствор полиаминосахарида в результате приводит к более высокой ферментативной активности получающихся препаратов трипсина, в данном случае – комплексных ПСФА. Вместе с тем вполне понятно, что нецелесообразно существенно повышать концентрацию хитозана в таких препаратах, поскольку это снижает содержание в них действующего каталитического начала, собственно фермента. Поэтому при последующем включении такого наполнителя в матрицу криогеля ПВС для получения композитного биокатализатора нами был использован комплексный препарат ПСФА, приготовленный при концентрации хитозана 12,8 мг/г в совместном растворе с трипсином.
Невысокий уровень сохранения ферментативной активности при получении трипсиновых ПСФА, вероятно, объясняется взаимодействием ГА с активным центром трипсина. Подобное действие глутарового альдегида при получении ПСФА известно из литературы но, поскольку наша задача состояла не в получение конкретного иммобилизованного биоктализатора, а в разработке подходов, позволяющих сформировать удобные в применении композитные иммобилизованные биокатализаторы, обладающие высокой ёмкостью по биокаталитическому началу, то дальнейшая оптимизация условий получения иммобилизованного трипсина была признана нецелесообразной.
Третий тип нерастворимых препаратов трипсина, использовавшихся в качестве дисперсных наполнителей при получении композитных биокатализаторов, это – фермент, химически пришитый к мелким полимерным частицам. Для формирования такого наполнителя сначала были получены ковалентно-сшитые гели ПВС (таблица 6) при взаимодействии водных растворов ПВС и ГА в сильнокислой среде. Наиболее удобными в работе оказались образцы, при получении которых отношение количества мономерных звеньев ПВС к количеству молекул ГА составляло 1,32; это соотношение использовали в дальнейшей работе. После введения в сшитый гель ПВС дополнительных альдегидных группировок и последующего присоединения фермента были получены препараты с ёмкостью носителя 25,2 мг белка на 1 г влажного веса препарата; а его ферментативная активность была 0, ед. акт./мг.
Таблица 6. Концентрации ГА и ПВС в реакционной смеси и мольные соотношения звеньев ПВС и ГА при получении сшитых гелей ПВС.
Концентрация ПВС Концентрация Мольное отношение Результат взаимов реакционной сме- ГА в реакцион- количества моно- действия ГА и ПВС Композитные биокатализаторы Для формирования композитных биокатализаторов применялась однотипная методика: соответствующий препарат трипсина измельчали до частиц размером 5мкм, суспендировали в растворе ПВС и затем из этой суспензии на установке для получения замороженных гранул формировали композитный биокатализатор в виде частиц, близких по форме к сферическим. В работе были получены гранулы диаметром 0,7-1,5 мм (рис. 3).
Рисунок 3. Микрофотографии гранул криогеля поливинилового спирта:
а) ненаполненных и б) содержащих включённые частицы измельчённых Пористая морфология полимерного криогеля обеспечивает диффузионнонезатрудненный транспорт субстратов и продуктов биокаталитического процесса.
Подтверждением этого служат приведённые на рис. 4 кривые изменения оптического поглощения раствора пара-нитроанилина, выделяющегося при гидролизе хромогенного субстрата БАНА эквивалентными количествами трипсина, входящего в состав ПСФА и композитного биокатализатора, состоящего из ПСФА, включённых в макропористую матрицу криогеля поливинилового спирта. Видно, что несмотря на наличие некоторого индукционного периода на начальных участках соответствующих кинетических кривых, связанного с необходимостью начальной диффузии субстрата через поры геля к каталитически-активным частицам, прямолинейные участки кривых имели практически одинаковый наклон, что свидетельствует об отсутствии препятствий со стороны матрицы криогеля ПВС для массопереноса субстрата и продуктов реакции.
Для выяснения вопроса о том не ухудшаются ли физико-механические свойства композитной системы “криогель ПВС – наполнитель” по сравнению с контрольным криогелем ПВС был приготовлен ряд препаратов с включением частиц наименее жёстких из использованных нами наполнителей – ПСФА на основе трипсина и ПСФА с хитозаном. Для этих композитов затем измерили величину условно-мгновенного сдвигового модуля (G0 – характеризует упругие свойства материала) и сдвигового модуля за 30 мин действия нагрузки (G30 – характеризует пластические свойства испытуемого объекта). Полученные результаты суммированы в таблице 7.
Анализ данных этой таблицы показывает, что при включении подобных наполнителей в матрицу криогеля ПВС физико-механические свойства сформированных таким образом композитов не только не ухудшались, а имело место даже заметное повышение жесткости соответствующих препаратов. При этом, если в случае ненаполненных (контрольных) криогелей увеличение концентрации ПВС в исходном растворе приводило к систематическому повышению значений G0 и G30, то для композитных криогелей абсолютная величина упрочняющего эффекта еще зависела и от концентрации наполнителя, и от его типа.
«