На правах рукописи

СУПРУН ОЛЬГА ВАСИЛЬЕВНА

Полимерные комплексы сорбиновой кислоты и их

антифунгальное действие

Специальность: 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва – 2006 www.sp-department.ru

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете имени Д.И.Менделеева

Научный руководитель доктор химических наук, профессор Штильман М.И.

доктор химических наук,

Официальные оппоненты профессор Ямсков И.А.

доктор химических наук, профессор Коршак Ю.В.

Московская государственная

Ведущая организация академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова 2006 г. в 1400 часов на заседании

Защита состоится «01» ноября Диссертационного совета Д 212.204.01 в Российском химикотехнологическом университете им. Д.И.Менделеева (125047 Москва, Миусская площадь, д.9.) в ауд. 443.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И.Менделеева Автореферат разослан «29» сентября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.204.01, доцент, кандидат технических наук Л.Ф.Клабукова www.sp-department.ru 1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Создание биологически активных систем, обладающих повышенной эффективностью, имеет большое значение для разработки новых типов препаратов, предназначенных для применения в медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве, пищевой и косметической промышленности.

Одним из направлений разработки таких систем, привлекающих в последнее время широкое внимание, является использование биологически активных веществ в виде форм с контролируемым выделением этих веществ. В большинстве случаев такие формы содержат макромолекулярные компоненты, связанные с выделяющимся активным веществом лабильной (чаще всего за счет гидролиза) связью.

В частности, для таких препаратов, обладающих пролонгированным (контролируемым) действием, важную роль играет прочность связи полимерного носителя и выделяющегося активного вещества. В большинстве случаев связывание компонентов системы реализуется за счет образования между ними гидролизуемой ковалентной, реже ионной, связями.

В то же время, для препаратов c ингибирующей и биоцидной активностью, когда требуется обеспечить высокую концентрацию активного вещества уже в начальные периоды действия, эффективность препарата может обеспечить образование более слабой связи полимерного носителя и иммобилизованного вещества, например, водородной связи.

Несмотря на то, что получение таких полимерных комплексов осуществляется значительно проще, чем систем с ковалентной связью, разработка эффективных препаратов на их основе сдерживается недостаточной изученностью взаимосвязи их строения и активности.

В связи с этим, большое значение имеют выбор технологически доступных методов получения таких систем и оптимизация их строения в соответствии с требуемыми свойствами.

В том числе это относится к препаратам, обладающим фунгицидным и фунгистатическим действием, находящим применение в различных областях.

Цели и задачи исследования. Целью работы является получение новых полимерных производных сорбиновой кислоты (полимерных комплексов с эпоксидсодержащего поли-N-винилпирролидона), обладающих антифунгальной активностью по отношению к микроскопическим грибам, и исследование влияния их строения на свойства и активность. Выбор данного активного вещества в том числе связан с его весьма низкой побочной токсичностью для человека и широкими возможностями практического применения.

Научная новизна.

• Получены полимерные комплексы сорбиновой кислоты и поли-Nвинилпирролидона широкого ряда молекулярных масс (от 2 до 360 тыс), исследованы их свойства и показана высокая антифунгальная активность против различных типов микроскопических грибов.

установлено, что взаимодействие ее компонентов реализуется с участием водородной связи между водородом карбоксильной группы и кислородом карбонильной группы пирролидового кольца полимера, причем с использованием диализа, вискозиметрии и метода конкурентного комплексообразования показано, что устойчивость комплексов поли-Nвинилпирролидона и сорбиновой кислоты повышается с увеличением молекулярной массы полимера.

иммобилизованной на полимерном носителе сорбиновой кислоты (на примере Fusarium oxysporum f. radicis-cucumerinum N-10, Candida albicans TEI 101, Candida tropicais TEI 184, Aspergilus parasiticus 1130, Penicillium viridcatum CA 100) определяется прочностью ее связи с полимерным носителем, повышаясь с ее уменьшением, причем активность полимерных комплексов сорбиновой кислоты с поли-N-винилпирролидоном превышает активность самой кислоты, сорбата калия и ее полимерных эфиров.

Практическая значимость. Показано, что полученные системы могут найти применение в ряде пищевых технологий, в частности для создания грибоустойчивой бумажно-полимерной упаковки и оболочки пищевых продуктов.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международных конференциях Biomed 2002 (IXth International Symposium on Biomedical Science and Technology [19-22 Sept. 2002, Kemer-Antalya, Turkey], European Material Research Society. Fall Meeting [Warshaw, 15-19 September, 2003], «Биологически активные полимеры: Синтез, свойства и применение»

[Ташкент, 2003] и XIV, XV и XVI Международных конференциях молодых ученых [2002, 2003, 2004, Москва].

Публикации. Основные положения и результаты работы изложены в печатных работах, в том числе, 5 статьях в журналах и сборниках, 3 тезисах докладов и 4 депонированных рукописях.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 107 страницах, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы; содержит 10 таблиц, 18 рисунков, 155 библиографических ссылок.

Как известно, сорбиновая кислота (СК), являющаяся известным антифунгальным агентом, обладающим низкой токсичностью и широко используемым в пищевой промышленности, медицине, биотехнологии является наиболее активной в ряду низкомолекулярных карбоновых кислот, обладающих антифунгальной активностью.

В то же время, недостаточная растворимость СК и невысокая устойчивость самой кислоты и ее солей в жидких средах, их подверженность побочной биодеградации позволяют предположить, что эффективность сорбиновой кислоты может быть увеличена при ее использовании в виде «систем с контролируемым выделением активного вещества».

В данной работе в качестве таких систем были рассмотрены полимерные комплексы и полимерные эфиры СК, способные выделять свободную кислоту со скоростью, зависящей от строения системы и влияющей на уровень биологической активности.

2.1. Получение полимерных производных сорбиновой кислоты В качестве полимерного ностеля для получения полимерных комплексов в работе был использован поли-N-винилпирролидон (ПВП), который, как известно, образует комплексы с различными соединениями, что, в частности, определяет его широкое использование в качестве компонента кровезаменителей-дезинтоксикаторов и носителя различных лекарственных препаратов. В работе для получения комплексов были использованы полимеры N-винилпирролидона с различной молекулярной массой.

Для исследования и препаративного получения полимерных комплексов было использовано взаимодействие полимерного носителя и кислоты в среде этанола с последующим выделением образовавшегося комплекса осаждением в диэтиловый эфир. Полимерные комплексы могут быть получены и в водной среде.

Исследование влияния на состав полученных полимерных комплексов условий получения показало, что содержание СК в более высокомолекулярных комплексах было ниже (Рис.1). Можно предположить, что это явление связано с более затрудненным образованием комплексов в случае высокомолекулярных полимеров, что возможно объясняется меньшей доступностью их карбонильных групп при более крупном макромолекулярном клубке, особенно, как будет показано ниже, в условиях его компактизации при связывании годрофобных молекул кислоты.

Рис. 1. Влияние молекулярной массы поли-N-винилпирролидона на содержание сорбиновой кислоты в комплексах (Т = 70°С, соотношение 1:1 осново-моль/моль).

На рис. 2 приведена зависимость количества связанной кислоты от ее количества, введенного в систему.

Рис. 2. Влияние соотношения СК:ПВП на содержание сорбиновой кислоты в комплексах (Т = 70°С, М = 10103). 1- % масс., 2- % мольн.

Содержание сорбиновой кислоты в комплексах, полученных на основе полимеров с различной молекулярной массой (ПК-10, ПК-25, ПК-30, ПК-40, ПК-90, ПК-360, где цифра обозначает тысячи молекулярной массы) в различных исследованных образцах было от 2,5 до 12,0 масс.% (2,56 – 14,0 мольн.%).

Для сравнения свойств полимерных комплексов сорбиновой кислоты с другими ее полимерными производными, в которых кислота связана с полимерным носителем гидролизуемой ковалентной связью, в работе были взаимодействием кислоты с эпоксидированным полимером Nвинилпирролидоном в среде сухого диметилформамида при 100оС:

В этом случае были использованы образцы полимера с различной молекулярной массой (10, 40, 360103) и приблизительно одинаковым содержанием эпоксидных групп (7-11 молн.%) и содержанием звеньев со связанной кислотой (3,4-5,1 молн.%).

Содержание сорбиновой кислоты в ее иммобилизованных формах определяли по поглощению в УФ-области ( = 254 нм).

2.2. Строение и структура полимерных комплексов.

Для исследования строения комплексов был использован ИКспектральный анализ. Наличие на спектрах поглощения в области 2500- см-1, отсутствующего на спектре кислоты и на спектре полимера и соотвествующего колебанию водородной связи типа С=О···Н-О-, позволяет полагать, что образование комплекса протекает с участием гидроксила карбоксильной группы и карбонила кольца пирролидона:

При этом, для самой кислоты поглощение, соответствующее водородной связи, проявляется в области 2000-2200 см-1 и не наблюдается в случае комплекса, что подтверждает, что большинство молекул кислоты в системе (в рамках точности метода) находится в виде Н-комплекса с полимером.

Комплексообразование полимеров N-винилпирролидона с сорбиновой кислотой приводило к нарушению ее кристаллической структуры. На рентгенограммах систем на основе ПВП с различной молекулярной массой (2.6, 10, 40, 360103) и СК не наблюдаются рефлексы кристаллической решетки кислоты. Можно предположить, что аморфизация системы, наблюдаемая в этом случае, объясняется распределением отдельных молекул кислоты по полимерной цепи в процессе образования полимерного комплекса.

2.3. Свойства полимерных комплексов сорбиновой кислоты и Вероятно, на выделение активного вещества в случае полимерных комплексов влияет не только образование водородной связи между носителем и иммобилизованной СК, но также и уплотнение макромолекулярного клубка, наблюдаемое при связывании сорбиновой кислоты с полимером. Это было показано исследованием вискозиметрических свойств, светорассеяния комплексообразования.

Вязкость разбавленных растворов. Комплексообразование поли-Nвинилпирролидона с низкомолекулярными веществами приводит к изменению макромолекулярного клубка, что объясняется введением в макромолекулярную характеристической вязкости разбавленных растворов показало снижение последней в случае комплекса по сравнению со свободным полимером уже при введении в раствор 2 мол.% СК, что, вероятно, определяется повышением общей гидрофобности системы после связывания с поли-Nвинилпирролидоном кислоты, содержащей длинноцепной алифатический радикал.

Светорассеяние водных растворов. В работе факт компактизации макромолекулярного клубка поли-N-винилпирролидона при связывании с ним растворов полимерных комплексов. Эти исследования позволили определить уравнение Стокса-Эйнштейна.

Рис.3. Эффективный гидродинамический радиус ПВП и ПВП/СК комплексов как функция от молекулярной массы полимеров.

Как было показано (рис.3), введение СК в систему вызывает значительное понижение размеров макромолекулярных клубков полимера, в который введена связанная кислота.

Как видно, соотношение эффективных гидродинамических радиусов чистого поли-N-винилпирролидона и его комплексов с СК зависят от молекулярной массы полимеров. Причем степень компактизации при увеличении молекулярной массы повышается. При этом во всех случаях соотвествующих полимерных носителей.

Исследование конкурентного комплексообразования. Склонность СК к образованию комплекса с ПВП была оценена также методом конкурентного связывания. Этот метод основан на исследовании спектров флуоресценции двух систем – системы, содержащей ПВП и флуоресцентный краситель и системы, содержащей ПВП, флуоресцентный краситель и СК.

В качестве флуоресцентного зонда в работе была использована N-фенилнафтиламин-8-сульфокислота (1-анилинонафтил-8-сульфокислота) (АНСК), находящаяся в свободном состоянии в виде не флуоресцирующего димера:

и образующая флуоресцирующий комплекс состава 1 молекула АНСК на звено полимера за счет водородной связи между –SO3Н группой и кослородом карбонила пирролидонового кольца.

При наличии в системе СК - конкурента в связывании АНСК с полимером, уровень флуоресценции снижался.

Как было показано, интенсивность флуоресценции, с одной стороны, увеличивается с увеличением количества введенной АНСК, а с другой стороны, проявляется зависимость между интенсивностью флуоресценции и молекулярной массой используемого полимера. Наибольшая величина интенсивности флуоресценции наблюдается для ПВП с молекулярной массой 360103 и уменьшается с уменьшением молекулярной массы.

Зависимость между интенсивностью флуоресценции и молекулярной массой полимера для систем, содержащих СК и АНСК представлена на рис.4.

Интенсивность флуоресценции, отн. ед.

Равновесный диализ. Для исследования уровня связывания сорбиновой кислоты в заранее приготовленных комплексах с ПВП в работе был использован метод равновесного диализа через полупроницаемую мембрану (диализные мешки на основе целлюлозы).

При исследованиях были использованы предварительно диализованные через эти же мембраны образцы ПВП молекулярной массы 10 и 360103.

Содержание СК в исследованных при диализе комплексах соответствовало мольн.% звеньев, содержащих связанную СК. Количество выхода кислоты через диализную мембрану оценивали по поглощению при длине волны 254 нм.

Изменение интенсивности поглощения вне диализного мешка при помещении в него раствора комплекса сорбиновой кислоты и полимера с молекулярной массой 10 и 360 10-3 показано на рис. 5.

Рис.5. Зависимость количества выхода СК из водного раствора (1), из M=360х103 (3) через диализную мембрану от времени. Температура Как видно, в случае комплексов скорость выхода СК снижалась с увеличением молекулярной массы полимера, что указывает на большую устойчивость комплексов, образовавшихся на основе ПВП с большей молекулярной массой.

Таким образом, комплексы АНСК и ПВП образуются легче в случае более низкомолекулярных полимеров. Однако, с другой стороны, уже высокомолекулярных полимеров.

иммобилизация СК на полимерном носителе существенно изменяет свойства системы, что сказывается на скорости выделения активного вещества и отражается на биологической активности полимерных комплексов по сравнению с самой кислотой.

По-видимому, существенное влияние на выход кислоты оказывает и установленная выше степень компактизации макромолекулярного клубка.

2.4. Биологическая активность полимерных производных В работе были исследованы особенности биологической активности полимерных производных сорбиновой кислоты, связанных с полимерными носителями различными типами связи – водородной связью и ковалентной гидролизуемой (в данном случае - сложной эфирной).

Сравнительное исследование антифунгальной активности трех полимерных эфиров и трех полимерных комплексов, полученных на основе полимеров с молекулярной массой 10, 40 и 360 103. Сравнение активности полимерных эфиров и полимерных комплексов проводили на культуре Fusarium oxysporum f. radicis-cucumerinum N-10. Опыты проводили методом агаровых блочков в течение шести дней, при 27С, pH=6.4.

На рис. 6 показана сравнительная эффективность ингибирующего действия этих полимерных производных по окончании эксперимента.

Как видно, во-первых, во всех случаях антифунгальная активность для полимерных носителей с одинаковой молекулярной массой значительно выше в случае полимерных комплексов, и во-вторых, во всех случаях активность повышается с уменьшением молекулярной массы полимеров.

уменьшением молекулярной массы полимерного носителя при действии комплексов и на другие типы микроскопических грибов, например, относящихся к группам плесени (Aspergillus prasiticus и Penicillum viridicatum) и дрожжей (Candida tropicallis и Candida albicans) (Таблица 1).

Рис. 6. Степень ингибирования роста колонии культуры Fusarium oxysporum f.

radicis-cucumerinum N-10 (6 дней, 27С, pH=6.4) для различных полимерных производных сорбиновой кислоты.

Рис. 7. Зависимость степени ингибирования роста колонии культуры Fusarium oxysporum f. radicis-cucumerinum N-10 (6 дней, 27С, pH=6.4) для различных полимерных комплексов сорбиновой кислоты при различной ее концентрации в комплексах.

Минимальная ингибирующая концентрация сорбиновой кислоты (СК), сорбата калия (К-С) и полимерных комплексов (ПК) сорбиновой кислоты и поли-Nвинипирролидона различной молекулярной массы при действии на различные культуры.

Candida albicans TEI Candida tropicais TEI Aspergilus parasiticus Penicillium viridcatum CA Заметное различие в активности самой СК и ее комплексов было выявлено и в опытах по исследованию способности к росту колоний культур (Candida tropicalis TEI 184 и Aspergillus parasiticus 1130) после отмывки от среды, содержащей антифунгальный агент.

Как было показано, сама сорбиновая кислота и более высокомолекулярные комплексы оказывают фунгистатическое действие. С другой стороны, в случае комплекса с низкомолекулярным полимерным носителем при длительном культивировании в присутствии антифунгального агента наблюдается фунгициное действие вводимого антифунгального агента (полученные данные приведены в работе).

Таким образом, во всех исследованных случаях повышение активности систем с иммобилизованным антифунгальным агентом проявляется в большей иммобилизованным активным веществом, как это имеет место в случае перехода от полимерных эфиров к полимерным комплексам или при уменьшении молекулярной массы полимерного носителя.

Полученные полимерные комплексы СК представляют собой системы, хорошо растворимые в воде и большинстве органических растворителей и образуют при нанесении из раствора прозрачные гомогенные пленки, обладающие антифунгальной активностью.

Как было показано (опыты проводились в Проблемной лаборатории полимеров и Испытательном центре Московского государственного университета прикладной биотехнологии), комплексы ПВП и СК могут быть использованы в качестве антифунгальных добавок к полимерным латексам, используемым для покрытия сыров, и для пропитки бумажной упаковки продуктов, снижая их осемененность микроорганизмами.

сорбиновой кислоты и поли-N-винилпирролидона широкого ряда молекулярных масс (от 10 до 360 тыс), исследованы их свойства и показана микроскопических грибов. Взаимодействием эпоксидсодержащего поли-Nвинилпирролидона различной молекулярной массы и сорбиновой кислоты получен ряд ее водорастворимых полимерных эфиров.

2. Исследованием ИК-спектров системы «поли-N-винилпирролидон – сорбиновая кислота» установлено, что их взаимодействие реализуется с участием водородной связи между водородом карбоксильной группы и кислородом карбонильной группы пирролидового кольца полимера. Изучением рентгенограмм комплексов показано, что при этом нарушается кристаллическая система кислоты.

3. Определением вязкости разбавленных водных растворов комплексов и методом светорассеяния показано, что комплексование поли-Nwww.sp-department.ru винилпирролидона и сорбиновой кислоты приводит к уплотнению макромолекулярного клубка, проявляющемуся в большей мере для более высокомолекулярных полимеров.

исследованием особенностей получения комплексов установлено, что образование и разрушение комплексов происходят легче в случае более низкомолекулярных полимеров.

5. Показана высокая активность комплексов поли-N-винилпирролидона и сорбиновой кислоты по отношению к микроскопическим грибам различных групп. При этом антифунгальная активность полимерных производных сорбиновой кислоты повышается с уменьшением прочности ее связи с полимерным носителем, причем активность полимерных комплексов сорбиновой кислоты с поли-N-винилпирролидоном превышает активность самой кислоты, сорбата калия и полимерных эфиров сорбиновой кислоты.

6. Показано, что полученные полимерные комплексы, обладающие хорошей растворимостью в воде и в полярных органических растворителях и способные к образованию пленок, могут быть использованы для создания антифунгальных покрытий пищевых продуктов и пропитки бумагополимерных упаковочных материалов.

1. Штильман М.И., Супрун О.В., Tzatzarakis E., Лоттер М.И., Лебедева Т.Л., Харенко А.В., Tsatsakis A.M. Комплексы поли-N-винилпирролидона и сорбиновой кислоты. // Пластические массы, 2004, № 2, С.23-27.

2. Снежко А.Г., Федотова А.В., Борисова З.С., Филинская Ю.А., Штильман М.И., Супрун О.В. Использование полимерных комплексов сорбиновой кислоты для получения антимикробных покрытий пролонгированного действия из полимерных латексов. // Лакокрасочные материалы и их применение, 2006, № 10, С.25-32.

3. Супрун О.В., Садовский С.Н., Шашкова И.М., Штильман М.И.

Иммобилизация фунгицида сорбиновой кислоты на полимерных носителях.

// Успехи в химии и химической технологии, 2002, Т.16, №3(20), С.63.

4. Супрун О.В., Лоттер М.М., Штильман М.И. Исследование полимерных комплексов сорбиновой кислоты. // Успехи в химии и химической технологии, 2003, Т.17, №5, 118-125.

5. Супрун О.В., Ловягин Дм.А., Штильман М.И. Биологическая активность полимерных комплексов сорбиновой кислоты и поли-N-винилпирролидона.

// Успехи в химии и химической технологии, 2004, Т.18, №2 (42), С.79-82.

6. Исследование физико-химических свойств комплексов сорбиновой кислоты и поли-N-винилпирролидона / Штильман М.И., Супрун О.В., Лоттер М.М., Tzatzarakis Е., Tsatsakis A.M., Депонир.рукопись (ВИНИТИ), № 2069-В- от 28.11.03.

7. Исследование полимерных комплексов сорбиновой кислоты методом равновесного диализа / Штильман М.И., Супрун О.В., Лоттер М.М., Tzatzarakis Е., Tsatsakis A.M., Депонир.рукопись (ВИНИТИ) № 2070-В- от 28.11.03.

8. Фунгицидная активность сорбиновой кислоты и полимерных производных / Штильман М.И., Супрун О.В., Лоттер М.М., Tzatzarakis Е., Tsatsakis A.M.

Депонир.рукопись (ВИНИТИ) № 2071-В-2003 от 28.11.03.

9. Фунгицидная активность сорбиновой кислоты, ряда органических кислот и их солей / Штильман М.И., Супрун О.В., Лоттер М.М., Tzatzarakis Е., Tsatsakis A.M. Депонир.рукопись (ВИНИТИ) № 2072-В-2003 от 28.11.03.

10. Tsatsakis A.M., Manolis N.Tzatzarakis, Suprun O.V., Shtilman M.I. Polymeric derivatives of sorbic acid – water-soluble preparations for fungicide activity. // Biomed 2002 (IXth International Symposium on Biomedical Science and Technology [19-22 Sept. 2002, Kemer-Antalya, Turkey], 2002, P-48.

11. Супрун О.В., Лоттер М.М., Тзатзаракис Э., Тсатсакис А.М., Штильман М.И.

Полимерные комплексы сорбиновой кислоты. // Тезисы докл.

Международной конференции «Биологически активные полимеры: Синтез, свойства и применение» [Ташкент, 2003].- АН Респ.Узбекистан-2003, с.64.

12. Suprun O.V., Lotter M.M., Shtilman M.I., Tsatsakis A.M. Polymeric complexes of sorbic acid. // Тезисы докл. European Material Research Society. Fall Meeting [Warshaw, 15-19 September, 2003].- 2003, P.168.