На правах рукописи
РЕШЕТКА МИХАИЛ БОРИСОВИЧ
ПРОФИЛАКТИКА И ЛЕЧЕНИЕ МАСТИТА БЕЗ
ПРИМЕНЕНИЯ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ
СРЕДСТВ
06.02.03 – ветеринарная фармакология с
токсикологией
06.02.06 – ветеринарное акушерство и биотехника
репродукции животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук
Краснодар 2013
Работа выполнена на кафедре терапии и фармакологии факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»
Научные руководители: Заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор, член-корр. РАСХН Антипов Валерий Александрович доктор ветеринарных наук Коба Игорь Сергеевич доктор ветеринарных наук
Официальные оппоненты: Семененко Марина Петровна доктор ветеринарных наук, профессор Авдеенко Владимир Семенович
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет»
Защита диссертации состоится «04» июля 2013 года в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.07 при ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» (350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу:
350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.
Автореферат размещен на официальном сайте ФГБОУ ВПО «Кубанский ГАУ» http://www.kubsau.ru «30» мая 2013 г. и официальном сайте ВАК РФ – http://vak.ed.gov.ru.
Автореферат разослан «» июня 2013 года.
Ученый секретарь диссертационного совета Родин И.А.
1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Заболевания молочной железы у крупного рогатого скота представляют собой хозяйственно-экономическую проблему во всех странах с интенсивным молочным скотоводством. Поражения вымени очень распространены и причиняют животноводству большой ущерб. Они обуславливают огромные потери молока за счет снижения молочной продуктивности, ограничивают сроки хозяйственного использования коров, снижают качество молока и молочной продукции (Л.Д. Демидова, 1997; Л.К. Попов с соавт., 1999; А. Данкверт, Л. Зернаева, 2003). По мнению отечественных и зарубежных авторов наибольшее распространение мастит получил: во время запуска, в сухостойный период, а также после родов (В.М. Морев, А.П. Береснова, А.Р. Корягина, 1984; Г.В. Зверева, В.Н. Олескив, Д.Е. Капур, 1983;
Ю.П. Полянцев, 1985; А.Н. Савостин, 1988; В. Шевкопляс, Н. Филиппов, А. Смеянов, 2000; В.А. Париков с соавт., 2000; В.К. Понамарв, 2002).
Другая проблема, связанная с маститом – наличие ингибирующих веществ в молоке во время и после лечения больных животных.
Основная доля этих веществ приходится на антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны и гормоны, которые содержатся в комплексных противомаститных препаратах и широко применяются в ветеринарной практике. (А.И. Тузов, 2002).
В системе лечебно-профилактических мероприятий при мастите у коров важная роль отводится сухостойному периоду. Одним из эффективных приемов профилактики мастита является обработка вымени коров в начале сухостоя пролонгированными антимикробными препаратами. (С.И. Ширяев, 2010).
В нашей стране разработан арсенал новых, высокоэффективных противомаститных препаратов антимикробного и противовоспалительного действия (Л.Д. Демидова, 1997; A.A.Архипов, 2008; Е.А. Сидоркин, 2009 и др.), доступных к применению в условиях любых животноводческих ферм. Однако их эффективность все еще уступает зарубежным средствам. Особенно это относится к препаратам, предназначающимся для профилактики и терапии мастита в периодах запуска и сухостоя. Поэтому, разработка и введение в ветеринарную практику новых более эффективных и недорогих противомаститных препаратов является актуальной задачей ветеринарной науки.
Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований состояла в разработке нового эффективного средства для профилактики мастита у коров в период сухостоя и создание препарата для лечения коров больных маститом, не содержащего в своем составе химиотерапевтических средств.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Изучить степень распространения мастита у коров в 1.
некоторых хозяйствах Краснодарского края.
Изучить микробный фон коров, больных маститом.
2.
Разработать новые препараты для профилактики и лечения мастита в сухостое и изучить его фармако-токсикологические свойства.
Изучить их профилактическое и лечебное действие при маститах у коров.
Научная новизна. Определена степень распространения мастита у коров в хозяйствах Краснодарского края, установлен видовой состав микрофлоры, выделенный от больных маститом коров. Разработан новый препарат для профилактики мастита у коров в период сухостоя, дано его фармако-токсикологическое обоснование и оценка профилактической эффективности в сравнительном аспекте с другим аналогичным по действию препаратом. Разработан новый препарат для лечения мастита у коров без химиотерапевтических средств, дана его фармакотоксикологическая характеристика и оценка терапевтической эффективности при лечении маститов в сравнении с другими препаратами.
Практическая значимость. Установлена степень заболеваемости коров маститом в некоторых хозяйствах Краснодарского края. Проведены научные исследования по выяснению некоторых причин заболеваемости коров маститом, в частности в период сухостоя. Предложено новое средство для профилактики мастита у коров в период сухостоя и получена заявка на патент № 2012153019. Предложен новый препарат для лечения мастита у коров не содержащий в своем составе антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны. Получено решение о выдачи патента на изобретение по заявке №2012121970/15.
Апробация результатов собственных исследований. Результаты исследований и основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на заседаниях кафедры терапии и фармакологии ветеринарного факультета Кубанского государственного аграрного университета (2010-2013); международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной ветеринарии» посвященной 90-летию со дня образования Кубанского государственного аграрного университета и 65-летию ветеринарной науки Кубани (2011);
межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии и фармации» посвященной 90летию Кубанского государственного аграрного университета (2012);
международной научно-практической конференции «современные проблемы ветеринарного акушерства и биотехнологии воспроизведения животных» (2012); научной конференции профессорскопреподавательского состава факультета ветеринарной медицины Кубанского аграрного университета (2013).
Публикации материалов диссертации. По материалом диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 155 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, выводов и практических предложений, списка литературы и приложений. Список использованной литературы включает 211 источников, в том числе 26 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 9 рисунками.
Основные положения выносимые на защиту:
Распространение мастита в стадах коров и формы его проявления.
Материалы разработки препарата профмастит, определение его фармако-токсикологических свойств и оценка профилактической эффективности маститов у коров в период сухостоя.
Материалы разработки препарата сангвимаст, определение его фармако-токсикологических свойств и оценка терапевтической эффективности при лечении мастита у коров.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Работа выполнена в период с 2010 по 2013 год на кафедре терапии и фармакологии ветеринарного факультета Кубанского государственного аграрного университета совместно с лабораторией акушерства и гинекологии с/х животных Краснодарского научноисследовательского ветеринарного института, а также в хозяйствах Краснодарского края: Учхоз «Кубань», филиал Смоленский ООО «Предгорье Кавказа» Северского района и ЗАО АФ «Искра» Тимашевского района.Исследованию было подвергнуто: 3868 коров с продуктивностью 4,0-7,5 тысяч кг и более молока в год, исследовано 15427 проб молока на скрытую форму мастита, бактериологическому исследованию было подвергнуто 54 пробы от больных маститом коров, исследовано 39 проб крови и 338 лабораторных животных.
Исследования проведены в соответствии с рекомендацией «Диагностика, профилактика и лечение мастита у коров» (Краснодар, 1986), «Наставлением по диагностике терапии и профилактике мастита у коров» (М., 2000), «Методическими рекомендациями по диагностике, терапии и профилактики субклинического мастита у коров в сухостойный период» (Воронеж, 2005).
При клиническом исследовании коров определяли состояние вымени методом осмотра и пальпации, а также проводили пробное сдаивание секрета вымени.
При наружном осмотре обращали внимание на форму вымени, состояние волосяного покрова, симметричность четвертей, цвет кожи, величину сосков, состояние сфинктера соскового канала.
Пальпацией определяли местную температуру молочной железы, консистенцию, наличие болевой реакции, состояние надвыменных лимфатических узлов их величину, консистенцию и болезненность.
Пробным сдаиванием определяли тонус сфинктера соскового канала и его проходимости. Так же обращали внимание на внешний вид секрета, цвет, количество, однородность и наличие в нем сгустков и хлопьев.
Для выявления субклинического мастита учитывалась реакция секрета молочной железы с кенотестом на молочно-контрольной пластинке ПМК-2, а также постановкой пробы отстаивания по В.И. Мутовину (1974). Диагноз на субклинический мастит ставили при наличии положительной реакции секрета молочной железы с диагностическим реактивом при повторном исследовании через 48 ч, а также при замерах слоя сливок в пробе отстаивания. Также проводили подсчет соматических клеток в счетной камере с сеткой Горяева (по Н.М. Хилькевичу, 1973) и при помощи прибора «Соматос-мини».
Для определения видового состава микрофлоры, выделенной из вымени коров, нами было исследовано 54 пробы секрета вымени взятого от больных маститом коров. Взятие проб проводили по методике В.И. Слободяник, В.А. Париков, Н.Т. Климов и В.В. Подберезный (2009). Из взятых проб делали посевы на МПА, МПБ, МПА с 7,5% натрия хлорида, МПА с 5% дефибринированной крови барана, МПА с 1% глюкозой, среду Сабуро, среду Эндо, цветные среды Гисса. Для культивирования микроорганизмов чашки Петри с посевами помещали в термостат при +38°С.
Культуральные свойства определяли по характеру роста на питательных средах и по внешнему виду колоний микроорганизмов.
Учитывали форму колоний, цвет, размер, характер поверхности и прозрачность. При посевах на кровяной агар учитывали отсутствие или наличие зоны гемолиза.
Для определения вида бактерий использовали пластины биохимические дифференцирующие стафилококки и энтеробактерий научнопроизводственного объединения «Диагностические системы», г. Н.
Новгород, углеводные среды Гиса. Видовую принадлежность микроорганизмов устанавливали, руководясь «Определителем бактерий Берги»
(1980) и рекомендациями Н.Н. Михайлова (1983), В.М. Карташовой с соавт. (1988), а грибов - «Определителем патогенных, токсигенных и вредных для человека грибов» (1979) и также «Атласом грибов патогенных для сельскохозяйственных животных и птиц» (1953). Идентификацию проводили с учетом культуральных, морфологических и биохимических свойств бактерий по общепринятым методикам (Сидоров М.А. 1982).
Патогенность микроорганизмов устанавливали при внутрибрюшинном заражении белых мышей массой 18-20 г 1 млрд взвесью микробных тел в мл смытой с агаровой культуры в дозе 0,2-0,5мл (200млн микробных тел).
Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяли на среде АГВ луночным методом, а также методом наложения стандартных дисков с антибиотиками и методом кратных серийных разведений в МПБ.
Для лабораторных исследований брали кровь из подхвостовой вены до кормления животных. При гематологических исследованиях определяли количество лейкоцитов и эритроцитов в камере с сеткой Горяева, содержание гемоглобина – гемоглобинцианидным методом, подсчитывали СОЭ в аппарате Панченкова, вычисляли цветовой показатель, выводили лейкоформулу по В.Г. Мухину, характер лейкограммы (микроскопией мазков крови окрашенных по РомановскомуГимзе). Биохимические исследования заключались в определении в сыворотке крови белковых фракций (нефелометрически), общего белка (колориметрически), мочевины (цветной реакцией с тиосемикарбазидом и диацетилмонооксимом), неорганического фосфора (с ванадатмолибдатным реактивом), общего кальция (с орто-кризолфталеином), глюкозы (ферментативно). Активность трансаминаз, щелочной фосфатазы, билирубин – с помощью наборов фирмы «ДДС».
Исследование специфического действия антимикробных препаратов включало: установление антимикозных и антибактериальных свойств методами последовательных серийных разведений в МПБ и диффузии в агар с образованием лунок с применением в качестве тесткультур, микроорганизмов выделенных из молочной железы коров больных маститом.
Изучение острой токсичности и хронической токсичности препаратов проводили на беспородных белых мышах, массой 20-25 г и белых крысах, массой 150-200 г в соответствии с «Оценкой биологического действия медицинских изделий. Часть 11. Исследование общетоксического действия» (Утвержденной и введенной в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 6 августа 2009 г. ГОСТ Р ИСО 10993-11-2009).
Изучение раздражающего и сенсибилизирующего действия препаратов проводили на 8 молодых кроликах-альбиносах массой 2300г, 50 морских свинках-альбиносах массой 250-330 г и 30 беспородных белых мышах массой 20-25 г в соответствии с «Оценкой биологического действия медицинских изделий. Часть 10. Исследование раздражающего и сенсибилизирующего действия» (Утвержденной и введенной в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 6 августа 2009 г. ГОСТ Р ИСО 10993-10-2009).
Всего для оценки безвредности препаратов было задействовано 188 белых мышей-альбиносов, 92 белые крысы, 50 морских свинокальбиносов и 8 кроликов-альбиносов.
Изучение пленкообразующей способности профмастита провели на 15 коровах голштинской породы, находящихся в сухостое. Для этого профилактическое средство наносили на соски вымени в период запуска животных, непосредственно после последней дойки. В дальнейшем каждые 5 дней проводилось наблюдение за сосками вымени животных и проверка наличия пленки на сосках коров.
Изучение общей микробной обсеменнности секрета молочной железы и кожи сосков коров после применения профмастита осуществляли на 10 клинически здоровых коровах, находящихся в процессе перевода в сухостой.
Изучение профилактической эффективности профмастита провели на 300 животных, которых разделили на 3 равные группы опытную, 1-ю контрольную (положительный контроль) и 2-ю контрольную (отрицательный контроль) по 100 животных в каждой. Коровам опытной группы во время запуска, непосредственно после последнего доения, и проведения туалета вымени при помощи пластмассового стаканчика для обработки сосков наносили профмастит, после чего коров определяли в группу сухостоя. Коровам первой контрольной группы по аналогичной схеме при помощи пластмассового стаканчика для обработки сосков наносили ProfilacDryOff. Животных второй контрольной группы определяли в сухостой без средств фармакопрофилактики.
У подопытных животных на 15-е сутки сухостойного периода и после отела исследовали молочную железу клиническими методами и постановкой тест-реакций на скрытую форму мастита.
Влияние сангвимаста на молочную железу изучили на 5 клинически здоровых коровах на 4-6 месяце лактации. Препарат, разогретый до 38-39°С в дозе 10 мл, вводили внутрицистернально в соски правой половины молочной железы после предварительного выдаивания молока и вытирания сосков 70° этиловым спиртом (соски левой половины вымени служили контролем). За животными вели наблюдение и исследовали молоко оценки реакции с кенотестом и постановки пробы отстаивания. Также определяли внешний вид, запах, цвет, рН, количество соматических клеток в 1 мл секрета.
Оптимальную лечебную дозу сангвимаста определяли на 30 коровах-аналогах голштинской породы больных катаральным маститом, разделенных на 3 равных группы. Животным первой группы после предварительного выдаивания молока внутрицистернально вводили препарат, подогретый до 38°С. в дозе 5мл, второй -10 мл и третьей мл до выздоровления. После всего курса лечения учитывали количество введений препарата, а также определяли состояние четвертей вымени визуально и при помощи пальпации, проводили исследование молока на скрытый мастит. Терапевтическую эффективность сангвимаста изучали в двух сериях опыта при различных клинически выраженных формах мастита на 216 животных в сравнительном аспекте с препаратами «Ваккамаст» и «Септогель», которые использовали согласно наставлению по применению. Препарат сангвимаст вводили животным после доения внутрицистернально в дозе 10 мл с интервалом 24 часа до выздоровления.
Математическую и биометрическую обработку полученных данных проводили при помощи программы WindowsVista, MicrosoftExcel 2010, степень достоверности «Р» устанавливали по распределению Стьюдента.
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Степень распространения и формы проявления мастита у По данным акушерско-гинекологической диспансеризации крупного рогатого скота в 2010-2012 годах в 3 хозяйствах Краснодарского края (ООО «Предгорье Кавказа» в Северском районе, ОАО «Искра» в Тимашевском районе, Учхоз «Кубань») было обследовано коров и из них выявлено с заболеванием маститом 1520 коров, что составляет 39,3%. Ежегодные исследования животных на мастит показали, что положительно реагирующих животных из года в год нарастало, несмотря на то, что поголовье ферм оставалось примерно на одном и том же уровне. Процент заболеваемости в 2010 году составил 39,0 % из 1290 обследованных животных, а в 2012 году – 39,6 % из 1289 обследованных животных.Проведенные исследования по изучению сезонности возникновения мастита на МТФ №2 ООО «Предгорье Кавказа» позволили нам установить, что мастит коров имеет определенный сезонный характер и основные его пики приходятся на март-май и сентябрь-ноябрь.
В эти месяцы было выявлено больных маститом коров от 2,5 % до 4,1 % от общего поголовья фермы. С декабря по февраль этот показатель снижается до 1,3-2,0 %, а с июня по август до 1,2-1,7 % от общего поголовья фермы.
Также заболеваемость коров маститом зависит и от технологии доения коров. Проведенный нами анализ показал, что наименьший процент заболеваемости маститом отмечается при линейном доении коров в молокопровод, а наибольший процент заболеваемости приходится на линейную в бочок. Это зависит от того, что при доении коров в молокопровод коровы разделены на группы и каждая группа коров закреплена за определенными доярками в связи, с чем они уделяют пристальное внимание к каждой корове, как в период лактации, так и в период запуска. При доении коров в бочок нами было замечено, что вследствие высокой нагрузки на операторов машинного доения: вместо двух доильных аппаратов они используют три и четыре, происходит передержка доильных аппаратов, что ведет к раздражению вымени и, как правило, заболеванию коров маститом. Так же в трех хозяйствах были замечены нарушения в преддоильной подготовке вымени к машинному доению. В Учхозе «Кубань» и ОАО «Искра» больные животные доились совместно со здоровыми, что ведет к передаче через доильный аппарат возбудителей мастита от больных животных к здоровым. В ООО «Предгорье Кавказа» больных коров доили только после того как подоили здоровых, что в свою очередь не ведет к передачи возбудителей от больных к здоровым через доильный аппарат.
В результате мониторинга было выявлено 74 коровы с воспалением вымени в период сухостоя и установлено, что 46 животных заболели в первые 15 дней, 17 – на 16-30 день, а 11 животных в оставшиеся дни сухостоя. При этом у 34 (46%) коров диагностировали клинически выраженный мастит, а у 40 (54%) коров – субклинический мастит (табл. 1).
Заболевание маститом коров в период сухостоя по дням (n=74) Заболело Заболело субклиническим клиническим Заболело маститом в сухостое При анализе данных распространения мастита в Краснодарском крае нами было отмечено, что мастит имеет широкое распространение и является актуальной проблемой.
3.2. Видовой состав микрофлоры молока у коров больных При микробиологическом исследовании молока от 54 коров больных маститом было выделено 17 видов микроорганизмов и 4 вида грибов, всего 105 изолята. У 50 коров (92,6%) больных маститом выделялась условно-патогенная микрофлора: при посевах молока из пораженных долей вымени на МПА в чашках Петри обнаруживали массовый рост микробных колоний. У 4 (7,4%) животных в секрете пораженных долей вымени, как правило, больных субклиническим и серозным маститом микрофлора не выделялась, воспаление протекало, как асептическое.
«