ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ГРОХОВСКИЙ

Сергей Львович

СИНТЕЗ АНАЛОГОВ ДИСТАМИЦИНА А

И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ДНК

(специальность 02.00.10 - Химия природных

и физиологически активных веществ)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Работа выполнена в Лаборатории химии белкового синтеза Института молекулярной биологии АН СССР Научные руководители:

доктор химических наук Б.П. Готтих кандидат химических наук А.Л. Жузе

Официальные оппоненты:

доктор химических наук М.Н. Преображенская доктор химических наук В.Н. Шибаев Ведущее предприятие:

Институт по изысканию новых антибиотиков АМН СССР 1977 г.

Защита диссертации состоится а в 17 часов на заседании Специализированного совета № (шифр Д 053.05.47) по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу:

Москва II7234, Ленинские горы, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

I

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Одной из основных проблем современной молекулярной биологии является нахождение общих принципов белковонуклеинового узнавания. Трудность изучения больших природных макромолекул, а тем более их комплексов, заставляет искать более простые системы, которые позволили бы моделировать отдельные этапы этого сложного процесса, упростить, выделить составляющие его элементы.

Удобной моделью белково-нуклеинового узнавания могут служить комплексы с нуклеиновыми кислотами различных низкомолекулярных веществ, в частности, антибиотиков, обладающих сродством к определенным основаниям или последовательностям оснований нуклеиновой кислоты. Определение молекулярных основ специфического сродства таких веществ к нуклеиновой кислоте даст возможность сделать некоторые теоретические предположения и о структуре белково—нуклеиновых комплексов.

Целью работы явилось выяснение структуры комплекса антибиотика дистамицина А с двухспиральной ДНК и факторов, определяющих специфичность его к АТ-парам оснований ДНК. Для этого нами синтезирован ряд аналогов дистамицина А и изучено их связывание с ДНК и синтетическими, полидезоксирибонуклеотидами.

Научная новизна работы. Впервые синтезирован ряд аналогов дистамицина А, содержащих различные заместители у гетероциклического атома азота пиррольных циклов. Изучение оптическими методами свойств комплексов ЭТИХ веществ с ДНК позволило определить ориентацию пиррольных циклов в комплексе. Исследование ряда синтезированных модельных соединений методом ПМР позволило сделать вывод относительно конформации олигопирролкарбоксамидного остова дистамицина А в растворе. Изучение методом флуоресценции связывания аналогов, содержащих остаток дансилглицина с числом N-метил- и N-пропилпиррольных циклов в молекуле от одного до трех, позволило определить значения их констант связывания с poly(dA)*poly(dT). Показано, что дистамицин А и его аналоги локализуются при связывании в узкой бороздке двойной спирали ДНК.

Практическая ценность. На основании модели, предложенной для комплекса дистамицина А с двухспиральной ДНК, были высказаны некоторые предположения относительно возможного механизма действия аналогов антибиотика в различных биологических системах. Ингибирование ими развития некоторых ДНК-содержащих вирусов и культуры синхронизированных клеток, а также влияние на действие рестриктазы EcoRI подтвердило высказанные предположения. Аналоги дистамицина А могут найти применение в качестве весьма тонких инструментов для избирательного изменения действия ферментов транскрипции и репликации.

Ограничение действия рестриктационных эндонуклеаз, приводящее к получению укрупненных фрагментов ДНК, имеет большое значение для картирования ДНК и может быть использовано в генной инженерии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем работы. Диссертация содержит 140 страниц текста, 10 таблиц, 54 рисунка и список цитированной литературы (189 ссылок). Работа состоит из четырех глав. Глава I - обзор литературы "Специфическое связывание с двухспиральной ДНК различных низкомолекулярных лигандов". В главе П приведено обсуждение схем синтеза различных аналогов дистамицина А и содержатся данные по связыванию этих аналогов с ДНК и синтетическими полидезоксирибонуклеотидами. В главе Ш рассмотрено конкретное использование аналогов дистамицина А в некоторых биохимических системах. Глава IУ - "Экспериментальная часть".

Содержание работы Известно, что биологическое действие дистамицина А (I) и сходного с ним по химической структуре антибиотика нетропсина (П):

обусловлено образованием прочного комплекса о АТ-богатыми участками двухспиральной ДНК. Было предложено несколько моделей для комплексов этих антибиотиков с ДНК. С целью экспериментальной проверки этих моделей и нахождения реальной структуры комплекса нами был осуществлен синтез различных аналогов дистамицина А и изучено их связывание с ДНК и синтетическими полидезоксирибонуклеотидами.

I. Схемы синтеза дистамипдна А и его аналогов.

Схема I отличается от схемы, предложенной Аркамоне и сотр. тем, что в ней исключена стадия гидрирования нитропроизводных, содержащих нитрильную группу. Последняя переводилась в хлоргидрат амидина уже на начальной стадии синтеза. Как видно из схемы, синтез проводился ступенчатым наращиванием с амидинового конца молекулы остатков 1-метил-4-нитропиррол-2-карбоновой кислоты хлорангидридным методом. По этой схеме нами были синтезированы дистамицин А и его аналоги, содержащие в молекуле от одного до трех N-метил- или N-пропилпрролкарбоксамидных фрагментов, а также аналоги, содержащие различные ацильные заместители в левой части молекулы.

Вторая схема синтеза отличалась от первой тем, что с b-аминопропионитрилом конденсировали соединение XXI, содержащее два пиррольных цикла, а затем переводили нитрильную группу в амидиновую.

Следует отметить, что нам не удалось получить дистамицин А, исходя из соединения, аналогичного XXI, но содержащего три N-метилпиррольных цикла, вследстйие очень низкой реакционной способности карбоксильной группы последнего. После восстановления нитрогруппы соединения ХХШ полученное вещество вводили в конденсацию с соответствующей ациламидопирролкарбоновой кислотой. По этой схеме были синтезированы аналоги, содержащие N-метил- или N-изоамилпирролкарооксамидные фрагменты. Поcкольку последней стадией синтеза является конденсация двух готовых блоков, то упрощается очистка и увеличивается суммарный выход конечного продукта. Для синтеза соответствующих 1-метил-4-ациламдопиррол-2-карбоновых кислот были использованы различные методы (схема 3 ). Один из них заключался в ацилировании трет-бутилового эфира 1-метил-4-аминопиррол-2-карбоновой кислоты.

Этот метод оказался неудовлетворительным, так как при кислотной обработке (3% НВr/АсОН или безв. CF3C00H, 20°, 15 мин.) трет-бутиловых эфиров соответствующих ациламидопирролкарбоновых кислот Проходила преимущественно реакция декарбоксилирования вместо снятия трет-бутильной группы. На схеме 3а показан путь синтеза дансильного производного ХХУП. Реакция декарбоксилирования наблюдалась также при ацидолизе трет-бутиловых эфиров 1-метил-4-ацетил (или 4-формил)амидопиррол-2-карбоновой кислоты. По этой причине синтез дансильного производного (ХХУП) был проведен также по схеме 3b Для синтеза формильного производного XXXI такой метод неприменим из-за необходимости использования жестких условий при щелочном гидролизе этилового эфира. Формильное производное (XXXI) было получено по схеме Зс.

Недостатком последней схемы является низкий выход на стадии гидролиза этилового эфира 1-метил-4-аминопиррол-2-карбоновой кислоты.

2. Экспериментальные данные о продольной локализации дистамицина А в узкой бороздке двойной спирали ДНК Связывание дистамицина А и его аналогов с ДНК и модельными полимерами изучалось спектральными методами. Спектр КД связанного дистамицина А характеризуется наличием полосы поглощения в области 320нм, отсутствующей у свободной ДНК (сам дистамицин А и его аналоги не проявляют оптической активности). Изучение методом КД связывания дистамицина А и его N-пропильного аналога (Ib) с ДНК фага Т6 показало, что остатки глюкозы, занимающие почти всю широкую бороздку у этой ДНК, не мешают связыванию этих веществ с ДНК.

Методом неравновесного метилирования комплекса дистамицина А и его N-пропильного аналога (Ib) с ДНК тимуса теленка A.M. Колчинским и А.Д. Мирзабековым было показано, что антибиотик и его аналог экранируют от метилирования только узкую бороздку ДНК и не влияют на доступность широкой бороздки ДНК для диметилсульфата. Эти данные свидетельствуют о локализации антибиотика и его аналога в узкой бороздке двойной спирали. ДНК.

Титрование poly(dA)*poly(dT) дистамицином А и его аналогом с двумя N-метилпиррольными циклами (ХШа) показало, что изломы кривых, соответствующие насыщению комплекса, свидетельствуют о том, что одна молекула дистамицина А занимает на полимере 5 пар оснований, а аналог с двумя пиррольными циклами - 4 пары оснований. Такое число занимаемых нуклеотидных пар соответствует ван-дер-ваальсовым размерам этих соединений при их продольном расположении в узкой бороздке двойной сдирали ДНК.

3. Конформация дистамицина А в растворе. Определение ориентации пиррольных циклов антибиотика в комплексе с ДНК.

Для определения ориентации пиррольных циклов относительно амидных связей в молекуле дистамицина А нами был синтезирован ряд модельных соединений, содержащих в молекуле только один пиррольный цикл:

и изучены их спектры ПМР. Было обнаружено, что характер заместителя по карбоксильной группе оказывает сильное влияние на химический сдвиг протона в положении 3 пиррольного цикла и практически не влияет на химический сдвиг протонов группы N-CH 3. Такая зависимость свидетельствует о том, что для этих соединений предпочтительной является конформация, в которой кислород карбонила в положении пиррольного цикла сближен с N-метильной группой.

Из анализа спектров ПМР модельных соединений с двумя пиррольяыми циклами, снятых в присутствии парамагнитного сдвигающего реагента, был сделан вывод, что эти соединения находятся в конформации с транс-ориентацией связей С 3 -С 4 и СО-NН:

Это дает основание предполагать, что для дистамицина А в растворе предпочтительна такая конформация олигопирролкарбоксамидного остова, в которой заместитель у атома азота пиррольного цикла и протон амидной группы направлены в противоположные стороны.

Изучение связывания с ДНК и синтетическими полидезоксирибонуклеотидами аналогов дистамицина А, содержащих N-пропильные и N-изоамильные радикалы (соединения Ib,Ic, ХШb и ХШс), показало, что они также проявляет выоокое сродство к ДНК и модельным полимерам, содержащим только АТ-пары оснований. Оптические эффекты, наблюдаемые при связывании с ДНК этих соединений и соответствующих N-метильных производных, имеют сходный характер. На основании этого был сделан вывод, что в комплексе дистамицин А - ДНК заместитель у атома азота пиррольных циклов антибиотика направлен из узкой бороздки ДНК наружу.

Для определения угла наклона пиррольных циклов к продольной оси ДНК был использован метод анизотропии поглощения комплексов дистамицина А и его аналогов с ДНК, ориентированных в потоке. Измерения, проведенные А.И.Полетаевым и др., показали, что угол наклона пиррольных циклов к продольной оси ДНК для дистамицина А и его N-пропильного (Ib) и N-изоамилького (Ic) аналогов одинаков и составляет 50+_3°.

4. Модель комплекса дистамицина А с двухспиральной ДНК Изучение связывания с ДНК ряда аналогов дистамицина А с двумя пиррольными циклами:

показало, что замена формамидогруппы на нитрогруппу приводит к уменьшению сродства лиганда к ДНК, в то время как замена на амино-, ацетамидо-, бензамидо- и дансилглициламидогруппу слабо влияет на сродство этих соединений к ДНК. Таким образом, удаление даже одной NНгруппы приводит к уменьшению способности лиганда связываться с ДНК (следует отметить, что сродство к ДНК соединения ХУПа, содержащего три пиррольных цикла и нитрогруппу, сравнимо со сродством соединения ХШа, но меньше чем у дистамицина А ). Эти данные свидетельствуют об участии протонов амидных групп в связывании антибиотика с ДНК.

Нами был синтезирован ряд аналогов дистамицина А, содержащих вместо амидных N-метиламидные группы. Такие соединения не связывались с ДНК. Однако, на основании этого нельзя делать вывод относительно роли амидных групп в связывании с ДНК, поскольку методом ПМР показано, что их конформация сильно отличается от конформации соответствующих соединений с амидными группами.

Агенты, разрушающие водородные связи (мочевина и гуанидин), оказывают дестабилизирующее действие на комплекс дистамицина А с ДНК, в то время как изменение ионной силы в широком диапазоне слабо влияет на устойчивость комплекса.

Были синтезированы аналоги дистамицина А, содержащие остаток дансилглицина в левой части молекулы:

Было проведено изучение связывания таких аналогов с полидезоксирибонуклеотидами. При связывании с полимерами, содержащими АТ-пары оснований, флуоресценция дансильного остатка резко возрастает и максимум флуоресценции сдвигается в коротковолновую область. Построение изотерм адсорбции дансильных аналогов на poly(dA)*poly(dT) позволило определить значения констант связывания и число пар оснований, занимаемых одной молекулой аналога на полимере:

Полученные значения констант связывания свидетельствуют о том, что вклад, вносимый одним N-метилпирролкарбоксамидным фрагментом, является величиной постоянной и равен примерно 2 ккал/моль. Эта величина сравнима с величиной энергии образования одной водородной связи. Проведение конформационных расчетов и построение молекулярных моделей комплекса показало, что наиболее вероятным является образование водородных связей между амидными группами антибиотика и кислородами 02 тиминов. В случае альтернативного полимера poly(dA-dT)* poly(dA-dT) водородные связи могут быть образованы также и гетероциклическими азотами NЗ аденинов. Найденное значение константы-связывания соединения XVIIa с этим полимером (1,0-107л/моль) показывает, что такая связь менее прочна и составляет около 1,4 ккал/моль.

Ниже приведена модель комплекса дистамицина A с последовательностью ТAТТ ДНК.

5. Некоторые следствия из предложенной модели Молекулярная модель комплекса, предложенная нами для объяснения специфического связывания антибиотиков дистамицинового типа с АТ-богатыми участками ДНК, хорошо согласуется с большинством известных в настоящее время экспериментальных данных. В Институте антибиотиков Т.Я.Гончарской и И.П.Фоминой были проведены испытания противовирусного действия синтезированных аналогов дистамицина А. Показано, что уменьшение числа пирролкарбоксамидных фрагментов или замена формамидогруппы на нитрогруппу приводит к ослаблению противовирусного действия на ДНК-содержащие вирусы; N-пропильные и N-изоамильные аналоги дистамицина А обладают меньшим ингибируюцим действием, чем сам антибиотик.

Синтетические аналоги дистамицина А были использованы для ограничения действия рестриктазы EcoRI на ДНК фага лямбда. Эти эксперименты, проведенные О.Л.Поляновским и др., показали, что при определенных концентрациях аналогов наблюдается исчезновение ряда фрагментов расщепления фаговой ДНК, образуемых рестриктазой в отсутствие антибиотика, и появление более крупных фрагментов. Порядок закрывания участков рестрикции для различных аналогов одинаков.

А.Д.Мирзабековым и сотр. изучалось связывание дистамицина А и аналога с двумя N-метилпиррольными циклами (ХШа) с хроматином. Отсутствие существенного влияния белков хроматина на связывание антибиотиков указывает на то, что большинство белков хроматина располагается, вероятно, в широкой бороздке ДНК. Таким образом, антибиотики дистамицинового типа являются удобными инструментами для установлении места локализации различных белков на ДНК.

Доказательство локализации дистамицина А в узкой бороздке и объяснение его специфичности к АТ-парам оснований ДНК образованием водородных связей между амидными группами антибиотика и кислородами тиминов в положении С2 или атомами азота аденинов в положении 3 послужило одной из предпосылок для построения теоретической модели взаимодействия регуляторных белков с ДНК (Г.В.Гурский и др., Молекуляр. биология, 2, 635, 1976).

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы синтеза дистамицина А и его аналогов с различным числом N-алкилпирролкарбоксамидных фрагментов и различными заместителями по аминогруппе концевого пиррольного цикла молекулы.

2. На основании изучения связывания с двухспиральной ДНК аналогов дистамицина А с различным числом пирролкарбоксамидных фрагментов сделан вывод о продольном расположении антибиотика в узкой бороздке ДНК.

3. Изучение связывания с ДНК аналогов с различными заместителями у атома азота пиррольных циклов показало, что N-метильные группы дистамицина А направлены из узкой бороздки ДНК наружу.

4. Изучение ряда модельных соединений методом ПНР позволило придти к заключению относительно предпочтительной конформации олигопирролкарбоксамидного остова дистамицина А в растворе.

5. Определены константы связывания с poly(dA)*poly(dT) и poly(dA-dT)*poly(dA-dT) флуоресцентных аналогов дистамицина А с различным числом N-алкилпирролкарбоксамидных фрагментов. Показано, что вклад, вносимый в энергию связывания с poly(dA)*poly(dT) одним N-алкилпирролкарбоксамидным фрагментом, составляет около 2 ккал/моль.

6. Полученные экспериментальные данные указывают на то, что дистамицин А связывается в узкой бороздке ДНК с образованием водородных связей с кислородами 02 тиминов и азотами NЗ аденинов. Предложена модель комплекса дистамицина А с двухспиральной ДНК.

7. Противовирусное действие аналогов дистамицина А и влияние на активность ряда ферментов находится в прямой зависимости от прочности их комплекса с ДНК, определенной на основании физико-химических измерений.

Отдельные этапы исследований были представлены в виде докладов на I Республиканской конференции молодых исследователей "Структура и генетические функции биополимеров", Киев, 1975; Всесоюзном симпозиуме "Изучение механизма действия антибиотиков", Ленинград, 1975; УП Йенском симпозиуме по кинетике биополимеров, Йена, 1976;

X Международном биохимическом конгрессе, Гамбург, 1976.

Основные результаты диссертации опубликованы в статьях:

I. Гроховский С.Л., Жузе А.Л., Готтих Б.П. (1975). "Лиганды, обладающие сродством к определённым парам оснований ДНК. I. Синтез дистамицина А и его аналогов с различным числом N-метил- и N-пропилпиррольных остатков в молекуле". Биоорганич.химия,.1, I6I6-I623.

2. Колчинский A.M., Мирзабеков А.Д., Заседателев А. С, Гурский Г.В., Гроховский С.Л., Жузе А.Л., Готтих Б.П. (1975). "О структуре комплексов антибиотиков дистамицинового типа и актиномицина Д с ДНК:

новые экспериментальные данные о локализации антибиотиков в узкой бороздке ДНК". Молекуляр.биология, 9, 19-27.

3. Гроховский С.Л. "Модификация дистамицина А с целью изучения механизма комплексообразования антибиотика с ДНК". (1975). Тезисы докладов I Республиканской конференции молодых исследователей "Структура и генетические функции биополимеров". Изд. "Наукова думка", Киев, стр. 19.

4. Жузе А.Л., Готтих Б.П., Гроховский С.Л., Гурский Г.В., Заседателев А. С, Туманян В.Г. (1975). "Взаимодействие дистамицина А и его аналогов с ДНК и синтетическими полидезоксирибонуклеотидами. Модель комплекса антибиотика с двухспиральной ДНК". Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Изучение механизма действия антибиотиков", Ленинград, стр. 7-8.

5. Zhuze A.L., Gottikh B.P., Grokhovsky S.L., Gursky G.V., Zasedatelev A.S., Tumanyan V.G. (1975). "Binding of distamycin A and its analogs to DNA and synthetic polydeoxyribonucleotides. Abstracts 9th International congress of chemotherapy, London, M-43.

6. Заседателев А.С., Жузе А.Л., Циммер К., Гроховский С.Л., Туманян В.Г., Гурский Г.В., Готтих Б.П. (1976). "Стереохимическая модель молекулярного механизма "узнавания" АТ-пар при связывании с ДНК антибиотиков дистамицина А и нетропсина". ДАН СССР, сер. биохимия, 231, 1006-1009.

7. Grokhovsky S.L., Zhuze A.L., Gottikh B.P., Zasedatelev A.S., Tumanyan V.G., Gursky G.V.(1976). "Binding distamysin A and its analogs to DNA". Abstracts VII Jenaer Molekularbiophysikalisches Symposium "Kinetik mit Biopolymeren, Jena.

8. Gursky G.V., Tumanyan V.G., Zasedatelev A.S., Zhuze A.L., Grokhovsky S.L., Gottikh B.P. (1977). "A code controlling specific binding of proteins to double-helical DNA and RNA".

"Nucleic acid - protein recognition", ed. H.J.Vogel, Acad.

Press, N.J., p. 187-217.

9. Keroyedov A.A., Grokhovsky S.L., Zhuze A.L., Nosikov V.V., Polyanovsky O.L. (1977). "Distamycin A and its analogs as agents for blocking of endo R.EcoRI activity". Gene, 1, 389-395.