На правах рукописи
ШИБАЕВ Михаил Александрович
РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ
БИОЛОГИИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
РЕСПИРАТОРНЫХ ИНФЕКЦИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
06.02.02 «Ветеринарная микробиология,
вирусология, эпизоотология, микология
с микотоксикологией и иммунология»
АВТОРЕФЕРАТ
на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук
ВЛАДИМИР – 2010 2
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»)
Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор МИЩЕНКО Владимир Александрович
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор РУСАЛЕЕВ Владимир Сергеевич ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир доктор ветеринарных наук, профессор СУББОТИН Владимир Викторович ГНУ «Всероссийский научно исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» (ГНУ «ВИЭВ»), г. Москва
Ведущая организация – Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГНУ ВНИИВВиМ), г. Покров Владимирской области
Защита состоится «15» июня 2010 г. в 1400 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГУ «ВНИИЗЖ».
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и на сайте: http//www.arriah.ru.
Автореферат разослан «» _ 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент А.П. Пономарёв
1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В условиях новых технологий ведения животноводства существенное влияние на эпизоотическую ситуацию оказывают смешанные инфекции респираторного тракта КРС. По широте распространения и смертности респираторные болезни телят превалируют над всеми остальными заболеваниями молодняка [О. Гамелин, 2002; В.А. Мищенко, 2003; G.D. Snowder, 2006].
Массовые респираторные болезни молодняка КРС являются комплексными многофакторными синдромами, возникающими на фоне взаимодействия различных инфекционных агентов, изменения иммунного статуса, физических и экологических факторов [В.П. Урбан, 1984; P.M. Cusack, 2003; S.W. Martin, 1981]. Основная роль в развитии смешанных респираторных инфекций телят принадлежит вирусам (парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, коронавирусу, респираторно-синцитиальной инфекции и др.) и бактериям (прежде всего Pasteurella multocida (P. multocida), Mannheimia haemolytica (M. haemolytica), а также Chlamydophila pecorum (Chl. pecorum) и Mycoplasma bovis (M. bovis) [В.Н. Сюрин, 1998; А.Н. Куриленко, 2005; D.F. Twomey, 2006; T. Autioa, 2007; J.A. Rice, 2007].
Сходство в течении заболевания, вызванного различными возбудителями, обуславливает необходимость применения методов лабораторной диагностики данных инфекций. Разработанные ранее методы прямой и ретроспективной диагностики заболеваний, вызываемых M. haemolytica, P. multocida, Chl. pecorum и M. bovis не всегда позволяют надёжно идентифицировать инфекционные агенты.
Таким образом, представляется актуальным усовершенствование методов выявления вышеуказанных микроорганизмов, основанных на применении методов молекулярной биологии, что приобретает особую важность в связи изменениями классификации M. haemolytica и Chl. pecorum [K.D.E. Everett, 1999; O. Angen, 1999].
Кроме того, исследования, направленные на уточнение распространённости названных возбудителей на территории РФ, будут способствовать успешному проведению противоэпизоотических и профилактических мероприятий.
Выяснение этиологической структуры реcпираторных заболеваний молодняка КРС и оценка вклада отдельных возбудителей невозможна без применения методов аналитической эпизоотологии [С.А. Дудников, 2004; M. Thrusfield, 1995].
Цель и задачи исследования. Цель исследований заключалась в разработке методов выявления генома P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis превалентности данных возбудителей в популяции телят 0,5 – 7,0 месячного возраста в хозяйствах ЦФО РФ. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
- разработать метод выявления генома P. multocida и M. haemolytica на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования;
- разработать метод выявления генома Chl. pecorum на основе ПЦР;
- разработать метод для выявления генома M. bovis на основе ПЦР;
P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis в популяции телят 0,5 – 7, месячного возраста в хозяйствах ЦФО РФ;
- оценить связь выявления P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis с респираторной патологией телят, используя метод факторного анализа по Ротману [K.J. Rothman, 1976].
Научная новизна исследования. С помощью метода мультиплексной ПЦР и секвенирования разработан способ идентификации геномов M. haemolytica и P. multocida с последующей их дифференциацией в соответствии с современной таксономией Pasteurellaceae.
Сконструированы системы праймеров и разработаны методы идентификации Chl. pecorum и M. bovis на основе метода ПЦР.
Определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов sodA и lktD изолятов M. haemolytica, выявленных в пробах патологического материала на территории РФ в течение 2006-2009 гг.
Chl. pecorum. Определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена ompA изолятов Chl. pecorum, выявленных в пробах патологического материала от КРС на территории РФ в течение 2006-2009 гг. Изучены вероятные филогенетические отношения между изолятами, выявленными на территории РФ, и изолятами Chl. pecorum, имеющимися в базе данных GenВank.
Впервые определены показатели стадной и индивидуальной превалентности P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis на репрезентативной выборке КРС в возрасте 0,5 – 7,0 месяцев в хозяйствах ЦФО РФ.
Впервые с использованием факторного анализа и общей модели факторного взаимодействия установлена достоверность различий в частоте выявления P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis у здоровых телят и телят с респираторной патологией в хозяйствах РФ.
Практическая значимость исследования. В результате проведённых исследований разработаны:
- «Методические рекомендации по нуклеотидному секвенированию генома бактерий рода Mannheimia с целью определения их видовой принадлежности». Данная методика позволяет выявлять и дифференцировать M. haemolytica и P. multocida в патологических и культуральных бактериосодержащих материалах (2007 г.).
- «Методические рекомендации по индикации генома Chlamydophila pecorum методом полимеразной цепной реакции» (2009 г.).
- «Методические рекомендации по индикации генома Mycoplasma bovis методом полимеразной цепной реакции» (2009 г.).
Данные методические рекомендации прошли комиссионные испытания, рассмотрены и одобрены учёным советом, утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ»
и рекомендованы для использования в лабораториях при проведении диагностических исследований.
Результаты изучения превалентности и оценки связи выявления P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis с респираторной патологией в изучаемой популяции КРС с использованием факторного анализа и общей модели факторного взаимодействия имеют как теоретическую, так и практическую значимость, поскольку дают возможность расширить знания о роли изучаемых возбудителей в респираторной патологии молодняка КРС, и в дальнейшем могут быть использованы при разработке комплекса научно-обоснованных мер борьбы и профилактики смешанных респираторных инфекций КРС.
Основные положения, выносимые на защиту:
- метод идентификации и дифференциации M. haemolytica и P. multocida методом мультиплексной ПЦР и нуклеотидного секвенирования;
- метод выявления генома Chl. pecorum на основе амплификации фрагмента гена ompA;
- метод выявления генома M. bovis на основе амплификации фрагмента гена uvrC;
-результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена ompA изолятов Chl. pecorum, выявленных в РФ в 2006-2009 гг.;
-результаты исследования по оценке превалентности P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis в популяции телят 0,5 – 7,0 месячного возраста в ЦФО РФ;
-результаты факторного анализа по Ротману и анализа общей модели факторного взаимодействия P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum, M. bovis и их ассоциаций у телят с респираторной патологией в хозяйствах ЦФО РФ.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Нуклеотидное секвенирование осуществлялось сотрудниками лаборатории диагностики вирусных болезней птиц ФГУ «ВНИИЗЖ». Исследования по диссертационной работе выполнены в 2006-2009 гг. в ФГУ «ВНИИЗЖ».
Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах научных конференций: «Диагностика профилактика и лечение болезней животных» (г. Новосибирск, 2008 г.), «Достижения молодых учёных в ветеринарную практику», посвящённая 50-летию создания ФГУ «ВНИИЗЖ»
(г. Владимир, 2008 г.), «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» посвященная 70-летию со дня рождения членакорреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. (г. Покров, 2009 г.), а также на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2006- 2010 гг.
Публикация научных исследований. По теме научных исследований опубликовано 5 научных работ в журналах и материалах научных конференций, три из них – в журнале «Ветеринарная патология», рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 165 страницах компьютерного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 262 источника, в том числе зарубежных. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 22 таблицами.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
штаммов и изолятов микроорганизмов, использованных в работе, приведён в табл. 1.Характеристика контрольных штаммов и изолятов микроорганизмов M. haemolytica M. haemolytica P. multocida subsp. multocida Chl. pecorum Chl. pecorum Chl. pecorum Химические реагенты. В работе использованы химические реактивы производства “Promega” (США), “Sigma” (США), “Serva” (Германия), “Esso” (Франция), а также отечественные реактивы марки о.с.ч.
Выделение суммарной ДНК. Суммарную ДНК из культуральной бактериосодержащей суспензии и патологического материала от животных выделяли с помощью набора реагентов для выделения ДНК, в соответствии с инструкцией производителя (ООО «Компания Биоком», г. Москва).
Мультиплексную ПЦР для индикации и дифференциации серогрупп A, B, D, E и F P. multocida выполняли согласно протоколу изложенному в Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals [Paris: OIE, 2008].
Очистку продуктов ПЦР проводили с помощью набора реактивов «Wizard® PCR Preps DNA Purification System» (Promega) согласно методике производителя.
Секвенирование продуктов ПЦР осуществлялось на автоматическом секвенаторе «ABI Prism 3100» (Applied Biosystems, США).
Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых кислот проводили с помощью пакета программ BioEdit версия 7.0.5.2, 2005. Выбор праймеров осуществляли с помощью программы OLIGO версия 4.0, а филогенетический анализ - с помощью алгоритма NJ в реализации пакета MEGA версия 4.0.
Формирование выборки. Для изучения широты распространения M. haemolytica, P. multocida, Chl. pecorum и M. bovis в популяции КРС был проведён отбор проб мазков из носа у телят. Определение требуемого объёма выборки осуществляли, исходя из 95% уровня достоверности и 10% превалентности [Cannon & Roe 1982] M.haemolytica, P.multocida, Chl.pecorum и M.bovis в популяции КРС ЦФО.
Методы анализа данных. Обработка данных, полученных в ходе инструментального учёта результатов применённых тестов проводилась с использованием программного обеспечения STATISTICA 6,0 (StatSoft, Inc, 2001).
С применением эпизоотологических аналитических методов вероятностного расчёта, использующих матрицу 2х2, были оценены эпидемические критерии ассоциации результатов диагностического теста (ПЦР) и клинических признаков поражения респираторного тракта в обследуемых хозяйствах по показателям: хи – квадрат (2) и соотношение шансов (OR) [С.А. Дудников, 2004]. Для количественной и качественной оценки ассоциативной инфекции респираторного тракта молодняка КРС использовали факторный анализ по Ротману с последующим построением общей модели факторного взаимодействия в форме диаграмм Венна.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка метода идентификации и дифференциации геномов M. haemolytica и P. multocida с помощью ПЦР и нуклеотидного секвенирования Одной из преград при разработке ПЦР для выявления M. haemolytica является сложность её дифференцирования от других видов рода Mannheimia, нуклеотидные последовательности генов которых обладают высокой степенью сходства с аналогичными генами M. haemolytica. Анализ нуклеотидных последовательностей генов оперона lktCABD показал, что ген lktC является высоко консервативным у всех представителей рода Mannheimia, что позволило использовать его для выбора родоспецифических праймеров. В результате сконструированы праймеры TOX-F1 и TOXR1, фланкирующие фрагмент гена lktC (табл. 2).Праймеры для амплификации и секвенирования фрагментов генов lktC, sodА и lktD M. haemolytica и амплификации гена КМТ1 P. multocida TOX F-1 5'–TGATTCCTGCAATTGAAAATGAACAATATA–3' Тем не менее, ген lktC не несет генетической информации о видовых отличиях представителей рода Mannheimia.
Для дифференциации М. haemolytica от наиболее генетически близкого к нему вида – M. glucosida были сконструированы специфичные для рода Mannheimia праймеры LKTD-F и LKTD-R, фланкирующие фрагмент гена lktD (табл. 2).
Для дифференциации М. haemolytica и M. glucosida от других представителей рода Mannheimia, был выбран ген sodA. В результате были сконструированы праймеры - SODA-F и SODA-R, также специфичные для рода Mannheimia (табл. 2).
Для специфической индикации генома P. multocida был выбран ген KMT1 уникальный для данного вида. В результате нами была сконструирована пара праймеров (PM-SV-F и PM-SV-R), которые были использованы в ПЦР (табл. 2).
M. haemolytica и P. multocida (табл. 1). В оптимизированном варианте схему анализа можно представить следующим образом:
Этап 1: постановка ПЦР с праймерами TOX F-1/TOX R-1 и PM-SV-F/PM-SV-R в варианте мультиплекс для выявления и дифференциации геномов микроорганизмов рода Mannheimia и вида P. multocida. При проведении ПЦР амплифицируются фрагменты ДНК генов lktC и KMT1, размер которых составляет 202 п. н. для микроорганизмов рода Mannheimia и 272 п. н. – P. multocida (рис. 1).
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР для выявления геномов P. multocida и микроорганизмов рода Mannheimia.
Обозначения дорожек: M – маркер молекулярных весов ДНК pUS Mix Marker, 8 (стрелками обозначены длины фрагментов п.н.); 1– вода (отрицательный контроль ПЦР); 2 – проба содержащая М. haemolytica и P. multocida одновременно; 3 – P. multocida; 4 – М. haemolytica.
Этап 2: при наличии на первом этапе положительной реакции на род Mannheimia проводят ПЦР (с использованием выделенной ДНК) и секвенирование продуктов с праймерами на ген sodA для дифференциации M. haemolytica и M. glucosida от других представителей рода. Размер продуктов амплификации в этой реакции составляет 446 п. н. (рис. 2).
Этап 3: если первичная структура ампликона указывает на наличие в исследуемом материале M. haemolytica или M. glucosida, проводят еще одну ПЦР и секвенирование продуктов с праймерами на ген lktD для дифференциации M. haemolytica и M. glucosida. Продукты амплификации имели длину 848 п. н. (рис. 2).
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагментов Обозначения: M – маркер молекулярных весов ДНК pUS Mix Marker, 8 (стрелками обозначены длины фрагментов п. н.); 1 – вода (отрицательный контроль ПЦР); 2– продукт ПЦР гена lktD; 3– продукт ПЦР гена sodА; 4– продукт ПЦР гена lktC;
проверили на биологических материалах содержащих как M. haemolytica и P. multocida, так и гетерологичные микроорганизмы (Ornithobacterium rhinotracheale, Actinobacillus pleuropneumoniae, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, M. bovis, Acholeplasma granularum, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Chl. pecorum и др.). При этом во всех образцах, содержащих M.haemolytica, выявляли геном данного микроорганизма, а в образцах содержащих P.multocida геном этой бактерии. Неспецифической реакции не наблюдали, что подтвердило специфичность метода. При определении аналитической чувствительности метода установлено, что разработанный метод способен выявлять М. haemolytica в концентрации 102 КОЕ/мл, а P. multocida - 101 КОЕ/мл.
С использованием разработанного метода в 2007 – 2009 гг. были проведены исследования 2081 пробы патологического материала от КРС, поступившего из регионов РФ. Геном M. haemolytica выявлен в 132 пробах.
В результате проведённого филогенетического анализа фрагмента гена sodA у представленных в GenBank и выявленных в настоящем исследовании штаммов и изолятов M. haemolytica установлено, что их генетическая гомология составила 99,8Филогенетический анализ по гену lktD выявил, что нуклеотидные последовательности почти всех исследованных штаммов и изолятов M. haemolytica идентичны как между собой, так и с представленными в GenВank.
3.2. Разработка метода индикации генома Chl. pecorum с использованием ПЦР Проведённый анализ данных о нуклеотидных последовательностях генов всех видов семейства Chlamydiaceae, депонированных в базе данных GenBank показал, что ген ompA содержит наибольшее количество информации о видовых и типовых отличиях отличиях хламидий. В результате было сконструировано два специфичных для Chl. pecorum праймера PECF-2: 5 '– GCAATCTAAACCTCGCGTTCAAGAA–3' и PECR-4: 5' – TCAAGTAAAGTTGCTCCCAT(A/G)GAAA –3' фланкирующих III и IV вариабельные домены гена ompA. При оптимизации метода были использованы полевые изоляты Chl. pecorum, ранее нами охарактеризованные по гену 16S rRNA согласно схеме Everett с соавт. (1999) (табл. 1).
При проведении ПЦР амплифицируется фрагмент гена ompA Chl. pecorum, размер которого составляет 461 п. н. (рис. 3).
Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента Обозначения дорожек: M – маркер молекулярных весов ДНК pUS Mix Marker, 8 (стрелками обозначены длины фрагментов п.н.); 1 – вода (отрицательный контроль ПЦР); 2, 3, 4, 5 –изоляты Chl.pecorum: calf/Yaroslavl/2/2006, calf/N.Novgorod/1/2006, calf/Irkutsk/1/2007 и calf/S.Petersburg/1/2007, соответственно.
Для подтверждения специфичности разработанного метода исследовали биологические материалы, содержащие как Chl. pecorum (табл. 1), так и гетерологичные микроорганизмы (Chlamydia abortus, Chlamydophila psittaci, M. bovis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Сampylobacter jejuni, и др.). Во всех образцах биологического материала содержащих геном Chl. pecorum выявляли его присутствие. В то время как в пробах содержащих гетерологичные микроорганизмы, геном Chl. pecorum не выявляли. Для всех полученных ампликонов определили первичную структуру и проанализировали с помощью программы BLAST. При этом неспецифической реакции не наблюдали, что подтвердило специфичность метода.
С использованием разработанного метода в 2006-2009 гг. нами были проведены исследования 945 проб патологического материала от КРС из различных регионов РФ. Из них геном Chl. pecorum выявили в 87 образцах.
соответствующие им аминокислотные последовательности фрагмента гена ompA.
Проведённый филогенетический анализ показал, что популяция Chl. pecorum в РФ, характеризуется высокой генетической гетерогенностью. Уровень сходства между изолятами составил от 69 до 100 % по нуклеотидным и от 71 до 100% по аминокислотным последовательностям. При этом, некоторые изоляты, выявленные в РФ, показали 100%-ую генетическую гомологию с изолятами, выявленными в Германии, Великобритании, США, Австрии и Франции в 1989-1993 гг. (рис. 4).
Рис. 4. Дендрограмма: положение изолятов, выявленных в РФ по отношению к изолятам Chl. pecorum последовательности которых опубликованы в GenВank.
группа штаммов и изолятов имеющих идентичные нуклеотидные последовательности.
Данные факты, возможно, являются следствием импорта КРС, а также указывает на то, что они, вероятно, относительно медленно эволюционировали в сходных условиях. Также, не менее важным и эпизоотически значимым результатом нашего исследования было то, что в большинстве хозяйств (83 %) регистрировали одновременное присутствие нескольких различных генетических форм Chl. pecorum.
Представляют интерес изоляты calf/Moskow/1b/2008 и calf/Moskow/2a/2008, выявленные от телят с патологией респираторного тракта. Данные изоляты идентичны изоляту L71 Chl. pecorum выделенному от дикого кабана с признаками полиартрита в Австрии и изолятам выделенным из фекалий коз во Франции. Данные факты, могут свидетельствовать об отсутствии специфичности для хозяина, межвидового барьера и строгого тканевого тропизма при инфекции Chl. pecorum.
«