Присутствие противоиона не оказало влияния на размер получаемых НЧ, он варьировался в пределах 245-246 нм. Из выше изложенного можно сделать вывод о том, что в данном конкретном синтезе использование противоиона нецелесообразно.

Было изучено влияние режима первичной и вторичной гомогенизации на свойства получаемой наносомальной ЛФ ломефлоксацина. Гомогенизация может оказывать существенное влияние как на размер получаемых НЧ, так и на степень сорбции ЛВ в полимерную матрицу. Данную серию экспериментов проводили при двух различных условиях гомогенизации. Было выявлено, что изменение числа оборотов гомогенизации оказывает существенное влияние как на степень сорбции ЛВ в НЧ, так и на размер получаемых НЧ. Снижение интенсивности гомогенизации приводит к значительному укрупнению НЧ и существенному снижению степени сорбции ЛВ в НЧ. При различных режимах гомогенизации сохраняются зависимости, описанные ранее, а именно: увеличение степени сорбции ЛВ в НЧ с выходом на плато на фоне увеличения соотношения ЛВ:полимер и отсутствие закономерности во влиянии данного параметра на размер получаемых НЧ. Таким образом, при незначительной разнице в размере НЧ степень сорбции ЛВ различается практически в 4 раза, то есть в данном случае прямая зависимость между размером НЧ и степенью сорбции ЛВ не наблюдается. Все вышеизложенное отражено на рисунках № 1,2.

Для изучения зависимости свойств получаемых НЧ от времени первичной гомогенизации проводилась серия экспериментов с применением метода двойных эмульсий; в качестве полимера носителя был использован PLGA 50:50, первичным растворителем для полимера был хлороформ, первичным растворителем для ломефлоксацина был 0,01 М раствор НСl, в качестве ПАВ применяли 1% раствор поливинилового спирта. При прочих равных параметрах синтеза для всех образцов изменялся только режим первичной гомогенизации. Гомогенизацию проводили при скорости 24 000об./мин. в интервале времени от 1 минуты до 4 минут. Так как при проведении процесса гомогенизации выделяется достаточное количество тепла за счёт трения вращающихся деталей, длительность одного цикла не должна превышать мин. и между последующими циклами эмульгирования необходимо соблюдать паузы по 1 или более мин. Дальнейшее увеличение времени гомогенизации (> 4 мин.) будет требовать внешнего охлаждения. Экспериментальным путем было установлено, что время первичной гомогенизации сказывалось на степени включения ЛВ в полимерную матрицу и на размере получаемых НЧ. Увеличение времени гомогенизации приводило к небольшому увеличению степени сорбции и уменьшению размера частиц.

Наилучший результат был достигнут при трех кратном гомогенизировании в течение минуты с минутными интервалами. Степень сорбции при этом равнялась 44%±0,57, размер НЧ составил 279нм±8,08.

Для изучения зависимости свойств получаемых НЧ от времени вторичной гомогенизации проводилась серия экспериментов с теми же условиями, что и в предыдущей серии опытов. При прочих равных параметрах синтеза для всех образцов изменялся только режим вторичной гомогенизации. Гомогенизацию проводили при скорости 24 000 об./мин. в интервале времени от 1 минуты до 5 минут. Было выявлено, что время вторичной гомогенизации не оказывает существенного влияния на степень сорбции ЛВ в полимерную матрицу, но отражается на размере получаемых НЧ. Чем более интенсивный и долговременный режим гомогенизации, тем меньше размер получаемых НЧ. В качестве оптимального был выбран временной режим гомогенизации в течение 1 минуты трехкратно с минутными интервалами. Данный режим позволит получить НЧ с наилучшими показателями степени сорбции и оптимальным размером, не требуя больших временных и энергетических затрат.

Было более подробно исследовано влияние времени совместного перемешивания растворов ЛВ и PLGA перед первой гомогенизацией на степень сорбции ЛВ в НЧ.

Время перед вторичным гомогенизированием при этом составляло 20 минут и не изменялось. Максимальная степень сорбции (44%±0,57) была достигнута при совместном перемешивании двух растворов не менее 20 минут, затем она практически не изменялась. На размер получаемых НЧ данный технологический параметр оказывает незначительное влияние.

При изучение зависимости свойств получаемых НЧ от времени совместного перемешивания перед вторичным гомогенизированием в ходе экспериментов было выявлено, что сокращение времени перемешивания смеси перед вторичной гомогенизацией сказывается на степени сорбции ЛВ в НЧ намного меньше, чем сокращение времени перемешивания смеси перед первичной гомогенизацией.

Таким образом, был подобран оптимальный состав наносомальной ЛФ ломефлоксацина и оптимизированы технологические параметры ее получения, что позволило перейти к биологическим методам тестирования наносомального ломефлоксацина.

Результаты изучения специфической антимикробной активности, проведенного in vitro на культурах микроорганизмов с использованием указанной выше оптимизированной наносомальной ЛФ ломефлоксацина: Escherihia coli, Klebsiella pneumonia spp., Staphylococcus aureus, штамм 906, Salmonella enteritidis ATCC 9640, Salmonella infantis spp., Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Pseudomonas aeruginosa spp. приведены на рис. № 3. Из рис. № 3 видно, что включение ломефлоксацина не только не уменьшило его антибактериальной активности, но и в некоторой степени даже увеличило ее (до 14 %). Заключение ЛВ в наносомальную ЛФ также не повлекло за собой исчезновения бактерицидной активности ломефлоксацина. Чуть более эффективным по сравнению с чистым ломефлоксацином оказался наносомальный ломефлоксацин при воздействии на такие микроорганизмы как Salmonella enteritidis ATCC 9640. Практически во всех опытах было отмечено, что вторичная зона роста бактерий отсутствует там, где в качестве испытуемого образца был взят наносомальный ломефлоксацин, что может свидетельствовать о пролонгированном действии данного препарата. Особенно это явление было выражено в опыте, где в качестве испытуемых бактерий использовали Escherihia coli.

Рисунок 3.

Было проведено определение острого токсического эффекта. При однократном пероральном введении максимально возможных доз полимера, содержащего ломефлоксацин, в количестве от LD50 (LD50 для мышей=4г/кг) и введении эквивалентного количества чистого ломефлоксацина не было отмечено летальных исходов среди мышей, также не отмечалось визуально явного токсического воздействия и побочных эффектов как в контрольной, так и в испытуемой группах.

Более детальное исследование токсических эффектов при однократном и систематическом введении сополимера молочной и гликолевой кислоты не проводилось, хотя имеются литературные данные об их наличии.

При создании наносомального ЛП необходимо добиться максимального включения ЛВ в полимерную матрицу, но не менее важно затем оценить насколько полным будет высвобождение лекарственной субстанции из НЧ в условиях живого организма, и каким образом будет изменяться концентрация ЛВ в плазме крови и различных органах и тканях во времени. Именно с этой целью была проведена серия опытов по изучению высвобождения ЛВ из полимерной матрицы in vivo на крысах линии Wistar.

Сравнительная фармакокинетика свободного и наносомального ломефлоксацина изучалась с использованием крыс-самцов линии Wistar массой 240-250 г (питомник РАМН «Столбовая», Москва). Животные содержались на обычном пищевом рационе.

Лекарственные формы ломефлоксацина и наносомальный ломефлоксацин растворяли в воде для инъекций. Экспериментальные животные были разделены условно на две группы. Животным из первой группы вводили перорально однократно наносомальный ломефлоксацин (с содержанием действующего вещества 5,8% от общей массы) в дозе 270 мг/кг); животным второй группы, взятой в качестве сравнения вводили субстанцию ЛВ в эквивалентных количествах. Далее через определенные промежутки времени умерщвлялись экспериментальные и контрольные крысы. Выборка для каждой определяемой временной точки составляла 5 крыс. У крыс забирали органы и цельную кровь из полости сердца без использования гепарина. Полученный в результате пробоподготовки биологического материала образец анализировали с помощью ВЭЖХ.

Для характеристики изменения концентрации ломефлоксацина в крови и органах крыс во времени рассчитывали интегральный показатель площади под фармакокинетической кривой. Процент от дозы рассчитывали, исходя из значений масс органов (как правило масса навески составляла 1,8-2,1 г органа. Объем крови принимали равным 7% от массы животного. Адекватность выбранной модели для описания распределения исследуемых препаратов в организме экспериментальных животных подтверждаются полученными графиками, из которых следует, что фармакокинетическая зависимость, построенная по экспериментальным данным, практически полностью совпадает с зависимостью, моделирующей типичную кинетику второго порядка (двухчастевая математическая модель фармакокинетики).

Основные фармакокинетические константы субстанции ломефлоксацина, и ломефлоксацина, ассоциированного с полимерными наночастицами, обработаны с помощью двухчастевой математической модели и представлены в таб.№ 1.

Как видно из представленных данных, фармакокинетические константы, а именно время полувыведения (T) и среднее время удерживания (MRT) антибиотика, связанного с наночастицами, увеличилось по сравнению с константами антибиотика сравнения в случаях с некоторыми органами в 3,2 раза, что свидетельствует о наличии пролонгированного эффекта у наносомального ломефлоксацина.

C max/AUC MRT (среднее время Кр (коэфф.

Распределения) AUC ткани/AUCкрови Таблица № проанализированы далее для каждого из исследуемых органов отдельно.

Рисунок 4.

Как видно из рисунка № 4 фармакокинетические кривые субстанции ЛВ и ее наносомальной формы резко различаются между собой. В случае однократного перорального введения субстанции ломефлоксацина, его концентрация в печени возрастает до максимума через 2 часа и быстро спадает практически до нуля. В случае применения наносомальной лекарственной формы резкого скачка концентрации не наблюдается, определенный концентрационный уровень антибиотика поддерживается на протяжении всего изучаемого временного отрезка. О пролонгации нахождения антибиотика в исследуемом органе свидетельствует изменение среднего времени удержания (MRT), для наносомальной ЛФ этот показатель выше в 2,85 раза, а также площадь под фармакокинетической кривой (AUC), для наносомальной ЛФ этот показатель выше в 1,78 раза. Время полувыведения у испытуемого образца и контроля также значительно различалось. Для наносомальной ЛФ ломефлоксацина Т1/ составило 8,85 часа, а для субстанции ЛВ 2,13 часа. Показатели клиренса, константы характеризующей способность организма к элиминации (удалению) препарата, в данном случае также различаются более чем в 2 раза, что также указывает на более длительное присутствие ЛВ в печени по сравнению с чистым веществом.

Профили графиков изменения концентрации ломефлоксацина в почках с течением времени при однократном пероральном введении экспериментального образца и контроля оказались различны. Максимальная концентрация ЛВ при введении ломефлоксацина в наносомальной ЛФ достигается в почках уже через 1 час после перорального введения, однако она несколько ниже, максимальной концентрации препарата при его введении в виде чистой субстанции. Затем, в случае введения контрольного образца, концентрация ломефлоксацина резко возрастала и падала практически до нуля в течение первых 12 часов, в то время как при введении наносомальной ЛФ концентрация ломефлоксацина оставалась постоянной на оптимально высоком уровне и очень плавно снижалась в течение первых 24. Время полувыведения ломефлоксацина, значения клиренса и коэффициенты распределения в почках как для чистой субстанции, так и для наносомальной ЛФ приведены в таблице №1.

В легких при введении наносомального ломефлоксацина максимальная концентрация действующего вещества достигается через 1 час после однократного перорального приема и поддерживается на достигнутом уровне практически на протяжении часов. При аналогичном введении контрольного образца, максимальная концентрация ЛВ достигается через два часа и в 1,5 раза превышает максимальную концентрацию, достигаемую при введении нано-формы, но значительно быстрее снижается и после часов практически равна нулю. На рисунке № 5 четко видно наличие пролонгированного эффекта наносомального ломефлоксацина, о наличии которого также свидетельствует время полувыведения; для чистой субстанции время полувыведения составило 2,12 часа, а для нано-формы – 9,21 часа. Показатели клиренса и время удерживания для наносомального препарата в случае с легкими в три раза ниже, чем для чистой субстанции, введенной в качестве контроля.

Рисунок 5.

Рисунок № 6.

Графики изменения концентрации ломефлоксацина в селезенке с течением времени при однократном пероральном введении субстанции ЛВ и ЛВ, включенного в состав НЧ, схожи по профилю (рис. №6). Время достижения максимальной концентрации ЛВ в органе совпало как для образца, так и для контроля (2 часа с момента перорального введения). Важно отметить, что в случае с селезенкой максимальная концентрация ЛВ при введении наносомального препарата незначительно превышает максимальную концентрацию, достигнутую при ведении чистой субстанции ломефлоксацина. В данном случае также имеет место пролонгированный эффект, о котором свидетельствуют такие показатели, как клиренс и среднее время удержания ЛВ. Для наносомального ломефлоксацина в случае изучения селезенки указанные параметры в 2-3 раза ниже, чем для контроля. Сходные данные были получены при изучении сердечной мышцы и крови.

При однократном пероральном введении наносомальной ЛФ в предстательной железе максимальная концентрация ЛВ оказалась ниже, чем при введении чистой субстанции (рис. №7). Клиренс и среднее время удерживания совпадали как в случае с образцом, так и в случае с контролем.

Рисунок № 7.

Значимого пролонгированного эффекта, сопровождающегося поддержанием концентрации ЛВ в исследуемом органе на терапевтически значимом уровне для наносомального ломефлоксацина в случае с предстательной железой не отмечено.

После описания изменений в распределении исследуемого ломефлоксацина, вводимого в различных ЛФ, по отдельным органам необходимо остановиться на общей картине распределения антибиотика в организме экспериментальных животных. В ходе данного исследования отмечено перераспределение ЛВ в зависимости от ЛФ, в составе которой был введен. Полученные данные представлены на рис. № 8.

Рисунок № Из рисунка № 8 видно, что при введении ломефлоксацина в виде его наносомальной ЛФ удается увеличить степень его проникновения в печень, легкие и селезенку, т. е. в органы РЭС, а также в сердечную мышцу, в отличие от предстательной железы, степень проникновения ЛВ в которую снизилась.

Из приведенного выше материала можно сделать вывод о том, что НЧ из сополимеров молочной и гликолевой кислот, используемые в качестве носителя для действующего ЛВ, существенно меняют фармакокинетику ломефлоксацина в организме крыс. Установленно, что биодеградируемые и биосовместимые НЧ, использованные в качестве полимера-носителя при пероральном применении увеличивали биодоступность ЛВ, пролонгировали время его нахождения в организме, за счет его более длительного удержания в органах РЭС (эффект депонирования) и изменяли его распределение между тканями и органами, о чем свидетельствуют такие показатели, как площадь под фармакокинетической кривой (AUC), клиренс, среднее время удерживания (MRT), и коэффициент распределения Кр.

В данной работе был разработан метод включения противомикробного антибиотика широкого профиля фторхинолонового ряда – ломефлоксацина в состав частиц субмикронного размера на основе сополимера молочной и гликолевой кислот, с целью повышения эффективности и безопасности ЛВ, а также обеспечения его пролонгированного эффекта. Отбор оптимального состава и технологических параметров получения полимерных композиций проводился с использованием таких критериев, как размер полимерных частиц и степень включения в них ломефлоксацина. Удовлетворительными считались результаты позволяющие получать частицы с размерами от 100 до 500 нм и степенью включения ЛВ > 30 %.

В ходе выполнения работы было установлено, что оптимальным является состав наносомальной ЛФ ломефлоксацина, указанный в таблице № 2.

Таблица № 2 Состав лекарственного препарата (ЛП) В ходе выполнения данной научно-исследовательской работы была оптимизирована технология получения наносомальной ЛФ ломефлоксацина.

Оптимальным является использование в качестве растворителей 1) для ломефлоксацина -0,01 М раствор соляной кислоты, 2) для полимера – хлороформ;

соотношение водной и органической фазы 1:2,5; соотношение полимер:ЛВ 7:1;

использование стабилизатора первичной эмульсии Poloxamer 188. Кроме того, было установлено, что время совместного перемешивания компонентов перед первичным и вторичным гомогенизированием смеси должно составлять 20 минут; рекомендуемый режим первичной и вторично гомогенизации заключается в следующем: 1.скорость вращения ротора гомогенизатора – 24 000 об./мин; 2. время гомогенизации – трехкратно по одной минуте с минутными интервалами. Показана стабильность ЛФ при хранении более 1 года.

Полученная наносомальная ЛФ ломефлоксацина была охарактеризована с помощью различных физико-химических методов: уф-спектроскопии, ВЭЖХ, фотонной-корреляционной спектроскопии и т. д. Была также изучена кинетика высвобождения ЛВ из полимерной матрицы в модельных опытах в условиях равновесного диализа. Время полного высвобождения ЛВ из наночастиц составило 96 часов. Полученная наносомальная ЛФ может храниться без признаков разложения антибиотика в течение 1 года при 5-8 °С в защищенном от света месте.

Было проведено изучение антибактериальной активности полученной новой ЛФ на культурах микроорганизмов: Escherihia coli, Klebsiella pneumonia spp., Staphylococcus aureus, штамм 906, Salmonella enteritidis ATCC 9640, Salmonella infantis spp., Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Pseudomonas aeruginosa spp., которое показало некоторое увеличение активности ЛВ в ЛФ по сравнению с субстанцией ломефлоксацина.

В опытах in vivo на крысах линии Wistar наносомальная лекарственная форма проявила пролонгированность действия, в сравнении с чистым ломефлоксацином.

Изучение общего токсического воздействия наносомального ломефлоксацина на организм мышей не показало его увеличения, а также усиления токсических эффектов, равно как и возникновения новых ранее не описанных нежелательных явлений.

Полученная новая композиция ломефлоксацина может быть использована в виде суспензии для внутримышечного или подкожного введения, кроме того она может быть использована для получения таблеток, капсул и других лекарственных форм перорального применения.

Таким образом, полученная полимерная композиция не уступает по большинству параметров используемым в настоящее время ЛФ ломефлоксацина, а по некоторым из них превосходит. В дальнейшем после определенной доработки новая наносомальная ЛФ ломефлоксацина может стать предметом для внедрения в промышленное производство.

1. В ходе проведенного исследования разработаны подходы к созданию наносомальной ЛФ ломефлоксацина в виде наноразмерных частиц на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот; оптимизированы технологические параметры получения ломефлоксацина, иммобилизованного на НЧ.

2. Изучены физико-химические свойства полученной наносомальной ЛФ ломефлоксацина методами УФ-спектроскопии, ВЭЖХ, фотоннокорреляционной спектроскопии и др.

3. Показано, что иммобилизованный ломефлоксацин превосходит по специфической антимикробной активности субстанцию ломефлоксацина..

4. В опытах in vivo на крысах линии Wistar было показано пролонгированное действие иммобилизованного ЛВ по сравнению с субстанцией ломефлоксацина.

5. Изучено распределение по органам и тканям наносомального ломефлоксацина, полученного на основе сополимеров молочной и гликолевой кислоты.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Климова О. В., Воронцов Е. А. Изучение влияния технологических параметров синтеза на физико-химические свойства наночастиц, получаемых на основе биодеградируемых полимеров. // Наномедицина и токсикология. Сборник тезисов и статей. – М., 2009.- с. 2. Климова О. В., Воронцов Е. А. Влияние технологических параметров синтеза на физико-химические свойства наночастиц с ломефлоксацином на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот. // Материалы VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». – М., 2009.- с. 3. Климова О.В. Подходы к разработке наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина. // Тезисы итоговой научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день». – М.: Издательский дом «Бионика», 2010.

–с. 4. Климова О.В. Разработка методов получения наносомальной лекарственной формы рифампицина на основе полиалкилцианоакрилатов. // Приложение к журналу «Вестник Российской Академии медицинских наук» № 6, 2008.–с. 5. Климова О. В., Воронцов Е. А., Кузнецов С. Л., Северин С. Е. Разработка технологии получения наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот. // Сборник материалов XVII конгресса «Человек и лекарство». – М., 6. Климова О. В. Влияние некоторых параметров синтеза на свойства наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина. // Фармация, 2010, № 2.-с. 37Климова О. В., Воронцов Е.А., Семенов С. Ю., Северин С. Е., Северин Е. С.

Влияние некоторых параметров синтеза на свойства наносомальной лекарственной формы, получаемой на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2010, № 4.-с. 27- 8. Климова О. В., Годованный А.В., Рябцева М.С., Воронцов Е. А., Северин Е.С.

Изучение наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина, полученной на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот на наличие специфической активности и пролонгированного эффекта. // Молекулярная медицина, 2010, № 9. Климова О. В. Изучение наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина, полученной на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот на наличие специфической активности и пролонгированного эффекта. // Материалы VII Международной конференции РАН «Молекулярная медицина и биобезопасность». – М., 2010.- с.