На правах рукописи

ХОВАЕВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ИНФОРМАЦИОННОГО И НОРМАТИВНО-МЕТОДИЧЕСКОГО

ОБЕСПЕЧЕНИЯ СИСТЕМЫ ГИГИЕНИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЗА

ОБОРОТОМ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

14.02.01 – Гигиена

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научноисследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте питания РАМН.

Научные руководители академик РАМН, Тутельян Виктор Александрович доктор медицинских наук, профессор Народицкий Борис Савельевич доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты академик РАМН, Русаков Николай Васильевич доктор медицинских наук, профессор Истомин Александр Викторович доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 14 марта 2011 года на заседании диссертационного совета Д 001.002.01 в НИИ питания РАМН (Москва, Устьинский проезд, д. 2/14)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ питания РАМН.

Автореферат разослан 3 февраля 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Коденцова В.М.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Широкое применение современных методов биотехнологии, и в первую очередь, генной инженерии при производстве продовольствия сегодня признается наиболее перспективным направлением совершенствования качества и увеличения объемов пищевых продуктов.

Разработка и использование генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов (ГММ) с улучшенными технологическими свойствами (повышенная продукция ферментов, биологически активных веществ, устойчивость к микробному загрязнению) выгодны прежде всего экономически, поскольку требуют значительно меньших объемов исходного натурального продовольственного сырья, трудозатрат и времени, чем применение традиционных промышленных микроoрганизмов (Рогов И.А., Воробьев А.И., 2004; Тутельян В.А., 2003; Клер Робинсон, Глик Б., Пастернак Дж., 2002; Народицкий Б.С., 2006; MacKenzie D. J., 2000; James C., 2009; Chrispeels M.J., 2008).

Вместе с тем, большинство экспертов признает, что новые качества ГММ, особенно не имеющие истории безопасного использования в пищу, могут быть связаны с потенциальным риском для человека и окружающей среды, а созданные генетически модифицированные продукты (ГМ-продукты) перед выпуском на потребительский рынок в обязательном порядке должны подвергаться комплексным испытаниям на безопасность. При этом должно быть доказано отсутствие рисков неблагоприятного воздействия на человека и окружающую его среду, обусловленных как самими целевыми генами, так и кодируемыми ими новыми белками (в первую очередь, патогенности, аллергенности, токсичности). Одним из главных аргументов против использования трансгенных технологий в производстве пищи является нестабильность генетической конструкции, возможное присутствие генов антибиотикоустойчивости, потенциально способных к трансмиссии в представителей резидентной микрофлоры желудочно-кишечного тракта и контаминации пищевых продуктов (ВОЗ, 2005; Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л., 2006; Тутельян В.А., 2007; Кирпичников М.П., 2008).

Во избежание потенциального неблагоприятного воздействия продуктов, полученных с применением ГММ, на здоровье человека, животных и благополучие окружающей среды, при государственном регулировании генно-инженерной деятельности предусмотрены специальные требования к допуску ГММ и трансгенных продуктов на продовольственный рынок.

Несмотря на существующие различия подходов, во всех национальных схемах регулирования ГМM предрегистрационный этап является определяющим в обеспечении безопасности новых ГМ-продуктов. Он включает индивидуальную оценку риска каждого конкретного ГММ, итогом которого должно быть доказательство такой же степени его безопасности, как и традиционного аналога (Рогов И.А., 2003; Стандарты ЕС CAC/GL 44-2003, CAC/GL 46Сорокина Е.Ю., Тутельян В.А., 2005; ФАО/ВОЗ, 2006, 2008).

В настоящее время в мире не существует единых, гармонизированных подходов к созданию ГММ, к оценке их безопасности, маркировке и допуску трансгенных продуктов на международный рынок продовольствия.

В некоторых технологически развитых странах (США, Канада, Великобритания) в отдельных случаях не придают большого значения мерам контроля за ГММ. При этом мировые производители ссылаются на высокий научный и технологический потенциал при разработке ГММ, должный научно-методический уровень оценки и практически не подвергают сомнению, что любые риски от трансгенных продуктов, признанных безопасными, маловероятны (FDA, 1991; Food Chemicals Codex, 2001; Тутельян В.А., 2005).

Международные организации ФАО/ВОЗ и европейское законодательство стоят на позициях обеспечения прав потребителей на информированный выбор любых новых пищевых продуктов и предупреждения рисков. Механизмы регулирования ГММ должны включать систематический контроль за оборотом разрешенных и допущенных на продовольственный рынок пищевых продуктов, полученных с применением ГММ, а также использование специальной маркировки таких продуктов и технологии их производства (ILSI Europe, 1999; Директивы 18/2001/ЕЕС, 90/220ЕЕС) Вместе с тем, во многих странах, в т.ч. государствах Европейского сообщества, не предусматривается маркировка допущенных на рынок трансгенных продуктов, выработанных по технологиям, предусматривающих полную очистку конечных продуктов от ГМ штаммовпродуцентов. В последние годы вследствие причин экономического характера производство по данным технологиям переносится в регионы с менее развитой культурой производства и дешевой рабочей силой. Данное обстоятельство является причиной риска некачественного полного удаления ГМ штаммов из продуктов и может привести к попаданию на рынок продовольствия живых ГММ (Правила ЕС 1829/2003, 1830/2003; Брукс Г., Барфут П., 2006).

Поступление на мировой продовольственный рынок ГМ-продуктов без маркировки в результате нерегулируемого статуса ГММ на пострегистрационном этапе, помимо нарушений прав потребителей, создает серьезную проблему в оценке безопасности при ввозе ГММ, которая должна проводиться с учетом требований законодательства импортирующих стран.

Наряду с мониторингом ГММ, разрешенных для реализации на внутреннем потребительском рынке, необходимо обеспечивать контроль и защиту от потенциально небезопасных, не прошедших процедур допуска и поступающих в страну нелегально, а используемые методы должны опережать развитие технологий создания ГММ и базироваться на современных приоритетных исследованиях биологической и медицинской науки, молекулярной биотехнологии.

Поэтому контроль за оборотом ГММ в настоящее время является одной из наиболее актуальных проблем, решение которых направлено на охрану здоровья населения и имеет большое социальное значение. Разработка системы гигиенического контроля ГММ в пищевых продуктах была начата в 2003-2004 гг., включает новейшие отечественные и зарубежные научные подходы и основана на всестороннем научно-организационном, информационном, методическом обеспечении мероприятий по изучению, обнаружению и оценке безопасности ГММ, разработке соответствующих им маркерных систем; продуктов, в которые они вводятся; объемов мирового производства и торговли ГМ-продовольствием, в том числе поступающего на внутренний рынок Российской Федерации; а также на разработку и применение адекватных, чувствительных и высокоспецифичных методов и средств обнаружения, анализа безопасности ГММ (Скрябин К.Г., 2003; Народицкий Б.С.,2004; Онищенко Г.Г., Филатов Н.Н., Гульченко Л.П., 2008).

Исследования проводились в соответствии с планами НИР по теме № 098: «Генноинженерно-модифицированные источники пищи: безопасность и контроль».

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы являлась разработка информационного и нормативнометодического обеспечения системы гигиенического контроля за оборотом пищевой продукции, полученной с использованием ГММ.

Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

на основании анализа данных литературы, изучения объемов мирового производства ГММ, структуры и объемов импорта в РФ пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, и их традиционных аналогов, разработать информационные (справочные) базы данных о ГММ с учетом безопасности классических промышленных микроорганизмов и пищевых продуктов – потенциальных объектов генетических модификаций;

провести выборочные исследования репрезентативного перечня различных видов пищевой продукции, изготавливаемой с использованием биотехнологических микроорганизмов, на наличие ГММ с целью оценки риска допуска на рынок продовольствия потенциально опасных трансгенных продуктов;

на основании сравнительного анализа применяемых методов обнаружения и оценки безопасности ГММ в пищевой продукции и результатов лабораторного тестирования пищевых продуктов обосновать необходимость применения скрининговых методов и средств для детекции ГММ при ввозе из-за рубежа и реализации продукции на продовольственном рынке;

разработать унифицированный метод, диагностический набор и алгоритм проведения анализов для лабораторного контроля и мониторинга продукции в обороте для специалистов учреждений санитарно-эпидемиологической службы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые разработаны новые подходы к информационному анализу и нормативнометодическому обеспечению системы контроля пищевой продукции, основанные на молекулярно-генетических методах обнаружения и оценки безопасности ГММ в трансгенных и традиционных продуктах, которые могут служить объектами генно-инженерных модификаций.

Проведен научный анализ и разработаны информационные базы промышленных ГММ и их классических аналогов, представленных на мировом продовольственном рынке, статус легитимности, безопасности, уровень внедрения в производство (коммерциализации), определены ведущие страны и разработчики ГММ и пищевых продуктов на их основе.

Научно обоснована необходимость контроля (мониторинга), направленного на выявление живых ГММ в пищевых продуктах, содержащих пробиотическую микрофлору, на подтверждение отсутствия штаммов ГМ-продуцентов в ферментных препаратх, биологически активных веществах, пищевых добавках, используемых при производстве пищевых продуктов и подлежащих удалению из конечного продукта.

Изучена распространенность ГМ-штаммов, представленных на мировом продовольственном рынке. Представлены методы идентификации, важные при осуществлении контроля на наличие в пробах ГММ, применяемых при производстве пищевой продукции. Рассмотрены результаты микробиологических и молекулярно-генетических анализов пищевых ингредиентов, важные при контроле пищевых продуктов на наличие ГММ, указаны методы их определения и оценки безопасности, адекватные степени риска нелегитимного использования ГММ при производстве пищевых продуктов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Информационные базы ГММ, их традиционных аналогов, пищевой продукции, вырабатываемой с использованием промышленных микроорганизмов, алгоритмы лабораторного контроля были использованы при разработке Санитарно-эпидемиологических правил и нормативов СанПиН 2.3.2.2340-08 (Дополнения и изменения № 6 к СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов»).

Разработаны и внедрены в практику лабораторного контроля пищевой продукции в обороте Методические указания МУК 4.2.2305-07 «Определение генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией».

Разработан Набор реагентов («ГМ-БАКТ-1») для выявления ГММ бактериальной природы методом полимеразной цепной реакции в пищевых продуктах (ТУ 9398-001-01897357который применяется при контроле ГММ в учреждениях Роспотребнадзора.

Результаты работы используются в учебном процессе МПФ ГОУ ППО Первого Московского медицинского университета им. И.И.Сеченова Росздрава на кафедре инфектологии, кафедре гигиены питания и токсикологии и кафедре социальной гигиены и организации санитарно-эпидемиологической службы с курсом основ лабораторного дела на базе ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертационной работы были доложены на 6-й и 7-й всероссийских конференциях «Молекулярная диагностика – 2007, 2010» (Москва, 28-30 ноября 2007 г.

и 24-26 ноября 2010 г.), диссертация апробирована на совместной научной конференции ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России и НИИ питания РАМН декабря 2010 г.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки РФ, методические указания, санитарные правила и нормы.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 201 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обоснования цели и выбора методов исследования, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, приложения, включает 5 схем, 7 таблиц и 17 рисунков и диаграмм. Список литературы содержит 124 отечественных и 81 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследований использовали:

1. пищевые продукты, содержащие живые традиционные пробиотические микроорганизмы (кисломолочные продукты, сыры, напитки брожения, БАД к пище) и содержащие ингредиенты, полученные с использованием штаммов-продуцентов (ферментные препараты, витамины, незаменимые аминокислоты);

2. технологические пищевые добавки (ингредиенты), содержащие живые традиционные пробиотические микроорганизмы (бактериальные заквасочные, стартерные культуры), ферментные препараты, витамины, синтезированные из классических и ГМ-штаммов.

При выборе пищевых продуктов для лабораторного контроля на наличие ГММ учитывали современный перечень пищевых добавок и ингредиентов, получаемых из микроорганизмов, перечень традиционных пробиотических продуктов, рейтинги объемов использования промышленных микроорганизмов, перечень ГММ, имеющих официальное разрешение на применение в пищевой промышленности и получаемых на их основе пищевых добавок и ингредиентов.

Все образцы пищевых продуктов имели необходимую сопроводительную документацию, в которой имелись спецификация продукта и указание области применения, паспорт штамма, идентификационные данные, место депонирования, микробиологическая характеристика, устойчивость к антибиотикам, патогенность и другие свойства.

Были исследованы 1090 проб (образцов) пищевой продукции, предоставленных НИИ питания РАМН и учреждениями Роспотребнадзора. Количество и основные группы исследованной пищевой продукции представлены в таблице 1.

1 Закваски бактериальные (для производства кисломолочных продуктов, 2 Стартовые культуры (для производства колбас, сыров и т.д.) В том числе Ферментные препараты, полученные с применением ГММ 4 Пищевые добавки, в т.ч. дрожжи (для производства хлебобулочных изде- 5 Биологически активные добавки к пище (БАДп), содержащие пробиотики Лабораторные исследования проводили в аккредитованном испытательном лабораторном центре (ИЛЦ) на базе лаборатории молекулярной биотехнологии, лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов, лаборатории хламидиозов НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи. Для межлабораторных контрольных испытаний привлекалась лаборатория санитарно-пищевой микробиологии и микроэкологии НИИ питания РАМН.

При молекулярно-генетической оценке ГММ в пищевых продуктах в качестве основного метода для обнаружения и идентификация чужеродного генетического материала в штаммах применялась полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Для выявления генетической вставки использовали векторные последовательности.

Специально подобранные пары праймеров использовали как для проверки целевого гена, так и для последовательностей, свидетельствующих о возможных генетических модификациях.

Для обнаружения ГММ выбор праймеров проводили по следующим позициям:

1) для идентификации таксономической принадлежности микроорганизма (гены 16S/23S рРНК или другие специфические последовательности);

2) для идентификации целевых генов генетической вставки (гены, кодирующие продукцию технологически важных ферментов, например, таких как химозин; гены устойчивости к бактериофагам; гены-регуляторы уровня кислотности; гены устойчивости к этанолу и другим стрессовым факторам);

3) для идентификации генов селективных маркеров (гены устойчивости к антибиотикам, бактериоцинам, ауксотрофным селективным маркерам);

4) для идентификации маркерных (screenable) векторных генов (гены E.coli, кодирующие галактозидазу, -глюкоронидазу или гены бактериофага Т7, кодирующие РНК полимеразу);

5) для идентификации неэкспрессируемых последовательностей (полилинкеры, промоторы и терминаторы);

6) для идентификации мигрирующих элементов, используемых для создания транспозируемых векторов (например, Ty –элементы).

Выбор праймеров проводили в соответствии с правилами молекулярного дизайна. Для выбора праймеров использованы программы Primer, Oligo или аналогичные программы, позволяющие осуществлять многофакторный анализ выбранных последовательностей. Сравнительный анализ выбранных олигонуклеотидов производили с помощью программы Blast для исключения наличия областей гомологии с ДНК родственных и неродственных видов.

Конкретный набор праймеров для проведения экспертизы определялся таксономической принадлежностью штамма; информацией о его генетическом статусе и характере генетических модификаций; а также характере и месте использования ГММ в технологии получения пищевых продуктов и вероятности попадания живых ГММ в организм человека.

Выделение ДНК из культур ГММ проводили перед постановкой реакции из замороженной бактериальной пасты по методу Бирнобойма и Доли.

Проведение ПЦР осуществляли с помощью ДНК-амплификаторов (термоциклеров) «Терцик» мод. ТПЧ-ПЦР01 (Россия). Для проведения ПЦР использовали термостабильную Taq-полимеразу, соответствующий ей десятикратный ПЦР-буфер, растворы четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и выбранной пары праймеров.

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в пластине 6%-ного полиакриламидного геля (2,5 ч при 200 в). Для этого применяли прибор для капиллярного электрофореза 3130, Genetic Analyzer (Великобритания). ДНК-маркерами служили стандартный набор фрагментов ДНК плазмиды pBR322, полученный под действием рестриктазы Alu1. Окрашивание фрагментов ДНК осуществляли этидиум бромидом. Анализ результатов и фотографирование электрофореграммы осуществляли в условиях ультрафиолетовой подсветки на трансиллюминаторе.

характеристикам, декларированным производителем продукции, в ПЦР-лабораториях ИЛЦ проводили 2-кратные повторные (арбитражные) исследования. Случаев расхождений результатов при испытаниях в ИЛЦ не зарегистрировано.

Для проведения исследований пищевой продукции на пострегистрационном этапе оборота применяли разработанный и апробированный метод ПЦР-анализа с электрофоретической детекцией. 202 исследования проведены с помощью набора ГМ-БАКТ-1. Для контроля результатов и стандартизации метода одновременно исследования проводили в ПЦРлаборатории ИЛЦ.

Лабораторные исследования включали последовательные процессы: подготовка проб, выделение ДНК из образца пищевых продуктов, амплификацию ДНК, детекцию ДНК, анализ и интерпретацию результатов.

Метрологическую оценку методов и полученных результатов проводили по ГОСТ Р ИСО 5725-2002. Для статистической обработки были использованы методы описательной статистики (среднее значение, стандартное отклонение, стандартная ошибка среднего, медиана, максимум, минимум). Значимость расхождения результатов оценивали по критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ мирового и отечественного продовольственного рынка ГММ Анализ мирового продовольственного рынка показывает, что основные категории пищевой продукции, получаемой с применением биотехнологий, включают продукты:

- содержащие живые/жизнеспособные микроорганизмы (сбраживающие культуры для хлебопечения и пивоварения, молочнокислые бактерии и др.).

- содержащие нежизнеспособные/инактивированные ГММ.

- содержащие отдельные ингредиенты или добавки, синтезируемые ГММ (ферменты, витамины, незаменимые аминокислоты).

- содержащие отдельные ингредиенты, обработанные синтезируемыми ГММ ферментами, красителями и т.п.

Промышленные культуры микроорганизмов, имеющие документально подтвержденную историю безопасного применения, в первую очередь являются объектами генетических модификаций и используются для создания высокотехнологичных ГММ.

Данные мониторинга генно-инженерных биотехнологий и полученных с их использованием трансгенных микроорганизмов свидетельствуют о значительной роли промышленных пищевых микроорганизмов в производстве продовольствия.

Вследствие отсутствия веских доказательств безопасности и наличия рисков в мировом сообществе в настоящее время ГММ в жизнеспособном состоянии при производстве пищевых продуктов не применяются.

Доля пищевой продукции, содержащей инактивированные (убитые) ГММ крайне незначительна, не получила большого распространения, так как требует обязательной маркировки. Инактивация ГММ в ряде случаев приводит к снижению пищевой ценности, качества и ухудшению потребительских свойств продукта.

Подавляющую часть мирового биотехнологического рынка, получившего наибольшее развитие в последнее десятилетие и соответствующего требованиям безопасности, занимает пищевая продукция, где ГМ-штаммы применяются только в качестве продуцентов пищевых ингредиентов на производственном этапе и подлежат полной очистке продукта от штаммовпродуцентов на конечном технологическом этапе.

Изучение научных и промышленных разработок ГММ для применения в пищевой индустрии позволяет сделать вывод о преимущественном использовании ГММ только в качестве продуцентов необходимых пищевых ингредиентов. Технологии безопасного использования ГММ предусматривают полное удаление штамма-продуцента из конечного продукта.

В настоящее время в большинстве экономически развитых стран имеются развернутые и постоянно обновляющиеся базы данных о поддерживаемом фонде бактерий, мицелиальных грибов, дрожжей, в том числе ГММ, имеющих промышленное значение и депонированных в различных национальных Коллекциях микроорганизмов и клеточных культур. Информационные базы основных Коллекций (АТСС Американская коллекция культур (American Type Culture Collection), DSMZ Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), BKM (Всесоюзная, ныне Всероссийская, Коллекция Микроорганизмов) позволяют получать информацию о поддерживающихся культурах в необходимом для пользователя виде.

При разработке системе гигиенического контроля за оборотом пищевой продукции, полученной с применением ГММ, должна учитываться степень безопасности, которые связаны с родовидовой принадлежностью штамма-донора и микроорганизма-реципиента, а также истории длительного безопасного применения.

Анализ безопасности ГММ в равной мере свидетельствует, как о широком применении технологии самоклонирования микроорганизмов, так и технологий получения ГММ из гетерологичных микроорганизмов.

В настоящее время при производстве пищевых продуктов учитывается степень риска и безопасности ГММ.

Первый класс безопасности – штамм-донор генетического материала и штаммреципиент принадлежат строго к одному и тому же роду, виду; являются микроорганизмами, имеющими длительную историю безопасного использования в пищу человеком.

В настоящее время в мировом научном сообществе нет единого мнения, согласно которому микроорганизмы полученные с применением биотехнологических методов самоклонирования относятся к ГММ. В ряде стран восточной Азии ( Китай, Япония) самоклонированные микроорганизмы не считаются ГММ. В странах ЕС и России любые генные манипуляции с целью самоклонирования считаются генно-инженерными модификациями.

Второй класс безопасности - обмен генетическим материалом осуществлен между микроорганизмами, имеющими статус GRAS, но таксономически принадлежащими к различным родам. Третий класс безопасности - донорская ДНК принадлежит к роду организмов, не имеющему статуса GRAS. Рекомбинантные штаммы не должны содержать чужеродной ДНК кроме целевого гена, что должно быть подтверждено соответствующими исследованиями.

В 2009 г. (рисунок1 ) мировой объем продаж составил 440 млн. евро, в том числе ферментов, произведенных с применением традиционных (классических) штаммов-продуцентов - 180 млн. евро (41% от общего объема продаж), гомологичных ГММ 1-2 классов безопасности - 132 млн. евро (30% от общего объема продаж). Объем продаж ферментов из гетерологичных ГММ 3 класса безопасности составил 128 млн. евро (29% от общего объема продаж Объёмы продаж ферментных препаратов, полученных из различных групп промышленных микроорганизмов,на мировом продовольственном рынке в 2009 году, в млн. евро (по данным Ассоциации производителей ферментных продуктов (Amfep)) Анализ отечественного рынка продовольствия (таблица 2) свидетельствует о преимущественной доле импорта, который, в целом, составляет более 85%. Среди странэкспортеров наиболее значимы государства Европейского Союза. Продукция этих стран составляет почти 70% от всей продукции и более 80% от всего импорта. В странах ЕС основными производителями и экспортерами являются Дания, Германия, Ниделанды. Рынок продукции из США, Китая значительно уступает европейскому и составляет в среднем 4%.

Производство пищевой продукции с использованием микроорганизмов в странах СНГ и ее экспорт в Россию составляют менее 2%, что косвенно свидетельствует о низком уровне развития биотехнологий.

Репрезентативная выборка зарубежной и отечественной пищевой продукции, полученной с использованием промышленных микроорганизмов Всего На отечественном продовольственном рынке ГММ применяются при производстве разнообразных ферментных препаратов, а также пищевых добавок, представляющих собой в основном витамины (провитамин А – бета-каротин, витамин В2 – рибофлавин, витамин В - цианокобаламин) для обогащения пищевых продуктов, низин, натамицин для стабилизации и консервации продуктов. По отношению к данным группам продуктов доля ферментных препаратов, полученных с применением ГММ, составляет около 27%, а пищевых добавок около 7%. В целом, пищевые ингредиенты, полученные с использованием ГММ, составляют 9,4% от числа всех ферментных препаратов, получаемых с помощью микробного синтеза.

Анализ показал (рисунок 2) ГММ на продовольственном рынке России составляют около 10%, остальные 90% продукции представляют собой различные заквасочные и стартерные культуры (31%), пищевые продукты и биологически активные добавки к пище (20%), содержащие классические (природные) традиционные пищевые микроорганизмы, или их продуценты в ферментных препаратах (28%) и пищевых добавках (14%).

Количество импортных и Российских пищевых продуктов, Закваски бактериальные (для Результаты микробиологических и молекулярно-генетических исследований репрезентативной выборки пищевой продукции, произведенной с использованием За период с 2004 по 2010 гг. в России прошли полную медико-биологическую, микробиологическую и молекулярно-генетическую оценку и разрешены для использования в пищевой промышленности более 100 ферментных препаратов, полученных с использованием ГММ (в Государственный реестр пищевых продуктов, материалов и изделий, разрешенных для изготовления или ввоза на территорию РФ и оборота, внесено 70 наименований пищевых ингредиентов из ГММ). В настоящее время перечень такой продукции увеличился.

Проведены микробиологические и молекулярно-генетические исследования (таблица 3) 1292 образцов пищевой продукции, произведенной из или с использованием ГММ и МГМА.

Из них исследованиям и экспертной оценке на наличие ГММ с целью государственной регистрации в России подверглись 1090 проб (образцов). Технологические вспомогательные средства (ферментные препараты и пищевые добавки), полученные с применением ГММ, Молекулярно-генетические исследования бактериальных заквасочных Lactobacillus (acidophilus, casei, delbruecki subsp. subsp. lactis, fermentum, johnsonii, kefiri, lactis, paracasei, plantarum, reuteri, rhamnosus) Lactococcus (lactis subsp. cremoris, subsp. lactis, 122 - subsp. lactis biovar diacetilactis) Leuconostoc (lactis, mesenteroides) 42 - Streptococcus (salivarius, thermophilus) 1 При исследованиях традиционных живых микроорганизмов, входящих в состав бактериальных заквасочных культур и пищевых продуктов из репрезентативной выборки ГММ обнаружены не были.

Результаты лабораторных исследований пищевой продукции, содержащей живые микроорганизмы, в целом, позволили сделать вывод о ее соответствии показателям безопасности, декларируемым изготовителями.

Вместе с тем, в 5 лиофилизированных заквасочных культурах, содержащих Bifidobacterium bifidum, infantis, longum, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus выявлены гены устойчивости к эритромицину, ermC, тетрациклину, tetO.

Устойчивость микроорганизмов к эритромицину и тетрациклину может быть связана с природной множественной резистентностью к антибиотикам, но не была отражена в характеристиках штаммов, удостоверениях Национального Банка Промышленных микроорганизмов и клеточных культур страны-производителя о депонировании штаммов и не декларировалась производителем заквасок. В связи с обнаруженной устойчивостью к антибиотикам продукция была признана несоответствующей требованиям качества и безопасности.

Молекулярно-генетические исследования (таблица 4), показали, что в 4-х ферментных препаратах термостабильной альфа-амилазы, используемых для производства спирта, обнаружены жизнеспособные штаммы-продуценты Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis, ДНК маркерных векторных генов (lacZ), ДНК маркеров устойчивости к ампицилину.

Молекулярно-генетические исследования ферментных препаратов, синтезированных из Наименование штамма ПЦР-анализ Обнаружена Обнаружены мар- ОбнаружеДНК штамма- ДНК штамма- керы антибиоти- ны маркерпродуцента продуцента корезистентности ные гены Молекулярно-генетические исследования ферментных препаратов, синтезированных из Наименование штамма ПЦР-анализ Обнаружена Обнаружены Обнаружены (longibrachiatum) В 1 случае при исследовании ферментного препарата, произведенного с применением ГМ штамма Bacillus subtilis, обнаружены ДНК микроорганизма, маркерные векторные гены (lacZ, Ori), что также свидетельствует о нарушении технологии полного удаления микроорганизма и очистке конечного продукта (таблица 5).

Таким образом, при исследованиях микроорганизмов-продуцентов, применяемых при производстве ферментных препаратов, в ряде случаев были обнаружены ДНК штаммовпродуцентов, селективные маркеры и маркерные векторные гены, свидетельствующие о возможных генетических модификациях (таблица 6).

Признаки генетических модификаций, обнаруженные при исследовании традиционных штаммов-продуцентов ферментов Наличие ДНК живых клеток штамма-продуцента Bacillus licheniformis Наличие ДНК живых клеток штамма-продуцента Bacillus subtilis Анализ данных показал нарушения в методах использования промышленных штаммов, несоблюдения надлежащего качества технологии производства, что явилось причиной непреднамеренной попытки трансграничного перемещения не декларированных ГММ в составе пищевой продукции из региона с низким уровнем репутации экспортируемых товаров.

Анализ ферментных препаратов и пищевых добавок (таблица 7) показал, что при их производстве чаще всего выявляются нарушения технологии очистки конечного продукта, о чем свидетельствуют наличие ДНК штаммов-продуцентов, селективных маркеров и маркерных векторных генов. Выявление ГММ в ферментных препаратах свидетельствует о высокой степени биотехнологических рисков производства и требует лабораторного контроля ГММ.

Частота обнаружения ГММ в ферментных препаратах из классических микроорганизмов из ГММ Таким образом, полученные результаты лабораторных исследований позволяют сделать следующие выводы:

- на продовольственный рынок России поступают микроорганизмы с различными характеристиками (классические, селекционные, полученные с применением методов генной инженерии);

- ГМ штаммы преимущественно применятся при производстве ферментных препаратов и других технологических пищевых ингредиентов;

- наиболее часто встречаются нарушения технологии очистки конечного продукта от штаммов-продуцентов;

- полученные данные о содержании ГММ в ферментных препаратах подтвердили наличие потенциальной опасности для здоровья потребителей пищевых продуктов, полученных с их использованием;

- мониторинг генетических маркеров, свидетельствующих о присутствии ГММ, только на этапах регистрации и допуска на рынок пищевых продуктов является недостаточным для России, импортирующей много продовольствия. В связи с этим для защиты от потенциально небезопасных ГММ контроль такой продукции в обороте должен быть приоритетным направлением в системе гигиенического контроля.

Разработка информационных баз ГММ и традиционных аналогов, Результаты изучения и анализа мирового и отечественного продовольственного рынка ГММ и промышленных микроорганизмов были положены в основу при разработке информационных баз данных, включающих перечень ГММ применяемых в мировом производстве продовольствия, перечень и характеристики штаммов имеющих генетически модифицированные аналоги, перечень и характеристики плазмид используемых для создания ГММ.

В перечень ГММ, имеющих коллекционный статус и применяемых для производства пищевой продукции, вошло 134 микроорганизма. Основными из них являются бактерии, мицелиальные грибы и дрожжи. Удельный вес и характеристика основных ГММ представлены в таблице 8.

Мицелиальные грибы и дрожжи Данные таблицы показывают, что наиболее часто при производстве пищевой продукции используются ГМ-штаммы Bacillus subtilis и Aspergillus oryzae (по 26 штаммов с разными функциональными характеристиками или по 19,4%). ГМ-штаммы-продуценты различных ферментов Aspergillus niger стоят на втором месте по частоте применения. 24 разновидности штаммов Aspergillus niger составляют около 18% от всех зарегистрированных в основных коллекциях. ГМ-штаммы Trichoderma reesei и Bacillus licheniformis также относятся к широко распространенным микроорганизмам, использующихся в качестве продуцентов при производстве ферментных препаратов (20 штаммов Trichoderma reesei и 13 штаммов Bacillus licheniformis, около 15 и 10% от всех ГММ соответственно).

Несмотря на технологическую привлекательность ГМ-штаммы Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Fusаrium venetatum для производства пищевой продукции применяются редко (2-3% от общего числа зарегистрированных промышленных коллекционных ГММ), но для создания всех этих штаммов в качестве донора использовались гетерологичные микроорганизмы.

При изучении трансгенных штаммов микроорганизмов важным является их характеристика безопасности. Так 65% широко использующихся ГММ Aspergillus oryzae и Trichoderma reesei созданы из гетерологичных микроорганизмов и относятся к III классу безопасности и соответственно требуют особого внимания при оценке целесообразности их использования. Вместе с тем другая разновидность генетически модифицированного мицелиального грибка Aspergillus niger в основном, в 70 % случаев, производится из самоклонированных или гомологичных микроорганизмов. ГМ-штаммы Bacillus subtilis создаются в 53% от всех разновиднодностей из самоклонированных или гомологичных микроорганизмов и только в 15% из гетерологичных штаммов.

Изучение пищевой продукции при производстве которой используются различные бактерии, мицелиальные грибы и дрожжи, а также анализ частоты и распространенности имеющих место генетических модификаций позволили систематизировать и сформировать информационную базу основных микроорганизмов, имеющих наибольшее значение при контроле ГММ впищевых продуктах.

Наибольшее число штаммов представлено разновидностями Escherichia coli (более штаммов). Escherichia coli является наиболле удобным и широко используемым материалом для проведения генетических модификаций, создания плазмид и ГММ. Бактерия Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835) Cohn 1872 имеет 23 классических штамма, подвиды Bacillus sp. - штамма, Streptomyces sp. - около 400 штаммов. Использование информационной таблицы позволяет сравнить характеристики изучаемого штамма со штаммами, депонированными в коллекциях ВКПМ и DSMZ.

Сравнительный анализ микроорганизмов, используемых при производстве пищевой продукции, депонированными в основных коллекциях позволили разработать информационную базу плазмид, используемых для создания ГММ, которая содержит идентификационные данные, информацию о маркерах для их обнаружения и идентификации, характеристики плазмид.

База содержит характеристику более 250 плазмид. Использование информации о плазмидах, использующихся для создания ГММ, облегчает сравнительную экспертную оценку микроорганизмов, применяемых для производства конкретной пищевой продукции.

Разработка алгоритмов проведения лабораторного контроля ГММ На основании анализа зарубежных методических подходов к контролю за оборотом ГММ, особенностей отечественного рынка ГММ и существующих нормативных требований к их обороту были разработаны алгоритмы проведения лабораторного контроля на наличие ГММ в пищевых продуктах в обороте.

Алгоритм 1 (рисунок 3) лабораторного контроля пищевой продукции, произведенной с использованием живых МГМА на наличие ГММ 1. Подтверждение родовой или видовая принадлежПоложительное и/или видовой принадлежно- ность микроорганизма сопродукт рекости микроорганизма соглас- гласно представленной заямендуется к исно сопроводительной доку- вителем документации.

2.Выявление в образце пищевого продукта ДНК марНе подтверждена родокерных векторных генов (наОтрицательное Алгоритм 2 (рисунок 4) лабораторного контроля пищевой продукции, произведенной с использованием ГММ, не допускающей или допускающей присутствие ДНК штамма-продуцента согласно нормативной документации (НД), включает следующие последовательные анализы.

1. Выявление ДНК ГМ 2. Выявление в образце ДНК маркерных векторнию) ных генов (генов Антибиотикорезистентности и др.) 1. Обнаружено присутствие Разработанные алгоритмы лабораторного контроля пищевой продукции адаптированы для пострегистрационного мониторинга ГММ в обороте и были использованы при разработке СанПиН 2.3.2.2340-08 (Дополнения и изменения № 6 к СанПиН 2.3.2.1078- «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов»).

Разработка скрининговых методов и средств лабораторного контроля ГММ Анализ наиболее распространенных ГМ-штаммов и обобщение опыта проведения молекулярно-генетического и микробиологического анализа пищевых продуктов на наличие ГММ в ИЛЦ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи позволили обосновать и разработать скрининговые методы детекции ГММ, направленные на выявление наиболее типичных маркерных и селективных генов, используемых в генетических конструкциях по технологии рекомбинантных ДНК в различных группах микроорганизмов (бактерии и грибы), используемых в пищевой промышленности.

Для применения в лабораториях учреждений Роспотребнадзора, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор и контроль, были разработаны методы определения ГММ в пищевой продукции, полученной из/или с использованием микроорганизмов. Методы основаны на постановке ПЦР в реальном времени или ПЦР с детекцией результатов методом электрофореза.

С целью обеспечения единого методического подхода для определения ГММ при мониторинге пищевой продукции применение этих методов нормировано и утверждено Главным государственным санитарным врачом в Методических указаниях МУК 4.2.2305-07.

Требования, которые учитывались при разработке методов детекции ГММ, включали доступность оборудования и материалов, типовая оснащенность ПЦР-лаборатории, уровень подготовки врача-микробиолога (вирусолога) Центра гигиены и эпидемиологии.

Для разных видов пищевых продуктов были подобраны специальные методы пробоподготовки и экстракции ДНК.

Для выявления генетических модификаций у микроорганизмов бактериальной природы был выбран и скомпонован в виде тест-систем ряд праймеров для анализа маркерных генов, наиболее часто употребляющихся при конструировании ГММ. Поскольку эти маркерные гены происходят из не пищевых микроорганизмов, то обнаружение таких последовательностей в штаммах, используемых при производстве пищевых продуктов, может свидетельствовать о произведенных генетических модификациях. В систему входят праймеры, фланкирующие следующие последовательности:

1. гена ermC, кодирующего устойчивость к эритромицину у плазмиды pE Staphylococcus aureus (размер фрагмента 349 п.н.);

2. гена tetO, кодирующего устойчивость к тетрациклину хромосомы Streptococcus pneumoniae, (размер фрагмента 242 п.н.);

3. гена amp, кодирующего устойчивость к ампициллину плазмиды pBR322, (размер фрагмента 321 п.н.);

4. гена lacZ, кодирующего фермент -галактозидазу хромосомы Esherichia coli, (размер фрагмента 158 п.н.).

5. гена ori, кодирующего ориджин репликации, плазмиды p15A Esherichia coli, (размер фрагмента 382 н.п.);

6. гена hph, кодирующего устойчивость к гигромицину, хромосомы Streptomyces hygroscopicus, (размер фрагмента 288 н.п);

7. гена Sh ble, кодирующего устойчивость к блеомицину, хромосомы Streptomyces verticillus (размер фрагмента 301 н.п.).

Лабораторные исследования включают последовательные процессы: подготовка проб, выделение ДНК из образца пищевых продуктов, амплификацию ДНК, детекцию ДНК методом электрофореза, анализ и интерпретацию результатов.

Метод ПЦР с электрофоретической детекцией является наиболее доступным и приемлемым для целей лабораторного контроля наличия ГММ при мониторинге пищевых продуктов на пострегистрационном этапе оборота.

Развитие системы идентификации ГММ в пищевой продукции связано с количественным определением специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Наиболее перспективным является метод ПЦР в реальном времени, основанный на детекции флюоресценции, отражающей накопление ампликонов на каждой стадии амплификации ДНК определенного ГММ в пище.

Молекулярно-генетический анализ пищевой продукции на наличие ГММ методом ПЦР в реальном времени проводится с использованием амплификаторов с оптической приставкой типа Rotor Gene – 3000, ABI Prism 7000, iCycler IQ или отечественные аналоги производства «Синтол», «ДНК-технология».

Исследования проводят с использованием модифицированного комплекта реагентов для амплификации ДНК. Модификация заключается в использовании в реакционной смеси не только праймеров, но и флуоресцентно-меченых зондов “Taqman”, а также использование контрольной ДНК в нескольких десятикратных разведениях известной концентрации.

Метод ПЦР в реальном времени является информативным и одновременно более сложным и требует специального оборудования и навыков работы с генетическим материалом.

Метод ПЦР с электрофоретической детекцией более подходит для скрининговых исследований пищевых продуктов на наличие ГММ. Анализ наиболее типичных ГММ, применяемых в производстве пищевых продуктов, позволили оптимизировать число праймеров для разработки тест-системы для лабораторного контроля ГММ в обороте.

Для реализации целей контроля в НИИ эпидемиологии и микробиологии им.

Н.Ф.Гамалеи РАМН был разработан набор реагентов ГМ-БАКТ-1 (ТУ 9398-001-01897357для выявления ГММ в пищевых продуктах, который позволяет производить детекцию ГММ подготовленному врачу-микробиологу (вирусологу) в условиях ПЦР-лаборатории.

Набор реагентов для выявления ДНК генетически модифицированных микроорганизмов методом ПЦР представляет собой многокомпонентный набор, предназначенный для качественного определения ДНК ГММ в пищевых продуктах, ферментных препаратах, стартерных и заквасочных культурах, БАД к пище.

При апробации и стандартизации тест-системы для проведения исследований использовались программируемый термостат (ДНК-амплификатор) типа “Терцик МС2” или иные типы амплификаторов, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке, термостат поддерживающий температуру + 45оС, Центрифуга со скоростью вращения ротора до 12000 об/мин, встряхиватель вибрационный типа “Вортекс” со скоростью вращения до 3000об/ мин, прибор для горизонтального электрофореза и другие типовые лабораторные материалы.

В систему входят праймеры, фланкирующие следующие последовательности:

- гена amp, кодирующего устойчивость к ампициллину плазмиды pBluescriptII;

- гена lacZ, кодирующего фермент -галактозидазу в плазмиде pBluescriptII;

- гена ermC, кодирующего устойчивость к эритромицину плазмиды pE194;

- гена tetO, кодирующего устойчивость к тетрациклину плазмиды pACYC184.

Условия проведения реакции определяют степень точности и воспроизводимости результатов. Их отработка была произведена для каждой конкретной пары праймеров. Выбор условий проведения ПЦР включал подбор оптимального соотношения компонентов реакционной смеси, структуры программы амплификации (временных и температурных характеристик каждого этапа амплификации) и адекватного метода детекции результатов. Выбор оптимальных условий проведения ПЦР обеспечил высокий уровень чувствительности и специфичности прохождения реакции, исключающий наличие перекрестных реакций с неспецифическими ДНК.

В состав набора входят 3 комплекта реагентов и 1 вспомогательный реагент:

- комплект № 1А для выделения ДНК из образца ферментных культур, заквасок, бакконцентратов и БАД;

- комплект № 1Б для выделения ДНК из образца кисломолочных пищевых продуктов и сыров;

- комплект № 2 для амплификации ДНК;

- комплект № 3 для детекции ДНК;

- вспомогательный реагент MQ (вода деионизированная высокоочищенная).

Проверку набора на специфичность осуществляли на препаратах ДНК, выделенных из штаммов пищевых микроорганизмов из коллекции лаборатории санитарно-пищевой микробиологии и микроэкологии НИИ питания РАМН. Список штаммов приведен в таблице 9.

Проверку проводили методом полимеразной цепной реакции с детекцией специфических амплифицированных фрагментов ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле.

В пробах с положительными контролями ДНК селективных маркеров в концентрации не менее 5х104 ГЭ/мл были получены положительные результаты ПЦР, и не было получено перекрестных реакций с неспецифическими ДНК при концентрации не менее 1х103 ГЭ/мл.

8 Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium longum 12 Lactobacillus paracasei, subsp. paracasei Шт. Dalton 13 Композиция Lactobacillus plantarum + Шт. 8P-A3 La + шт. 90TC- Lactobacillus fermentum Поскольку набор предназначен для выявления ДНК генетически модифицированных микроорганизмов в пищевых продуктах с различными уровнями содержания микробной ДНК и ДНК пищевого субстрата, то для выделения ДНК из образцов различной природы предусмотрено два разных комплекта: Комплект № 1А для выделения ДНК из ферментных препаратов, стартерных и заквасочных культур, БАД; Комплект № 1Б для выделения ДНК из образца пищевых продуктов.

Лабораторные исследования включают типовые последовательные процессы, включающие амплификацию ДНК, детекцию ДНК методом электрофореза, анализ и интерпретацию результатов.

В процессе стандартизации метода и набора ГМ-БАКТ-1 (ТУ 9398-001-01897357-2008) в целях гигиенического контроля и мониторинга за ГММ в процессе оборота проведены исследования 202 кисломолочных продуктов, выработанных из бактериальных заквасок производства «Хр.Хансен» и «Даниско», имеющих государственную регистрацию. Из них 110 образцов исследованы по заявлению продавцов с целью подтверждения отсутствия ГММ и дополнительной маркировки. Образцы продуктов в этом случае отбирались в крупных торговых сетях Москвы и Московской области представителями продавцов совместно со специалистами Центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. В целях контроля за ГММ в пищевых продуктах на стадиях оборота проведены сравнительные контрольные исследования 92 образцов пищевых продуктов по направлениям из Центров гигиены и эпидемиологии Брянской и Белгородской областей.

В настоящее время тест-система успешно применяется для лабораторного контроля ГММ в субъектах РФ.

Таким образом, разработка и внедрение в практику метода обнаружения ГММ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией и набора ГМ-БАКТ-1 обеспечивают преемственность и последовательность в лабораторном контроле пищевой продукции, выработанной с использованием ГММ или традиционных микроорганизмов, после допуска на продовольственный рынок на всех этапах ее оборота.

Постоянный регистрационный мониторинг ГММ в обороте должен иметь обратную связь с целью немедленного принятия мер в случае обнаружения ГМ продукции.

Результаты по обнаружению потенциально опасных для здоровья потребителей ГММ в ряде ферментных препаратов, полученные в ходе лабораторных исследований репрезентативной выборки пищевых продуктов, свидетельствуют о достаточной чувствительности и специфичности применявшихся методов лабораторного контроля и диагностической тестсистемы ГМ-БАКТ-1 и подтверждают необходимость лабораторного мониторинга за ГММ после допуска продукции на рынок продовольствия.

ВЫВОДЫ

На основе мониторинга современных стратегий, методов обнаружения и оценки безопасности ГММ, проведенных лабораторных исследований в системе гигиенического контроля за оборотом ГММ, применяемых при производстве пищевой продукции разработаны:

информационная база традиционных (классических) микроорганизмов, применяемых при производстве пищевой продукции;

информационная база ГММ, применяемых при производстве пищевой продукции;

информационная база ферментных препаратов, полученных с использованием промышленных микроорганизмов (ГММ), позволяющие целенаправленно проводить выбор объектов и методов экспертной оценки продукции в целях контроля;

алгоритм проведения лабораторного контроля на наличие ГММ в различных видах пищевой продукции при пострегистрационном мониторинге;

скрининговый метод обнаружения ГММ в пищевых продуктах на основе ПЦР с электрофоретической детекцией с использованием Набора «ГМ-БАКТ» (ТУ 9398-001СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки Российской Федерации:

1. Ховаев А.А. Вопросы безопасности и тенденции использования генно-инженерномодифицированных микроорганизмов при производстве пищевых продуктов, пищевых ингредиентов и продовольственного сырья // Вопросы питания.– 2008.- Т. 77, № 3. – С. 58-63.

2. Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р., Нестеренко Л.Н., Зигангирова Н.А., Ховаев А.А., Народицкий Б.С., Иванов Г.Е., Тутельян В.А., Гинцбург А.Л. Требования к медикобиологической оценке и гигиеническому контролю за оборотом пищевой продукции, полученной из генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов // Вопросы питания. 2008.

– Т.77, №3.- С. 49-57.

3. Ховаев А.А., Нестеренко Л.Н., Народицкий Б.С. Современные методы обнаружения и оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов (ГММ), применяемых при производстве пищевой продукции // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2011.- № 1.-С.108-113.

4. Ховаев А.А., Нестеренко Л.Н., Шевелева С.А., Ананьина Ю.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л., Тутельян В.А. Оценка безопасности и система контроля генно-инженерномодифицированных микроорганизмов в пищевых продуктах // Химическая и биологическая безопасность. – ВИНИТИ, 2010.- № 1-3. С. 3-14.

5. Ховаев А.А., Нестеренко Л.Н., Зигангирова Н.А., Народицкий Б.С. Молекулярногенетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генно-инженерномодифицированных микроорганизмов // Труды 6-й Всероссийская конференция с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007» 28-30 ноября 2007 г..- М.:, 2007 – T.1, С. 230-231.

6. Ховаев А.А., Нестеренко Л.Н., Зигангирова Н.А., Народицкий Б.С. Молекулярногенетические методы детекции генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов (ГММ) в системе гигиенического контроля за оборотом пищевой продукции, полученной с использованием промышленных микроорганизмов // Труды 7-й Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010» 24-26 ноября 2010 г..- М.:, 2010 – T.2, С. 36-39.

7. Ховаев А.А., Нестеренко Л.Н., Шмаров М.М., Зигангирова Н.А. Подходы и принципы законодательного и нормативно-методического регулирования применения и оборота пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных организмов (ГМО) // Вестник Российской военно-медицинской академии (II съезд Военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ) Приложение – С-Пб, № 1(15)-2006 – С. 317-319.

8. Зигангирова Н.А., Нестеренко Л.Н., Шмаров М.М., Ховаев А.А. Опыт проведения санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов (ГММ) и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги (МГМА) // Вестник Российской военномедицинской академии (II съезд Военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ) Приложение – С-Пб, № 1(15)-2006 – С. 319-321.

9. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.3.2.2340-08 (Дополнения и изменения № 6 к СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов») М.: Роспотребнадзор. 2008.

10. Методические указания МУК 4.2.2305-07 «Определение генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией» - приложение к Постановлению Главного государственного санитарного врача от 30.11.2007 № 80 «О надзоре за оборотом пищевых продуктов, содержащих ГМО». М.: Роспотребнадзор. 2008.

11. Набор реагентов для выявления ГММ бактериальной природы методом полимеразной цепной реакции в пищевых продуктах «ГМ-БАКТ-1». ТУ 9398-001-01897357-2008.