РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОТДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕСУРСЫ ДАЛЬНЕГО

ВОСТОКА РОССИИ: КОМПЛЕКСНЫЙ

РЕГИОНАЛЬНЫЙ ПРОЕКТ ДВО РАН

BIOLOGICAL RESOURCES OF THE

RUSSIAN FAR EAST: COMPLEX REGIONAL

PROJECT OF FEB RAS

ТОВАРИЩЕСТВО НАУЧНЫХ ИЗДАНИЙ КМК

Москва 2007 УДК 574:573.6 Биологические ресурсы Дальнего Востока России: комплексный региональный проект ДВО РАН / под ред. Ю. Н. Журавлева. – Москва: Товарищество научных изданий КМК, 2007. 262 с.

В книге представлены результаты исследований по 15 научным проектам, выполнявшимся в 2003- гг. в рамках комплексного регионального проекта Дальневосточного отделения РАН "Биологические ресурсы Дальнего Востока России". Материалы отражают основные направления работ, посвященных наиболее значимым дальневосточным биоресурсам (растения, грибы, животные, лесные и охотничьепромысловые ресурсы), актуальным проблемам динамики и мониторинга, а также созданию эффективных биотехнологий расширенного воспроизводства ресурсных видов.

Biological resources of the Russian Far East: complex regional project of FEB RAS / Ed. by Yu.N. Zhuravlev.

– Moscow: KMK Scientific Press Ltd. 2007. 000 p.

The book includes chapters representing results of 15 scientific projects which have been carried out in 2003in frameworks of the complex regional project of Far East Branch of the Russian Academy of Sciences "Biological resources of the Russian Far East". Materials of these chapters demonstrate the main direction of scientific researches related to the most important groups of bioresources of Russian Far East (plant, fungi, animal, forestry, hunting resources), actual problems of resource dynamics and monitoring, and development of biotechnologies of the extending reproduction of resource species.

Р е д а к ц и о н н а я к о л л е г и я : Ю.Н. Журавлев (ответственный редактор), Л.П. Рысин, Б.Р. Стриганова, С.Ю. Стороженко, В.И. Малиновский, Ю.И. Манько, Л.В. Фрисман Р е ц е н з е н т ы : В.В. Богатов, Е.А. Макарченко

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕСУРСНЫХ ВИДОВ НАЗЕМНЫХ

ПОЗВОНОЧНЫХ РОССИЙСКОГО ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА

А. П. Крюков, И. Н. Шереметьева, И. В. Картавцева, М. В. Цвирка, Л. В. Фрисман, В. П. Кораблев Биолого-почвенный институт ДВО РАН Приведены результаты исследования многочисленных и играющих важную роль в природных биоценозах видов позвоночных животных: длиннохвостого суслика Spermophilus undulatus, дальневосточной полевки Microtus fortis и полевки Максимовича M. maximowiczii и десяти видов врановых птиц (ворона Corvus corone, грача C. frugilegus, обыкновенной и даурской галок C.

monedula, C. dauuricus, вороны C. corax, сороки Pica pica, двух видов голубых сорок Cyanopica cyanus, C. cooki, кукши Perisoreus infaustus и кедровки Nucifraga caryocatactes). Использован кариологический, аллозимный, RAPD-PCR-анализ и секвенирование ДНК, а также морфометрия черепов. Определены параметры и закономерности внутривидовой генетической изменчивости, уточнено систематическое положение и филогенетические связи ряда таксонов.

Российский Дальний Восток обладает богатейшими биологическими ресурсами. Несомненно, что значимость объекта, как биологического ресурса, определяется не только его народно-хозяйственным значением, но и ролью в природных биоценозах. Так, грызуны, не являясь непосредственным объектом хозяйственного использования, в то же время представляют кормовую базу для многих хищных птиц и млекопитающих, в том числе ценных и промысловых видов. Велика роль мелких млекопитающих и птиц в качестве хранителей возбудителей особо опасных инфекций. Рациональное использование биологических ресурсов требует мультидисциплинарного подхода к их исследованию, в котором все более возрастает роль генетического анализа. Однако в Дальневосточном регионе генетическая изученность биоресурсов явно недостаточна, ведь всего 3 лаборатории в институтах ДВО РАН (БПИ, ИБМ и ИБПС) занимаются генетикой позвоночных животных. Вместе с тем, в таких знаниях нуждается биотехнология, медицина, сельское и охотничье хозяйство, охрана природы и другие виды практической деятельности.

В данной статье приведены краткие сведения о проведенных нами в последние годы исследованиях позвоночных животных российского Дальнего Востока (РДВ): длиннохвостого суслика, дальневосточной полевки и полевки Максимовича, а также десяти видов врановых птиц. Их значимость в качестве биологического ресурса определяется важной ролью в природных биоценозах. Кроме того, они являются модельными объектами исследования биологического разнообразия – его нынешнего состояния и происхождения.

Для анализа избранных видов грызунов и птиц нами использованы следующие генетические методы:

кариологический или хромосомный, аллозимный, RAPD-PCR и секвенирование ДНК. Для дальневосточной полевки и полевки Максимовича проведен также морфологический анализ. Исследованные нами виды распространены не только на территории РДВ, поэтому для оценки их генетической изменчивости были привлечены данные по популяциям из других частей ареала.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ДЛИННОХВОСТОГО СУСЛИКА

Суслики рода Spermophilus являются обычными обитателями степей и полупустынь, где они потребляют значительное количество травянистой растительности. Ареал длиннохвостого суслика Spermophilus undulatus Pallas, 1778 охватывает территорию от северо-восточных предгорий Тянь-Шаня до Приамурья и Якутии. От центрального массива, представляющего собой совокупность изолированных и полуизолированных популяций Алтая, Тувы, Саян, Прибайкалья, Забайкалья и Монголии, пространственно отделены суслики Семиречья, Приамурья и Якутии. Обширность ареала и обитание в различных ландшафтных и климатических зонах приводит к значительной географической изменчивости фенотипических характеристик длиннохвостого суслика. На основании этих различий выделено современных подвидов этого вида: S. u. stramineus Obolensky, 1927; S. u. eversmanni Brandt, 1841; S. u.

undulatus Pallas, 1778; S. u. intercedens Ognev, 1937; S. u. jacutensis Brandt, 1843; S. u. menzbieri Ognev, (Громов, Ербаева, 1995).

Географическая изменчивость морфометрических и морфотипических признаков демонстрирует заметное отличие восточных подвидов S. u. menzbieri, S. u. jacutensis и S. u. intercedens от западных S. u. stramineus и S.

u. eversmanni (Попков, 1978; Линецкая, Линецкий, 1989). S. u. undulatus занимает промежуточное положение между группами западных и восточных подвидов. Электрофоретическое исследование белков сыворотки крови позволило нам обнаружить между западными и восточными группами подвидов гибридную зону, локализованную в юго-западном Прибайкалье и южном Забайкалье (Vorontsov et al., 1980). Проведенное позже (Фрисман, Воронцов, 1989) исследование геногеографии показало полное отличие аллельного состава по трем локусам (трансферрин, альбумин и постальбумин) у представителей западных (S. u. stramineus и S.

u.eversmanni) и восточных (S. u. intercedens, S. u. jacutensis и S. u. menzbieri) подвидов длиннохвостого суслика. Гибридные фенотипы были обнаружены в юго-западном Прибайкалье и южном Забайкалье.

Настоящая работа является продолжением исследования географической изменчивости и внутривидовой дифференциации S. undulatus с привлечением характеристик ядерного генома, выявляемых с помощью электрофоретического анализа водорастворимых ферментов и других белков и метода RAPD-PCR анализа ДНК.

Для белкового электрофореза использованы образцы тканей от 73 сусликов – представителей западной (S. u.

eversmanni, Алтай – 8 экз.) и восточной (S. u. jacutensis, Якутия – 16 экз., S. u. intercedens, юг Читинской области – 31 экз. и S. u. menzbieri, Приамурье – 18 экз.) форм. Для RAPD-PCR анализа использованы представители 4 подвидов из тех же локалитетов – S. u. intercedens (5 экз.), S. u. jacutensis (6 экз.), S. u.

menzbieri (6 экз.) и S. u. eversmanni (2 экз.).

Аллозимный анализ. Разделение белков методом электрофореза в крахмальном геле с последующим гистохимическим окрашиванием произведено в соответствии с общепринятыми методиками (Pasteur, 1988).

Подсчет генетических коэффициентов проводился с помощью пакета компьютерных программ Biosys- (Swofford, Selander, 1981).

RAPD-PCR анализ. Выделение ДНК проводили с использованием протеиназы К стандартным методом фенольной депротеинизации (Sambrook et al., 1989). Полимеразную цепную реакцию (RAPD-PCR) проводили в амплификаторе UNO II (“Biometra”, Германия), используя реакционную смесь и температурный режим, описанные ранее (Цвирка и др., 2006). Продукты амплификации анализировали в 1,5% агарозном геле в трис-боратном буфере. В качестве маркера молекулярного веса использовали Pst I-гидролизат ДНК фага лямбда. В качестве негативного контроля использовали пробу, содержащую полную амплифицированную смесь, но без добавления ДНК. При построении бинарных матриц "1 - 0" (наличие – отсутствие полос) учитывали все визуально детектируемые фрагменты. Обсчет данных произведен с помощью компьютерных программ POPGENE (Yeh, Boyle, 1997), TFPGA-ver. 1.3 (Miller, 1997) и TREECON-ver. 1.3 (Van de Peer, De Wacher, 1994).

Нами проведен электрофоретический анализ семи ферментных систем из почек (LDH, MOR, PGD, SOD, IDH, AAT, SDH), двух ферментных систем крови (LAP, EST) и общего белка крови, включая гемоглобины и пять белков плазмы (суммарно 26 интерпретационных локусов). Аллозимный анализ показал, что суслики восточной формы (S. u. intercedens, S. u. jacutensis и S. u. menzbieri) обнаруживают намного более тесные родственные связи между собой, чем с представителями западной формы (S. u. eversmanni). Полученные значения генетических дистанции D (Nei, 1978) между выборками из популяций восточных подвидов лежат в интервале 0-0,021, а значения дистанций между выборками западной и восточной форм – в интервале 0,187Генетическая дифференциация западной и восточной форм длиннохвостого суслика превышает таковую между парами видов S. suslicus – S. odessanus; S. pygmaeus – S.musicus и близка к наблюдаемой в надвидовой группе major (Фрисман и др., 1999; Кораблев и др., 2003).

При RAPD-PCR анализе использовали десять декамерных олигонуклеотидных праймеров: OPA-02, OPC–02, OPC–05, OPC–09, OPC-10, OPC–12, OPC–16, OPC-20, OPD–05, OPE-20 (“Operon Technologies Inc.”, США).

Идентифицировано 173 признака, число амплифицированных фрагментов в спектрах варьировало от 13 до 21, а молекулярный вес фрагментов – от 250 пар нуклеотидов (пн) до 2150 пн. В целом, особи S. undulatus обладали сходными спектрами продуктов амплификации. S. u. eversmanni наиболее отличался от других подвидов набором фрагментов (рис. 1). Выявлены молекулярные маркёры двух типов: уникальные, характерные для отдельных подвидов, например, для S. u. eversmanni - OPC-20670, OPE-201260, OPE–201700 и для S. u. menzbieri – OPE-20660, и полиморфные, присутствующие у трёх восточных подвидов длиннохвостого суслика S. u. intercedens, S. u. jacutensis и S. u. menzbieri (OPC–05790, OPC-20920, OPC–091700, OPC–091230, OPD–051700 и ОPD-051030) и, соответственно, отсутствующие у западного подвида S. u.

eversmanni. Кроме того, обнаружены количественные различия между отдельными выборками длиннохвостого суслика по яркости окрашивания на фореграммах некоторых фрагментов. Так, особи S. u.

menzbieri имеют один «мажорный» фрагмент OPE–20660, а S. u. eversmanni два – OPE-201260 и OPE–201700.

По параметрам генетической дифференциации S. u. menzbieri, S. u. jacutensis и S. u. intercedens из южного Забайкалья близки между собой (D=0.06-0.26, p=1). Данные подвиды на дендрограммах генетического сходства (UPGMA) и филогенетической реконструкции (NJ) образуют единую хорошо поддерживаемую группу (с бутстреп поддержкой 100%), что можно рассматривать как результат общности их происхождения. Подвид S.

u. eversmanni генетически от них удален, и с высокой достоверностью (бутстреп поддержка 100%) образует самостоятельный подкластер. По параметрам генетической дифференциации наибольшие различия наблюдаются между S. u. intercedens – S. u. eversmanni (D=0.41, Gst=0.76, p=1), S. u. menzbieri – S. u.