«ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ А.И. Рукавишников АЗБУКА РАКА Рекомендуется учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия ...»

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ

И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ

ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

А.И. Рукавишников

АЗБУКА РАКА

Рекомендуется учебно-методическим объединением по медицинскому

и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для студентов, обучающихся по специальности 040400 – Стоматология.

Издательство Волгоградского государственного медицинского университета 2007 1 А.И. Рукавишников Азбука рака. – Волгоград: Изд-во Волг. гос. мед. ун-та. – 2007. – 360 с.:

ил.

Учебное пособие посвящено диагностике и лечению солидного рака на основе его причины – раковой клетки.

В главах рассматриваются современные знания о канцерогенезе и его источниках, свойства раковой клетки и их молекулярные причины в сравнении с нормальной клеткой того же типа.

На этой основе излагаются современные методы ранней диагностики раковых клеток и их ликвидации – методы уничтожения и реверсии раковых клеток.

Учебное пособие предназначено для студентов стоматологического факультета медицинских вузов и университетов. Оно может быть полезно для врачей-онкологов.

Рецензенты:

А.В. Лепилин – заведующий кафедрой хирургической стоматологии и челюстнолицевой хирургии Саратовского государственного медицинского университета, д.м.н., профессор.

М.П. Водолацкий – заведующий кафедрой челюстно-лицевой хирургии и стоматологии детского возраста Ставропольской государственной медицинской академии, д.м.н., профессор.

Печатается по решению ЦМС Волгоградского государственного медицинского университета.

УДК 616 – 006.6 (075) ББК 55.6 я А.И. Рукавишников Волгоградский государственный медицинский университет, Введение Согласно концепции Р. Вирхова (1821–1902), любая болезнь начинается с патологии клетки или клеток.

Что есть «патология» клетки, оставалось неясным до 1953 г. ХХ века, когда была раскрыта структура молекулы ДНК. Тогда на примере одного свойства клетки – деления е на две дочерние клетки, было впервые обнаружено, что это свойство создается репликацией молекулы ДНК. Иными словами, репликация ДНК – это молекулярная причина, а деление клетки – следствие этой причины. Этим был открыт путь к молекулярной медицине.

Но переход медицины на молекулярный уровень начался с расшифровки генома человека – с открытия структуры генов, их количества и места в хромосомах клетки, а также с началом протеомики – науки о белках, их строении и функциях.

Уже в 2000 г. акад. А.И. Арчаков впервые разделил все болезни на две группы на основе того факта, что все болезни возникают «от генов». Первая группа – наследственные, – от дефекта гена или генов в клетке, а вторая – ненаследственные болезни, – от изменения экспрессии гена или генов.

Однако, ген – это только «схема», по которой синтезируются его продукты – иРНК и белки. Но именно белки создают все свойства или функции клетки каждого типа. Позднее в некодирующих белок участках ДНК были открыты гены и их продукт – малые РНК или интерферирующие РНК (РНКи). Они осуществляют контроль экспрессии обычных генов в клетке: РНКи связывается с копией гена, т.е. иРНК, и затем фермент ее разрушает, – так выключается ген.

Познание всего этого и совершило революцию в медицине – она начала переход на молекулярный уровень: клетка – это место болезни, а причина болезни внутри клетки – на уровне молекул, т.е. генов и их продуктов. То есть «патология» клетки Р. Вирхова теперь раскрыта – это изменения в обычном гене или генах и их продуктах – иРНК и их белках, а также в генах и их продукте – малые РНК в клетке.

Теперь учные стремятся скорее выяснить гены-причины и белкипричины в соответствующей клетке, вызывающие конкретную болезнь человека. На этой основе они готовятся «радикально изменить средства и методы ранней диагностики и лечения каждой болезни, в том числе, рака».

До сих пор многие болезни и рак начинают лечить после того, как болезнь проявляется симптомами. При этом объектом воздействий лечебных средств и лекарств оказываются не причины болезней, а их симптомы.

Но термин «рак» не выражает ни причины и ни сущности этой, самой древней и опасной для жизни человека болезни. В учебном пособии рассматривается солидный рак; часто такой рак представляют как одно целое.

Поэтому в раке важно различать, что является его причиной, а что – е следствием. Причиной является раковая клетка, а следствием – это колония из нее клеток-потомков, т.е. рак. При этом каждая раковая клетка от включения в ней гена теломеразы – бессмертная и является самостоятельным одноклеточным организмом, т.е. клетка-организм.

Но солидный рак – не одно целое: часть его клеток образует скопления в виде первичной опухоли и метастазов – это симптомы рака; часть клеток мигрирует в окружающие ткани, разрушают их, и занимает их места, а часть через кровь и лимфу расселяется по организму, где из них в различных органах образуются метастазы.

Клетки солидного рака расселяются по всему организму через кровь и лимфу очень рано – при узелке из раковых клеток в тканях размером 2 мм. Это означает, что с этого момента рак уже становится болезнью всего организма, т.е. системным.

Расселение раковых клеток по организму во многом сходно с распространением бактерий при инфекциях, которое также регулируется генами. Но бактерия – прокариот и извне. Раковая клетка – это тоже организм, но эукариот и из клетки своего организма-хозяина.

При инфекциях первым этапом является диагностика возбудителя и его типа в организме пациента. Вторым этапом является лечение, которое сводится к уничтожению каждой клетки-возбудителя. То есть, действуя на причину – бактерию, ликвидируется само собой и ее следствие – инфекция.

Из того, что рак – не одно целое, а каждая его клетка – это клеткаорганизм, то для пациента опасен вовсе не рак, а его раковые клетки.

Акад. Н.Н. Петров (1947) – основатель отечественной онкологии, выражал это так: «рак целиком заключается в раковых клетках; удалить или сжечь их без остатка, значит вылечить больного».

Акад. В.А. Кордюм (1998) писал: «убрать бы все раковые клетки из организма, все до единой, и болезнь бы ушла».

Проф. А.С. Соболев (2002) также говорит: «убить бы все раковые клетки до единой и ни одной не оставить для потомства».

Отсюда следует, что объектом для методов диагностики и лечения должны быть не симптомы рака, а его раковые клетки. То есть принципы диагностики и лечения рака должны быть такими же, что и при бактериальной инфекции.

Не зря третьей мишенью химиотерапии после бактерий и вирусов, стали раковые клетки. Так как рак не одно целое, а расселяющиеся по всему организму без конца и границ потомки раковой клетки, то лечение от рака также должно сводиться к ликвидации каждой раковой клетки и тогда рак ликвидируется сам собой.

Так как причина и сущность рака, все трудности диагностики и излечения от рака «заключаются» не в раке, а в его раковых клетках, то это и явилось для нас основанием назвать учебное пособие – «Азбука рака».

В истории познание рака шло в направлении – от рака к его причине, т.е.

к раковой клетке. Это же привело к созданию существующих до сих пор методов диагностики и лечения – симптомов солидного рака, а не его причины – раковой клетки и е потомков.

Отставание науки об отличиях раковой клетки от нормальной клетки того же типа до последнего десятилетия ХХ века, не позволяло разрабатывать методы ранней диагностики раковых клеток и методы их избирательной ликвидации.

Основными методами лечения солидного рака во многих странах и в нашей стране являются: хирургический метод, лучевое лечение и химиотерапия.

Объектом лечения первых двух методов являются симптомы рака – первичный рак, метастазы и рецидив рака, но не раковые клетки, распространяющиеся за пределами границ операционного поля или лучевого воздействия и те, которые расселяются без конца и границ по всему организму пациента.

Если хирургическим методом часто сразу можно удалить из организма пациента множество раковых клеток иссечением первичного рака и его метастазов, то лучевое лечение, если убивает, то лишь часть раковых клеток.

Объектом стандартной химиотерапии являются раковые клетки, т.е. то, что и нужно уничтожать. Но она бессильная, так как стандартные лекарства сами по себе не отличают раковую клетку от нормальной клетки. Незнание молекулярных причин свойств раковой клетки препятствовало созданию лекарств и разработке других средств, избирательно уничтожающих раковые клетки, не затрагивая здоровых клеток.

По этим причинам во всех странах смертность от рака, несмотря на лечение стандартными методами, большая и пока нет е снижения.

проф. Д. Фелшер (D. Felsher, 2002) пишет: «рак поражает каждого третьего человека, а умирает каждый пятый от этой болезни»;

проф. У. Гиббс (2003) отмечает:

- «девять из десяти раковых больных погибают»;

- «к несчастью, когда у больного диагностируют рак, метастазы уже присутствуют; прогноз для таких больных неутешителен»;

проф. Л. Леб (L.A. Loeb, 2003) подчркивает, что «в любой опухоли, насчитывающей 100 млн. клеток, всегда найдется одна, в которой произошла мутация, защищающая эту клетку от любого препарата. Можно рассчитывать только на то, что удастся сдержать рост опухоли. Вылечивать больных от рака мы пока не умеем».

Что удалось достичь к настоящему времени в странах при объекте – рак и стандартных методах его диагностики и лечения? Ответ дан в работе А.В. Лихтенштейн, Г.И. Потаповой (2005) из НИИ канцерогенеза, Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва. В ней авторы на основе своих исследований и исследований зарубежных ученых характеризуют сложившуюся к настоящему времени ситуацию в онкологии так:

- имеется «разительный контраст между впечатляющим прогрессом в фундаментальных исследованиях, и практическим отсутствием достижений в клинической онкологии: смертность от основных форм рака сегодня примерно та же, что и 30-50 лет назад»;

- М.В. Sporn, N. Suh (2002), C. Leaf (2004) объясняют это следствием стратегического просчета: «клиницисты и тогда, и сегодня считают заслуживающей врачебного вмешательства только уже сформировавшийся рак. Но такая практика «устранения последствий» столь же мало эффективна, как и лечение, например, уже случившегося инфаркта миокарда или инсульта»;

- «в основе такого просчета лежит представление о раке как о сугубо локальном процессе». В ткани из возникшей раковой клетки вначале возникает клон всего лишь из нескольких клеток. Такой очаг рака обычно считают «исчезающе малой мишенью, что лишает, казалось бы, смысла на этой стадии процесса любые терапевтические и диагностические мероприятия». Однако авторы статьи считают, «что представленная картина не соответствует действительности и что на самом деле задолго до наступления клинической фазы рака существует реальная мишень для превентивных мер»;

- «устоявшаяся к настоящему моменту времени практика сводится к тому, что основные диагностические и терапевтические усилия направлены соответственно на выявление и уничтожение уже существующего опухолевого очага.

Иными словами, борьба со злокачественной опухолью начинается в момент, когда битва уже в значительной степени проиграна».

- исходя из этого, авторы считают, что «более благодарной мишенью для терапевтических воздействий является предшествующий раку массив мутантных клеток, не обладающих еще всеми свойствами злокачественности»; «мутантные клетки», не обладающие свойствами раковой клетки, – это предраковые клетки, – Прим. – А.Р.

- вс более актуальным «является необходимость концентрации противораковых усилий на превентивных мерах, способных либо обратить вспять процесс канцерогенеза, либо затормозить его настолько, чтобы отодвинуть момент появления рака за пределы естественных жизненных сроков» (M.B. Sporn, N.

Suh, 2002).

Из следствий «просчта» вытекает необходимость смены объекта для методов диагностики и лечения рака. Вместо рака, т.е. следствия, объектом для обеих целей должна быть его причина, т.е. раковая клетка и е потомки.

Достижения молекулярной, т.е. генной медицины уже сейчас позволяют начать диагностику и лечение многих болезней задолго до их симптомов. Цель этой медицины – не ликвидация симптомов болезни, а устранение е причины.

Для рака это означает два уровня: «до начала» – это предраковые клетки, которые имеет опухолевый генотип, но нормальный фенотип, и «начало» – раковая клетка и е первые потомки.

Для уничтожения причины, т.е. раковой клетки, необходимо знать абсолютные отличия между ней и нормальной клеткой того же типа.

Но таких отличий до сих пор не было найдено, на их поиски учными потрачены все истекшие века. Все проблемы только в том, что раковая клетка – это не пришелец извне, а клетка, возникающая из нормальной клетки своего организма в результате дерепрессии в ней ряда генов фетальных белков. Хотя она имеет эти изменения в геноме, но этот геном организма-хозяина, он же кодирует протеом этой клетки.

Так как дерепрессия генов – это не мутация генов, то е белки-маркеры не являются белками-антигенами или они очень слабые для клеток иммунной системы, и поэтому для них раковая клетка не является чужеродной клеткой, а значит, нет и иммунного ответа. Кроме этого, имеют значение и другие причины – нарушения функции дендритных клеток и др.

Долгое время считалось, что раковая клетка возникает из любой клетки ткани, и все клетки рака обладают одинаковыми потенциями к делению. Поэтому методы лечения рака имели целью уничтожение всех раковых клеток в организме пациента.

Недавно доказано, что раковая клетка возникает из стволовой клетки или из любой клетки ткани, если она способна вернуться в «стволовое» состояние (J.E. Trosko, 2005). При этом большая часть клеток рака – нераковые клетки и с коротким сроком жизни, и лишь меньшая их часть – это раковые стволовые долгоживущие клетки. То есть потенции к делению клеток в составе рака разные (M. Clarke, 2003).

До сих пор считалось, что место метастаза определяется тем, в какой орган с потоком крови попадает раковая клетка из первичного очага рака.

Теперь доказано, что метастазирование раковых клеток не хаотический, а управляемый самой раковой клеткой процесс с участием гемопоэтических клеток костного мозга.

Миграция раковых стволовых клеток начинается с секреции ими фактора роста, а к нему на поверхности гемопоэтических клеток имеется белок – рецептор. Получив этот сигнал, гемопоэтические клетки из костного мозга мигрируют «в разные места» организма, где оседают и размножаются, образуя преметастазные ниши. В эти ниши позднее прибудут раковые клетки из первичного очага рака, так образуются метастазы. Этим открыты новые мишени для предотвращения и подавления метастазирования раковых стволовых клеток.

Эти открытия учных существенно дополняют прежние знания и дают принципиально новые возможности для решения основных проблем рака:

- в клетках рака необходимо диагностировать только раковые стволовые клетки;

- для излечения от рака, надо «выборочно целиться именно по раковым стволовым клеткам», и только их уничтожать;

- если после лечения рака в организме пациента останется даже одна раковая стволовая клетка, то рецидива рака «не избежать»;

- теперь стало возможным определять степень риска образования метастазов у каждого пациента, предупреждать и подавлять метастазы раковых клеток (R.N. Kaplan et al, 2005).

Дерепрессия генов свойств раковой клетки – это не изменение в структуре этих генов, а лишь изменения в выражении генов, а это – обратимый процесс. Поэтому раковую стволовую клетку можно не только уничтожать, но и возвращать в нормальное состояние. Затем она станет дифференцированной клеткой и погибнет через апоптоз. Это явление обозначается термином – реверсия.

То, что раковая клетка – это стволовая клетка, позволило ученым уже открыть некоторые отличия между раковой и нормальной стволовыми клетками на уровне генома. Это дат надежду на такое лечение рака, при котором будут уничтожаться только раковые стволовые клетки, тогда как нормальные стволовые клетки не будут повреждаться.

Для ликвидации раковых клеток в организме пациента в пособии рассматриваются основные современные методы лечения. Наибольшие перспективы в излечении пациента от рака следует ожидать от вакцин и методов реверсии раковых стволовых клеток, в том числе экстракты и белки из эмбриональных тканей и плаценты, а также вакцина из эмбриональных стволовых клеток.

У нас достаточно книг и статей о раке, но не было учебного пособия, в котором бы автор подошел к диагностике и излечению от рака пациента на основе новых знаний о раковой клетке, е свойствах и их молекулярных причин.

Такие материалы для всякого желающего ознакомиться, часто разрозненны и не всегда доступны.

В учебной программе – «Основная образовательная программа подготовки врача-стоматолога». Часть 2. – М., 2003 г., выделен раздел «Опухоли». Исходя из этого, мы стремились дать в учебном пособии ответы на основные вопросы этого раздела на примере солидного рака.

К настоящему времени уже многое известно о свойствах раковой стволовой клетки и их молекулярных причинах. На этой основе разработан ряд новых методов для ранней диагностики раковых клеток в организме пациента и их избирательной ликвидации. Часть этих методов уже внедрена в клиническую практику, в том числе индукция реверсии и апоптоза раковых клеток экстрактом из фетальных тканей человека.

Часть их лишь начинает «выходить» из лабораторий или «на выходе» в клиническую практику, например, метод «глушения» экспрессии генов свойств раковой клетки интерферирующей РНК: введенная в раковую клетку короткая молекула РНК связывается с иРНК гена и тогда синтез белка прекращается, а значит, раковая клетка утрачивает соответствующее белку свойство.

Желание приблизить время широкого внедрения новых методов ранней диагностики раковых стволовых клеток и методов их ликвидации в клиническую практику, а также в целях учебного процесса со студентами, явились для нас главными причинами написать это учебное пособие.

Из большого материала о раковой клетке, е свойствах и их молекулярных причинах, мы сделали критический выбор того, что особенно необходимо для ранней диагностики раковых клеток и их ликвидации с целью излечения от рака.

В основу учебного пособия положены: 1) материалы литературы по молекулярной медицине и молекулярной онкологии; 2) наши лекции по онкологии для студентов стоматологического факультета, отдельные лекции для студентов лечебного факультета, а также семинары по онкологии для студентов на элективном курсе; 3) наш опыт как хирурга-онколога с 1971 г. и по настоящее время в отделении «Опухоли головы и шеи» Волгоградского областного клинического онкологического диспансера («ВОКОД» №1).

Без смены объекта для диагностики и лечения с уровня рака на уровень раковой стволовой клетки, без знаний молекулярных причин свойств раковой клетки, нам не удастся справиться с е следствием, т.е. раком.

В книге каждый раздел написан как самостоятельная единица, но связь между разделами есть и ясна. Мы выражаем благодарность авторам и издательствам за использование в книге иллюстраций, заимствованных из журналов, книг и публикаций и стремились привести эти источники в списке литературы.

Учебное пособие – «Азбука рака» идет навстречу нуждам студента, как в ранней диагностике рака, так и в излечении от него новыми методами. Оно может быть полезным и для врачей-онкологов.

Глава 1. Геном нормальной соматической клетки 1.1. ДНК – молекула жизни. Открытие структуры и функции, значение открытия В 1910 г. стало ясно, что гены располагаются на хромосомах. Но не ясно было, из какого материала состоят гены – из белка или из нуклеиновой кислоты.

В 1928 г. Ф. Гриффит начал изучать роль нуклеиновой кислоты в жизни клетки в опытах на пневмококках.

Имеется два типа пневмококков. У одного пара бактериальных клеток окружена капсулой. Второй тип клеток – без капсулы. Капсула защищает микробы от фагоцитоза. Если ввести такие мышам, то они погибают. Пневмококк без капсулы не заражает мышей и не вызывает пневмонию.

Опыт. Мышей заразил смесью клеток живых пневмококков без капсул и мертвых пневмококков с капсулами.

Ожидалось, что мыши останутся здоровыми. Но они погибли от пневмонии. Живые бактерии, выделенные из мышей, имели капсулы. Это явление трансформации клетки.

Опыт. Микробиологи предположили, что какое-то вещество мертвых пневмококков способно заставить живые клетки образовывать капсулы. Они показали это в опытах.

Пневмококки с капсулами убили, растерли их и приготовили раствор из разрушенных этих клеток, – это экстракт. В культуральную среду внесли экстракт из мертвых клеток с капсулами, затем в эту среду внесли живые пневмококки без капсул.

Результат: некоторые из клеток без капсул трансформировались в клетки с капсулами; их потомки также обладали капсулами и при введении их мышам вызывали пневмонию.

Оказалось, что клетки без капсул претерпели изменение - они стали обладать капсулами и вызывали пневмонию. Важно, что и их потомки также образовывали капсулы и вызывали пневмонию.

Вывод: 1) признаки пневмококков изменились, 2) это вызвано скорее тем, что какой-то компонент экстракта или он стал частью пневмококка.

Опыты Ф. Гриффита продолжили американские учные – микробиолог О.Т. Эвери (1877-1955) и его сотрудники.

Они задались вопросом: какое вещество вызывает трансформацию одного штамма пневмококка в другой? Для этого они повторили опыты Ф. Гриффита, используя вместо микробов экстракт из них.

Экстракт в опытах с пневмококками сохранял свою трансформирующую активность при разрушении в нем белков и РНК, но терял ее при разрушении ДНК.

Вывод: трансформирующим веществом является ДНК. Отсюда гены построены из ДНК.

Трансформация состоит в передаче генов от умерших пневмококков в живые и внедрении их в хромосому-хозяина, т.е. в бескапсульные пневмококки.

Эти данные об открытии учные опубликовали в 1944 г. Так впервые было доказано, что признак от одной клетки передается другой веществом ДНК.

Но как?

Роль ДНК в клетке была дополнена из жизни вирусов, содержащих ДНК.

Они заражают клетки бактерий для того, чтобы осуществить в них цикл размножения.

При этом обнаружилась способность ДНК вируса синтезировать свои копии и белки.

Из всего следует, что ДНК контролирует жизнь содержащих ее клеток и способна синтезировать копии своих молекул. Этот процесс называется «самоудвоением» или размножением. ДНК – единственная в природе молекула, способная копироваться.

В 1927 г. наш ученый – акад. Н.К. Кольцов (1872-1940) писал, что «в одной хромосоме укладывается одна невероятно длинная молекула, а вдоль не располагаются отдельные группировки атомов – гены».

Он также впервые сказал, что «при делении клеток такие молекулы не создаются заново из отдельных кусков, а сначала достраивают на себе точные копии, а затем исходная молекула и копия разойдутся вместе с дочерними хромосомами в образующиеся заново клетки». Это матричный принцип репликации генов и затем хромосом перед делением клетки на две.

Как происходит удвоение ДНК перед делением клетки было тайной для биологов в течение многих десятилетий. Учные догадывались, что для понимания этого необходимо знать: 1) строение ДНК и 2) способы расположения нуклеотидов в молекуле.

К 1950 г. было известно, что ДНК молекула, которая состоит из тысяч соединенных между собой в линию молекул четырех разных типов – нуклеотидов.

Э. Чаргафф (1950) показал, что в любой ДНК количество аденина равно количеству тимина (А=Т), а количество гуанина – количеству цитозина (Г=Ц).

Это указывало на то, что в молекуле ДНК они находятся парами: А-Т; Г-Ц.

Р. Фраклин (1920-1958) в лаборатории М. Уилкинса методом рентгеновской кристаллографии получила «знаменитое ныне изображение картины структуры ДНК».

Однако из этих знаний не ясно было: как работает эта молекула или как она выглядит? Никто не знал, как выстраиваются химические единицы – А, Т, Г, Ц, чтобы нести в себе информацию о плане строения и воспроизводства живого.

Д. Уотсон и Ф. Крик занялись созданием модели молекулы ДНК, как Л.

Полинг – для изучения пространственной структуры белка. Она помогла бы понять детали структуры и возможные функции ДНК.

Проведя расчты, они в течение 18 месяцев были заняты созданием модели и создали модель ДНК. Но они не были уверены в правильности этой модели.

Руководитель Р. Франклин – М. Уилкинс разрешил Д. Уотсону ознакомиться с рентгеновским изображением молекулы ДНК, не сказав об этом ничего Р. Франклин. Когда Д. Уотсон увидел полученное Р. Франклин изображение, он понял: «они с Ф. Криком не ошиблись». На этом снимке они четко видели признаки спирали и пошли сразу в лабораторию, чтобы проверить «вс на объемной модели».

Из-за отсутствия пластин Д. Уотсон вырезал из картона четыре типа макетов нуклеотидов: аденина (А), Тимина (Т), гуанина (Г) и цитозина (Ц) и стал раскладывать их на столе.

Он тут же обнаружил, что аденин соединяется с тимином, а гуанин с цитозином по принципу «ключ-замок», образуя пары. Именно таким образом удерживаются между собой две цепи молекулы ДНК.

Последовательность этих пар в молекуле может бесконечно варьировать.

Это и служит шифром или кодом, при помощи которого зашифрована информация, определяющая тип белка, синтезируемого данной клеткой (Рис. 1).

Рис. 1. Молекула ДНК и двух цепей. Основания соединены водородными связями.

Молекула ДНК имеет две функции: 1) передавать информацию потомству, т.е. дочерним клеткам и 2) реализовывать информацию внутри клетки.

Из структуры двойной спирали сразу видно прямое следствие – репликацию, т.е. размножение ДНК. Способ: расхождение двух комплементарных цепей и построение по каждой из них новой – дополняющей цепи. Так из одной молекулы ДНК образуется две, что требуется для деления клетки на две.

Ошибки при репликации, т.е. мутации – причина превращения нормальной клетки в дефектную (Рис. 2 и 3).

Рис. 2. Расхождение цепей ДНК.

Pиc. 3. Достраивание по каждой из цепей новой, – дополняющей цепи.

Итак, был доказан матричный принцип репликации ДНК перед делением клетки, предсказанный великим учным, акад. Н.К. Кольцовым. Две части молекулы отделяются друг от друга, по каждой из них синтезируется новая половина молекулы. Порядок же оснований – в роли матрицы или образца для достраивания молекул.

ДНК – хранилище генетической информации Информация о синтезе каждого типа белка заложена в ДНК в виде некой линейной последовательности оснований.

В 1961 г. Ф. Крик доказал, что каждая группа из трех оснований образует кодон. Один кодон кодирует одну аминокислоту из 20 главных аминокислот.

Для переноса информации о структуре белка из ядра клетки имеется иРНК. Она – копия с фрагмента кодирующей матричной цепи ДНК. В ней вместо тимина содержится урацил.

По иРНК в рибосоме с помощью транспортной РНК будет синтезирован белок – конечное звено реализации генетической информации. Так как ДНК служит хранилищем генетической информации, ее называют молекулой жизни.

До начала работы Д. Уотсона и Ф. Крика над структурой ДНК, уже многое было известно.

Р. Франклин в 1951 г. впервые получила первую уникальную рентгенограмму молекулы ДНК, где видно, что эта молекула имеет форму двойной спирали, очень похожую на винтовую лестницу. Е снимки сыграли решающую роль в открытии Д. Уотсона и Ф. Крика. В знак этого, Р. Франклин называют «пионером» молекулярной биологии.

За открытие структуры ДНК и е функций Д. Уотсон, Ф. Крик и М. Уилкинс в 1962 г. удостоены Нобелевской премии. Р. Франклин не дожила. Она скончалась от рака в 1958 г.

Открытие пространственной структуры ДНК – стало основанием для ряда новых открытий.

В 60-х гг. ХХ в. механизм репликации ДНК подтвердился, обнаружен фермент – ДНК-полимераза, катализирующий этот процесс.

Открыт генетический код, т.е. шифр, по которому в клетке синтезируются белки.

В 70-х гг. XX в. ещ два метода были созданы: секвенирование и получение рекомбинантной ДНК.

Секвенирование дает возможность «читать» последовательность нуклеотидов в ДНК. С помощью этого метода расшифровывался «геном человека».

Получение рекомбинантной ДНК или метод молекулярного клонирования. Суть этого метода – в молекулу ДНК встраивают фрагмент, содержащий определенный ген.

Например, вводят его в бактерию, и она синтезирует его продукт – белок, который необходим человеку.

В 80-х гг. XX в. разработана полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эта технология необходима для быстрого «размножения» нужного фрагмента ДНК.

С помощью ПЦР можно осуществлять раннюю диагностику бактериальных и вирусных инфекций, а также первые раковые клетки в организме пациента по их генам-маркерам.

Например, в плазме крови пациента можно обнаружить фрагменты геновмаркеров раковой клетки. Если фрагмент в малом количестве или единственный, с помощью ПЦР его размножают и после этого легко идентифицируют.

Открытие структуры ДНК дало возможность учным расшифровать геном человека и многих других организмов. Это открытие позволило перейти к генной терапии любой болезни, в том числе рака.

Раковая клетка «плохо распознается иммунной системой пациента, т.к.

она возникает из нормальной клетки организма-хозяина».

Поэтому для уничтожения раковых клеток с помощью генной терапии, надо прежде сделать раковые клетки «чужими» для иммунной системы.

Есть много способов, как это сделать. Можно из материала биопсии рака выделить раковые клетки, ввести в них «чужой» ген, а затем эти раковые клетки ввести обратно в организм пациента. В таком случае иммунная система по белку этого гена будет распознавать раковые клетки как «чужие» и уничтожать их.

В опытах на животных такой метод воздействия на ДНК раковых клеток дал обнадеживающие положительные результаты. Но для лечения же пациентов от рака, подобный метод находится пока на этапе клинических испытаний (Е.Д. Свердлов, 2003).

И совсем необычно – начало новой эры «живых технологий». Учные ряда стран заявляют, что они почти готовы к созданию «искусственной жизни», т.е. абиогенезу.

Пока нет единого определения живого, для него характерны три признака; 1) наличие контейнера, т.е. мембраны, вмещающего содержимое клетки;

2) метаболизм – способность преобразовывать базовые питательные вещества в рабочие механизмы клетки; 3) наличие генов – химических конструкций, необходимых для построения клетки, которые могут передаваться потомству и изменяться вместе с изменениями окружающей среды.

Каждый из этих трх элементов уже воспроизведн в лабораториях, учные готовы приступить к попыткам соединить вс это «в одну рабочую единицу», т.е. клетку.

В случае успеха, это будет «мир сверхмалых живых машин: специальные клетки будут лечить организм человека и бороться с загрязняющими окружающую среду веществами».

Ближайшей задачей науки учные считают создание «искусственной клетки», способной к самовоспроизводству и вырабатывающей уникальные химические вещества, в том числе лекарства, которые пока не удатся синтезировать.

«Искусственное живое» будет находиться под полным контролем человека, например, «подпитывая» его элементами, не встречающимися в природе в чистом виде.

1. Проф. Э. Уиммер (E. Wimmer) и его группа из Нью-Йорка в 2002 г.

впервые со времн зарождения «живого» на Земле, создали вирус полиомиелита из неживой материи.

Ученые спорят: вирусы – это живые существа или неживые объекты?

У.М. Стэнли – лауреат Нобелевской премии – считает, что «в клетке вирус ведт себя как живое существо, а вне клетки он мертв, как камень».

Г. Надсон – наш микробиолог, говорит так: «Вирус – это то ли вещество, обладающее свойствами существа, то ли существо со свойствами вещества».

Акад. В.А. Энгельгардт – наш учный, писал: «Многие вирусы состоят всего лишь из белка и нуклеиновой кислоты. Они могут быть отнесены к химическим соединениям – нуклеопротеидам».

Геном вируса полиомиелита полностью расшифрован. На этом основании учные собрали точную последовательность нуклеотидов, соответствующую естественному образцу.

Этот генетический материал поместили в раствор, подобный цитоплазме.

В нм по информации, заложенной в ДНК, были синтезированы необходимые белки.

Они применили рецептуры, опубликованные в Интернете, и генетические последовательности, полученные по почтовому заказу.

Проф. Э. Уиммер сообщает, что как только в пробирку были помещены все генетические составляющие, вирус тут же «самособрался». Иными словами, «жизнь, или по крайней мере е подобие, завелась с пол-оборота».

Созданный вирус выглядел так же, как его природный образец. Для доказательства активности вируса ученые заразили им мышей. Животные погибли при классических симптомах полиомиелита.

На сборку генома вируса полиомиелита проф. Э. Уиммеру потребовалось три года.

В той же лаборатории К. Вентер (J. Craig Venter) синтез вируса произвел за 14 дней.

2. Синтез искусственного вируса phi-Х174. Это бактериофаг, существует в природе, безопасный для человека и животных.

К. Вентер и его группа взяли несколько участков ДНК и соединили их, создав полный геном вируса, содержащий одиннадцать генов. Эта смесь была помещена в пробирку, где самостоятельно собралась в генетическую цепочку, идентичную геному phi-Х174. После этого собранный геном имплантировали в живую клетку, которая начала производить копии вируса.

3. Американские учные создадут неизвестную в природе форму живого.

Учные из лаборатории Роквилля объявили о намерении создать при помощи генной инженерии новую форму жизни – 21.11.2002.

Цель проекта – исследования фундаментальных механизмов зарождения и развития органической жизни. Основные участники – генетик К. Вентер и Нобелевский лауреат Х. Смит.

Целью эксперимента является создание одной клетки, являющейся базовой для формирования организма с минимальным набором генов для поддержания жизни.

Если опыт удастся, то выращенная клетка будет расти и делиться, создавая, таким образом, целую клеточную структуру, не существующую в природе. Это будет «минималистский» организм.

В конце 1990-х гг.XX в. К. Вентер – в то время глава Института геномных исследований в Роквилле (США), – опубликовал перечень генов, необходимых для существования одноклеточного организма, – микоплазмы. По его подсчтам этот обитатель половых путей человека может обходиться 300 генами из своих 517, которые в этом микробе образуют одну хромосому.

В основе проекта – на 3 года, лежит та же бактерия. Из е клетки учные намерены извлечь весь генетический материал, затем скомпонаватъ из его «кусочков» искусственную цепочку генов, т.е. хромосому. В е состав войдут только те гены бактерии, которые «безусловно необходимы» для поддержания жизни нового организма. На завершающем этапе собранная цепочка генов будет инкорпорирована в лишенную генетического материала клетку.

Затем «должно случиться самое интересное, то, ради чего задуман эксперимент» – оживление бактерии. Дальше пойдут наблюдения за таким полуприродным организмом: как он живт и размножается.

«Нас интересует: можно ли придти к молекулярному определению жизни, и наша главная цель – фундаментальное понимание составляющих самой элементарной живой клетки».

Во избежание создания болезнетворного агента К. Вентер и Х. Смит лишат новую «микоплазму» генов, ответственных за е прикрепление к клеткам в организме человека, потом тех генов, которые позволяют ей выживать в неблагоприятных условиях. В результате получится «довольно хрупкое существо, абсолютно зависимое от своих создателей».

В задачу исследований также входит научиться искусственно создавать различные гены. «Это – воистину базовая наука, – говорит К. Вентер. – Даже при том, что мы обнаружили все гены в человеческом геноме, мы до сих пор не смогли постичь тайну самой простой клетки. Именно это мы и хотим сделать сейчас».

К. Вентер и Х. Смит и их группы в запасе имеют и другой вариант создания живой клетки: искусственно в лаборатории синтезировать эти базовые гены, собрать их в цепочку, а затем ввести их в такую же бактерию, из которой е генетический материал весь будет предварительно удалн.

Что вкладывает К. Вентер в свою задачу – дать «молекулярное определение жизни»?

Любая клетка построена из молекул, как и организм в целом. Их структура и состав, а также взаимодействие заложены в генах. В процессе эволюции каждая молекула скроена в соответствия с функцией в клетке. Клетка – это не хаотическое скопление молекул, а «их упорядоченность», т.е. организация, так как е строят гены через продукты – белки. Разрушь е, то хотя и останутся в виде смеси эти молекулы клетки,– это уже будет мртвое, так как разрушена молекулярная организация клетки. А она создана в процессе эволюции «живого».

Отсюда: К. Вентер стремится минимумом генов получить такую организацию неживых молекул, которая превратится в «живое». Это и будет абиогенезом.

1.2. Раскрытие секрета жизни – значение для медицины и онкологии В биологии проблема сущности жизни и е происхождения всегда стояла под номером один.

Главным признаком жизни или живого на уровне клетки является е деление, т.е. митоз.

Процесс митоза, видимый в микроскоп, при котором одна клетка делится на две, – «удивительное явление в биологии». Ещ удивительнее при этом представлялось возникновение двух хромосом там, где раньше была только одна.

Это являлось величайшим секретом биологии: «как удваивается это, имеющее первостепенное значение, тельце?»

Хромосома состоит из трх веществ: ДНК, белка и РНК. Нуклеиновые кислоты и белки состоят из гигантских молекул, каждая из которых имеет основной скелет и боковые группы. В белках содержатся элементы двадцати типов, в нуклеиновых кислотах – четырх типов и при том иных.

28.II.1953 г.Ф. Крик вошл в кембриджский «Игл паб» и сказал: «Мы раскрыли секрет жизни». Они действительно обнаружили «нечто подобное». И это было то, за что позднее он и ещ двое сподвижников, в 1962 г. получили Нобелевскую премию.

Они создали модель пространственной структуры молекулы ДНК и этим совершили прорыв, который, в частности, позволил разгадать загадку: как удваиваются хромосомы перед делением клетки на две. Эта тайна или секрет десятилетиями не давала покоя учным.

Модель молекулы – это е копия, но гораздо больше по размерам, чем существующая в клетках. Из-за слишком малого размера мы не видим реальную молекулу. Модель молекулы позволяет нам понять е строение вплоть до расположения в пространстве отдельных атомов, а то и е функции в клетке.

Оказалось, что хромосома удваивается за счт репликации, т.е. удвоения.

Молекула ДНК – это спираль из двух цепей. Каждая цепь состоит из нуклеотидов: аденина (А), тимина (Т), гуанина (Г) и цитозина (Ц). Две цепи соединяются между собой парами этих оснований по принципу «ключ – замок»: А-Т;

Г-Ц.

Механизм репликации, т.е. удвоения молекулы ДНК: две цепи расходятся. Каждая цепь из нуклеотидов служит матрицей или шаблоном для достраивания к ней дополняющей е цепи из нуклеотидов. Когда этот процесс закончится, у нас будет уже не одна, а две пары цепей, т.е. две молекулы ДНК.

Одна молекула – для одной хромосомы, другая – для другой, т.е. по одной для каждой из двух дочерних клеток. Для деления клетки на две дочерние, как раз и требуется удвоение хромосомы. Но только теперь становится ясно, что это происходит после удвоения молекулы ДНК. В этом и состоит раскрытие секрета жизни.

В 60-х гг. ХХ в. предположение Д. Уотсона и Ф. Крика о механизме репликации, т.е. удвоения ДНК, было подтверждено. Кроме того, было показано, что этот процесс осуществляется при участии специального фермента – ДНКполимеразы.

Примерно в то же время было сделано ещ одно открытие – открытие генетического кода. Гены содержат в себе информацию о плане строения клетки и е функционирования, что передается дочерним клеткам. Передатся информация о линейной структуре каждого белка в клетке.

Белки, как и ДНК, представляют собой длинные цепочки из аминокислот.

Аминокислот – 20. Было не ясно, каким образом «язык» ДНК, состоящий из четырхбуквенного алфавита: А, Т, Г, Ц переводится на «язык» белков, где используется 20 «букв», первая буква – название аминокислоты.

Было показано, что сочетание из трх нуклеотидов ДНК, каждое из которых, называется кодоном, чтко соответствует одной из 20 аминокислот. И, таким образам, «текст» на ДНК однозначно переводится в белок.

Схема синтеза белка с копии гена, т.е. иРНК в рибосоме: ген – иРНК – белки.

Все свойства клетки в виде «инструкций» заложены в соответствующем гене или генах, а создаются через их продукт – белки. Изменения в гене: дефект его структуры или изменение его экспрессии дадут изменения в его белках – изменения в структуре белка, отсутствие белка, избыток нормального белка. А это вызовет изменения в свойствах клетки.

Между размножением клетки и репликацией ДНК имеется принципиальное различие.

Первый процесс – это деление клетки на две. Это клеточный уровень.

Второй процесс – это создание молекулой точной своей копии. Это молекулярный уровень. Деление клетки на две дочерние не произошло бы, если не было бы репликации молекулы ДНК.

Отсюда: репликация ДНК – это молекулярная причина, а деление клетки – е следствие.

Таким образам, до раскрытия секрета жизни каждое свойство клетки как живого только описывали, а теперь – объясняют, т.е. знают его молекулярную причину.

Клетка стала предметом изучения биологии, а молекулярные причины свойств клетки, – предметом молекулярной биологии. Она возникла с момента раскрытия секрета жизни.

Зная молекулярную причину каждого свойства клетки, можно на не воздействовать. Это дало возможность учным управлять живым; управлять – это, значит, уметь изменять свойства живого.

В отличие от нормальной клетки, раковая клетка – бессмертна за счт восстановления в ней после каждого деления длины теломер.

Причина этого свойства – молекулярная: в раковой клетке включн ген теломеразы, а она восстанавливает длину теломер.

Цель: лишить раковою клетку свойства бессмертия, т.е. сделать е смертной. Здесь ген и его фермент – теломераза будут целями или мишенями для воздействия.

Для прекращения функции гена можно в раковую клетку ввести антисмысловую РНК к иРНК, т.е. к копии гена. Она по принципу комплементарности пар оснований соединится с иРНК, и тогда синтеза теломеразы уже не будет.

Чтобы блокировать теломеразу, можно по е трехмерной структуре синтезировать молекулу лекарства, комплементарную к активным участкам фермента теломеразы. Его ввести в раковую клетку, оно соединится с теломеразой по принципу – «ключ-замок», и теломераза будет блокирована. В результате в раковой клетке теломеры уже не будут достраиваться перед делением, и клетка погибнет через апоптоз.

Но эти средства блокирования гена теломеразы не всегда могут быть эффективными. Недавно сделано открытие – «малые интерферирующие РНК», введение которых в организм специфично «выключает» конкретный ген путем разрушения его копии – иРНК (см. раздел 8.1.).

Вот это и означает – управлять живым, в данном случае, раковой клеткой, воздействуя на молекулярные причины ее свойств.

Открытие того, что каждое свойство клетки в норме, а значит, и при болезни, создатся молекулярной причиной, привело к открытию молекулярной медицины.

Теперь мы знаем, что гены и их белки каждого свойства раковой клетки – это метки или маркеры для е диагностики. Они же – цели или мишени для лекарств, избирательно уничтожающих раковые клетки.

Точно также находят гены-маркеры и белки-маркеры для свойств возбудителей различных инфекций – бактерий, вирусов и др.

На примере со свойством бессмертия раковой клетки мы дали три способа уничтожения носителя этого свойства, т.е. раковой клетки.

Во-первых, через связывание копий гена-маркера этого свойства – иРНК.

Во-вторых, с помощью лекарства, связывающего белок-маркер, т.е. теломеразу, которая создат свойства бессмертия раковой клетки.

В-третьих, «выключение» гена свойства бессмертия раковой клетки путем разрушения его копий иРНК с помощью интерферирующей РНК.

Создание лекарств по генам-маркерам и белкам-маркерам позволяет, действуя только на них, избирательно уничтожать их носителей, не давая побочных эффектов. Это и есть молекулярная или генная медицина.

В ближайшие годы ХХI-го века эта медицина должна заменить существующую, которую теперь уже называют, – «старой». Ведь при «старой» медицине лекарство создают методом «проб и ошибок», поэтому они часто и вызывают у пациентов тяжлые побочные эффекты. В этом смысле в трудном положении находится сегодня стандартная химиотерапия рака.

Основные причины этого: 1) раковая клетка – это эукариот среди нормальных клеток организма человека, тоже – эукариотов; 2) отставание науки до последних лет об источниках канцерогенеза и его молекулярных причинах.

Лекарства стандартной химиотерапии сами по себе не могут различать раковую клетку среди нормальных клеток и направлены на уничтожение слишком быстро делящиеся клетки, к которым относили каждую клетку рака.

Недавно выяснено, что канцерогенез из двух источников: 1) из нормальной клетки ткани, ставшей прежде стволовой клеткой, или 2) из стволовой клетки ткани.

Оказалось также, что в составе клеток рака клетки неодинаковые:

- основную массу клеток составляют нераковые клетки: они быстро делятся и после выполнения функций ткани сами погибают через апоптоз; именно эти клетки – мишени для лекарств стандартной химиотерапии;

- значительно меньшую часть составляют раковые клетки: это раковые стволовые клетки, которые асимметричным делением копируют себя и генерируют нераковые клетки в составе клеток рака.

При этом, раковые стволовые клетки делятся редко и медленно. Это причина того, что лекарства стандартной химиотерапии оказываются неэффективными против раковых стволовых клеток (J.E. Trosko et al., 2005).

До сих пор в клинической практике преобладают пациенты с симптомами рака и крайне редко встречаются пациенты, у которых рак – «ин ситу», т.е. на месте.

Начинать лечение рака при его симптомах – это уже очень поздно. Ведь раковые клетки начинают распространяться по организму при размере рака в ткани какого-либо органа всего лишь 2 мм в диаметре, т.е. с началом в узелке ангиогенеза и лимфангиогенеза.

Теперь же, когда наступила эра молекулярной медицины, пациента начнут лечить ещ до того, как появятся первые симптомы болезни, в том числе и рака: в самом его начале – на уровне первой раковой клетки и е первых потомков, и даже до его начала – на уровне предраковых клеток.

Определив ген-маркер болезни, можно определить, какой именно белок е вызывает, а значит, надо и создать лекарство против этого белка или его гена – вот и «волшебная пуля», о чм так мечтал П. Эрлих. На этом и будет строиться фармакология будущего.

Новые лекарства и средства на основе генов-маркеров и белков-маркеров конкретной болезни станут прицельно атаковать только дефектные клетки, уничтожая их, и не повреждая при этом здоровые клетки. Отсюда – не будет побочных эффектов от лекарств у пациента.

Раковая стволовая клетка возникает из нормальной клетки или стволовой клетки ткани из-за дерепрессии в ней генов фетальных белков и одновременно репрессии генов-супрессоров метилированием CpG-динуклеотидов промотора этих генов или мутаций в генах. При этом она становится более живучей, чем нормальная клетка этого же типа.

Раковая клетка нест в себе ряд уловок, делающих е неуязвимой и способной к самостоятельному существованию в организме пациента. Т.е. эта дефектная клетка не просто клетка, а целый одноклеточный организм.

«Один в поле не воин», – гласит пословица. Но раковая стволовая клеткаорганизм – «одна в поле воин», так как легко обходит все защитные механизмы организма пациента.

Она в организме, но живт отдельно от него, паразитируя на нм. В организме пациента эта клетка-организм занята лишь одним делом – копированием себя и разрушением тканей и органов своего носителя вплоть до его смерти и погибает сама лишь после его смерти.

Из того, что причиной любой болезни являются гены и их продукты – белки в клетке, вытекают состояния пациента, знания которых важно для врача любого профиля.

1. Предболезнь.

Любая болезнь начинается с патологии клетки или клеток. Изменения в том или ином гене или генах клетки – не диагностика болезни, а лишь установление вероятной предрасположенности к ней.

При таких изменениях в половой клетке употребляют термин – предрасположенность к болезни, а в соматической клетке, чаще говорят – предболезнь.

При предболезни такой ген ещ не проявляет себя, так как в клетке ещ нет синтеза продукта гена – белков. При возникновении в нормальной клетке таких изменений в генах, – это предраковая клетка.

«Ремонт» такого гена или генов, или замена его в клетке на нормальный ген, «выключение» генов свойств раковой клетки ликвидируют предболезнь.

2. Болезнь.

Когда в клетке под контролем гена или генов уже есть синтез его продукта – белков, то это признак того, что ген уже начал разрушительную работу в клетке, ведущую к болезни.

Здесь изменения в гене или генах – первопричина болезни клетки, а изменения свойств клетки вызываются продуктом гена, т.е. его белками. Эти свойства формируют затем симптомы конкретной болезни.

Ген-причина в клетке – это ген-маркер, а его белок – белок-маркер. Ингибирование гена-причины и его продуктов – белков в клетке, может остановить болезнь.

3. Ранняя диагностика болезни.

До сих пор многие болезни и среди них тяжлые, в том числе – рак, диагностируются на этапе их симптомов. Лечение многих болезней на таком этапе крайне затруднительно в смысле излечения или даже невозможно.

Теперь диагностика любой болезни, в том числе, самой опасной болезни – рак, станет возможной в досимптомном периоде.

«До начала». Это будет осуществляться путм выявления в клетке или клетках у пациента гена-маркера конкретной болезни. В отношении рака – это будет диагностика предраковой клетки или клеток.

«С самого начала». Это будет осуществляться выявлением в клетке или клетках не только гена-маркера, но и белка-маркера для конкретной болезни. В отношении рака, это будет выявлением в организме пациента первой раковой клетки и е близких потомков.

Материалами для этих исследований могут быть: образцы ткани фонового процесса соответствующего органа – биопсия, а также кровь и другие биологические жидкости от пациента.

При любой локализации рака у пациента в крови за счт мозаичности капилляров узелка рака могут быть обнаружены как сами раковые клетки, так и их маркеры: в плазме крови – гены-маркеры, а в сыворотке крови – белкимаркеры из раковых стволовых клеток.

В плазме крови могут быть гены-маркеры из предраковых клеток, а также гены-маркеры – из раковых клеток, но различить их практически невозможно.

Теоретически найти эти различия можно с помощью МС-ПЦР и ПЦРММК и белковых микрочипов.

Если в плазме крови от пациента будут обнаружены гены-маркеры, характерные для раковой клетки, а в сыворотке этого же образца крови отсутствуют соответствующие белки-маркеры, то это могло бы указывать на присутствие предраковых клеток.

Обнаружение в плазме крови от пациента генов-маркеров из раковой клетки, можно было бы обозначать как I уровень ранней диагностики рака, так как нарушения в генах – это первопричина превращения нормальной клетки в раковую клетку. Тогда обнаружение белков-маркеров из раковых клеток в сыворотке крови от пациента – это II уровень ранней диагностики рака, так как белок-маркер – это продукт гена.

4. Лечение болезни.

Для этого в качестве мишеней для лекарств и средств будут использоваться – гены-маркеры и белки-маркеры клеток при каждой болезни.

Это новые лекарства и средства, которые будут прицельно действовать только на дефектные клетки, а для рака – это раковые стволовые клетки, не затрагивая при этом нормальные стволовые клетки. То есть эти лекарства и средства будут избирательны и индивидуальны для конкретного пациента (А.И.

Арчаков, 2000).

5. Критерии излечения от болезни и контроль.

Гены-маркеры и белки-маркеры позволят обнаружить дефектные клетки при любой болезни тогда, когда никакими другими методами их еще нельзя обнаружить в организме пациента.

Они позволят обнаружить рак у пациента при размере узелка из раковых клеток в ткани диаметром в 2 мм (А.С. Белохвостов, 2000).

Количество или титр генов-маркеров и белков-маркеров в крови из дефектных клеток конкретной болезни или из раковых стволовых клеток позволит осуществлять слежение за процессом лечения болезни и результатом лечения пациента.

Если титр маркеров в процессе лечения не уменьшается, тактику лечения нужно менять. Полное отсутствие маркеров через две-три недели после окончания лечения – признак излечения пациента от болезни.

Очень удобно будет вести такой контроль с помощью биочипов: ДНКчипы для генов-маркеров, а белковые чипы – для белков-маркеров дефектных клеток конкретной болезни и раковых стволовых клеток рака.

1.3. Открытие строения генома человека – значение для медицины и онкологии Причина любой болезни внутри клетки или клеток, – на уровне молекул ДНК и белков. В будущем причины болезней будут обнаруживать на уровне атомов и их электронных оболочек.

В настоящее время нарушения в молекулах ДНК и белков клетки или клеток – истинная причина любой болезни. Для понимания болезни, е ранней диагностики и излечения, необходимо знать их молекулярные причины.

Но это прежде требует знаний структуры и функций молекул ДНК и белков в нормальной клетке каждого типа. На уровне ДНК – это гены.

Ген – это фрагмент ДНК, который нест информацию о структуре иРНК, других РНК и белков.

Геном – это совокупность генов и межгенных участков в молекулах ДНК.

Геном изучает наука – геномика.

В ядре любой соматической клетки человека имеется 23 пары хромосом.

Каждая хромосома содержит одну молекулу ДНК из двух цепочек. Каждая цепочка построена из нуклеотидов, в каждом по одному из азотистых оснований.

Всего азотистых оснований четыре: аденин, тимин, гуанин, цитозин. Для краткости их обозначают первыми буквами слов – А, Т, Г, Ц. Эти буквы – алфавит ДНК.

Каждая молекула ДНК представляет собой целый ряд генов. Так как ДНК построена из двух цепочек, то е длина измеряется числом пар оснований, а каждую пару обозначают словом «буква».

Две цепочки из нуклеотидов с помощью пар оснований соединяются вместе и образуют целую молекулу ДНК. Пары оснований комплементарны друг другу и соединены между собой водородными связями только такими сочетаниями: А-Т или Т-А; Г-Ц или Ц-Г. На протяжении всей длины молекулы ДНК можно видеть такие сочетания оснований. Но порядок размещения пар оснований или их последовательность для каждого гена свой. Именно в последовательности пар оснований или «букв» и заключена генетическая информация.

Это инструкция о том, как должна быть построена клетка каждого типа, и как она должна функционировать. Это относится и к организму в целом. То есть генетическая информация всех генов – это «рецепт» построения и функционирования организма человека.

Из этого ясны цели открытия строения генома:

1) выявить последовательность пар оснований каждого гена вдоль длины молекулы ДНК;

2) определить место каждого гена и его границы по длине молекулы ДНК. Это необходимо было сделать в каждой хромосоме – с 1-й по 23-ю.

Весь процесс открытия строения генома человека состоял из этапов:

1) разделение молекул ДНК на большие фрагменты и секвенирование (от лат. sequi – следовать), т.е. определение последовательности пар оснований или «букв»;

2) картирование, т.е. идентификация генов и локализация места их расположения на хромосомах.

На первом этапе было обнаружено, что ДНК человека в 23-х хромосомах состоит из 3,2 млрд. пар оснований, т.е. химических «букв». Каждая пара оснований – это «кирпичик», из которых формируются гены.

На втором этапе учные расположили эти пары оснований в правильной последовательности, что позволило «прочитать» каждый ген и произвести инвентаризацию генов и межгенных участков. Так была составлена карта топографии генов на хромосомах. Но эти данные будут ещ уточняться и дополняться.

Прямая выгода от знания строения генов станет очевидна не сразу, пока не будут выяснены функции каждого гена в клетке, т.е. что он делает?

До открытия строения генома учные знали функции ряда генов. В целом учные знают о функциях не более одной трети генов, а о двух третях их – ничего.

То есть учным ещ предстоит выполнить важнейший третий этап – выяснить функции каждого гена в клетке каждого типа в норме. Важно узнать, какие гены в такой клетке работают, а какие «молчат». Затем учные то же сделают в дефектной клетке того же типа, например, в раковой клетке. По разнице можно выявить ген-причину, но это лишь один из путей обнаружения раковой клетки.

1. Оказалось, что в геноме человека всего 26-30 тысяч генов, а не больше, как предполагалось.

Очевидно, не зря в клетках человека обнаружено «расщепление» генов.

За счт этого с гена может копироваться не одна иРНК, а больше – в среднем до 10 таких молекул. Отсюда продукт гена – белок не один, а несколько – от 3 до 10 разных белков.

То есть в схему этапов реализации генетической информации от гена к его основному продукту, следует внести уточнение: ген – иРНК – белки, вместо – «белок» в прежней схеме.

Считают, что у человека «один ген отвечает за группу функций» или «за одну функцию отвечает сразу целая группа генов». Это будет изучено, так как есть методы определения функций генов.

2. Лишь 2% всех генов участвует в синтезе белков в клетке, остальные – 98% длины ДНК до недавнего времени считалось – не являются генами. Это длинные последовательности нуклеотидов, в которых часто повторяется – АГГ, АГГ… Функции этой части генома только начинают изучаться. Но уже ясно, что это не «мусор», как некоторые считали, а часть ДНК, которая регулирует экспрессию генов и их связей между собой.

3. Небольшое число генов в геноме человека имеет важное практическое значение – легче разобраться в роли генов, которые могут вызывать разные болезни, в частности, рак.

4. Оказалось, что около половины генов являются общими и для человека, и для червячка «C. elegans». Более того, в геноме человека только 300 генов, которых нет в геноме полевой мыши.

Для изучения функций генов широко используется клетки в культуре.

Принцип: с помощью введения в клетки антисмысловой РНК блокировать, а теперь можно малой молекулой РНКи разрушить в клетке иРНК, т.е. копию изучаемого гена. По изменению свойств такой клетки можно определить функции этого гена.

Открытие общих с человеком генов у червячка и мыши делает эти организмы новыми, очень нужными моделями для определения функций неизвестных у человека генов, но одинаковых с ними. Ведь изучать функции генов на этих организмах проще и легче, чем на человеке. Их гены можно легко изменять, т.е. вызывать мутации или выключать ген, следя за изменениями свойств клетки или свойств организма.

На мышах можно использовать и такой прим: в половых клетках удалять один, либо два, либо больше генов и изучать организм таких мышей-мутантов.

Это позволит понять какой ген или гены за что отвечают, изучать взаимодействие генов между собой.

5. Разница между генами мыши и человека не превышает 1%, а между разными людьми – 0,01%.

На выяснение функций всех генов в клетках каждого типа человека уйдт много лет. Когда это будет достигнуто, учные смогут на уровне нормальной клетки каждого типа установить стандарт или идеал нормы: а) последовательности пар оснований для каждого гена и б) функций каждого гена в клетке.

Акад. А.И. Арчаков (2000) подчркивает, что «теперь стало совершенно очевидно, что все болезни от генов». На этой основе он впервые предложил классификацию всех болезней на «два больших класса»:

1. Наследственные болезни. Они составляют всего 2% от всех болезней.

Их причина – дефект гена или генов в половых клетках.

2. Ненаследственные или приобретнные болезни. Они составляют 98% от всех болезней. Их причина – нарушения экспрессии гена или генов в соматической клетке или клетках.

Из причин болезней «сразу» вытекают и методы лечения пациентов: для пациентов первого класса – «перспективна генная терапия», а для пациентов второго класса – «создание новых лекарств».

В настоящее время для оценки функций генов и их изменений в клетках при различных болезнях, в частности, раке, разработан ряд новых методов. Но в клиническую практику они только начинают «входить». Они необходимы для ранней диагностики раковых клеток и для контроля излечения от рака.

1. ПЦР-ММК – это чувствительный и наджный метод получения фрагментов генов или РНК в неограниченном количестве копий для последующего их анализа. Им можно выявлять любые фрагменты мутантных генов или избыток иРНК генов из раковых клеток в образцах из плазмы крови и других биологических жидкостей, из клеток рака материала биопсий от пациента. А избыток иРНК и мутации в генах – это маркеры раковых клеток.

2. ДНК-чипы. На них можно определять, какие гены в нормальной клетке каждого типа активны, а какие – «молчат». Такие микрочипы позволяют оценить состояние десятков тысяч генов в клетке и даже сразу всех, т.е. 26-30 тысяч составляющих геном человека.

ДНК-чипы позволяют произвести раннюю диагностику рака, т.е. первую раковую клетку и е первые потомки по исследованию образца плазмы крови от пациента: в ней можно находить фрагменты генов фетальных белков, например, гена oct-4, гена белка «5Т4» и другие, а также фрагменты мутантного гена wt53 – «стража» генома из погибших раковых клеток.

Когда будут выяснены функции каждого гена в нормальной клетке каждого типа и гены-причины, вызывающие ту или иную болезнь, медицина будет изменена в корне: она станет молекулярной.

Перед учными стоят задачи:

1) какие гены в нормальной клетке разного типа, став дефектными, превращают нормальную клетку в раковую клетку;

2) сколько всего дефектных генов вызывает образование из нормальной клетки раковую клетку;

3) влияние таких дефектных генов на организм человека. Для этого необходимо создать мышь-мутант с таким дефектом гена или генов. То есть, работы по идентификации генов теперь могут длиться дни, а не годы, как раньше. Но главная задача молекулярной медицины заключается теперь в том, чтобы выяснить, какие гены и как изменены, что вызывают ту или иную болезнь, в частности, канцерогенез, «трансформировать в знание того, что с этим можно сделать».

Для этого учным потребуется лучше понять, как, строя и поддерживая наш организм, взаимодействуют между собой белки – молекулы, построенные по генетическим «шаблонам» ДНК.

Наука геномика уже существует и активно развивается, но наука протеомика ещ только вначале своего пути. И здесь впереди ещ «долгий путь».

Диагностика болезней будет основана на выявлении дефекта гена или генов, или изменения экспрессии генов по иРНК. Такие изменения в генах – это маркеры для ранней диагностики болезни и гены – причины конкретной болезни. Они же будут мишенями для воздействия лекарственных препаратов.

Среди лекарственных препаратов могут быть: нормальный ген для замены дефектного гена в клетке, ингибиторы дефектных генов – введение РНКи в дефектные клетки, «ремонт» генов в клетке и др.

Действие лекарственных препаратов будет избирательным, т.е. без повреждения здоровых клеток и направлено не на ликвидацию симптомов болезни, а против гена-причины. Это особенно необходимо соблюдать при лечении рака.

Что даст в перспективе для медицины открытие строения генома?

1. Проведение генетических тестов. Для любой болезни будут определены гены-маркеры: а) «до е начала» – это диагностика предболезни и б) «е начало» – это ранняя диагностика болезни – I уровень.

По одному небольшому образцу крови или плазмы от пациента достаточно, чтобы определить степень риска возникновения болезни, в том числе появления первых раковых клеток в организме. Для этого наука быстрыми темпами разрабатывает детальные тесты, что позволит очень рано выявлять предболезнь или болезнь. В таких случаях применение избирательных лекарственных препаратов может предотвратить возникновение болезни, в частности, рак.

2. Создание индивидуальных лекарственных препаратов. Лекарство будет создаваться для конкретного пациента. На уровне ДНК эти лекарства будут направлены против дефектов генов и их иРНК. В отличие от существующих препаратов, новые препараты будут давать максимальный эффект, а их избирательное действие на клетки-мишени предупредит побочные эффекты у пациента.

3. Проведение генной терапии. В настоящее время любой ген можно клонировать или синтезировать. Сам по себе такой ген, введенный в организм любого вида, не отторгается этим организмом.

Для излечения рака генная терапия крайне необходима. Для этого уже разработано много методов, но в клиническую практику только начинают внедряться.

Например: введение в раковые клетки нормального гена-супрессора wt белка р53 при мутациях его в раковой клетке, «гена-смерти» bах для индукции апоптоза в раковые клетках, подавление экспрессии генов oct-4, Nanog, hTERT, циклина D1, генов mts1 и остеопонтина и других генов инвазии раковых клеток.

До сих пор считалось, что хранилищем генетической информации являются только гены, кодирующие белки. Но в некодирующих белки областях ДНК, которые долгое время относили к «хламу», оказалось множество генов, кодирующих только малые, т.е. короткой длины двухцепочечные молекулы РНК. Они то и осуществляют контроль обычных генов – избирательно подавляя их экспрессию в клетке, путем разрушения копии, т.е. иРНК гена. Это интерферирующие РНК (РНКи).

Фенотип клетки любого типа во многом определяется метильными группами – (-СН3). Они могут связываться с цитозином (С), когда в одной цепи нуклеотидов за ним следует гуанин (G) – это дуплет CpG. Такие дуплеты часто располагаются в промоторе генов.

При присоединении к CpG – островкам метильной группы метилтрансферазой, – ген выключается, а когда удаляется метильная группа деметилазой, – ген включается. Важно то, что при этом последовательность нуклеотидов не затрагивается. Отсюда и название этого явления – эпигенетическое изменение гена. «Эпи» в переводе с греческого, – это «над» генами.

Открытие строения генома человека, – «это только начало пути», подчеркивает У. Гиббс (2004). В настоящее время учные приступили к изучению эпигенома, конечная цель которого – составление карты «всех сайтов метилирования в ДНК».

В отличие от мутаций метилирование и деметилирование промотора генов – процесс обратимый. В каждой нормальной клетке разного типа «рисунок» метилирования свой. Кроме редких типов клетки, ошибки в метилировании – главная причина превращения нормальной клетки в раковую клетку.

Для раковой клетки характерны:

- снижение метилирования геномной ДНК в целом;

- деметилирование ряда фетальных генов, что приводит их к дерепрессии;

- метилирование генов-супрессоров, препятствующих в норме превращению нормальной клетки в раковую клетку;

- введение деметилирующих лекарств в эти гены возвращает гены в нормальное состояние. Однако, в раковой клетке в отличие от нормальной клетки, такое изменение часто нестабильно. Учные заняты решением этой очень важной проблемой для онкологии.

Эпигенетическими изменениями занимается наука эпигенетика – е объект эпигеном человека.

4. Открывается подход к определению состояний живого существа.

«Живое существо» или «живое» начинается с уровня клетки, ниже этого уровня молекулы, ещ ниже – атомы и их электроны. Но это уже не живое.

Понятие «состояния» относится к живому существу, так как только живое существо, а не молекулы или атомы, могут реагировать на раздражители.

Состояния живого существа известны с глубокой древности – из работ нашего великого соотечественника – учного и врача ибн Сины (980-1037 г.).

Величайший труд ибн Сины «Канон врачебной науки» охватывает все разделы средневекового медицинского знания. Он включает анатомию и физиологию человека, патологию, лекарствоведение, клиническую диагностику и лечение болезней.

Этот труд по своей роли в истории медицины ученые сопоставляют только с Гиппократовым сборником.

«Канон» был составлен в первые десятилетия XI в., впервые был отпечатан на арабском языке в Риме в конце XVI в., затем был ряд переводов его на латинский язык.

Много веков подряд его штудировали в университетах и школах Запада и Востока как обязательное руководство для врачей. Да и сегодня каждый читатель находит в нм много интересного и поучительного.

Ибн Сина определял медицину так: «медицина – наука, познающая состояние тела человека, поскольку оно здорово или утратит здоровье, ради того, чтобы сохранить здоровье и вернуть его, если оно утрачено».

«Познание всякой вещи, если она возникает, достигается и бывает совершенным через познание е причин, если они имеются». Поэтому ибн Сина говорит: «в медицине следует знать причины здоровья и болезни. Причины эти бывают явные и скрытые».

«В истинных изъяснено, что познание вещи приобретается через познание е причин и начал. Материальные причины – это заложенные в теле основы».

Теперь нам можно перейти к определению состояний живого существа.

Среди состояний живого существа ибн Син различал: «здоровье» и «утрата здоровья». В утрату здоровья он включал два состояния: «болезнь» и «не здоровье и не болезнь». Для сегодняшнего дня «не здоровье и не болезнь» – это предболезнь.

Познание состояний живого, писал ибн Син, требует знания их причин. И на это ушли века. Многие учные пытались дать определение «болезни», а определения «здоровья» практически не касались. Но мы до сих пор не имеем правильного и понятного определения ни здоровья, ни болезни.

На наш взгляд, выделенные впервые ибн Син состояния живого, – основа для их определения.

Лишь недавно прогресс науки – расшифровка генома человека и начало изучения его эпигенома дают нам возможность решить эту проблему или заметно приблизиться к ней. Но для этого прежде надо дать ответ на вопрос: что является причиной этих состояний?

Ответ: причиной является эпигеном живого существа, так как: 1) именно эпигеном «контролирует и регулирует работу каждого гена» в клетке и 2) нарушения экспрессии гена или генов в нормальной клетке – причина болезни (А.И. Арчаков, 2000).

Анализ эпигенома позволит определить каждое из этих состояний, в том числе промежуточное состояние – предболезнь; в схеме это можно было бы сделать так1:

а) на уровне соматической клетки 2. Изменения в эпигеноме клетки без - Предболезнь клетки нарушениями е функций б) на уровне эпигенома человека по анализу клеток крови нарушениями функций организма 1. В пункте «а» тип исследуемой клетки должен быть одинаковым с типом клетки идеального эпигенома.

2. Регистрация отличий эпигенома исследуемого образца от идеального эпигенома.

3. Сравнение эпигеномов проще проводить на ДНК-чипах.

Идеальный эпигеном, т.е. стандарт здоровья.

Глава 2. Протеом нормальной соматической клетки 2.1. Протеом клетки – значение для медицины, ранней диагностики раковой клетки и излечения рака Скоро нынешняя медицина уйдт в прошлое. Давняя мечта П. Эрлиха – иметь лекарство без нанесения вреда пациенту – «волшебную пулю», станет реальностью.

Оно будет уничтожать: при инфекциях – возбудителей, при раке – раковую стволовую клетку, не повреждая здоровых клеток, действуя на белок, вызывающий болезнь. Для каждого пациента будут создаваться индивидуальные лекарства. Это началось после открытия структуры генома человека.

Причина – нынешний принцип создания лекарств. Их открывают слепым подбором веществ-«кандидатов» на лекарства (А.М. Егоров, 2002). Механизм их действия тот же: действие на те же мишени в возбудителях, в раковой клетке – на е ДНК, повреждая е в той же степени и в окружающих здоровых клетках.

Но раковые клетки – клетки-организмы, очень живучи и коварны. Многие из них остаются не пораженными намертво включением гена MDR1 Pгликопротеина: лекарства активно выводятся в межклеточную среду и клетки продолжают размножаться. Даже адресная доставка лекарств в раковые клетки, рассеянные по организму, но без подавления этого гена или белка, бессильна против них.

Выход из этого один: отказ от слепого способа создания лекарств, поиск в раковой клетке белков-маркеров и синтез против этих мишеней лекарств.

Белок-маркер раковой клетки находится на е поверхности, на нормальной клетке того же типа его нет. Все болезни начинаются с уровня гена и его продукта – белков. Простые белки или протеины состоят лишь из остатков аминокислот.

Белки или протеины известны с начала XIX в. Химики выбрали термин «протеины» для этих веществ, от греч. proteios – «первый», так как в начале XX в. стало ясно, что белки – главные участники всех жизненных процессов в клетке. После открытия структуры генома оказалось, что знания о нм можно применить на практике лишь: 1) через белки и 2) именно белки создают все свойства клетки. Любой белок – это продукт гена. В схеме это выражается так:

При любой болезни в клетке, в частности, раковой, какой-то ген или гены изменены. Поэтому в е белках произойдут соответствующие изменения: 1) нет белка или его мало; 2) изменена первичная структура белка; 3) избыток нормального белка в клетке; 4) нет деградации дефектного белка в клетке.

Термин «протеом» образован от слова «протеин» и окончания слова «геном».

Протеом – это набор белков в данной клетке в определенный момент времени. Его изучает наука – протеомика.

Набор генов в каждом типе клетки один и тот же, а набор белков в клетке каждого типа свой. Причина в том, что в одном типе клетки активны одни гены, в другом – другие.

Сколько белков в нормальной клетке каждого типа – никто пока не знает.

По некоторым данным в одной клетке может быть до 1 миллиона белков.

Учные торопились открыть строение генома клетки для того, чтобы понять, какие белки участвуют в выполнении функций в нормальной клетке каждого типа и в дефектных клетках при различных болезнях.

Для синтеза белка с его гена снимается копия – иРНК. Этот процесс называется транскрипцией. До последнего времени считалось, что с каждого гена снимается копия одного белка. Теперь оказалось, что с различных участков гена снимается несколько копий – до 20, значит, синтезирован будет не один белок, а несколько.

Синтез белка происходит на рибосоме, иРНК, т.е. копия гена, является матрицей для синтеза белка. Этот процесс называется трансляцией. В нм участвуют и другие РНК.

Функции каждого белка зависят от: 1) порядка или последовательности аминокислот в белке и 2) его пространственной структуры, т.е. трхмерной формы.

Порядок, в котором выстраиваются аминокислоты и какие аминокислоты, диктуются копией гена, т.е. иРНК. Это фрагмент из нуклеотидов, каждый из которых содержит одно из азотистых оснований, которых четыре: аденин, тимин, гуанин, цитозин.

Из трх нуклеотидов в ряд образуется кодон и порядок оснований в нм диктует, какая из аминокислот будет синтезироваться. Например, участку копии гена Т-Т-Т соответствует аминокислота лизин, а участок цепи гена А-Ц-А – цистеину и т.д.

На рибосоме по последовательности оснований синтезируются аминокислоты, а они в той же последовательности соединяются в цепь – первичную структуру белка. Как транскрипция, так и трансляция осуществляются специальными ферментами, ген в этих процессах дает только программу синтеза.

После синтеза этот продукт должен претерпеть ряд химических изменений и только после этого принимает пространственную структуру – трхмерную форму. Только в такой форме молекула белка в состоянии выполнять свои функции в клетке.

Пространственная структура молекулы белка – это «все эти выпуклости, бороздки и изгибы, позволяющие белку реагировать с другими молекулами в клетке» (А.И. Арчаков, 2001). Очень часто дефект именно в этой структуре мешает белку выполнять свои функции в клетке. Информация о пространственной структуре каждого белка – своя, она постоянная и неизменная. Это опознавательный знак или пароль для иммунной системы. Любой незнакомый организму белок подлежит уничтожению.

На поверхности раковой клетки из-за эпигенетических изменений в ней имеются фетальные белки, которых нет на нормальной клетке этого же типа.

Они «свои» для клеток иммунной системы, но являются белками-маркерами для диагностики раковой клетки.

На раковой клетке могут быть белки от мутации некоторых геновсупрессоров. Такие белки на клетке могут быть белками-антигенами, так как их синтез не закодирован в геноме организма-хозяина. Это метки или маркеры.

По метке иммунная система распознает раковую клетку, связывается с этим белком, уничтожает этот белок, а вместе с ним и его носителя – раковую клетку.

Считают, что отдельные раковые клетки иммунная система пациента способна уничтожать. Но против потомства раковых клеток, т.е. рака, обычно неэффективна. Это объясняют рядом причин.

В последнее время выяснено, что мутации генов в клетках иммунной системы способствуют «избеганию раковых клеток от клеток иммунной защиты».

Такие клетки иммунной системы не способны бороться с раковыми клетками.

Ключ к пониманию этого процесса может изменить подход лечения рака.

Все функции клетки каждого типа выполняют белки. Учные это выражают так.

N.J. Anderson (1998) считает, что: «белки определяют активную жизнь клетки, а гены представляют собой только план этой активности».

Акад. А.И. Арчаков (2003) пишет, что информация в генах – «это знания того, что может быть», а знания о состоянии белков в клетке, – «это конкретное знание того, что есть».

А. Волков (2002): «гены – всего лишь инструкция или схема, по которой изготавливается подлинный продукт – протеины, т.е. белки».

В генах все определяет последовательность нуклеотидов, в белке – последовательность аминокислот.

Функции белков в клетке каждого типа: белки – это строительный материал; белки-переносчики различных сигналов; белки-рецепторы для переносчиков этих сигналов; белки – это антитела в организме; важнейшими среди всех белков в клетке являются белки-ферменты, катализирующие каждую химическую реакцию в клетке и др.

Методы определения пространственной структуры молекулы белка Белок устроен намного сложнее гена. Если ген составлен из четырх видов нуклеотидов и его строение может быть записано в виде текста из четырех букв – А, Т, Г и Ц, то для записи строения белка нужен уже двадцатибуквенный алфавит.

Если генов в каждой клетке человека тридцать тысяч, хотя скорее всего будет больше, то различных белков – около миллиона. Ген лишь кодирует набор аминокислот – «молекулярных кирпичиков», из которых состоит молекула белка.

Линейная последовательность аминокислот в живой клетке сворачивается в молекулу белка со строго определенной для каждого белка пространственной структурой. Такой процесс самосборки называется фолдингом (от англ. to fold – сворачиваться). Этот фолдинг контролируется в клетке агрегатом из белков под названием «шаперон». По форме он напоминает «ведрко». Он проверяет пространственную структуру у каждой молекулы белка.

Из-за повреждения гена нарушается конфигурация его молекулы белка. В таком случае «шаперон» это распознат, втягивает белок в «ведрко», разворачивает молекулу в исходную цепь аминокислот и выбрасывает «на свободу», т.е. дат ей попытку ещ свернуться правильно.

Процесс фолдинга для медицины имеет огромный интерес. Правильная структура белка обеспечивает правильную функцию, а нарушение пространственной структуры приводит к неспособности такого белка выполнять свою функцию, и как следствие, к возникновению патологии.

В настоящее время для определения пространственной структуры белка исследователи используют технологии, которые основаны на определении положения каждого атома в данном конкретном белке. В первую очередь это метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), а также рентгеноструктурный анализ кристаллов белка.

В этом знании недавно сделан настоящий прорыв. В 2002 г. объявлены Нобелевскими лауреатами по химии специалисты в области массспектрометрии американец Дж.Б. Фенн и японец К. Танака, а также швейцарец К. Вютрих – специалист по проблемам ядерно-магнитного резонанса.

Учные разработали методы, позволяющие быстро и надежно определять: какие белки содержаться в пробах, а также воспроизводить трхмерное изображение молекул белков в растворе.

В заявлении при вручении премии было сказано, что награды «за успехи в понимании жизненных процессов», т.е. появляется возможность увидеть белковые молекулы и понять механизм их функционирования.

Учные поясняют, – за разработку мощных аналитических методов для исследования больших молекул – белков, что может привести к появлению новых эффективных лекарств.

Считают, что именно эти учные дали жизнь протеомике – познанию структуры и функций белков, их роли в поддержании жизни.

Дж.Б. Фенн и К. Танака ранее разработали метод для определения состава и размера больших биомолекул. До них масс-спектрометрия использовалась только для малых молекул.

Тогда же К. Вютрих создал метод, основанный на ядерном магнитном резонансе и позволяющим определять структуру белка.

В результате работ этих учных стало возможным делать трхмерное изображение молекул белка, а из этого понимание, как работает в клетке тот или иной белок. В настоящее время с помощью ядерного магнитного резонанса по методу К. Вютриха получают 20% всех «снимков» молекул белка. За эти открытия этих троих учных называют – «отцы-основатели протеомики».

Но, принимая во внимание громадное количество атомов даже в простейшей молекуле белка, очевидно, что такие методы очень трудомки, длительны и дорогие, т.е. «не для нас» (А.И. Арчаков, 2000).

Поэтому учные заинтересовались, можно ли предсказывать трхмерную структуру белка, основываясь лишь на известной последовательности его аминокислот или генетического кода, который определяет последовательность аминокислот. Предсказание, какая молекула белка получится из последовательности азотистых оснований конкретного гена – одна из важнейших задач, встающих после определения генома человека.

Оказалось, что с помощью компьютерного моделирования становится возможным правильно предсказывать пространственную структуру белка.

Зная свойства аминокислот притягиваться или отталкиваться друг от друга и применив компьютерное моделирование, теоретически можно спрогнозировать и их расположение в пространстве. Число работ с использованием молекулярного моделирования растт год от года, и на пути предсказывания конформации молекул белка приближаются большие сдвиги. До сих пор неизвестно, почему конкретные белки выглядят именно так, а не иначе.

Используя пространственную структуру белка с помощью передовых технологий, позволило полностью отказаться от «метода проб и ошибок» в поиске новых лекарств – лиганд. Для нас – это поиск лекарств от раковых клеток.

Раковая клетка или клетки возникают в любом организме, даже у здорового человека. Она имеет аномальное строение и нарушенные функции. Е появление обусловлено каким-либо из канцерогенов: радиация, химические вещества, токсические продукты кислорода, а также ошибками в репликации генов и другими причинами.

Возникновение раковой клетки в организме – это ещ не болезнь, но е начало. Если она не будет уничтожена апоптозом, то из не возникнет потомство клеток, т.е. рак.

Все белки раковой клетки кодируются геномом организма-хозяина, поэтому они не являются белками-антигенами. Исключение могут составлять белки, возникающие из-за мутации в гене-супрессоре раковой клетки.

Отсутствие белков-антигенов на поверхности раковой клетки или их мало и «слабые», – главные причины отсутствия ответа клеток иммунной системы на раковые клетки.

Если бы на раковой клетке были бы белки-антигены, то проблем излечения пациента от рака вообще не существовало бы.

Никакая бактерия или вирус извне, никогда не создадут таких трудностей в диагностике их и излечении от них пациента, какие создает раковая клетка, так как она – «возбудитель» изнутри, т.е. из клетки своего организма.

Как уже было сказано выше, каждый белок, в том числе чужеродный, выполняет определнную функцию в клетке. Наша задача заблокировать его действие или в другом случае восполнить функцию поврежднного белка.

Как можно заблокировать фетальный белок в раковой клетке?

Любой белок взаимодействует с другими белками или менее сложными веществами посредством активных зон. Эти активные зоны – как специализированные разъмы, к которым возможно присоединение других веществ. Для того чтобы заблокировать белок, надо присоединить к его активной зоне некоторое вещество, т.е. молекулу, которая полностью погасит активность этой зоны, а также создаст прочную химическую связь с белком-мишенью, с тем, чтобы эта связь была неразрывна. Такое вещество, т.е. молекула, и называется лиганд.

Молекула-лиганд – это «слепок» с активных зон белка-мишени. Получив его – вот и «волшебная пуля» против раковой клетки. Однако это не совсем так:

для каждого белка поиск лиганда требует множество опытов, что на практике занимает ряд лет.

Поэтому учные и пришли к мысли – моделировать задачу химической реакции белка и лиганда на компьютере. Здесь компьютер в роли «электронной пробирки», в которой по заданным параметрам, проводится процесс отбора нужных лигандов. На компьютере получают некоторые лиганды, которые он «примеряет» к белку-мишени, вычисляя параметры реакции каждого лиганда с этим белком.

Сейчас учные приближаются к решению «обратной задачи» – не искать лиганд для известного белка, а определить белок-мишень по структуре избирательно связываемого им лиганда.

1. Инвентаризация белков в нормальной клетке каждого типа; белкимаркеры данного типа клетки.

2. Пространственная структура всех белков нормальных клеток каждого типа и их функции; белки-рецепторы и белки-лиганды клеток.

3. Потенциальная способность белков взаимодействовать с другими молекулами в организме, например, лекарственные средства.

4. Поиск алгоритма формирования пространственной структуры белков в нормальной клетке.

5. Поиск белков, причастных к возникновению разных болезней у человека, в том числе белки, превращающие нормальную клетку в раковую. Эти белки – маркеры больной и дефектной клеток и мишени для воздействия на них лекарств.

6. Составление белковых тестов с помощью белковых микрочипов для ранней диагностики любой болезни, в том числе рака, в самом е начале и даже до е начала. Это есть II уровень ранней диагностики любой болезни, так как белок – это продукт гена.

На основе генов-мишеней и белков-мишеней лекарства и их дозы будут индивидуальными, т.е. для конкретного пациента. На основе белка-мишени можно будет создавать вакцины против любой болезни – для лечения и профилактики.

По изменениям генома раковой клетки будет определн е протеом. В нм будут опознаны белки, специфичные для раковой стволовой клетки, и рассчитана их пространственная структура. С помощью скрининга найдены лекарства, избирательно связывающиеся с этими белками. Геномика найдт генымишени в раковой клетке.

Прицельно действующие лекарства против генов-мишеней и белков-мишеней при различных болезнях – это «волшебные пули». О них мечтал сто лет назад великий П.Эрлих.

Как пишет акад. А.И. Арчаков (2002), рано или поздно генная и белковая диагностика болезней и, прежде всего раковых клеток, «станут массовыми» и окажутся «привычным делом, как анализ крови». Лекарства будут попадать точно «в цель», т.е. в ген-маркер и белок-маркер в дефектных клетках, поэтому, не вызывая побочных эффектов.

Сравнивая генные и белковые картины нормальной клетки данного типа и раковой клетки того же типа, можно будет оценивать эффект лекарств. И, наконец, сама медицина повернтся лицом к пациенту, став персонифицированной.

2.2. Сигнальный пептид Г. Блобеля, управляющий транспортом белков и их локализацией внутри клетки,1 – значение для онкологии В клетке любого типа много отделов – органелл: ядро, митохондрии и др.

Они окружены мембранами, как и сама клетка. В каждой клетке около миллиарда белковых молекул, т.е. белков разного типа.

ДНК клетки – это «чертж» построения клетки, а белки – «строители»

клетки. Перед делением клетки в ней удваивается набор всех белков для дочерних клеток.

Для белков характерно разнообразие пространственной укладки цепи, что порождает адекватное разнообразие функций белков. Есть белки в роли строительных элементов, белки-переносчики различных сигналов и белки-рецепторы для этих переносчиков, белки-маркеры для данного типа клетки и белки «агрессоры», которые атакуют клетки, несущие чужеродные маркеры. В конечном Сигнальный пептид или Zip-код – это продукт части гена данного белка.

счете, белки создают все свойства клетки и обеспечивают все е функция как части ткани.

В клетке постоянно происходит распад ненужных уже белков и замена их новыми путм их синтеза. После синтеза белки должны быть транспортированы из клетки или в ее различные органеллы, проникая соответственно через их мембраны.

Эволюция каждого типа клетки закрепила за каждым белком после его синтеза то место, где ему положено находиться. Если это нарушается, то клетка не выполнит свою функцию или функции.

Как вновь синтезированный белок находит сво место в клетке?

Этот вопрос был первым, на который ответил Г. Блобель – американский биолог.

Ещ в 1970-х годах он обнаружил, что каждый вновь синтезированный белок содержит в себе информацию о месте его в структуре клетки. Затем в течение 20 лет он изучал – чем является эта информация? В результате он открыл сигнальный пептид в молекуле каждого синтезированного белка.

Оказалось, что при синтезе каждого белка в рибосоме в его структуру закладывается сигнальный пептид или аминокислотный код, назвав его Zipкодом. Ясно, что он транспортируется вместе с этим белком.

Сигнальный пептид – это короткая цепочка из нескольких аминокислотных остатков – от 10 до 30. Синтез белка в клетке начинается с сигнального пептида. Он прикреплен к белку на его конце – в виде «хвоста», либо внутри белка отдельными участками, а в глобулярном белке в виде единой части (Рис.

1).

Размер и структура сигнального пептида не для вида белка, а для определения его места в клетке; то есть для каждого белка он специфичен. Поэтому сигнальный пептид можно сравнить с «адресом» на почтовом отправлении или с «ярлычком» на багаже, где написано место, куда надо его доставить.

Рис. 1. Два варианта сигнального пептида: а – в виде «хвоста»; б – в виде отдельных участков (рис. и цит. по: В. А.Ткачук, Л. П. Белянова, 2000).

Так что сигнальный белок определяет судьбу каждого белка: направить ли его в митохондрию, и он проникнет в не, в ядро клетки – для запуска экспрессии генов, или построить из него ионный канал или рецептор и встроить его в клеточную мембрану, или секретировать его в другие участки организма.

Но белок-носитель сигнального пептида, может быть по количеству аминокислот в нм, – большим и малым. Количество аминокислот может достигать от 50 до нескольких тысяч.

Как белок проникает через мембрану органеллы, и клеточную мембрану?

Этот вопрос был вторым, на который своими исследованиями также ответил Г. Блобель.

Оказалось, что сигнальный пептид служат пропуском для белка через мембраны. Это вторая функция сигнального пептида1.

На мембране органелл и клеточной мембране имеются специфические молекулы-рецепторы, проверяющие сигнальный пептид данного белка. Его структура комплементарна рецептору той органеллы, для которой этот белок предназначен.

При контакте сигнального пептида с рецептором происходит молекулярное узнавание: если их контакт подобен «застежке-молнии». В таком случае В литературе часто называют сигнальный пептид – «адресная метка».

мембрана пропускает в органеллу этот белок, признавая его «своим». По этому же принципу в органеллу не может проникнуть чуждая, т.е. «не своя» молекула белка, если при контакте не образуется подобия «застежке-молнии». Вот в чем причина удивительной избирательности белков, которая характерна для нормальной, т.е. здоровой клетки.