САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Дрибинский Борис Аркадьевич

КОНДЕНСАЦИЯ ДНК В РАСТВОРЕ,

ИНДУЦИРУЕМАЯ ПОЛИКАТИОНАМИ И МНОГОЗАРЯДНЫМИ

ИОНАМИ

Специальность 02.00.06 – высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Санкт - Петербург 2012 г

Работа выполнена на кафедре молекулярной биофизики физического факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель: доктор физ. – мат. наук, проф.

Касьяненко Нина Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор физ.- мат. наук, заведующий лабораторией молекулярной физики полимеров Филиппов Александр Павлович (Институт высокомолекулярных соединений РАН) доктор физ. – мат. наук, ведущий научный сотрудник Лушников Сергей Германович (Физико-технический институт им. А.Ф. Иоффе РАН)

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный политехнический университет

Защита диссертации состоится « » 2012 года в часов на заседании совета Д. 212.232.33 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 198504, СанктПетербург, Петродворец, ул. Ульяновская д. 1, НИИФ СПбГУ, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПбГУ.

Автореферат разослан « » 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физ. – мат. наук, проф. А. В. Лезов Актуальность темы исследования. Изучение конденсации ДНК in vitro (под конденсацией ДНК понимают конформационный переход из состояния набухшего молекулярного клубка в растворе в компактную форму с образованием наноразмерных частиц под действием различных агентов) обусловлен как необходимостью получения информации о молекулярном механизме эффективной упаковки ДНК в биологических структурах (хроматине, головках бактериофагов и др.), так и возможным использованием ДНК в новых технологиях. При создании наноструктур на основе ДНК часто необходимо провести компактизацию макромолекулы в растворе. Например, одной из задач генной инженерии является поиск способов формирования эффективных и нетоксичных генных векторов (наночастиц ДНК) для направленной передачи генетической информации в клетку. Для их получения в растворе необходимо преодолеть электростатическое расталкивание одноименно заряженных звеньев, приводящее к полиэлектролитному набуханию ДНК. Для формирования генных векторов широко используют синтетические поликатионы, которые обладают рядом преимуществ по сравнению с другими конденсирующими агентами из-за возможности создания структур с заданными физико-химическими свойствами, низкой стоимости и простоты их получения, а также малой вероятности иммунного ответа со стороны организма. Таким образом, проведенное в работе исследование влияния природы и структурных особенностей конденсирующих агентов на процесс компактизации ДНК, размер и форму образуемых частиц является актуальным.

Научно-практическая значимость работы. Результат изучения влияния длины и зарядовых свойств поликатионов на процесс конденсации молекулы ДНК в растворе может служить основой для простого и эффективного способа отбора конденсирующих агентов для создания невирусных генных векторов и других наноструктур на основе ДНК с заданными свойствами. Водные растворы ДНК представляют собой удобные модельные системы для изучения комплексообразования макромолекулы с различными биологически активными соединениями, так как вода является естественной средой функционирования биополимеров in vivo. Полученные в работе данные способствуют пониманию роли электростатических взаимодействий в процессе образования надмолекулярных структур в клетке. Способность ДНК формировать упорядоченные структуры под действием заряженных агентов может найти применение в наноэлектронике, компьютерных технологиях, при создании новых материалов.

Целью диссертационной работы является выявление особенностей формирования комплексов ДНК в растворе с поликатионами и малыми конденсирующими агентами в зависимости от длины цепочки, плотности заряда и структуры последних, а также изучение индуцированного этим комплексообразованием процесса конденсации ДНК и определение размера формируемых наночастиц.

В работе решаются следующие задачи:

1. Рассмотрено влияние степени полимеризации поли-L-лизина (далее полилизина) на конформационные изменения молекулы ДНК, индуцированные его присутствием в растворе.

2. Проводится сравнение комплексообразования ДНК с олигопептидами и полиаминами для изучения роли локализации заряда поликатиона при конденсации ДНК.

3. Анализируется влияние ионной силы раствора на характер изучаемого взаимодействия ДНК с поликатионами.

предшествующие ее конденсации в растворе, при использовании поликатионов различной длины.

индуцированной различными соединениями.

6. Изучаются временные характеристики процесса образования компактных структур при взаимодействии ДНК с конденсирующими агентами.

';

Научная новизна работы. Впервые построены фазовые диаграммы для систем ДНК-полилизин, ДНК-олигопептиды и ДНК-полиамины в растворе.

Показано, что определяющим фактором для реализации конденсации ДНК, индуцированной присутствием в растворе молекул полилизина достаточной длины (для используемых в работе образцов от 17 мономерных звеньев) является достижение равенства концентраций ионогенных групп поликатионов (N) и ДНК (Р), N/P=1, а при использовании в качестве конденсирующих агентов олигопептидов и полиаминов - достижение их определенной концентрации в растворе ДНК вне зависимости от N/P (концентрации ДНК).

Впервые показано, что перед конденсацией ДНК, вызванной присутствием в растворе полиаминов, происходит изменение конформации макромолекулы с появлением определенной упорядоченности в ориентации частей цепочки.

Впервые проведено исследование временных характеристик процесса образования конденсированных структур при использовании полилизина различной степени полимеризации.

Личный вклад автора заключается в непосредственном проведении экспериментов, в обработке и анализе полученных данных, участии в обсуждении результатов и в подготовке публикаций по теме исследований.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях:

6th International Symposium «Molecular Order and Mobility in Polymer Systems»

(St.-Petersburg, 2008); XIV Симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Челябинск, 2008); XIII European conference on the Spectroscopy of Biological Molecules (Palermo, Italy, 2009); 5th Saint-Petersburg Young Scientists Conference (St.-Petersburg, 2009); XV Симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Петрозаводск, 2010); III Международной конференции «Современные проблемы молекулярной биофизики» (Санкт-Петербург, 2011).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах, содержит 78 рисунков, 1 таблица. Список цитируемой литературы состоит из 121 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении сформулированы цели и задачи работы, обоснована их актуальность, научная новизна и практическая значимость. Глава 1 содержит анализ современного состояния исследований, связанных с изучением компактизации ДНК в биологических системах и в растворе. В главе рассмотрены теоретические основы используемых методов исследования (низкоградиентной вискозиметрии, динамического двулучепреломления (ДЛП), атомной силовой микроскопии (АСМ), динамического светорассеяния (ДСР), УФ спектрофотометрии, кругового дихроизма (КД), флюоресценции и приведена характеристика материалов. Использовали препараты фирмы ”Sigma”: тимусную ДНК (молекулярная масса М=12,6·106 и 13,6·106 Да определялась вискозиметрически), поли-L-лизин гидрохлорид (со степенью полимеризации n = 2, 17, 20, 327), гидробромид (n = 270), Lys-Lys-Lys-LysLys·1TFA·4 acetat (пентализин), Lys-Lys-Lys· 3 acetat (трилизин), полиамины – гидрохлориды спермина и спермидина (рис. 1), NaCl (х.ч). Глава 3 посвящена изучению конденсации ДНК в растворе, индуцированной присутствием полилизина различной степени полимеризации и природных полиаминов.

Вискозиметрические исследования растворов ДНК с поликатионами позволили условно разделить используемые соединения на две группы. Первую составляют образцы полилизина со степенью полимеризации более 16, индуцирующие компактизацию ДНК, которую фиксировали по резкому падению приведенной вязкости пр растворов при достижении зарядового отношения N/P>1 независимо от ионной силы раствора (N, P – молярная концентрация ионогенных групп полилизина и фосфатов ДНК соответственно);

вторую - более короткие олигомеры, не вызывающие компактизации ДНК в М NaCl (рис. 2 а,б).

Рис. 2. Зависимость относительного изменения приведенной вязкости растворов ДНК (а, б, г) и ее оптической анизотропии (в) в 0,005 M и 1М NaCl (на врезках а, б, в) от N/P (а), концентрации олигомеров С (б, в) и ДНК (врезка для г) в присутствии полилизина 17 (1), (2), 270 (3), 327 (4); би-(5), три-(6) и пентализина (7), спермина (8), спермидина (9) На рис. (г) приведены данные для пентализина при разных С(ДНК), значения (С(ДНК) х 103,%) приведены у значков; там же на врезке указаны концентрации пентализина. (С х 105,М).

Падение вязкости раствора для всех систем сопровождается столь же резким падением оптической анизотропии ДНК (рис. 2в) и скачкообразным изменением (сдвигом положительной полосы) в спектре кругового дихроизма ДНК (рис. 3), при этом определенная методом динамического светорассеяния функция распределения по размерам частиц имеет унимодальный характер (рис. 4). При этом АСМ изображения после фиксации ДНК из раствора на поверхность слюды с использованием 10-4 М MgCl2 свидетельствуют о формировании компактных частиц сферической и тороидальной формы (рис.

5).

Рис. 3. Спектры КД ДНК в 0,005 M NaCl при разных концентрациях полилизина (значения N/P даны на рисунке (а)), и пентализина (- приведены значения С х 105, М) (б).

При N/P < 1 вязкость раствора ДНК с полилизином, оптическая анизотропия и спектр КД ДНК меняются мало, а АСМ изображения ДНК после ее фиксации из таких растворов практически не отличаются от полученных для свободной ДНК (рис. 5).

определяющим фактором для начала конденсакции ДНК, которая происходит только в растворах малой ионной силы, является не значение N/P, а концентрация соединения в растворе (рис. 2г). Бипептид не компактизует ДНК олигопептидов, перед конденсацией ДНК вызывают сдвиг максимума положительной полосы спектра КД в коротковолновую область и возрастание оптической анизотропии макромолекулы (рис. 2в), которая для В–формы имеет максимальное значение, а АСМ изображения демонстрируют образование структур с определенной ориентацией частей макромолекулы - своего рода «закручивание» цепочки (рис. 5). Это может свидетельствовать об изменении ориентации сегментов ДНК и быть причиной роста ее оптической анизотропии.

Рис. 4. Концентрационная зависимость коэффициента поступательной диффузии ДНК в 0,005 M NaCl (М=13,6 х 106 Да) (а) и угловая зависимость скорости релаксации для ДНК, конденсированной пентализином, С(ДНК)= 0,004%, C(пентализина) = 2,4 х 10-4 M (б). На врезках – функции распределения по размерам, полученные при углах 90 градусов.

использованием иных конденсирующих агентов - ионов La3+, Fe3+ и Co(NH3)63+. Следует подчеркнуть, что при использовании олигопептидов конденсацией не наблюдается, хотя АСМ изображения фиксируют появление структур с плотным ядром, окруженным несконденсированными частями макромолекулы, не характерных для систем ДНК-поликатион (для n>16). Повидимому, короткие пептидные цепочки выступают не только в качестве мостиков, связывающих удаленные участки ДНК (как это делают полиамины и точечные мультивалентные ионы), но и провоцируют появление «зародышей конденсации» при наличии некомпактизованной ДНК. Длинные полимерные цепочки полилизина имеют конформацию статистического клубка и окружены взамодействие с также заэкранированной противоионами молекулой ДНК до достижения определенных условий (близких к N/P=1). По-видимому, этим объясняется отсутствие видимых изменений в АСМ изображениях ДНК в области N/P 1, когда фиксируется образование конденсированных структур, интенсивность флюоресценции падает существенно. Известно, что в свободном состоянии EthBr (как и ДНК) флюоресцирует слабо, а при интеркаляции красителя в двойную спираль интенсивность флюоресценции меняется на порядок. Интересно отметить, что при добавлении EthBr к раствору ДНК с полилизином при N/P = 1 интенсивность флюоресценции падает вдвое по сравнению с системой при N/P=0. Возможно, это условие соответствует сосуществованию в растворе доступной для EthBr и конденсированной ДНК. При N/P =1,25 свободной ДНК в растворе уже нет.

Подчеркнем, что при добавлении красителя после формирования конденсированных частиц при N/P >1 интенсивность флюоресценции не меняется со временем, что указывает на устойчивость таких структур.

После конденсации ДНК в комплексе с EthBr краситель либо выходит в раствор, либо не может флюоресцировать в таких условиях - наблюдается скачкообразное падение флюоресценции при N/P=1, а при N/P > 1,25 она падает до значений, совпадающих с флюоресценцией свободного EthBr. И в этом случае при N/P < 1 интенсивность флюоресценции практически не меняется, что подтверждает данные других методов об отсутствии заметного комплексообразования ДНК с полилизином в этих условиях. Подобные олигопептидами.

Интегральная интенсивность светорассеяния (рис. 7в), измеренная на спектрофлюориметре под углом 90 градусов при N/P < 1, очень низка (что указывает на отсутствие изменений в состоянии ДНК при добавлении поликатиона), при N/P > 1 она резко возрастает из-за конденсации, а затем снижается из-за агрегации и частичного выпадения ДНК в осадок. Ее временные зависимости для систем с 116), не наблюдается образования каких-либо промежуточных структур, тогда как при использовании олигопептидов методом атомной силовой микроскопии зафиксировано формирование плотных структур, окруженных несконденсированными частями макромолекул.

6. Конденсация ДНК, индуцированная поликатионами при N/P > 1, протекает быстро (менее 20 сек), размер конденсированных частиц не меняется с течением времени, тогда как при использовании олигопептидов после быстрой конденсации ДНК с образованием частиц такого же размера происходит их дальнейшее укрупнение, которое заканчивается через 250- секунд.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Kasyanenko N., Afanasieva D., Dribinsky B., Mukhin D., Nazarova O., Panarin E., DNA interaction with synthetic polymers in solution. Structural Chemistry, 2007, vol. 18, № 4, Р. 519-525.

2. Касьяненко Н. А., Дрибинский Б. А., Компактизация ДНК в водных растворах индуцируема полилизином и спермидином. Журнал Структурной Химии, 2007, т. 48, № 4, с. 778–782.

3. Грищенко А. Е., Кононов А. И., Наумова Л. В., Дрибинский Б. А., Касьяненко Н. А., Оптические свойства и ориентационный порядок молекул Высокомолекулярные соединения, 2010, Т. 52, № 1, с. 47 – 52.

4. Дрибинский Б. А., Касьяненко Н. А., Влияние длины олигопептида на процесс конденсации ДНК в растворе. Журнал Структурной химии, 2011, т. 52, № 6, 1239 – 1245.

5. Mukhin D., Dribinsky B., Nazarova O., Zolotova Yu., Panarin E., Kasyanenko N.;

DNA complexes with polycations as nonviral gene vectors; Book of abstracts of 6th International symposium Molecular Order and Mobility in Polymer Systems, St.Peterburg, 2008, p. 168.

6. Мухин Д. А., Дрибинский Б. А., Слита А. В., Назарова О. В., Панарин Е. Ф., Касьяненко Н. А.; Генные векторы на основе синтетических поликатионов: их свойства и условия формирования; XIV Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, Челябинск, 2008, c. 65.

7. Dovbeshko G., Fesenko O., Gnatiuk O., Dribinsky B., Kasyanenko N.; SEIRA markers of DNA condensations by La3+; XIII European conference on the spectroscopy of biological molecules, Palermo, Italy, 2009, p. 43.

8. Dribinsky B., Kasyanenko N.; Influence of degree of polymerisation poly-Llysine on formation on DNA-polycation complexes; 5th Saint-Petersburg young scientists conference, Saint-Petersburg, 2009, p. 39.

9. Дрибинский Б. А., Касьяненко Н. А.; Влияние длины цепочки поликатиона на процесс конденсации ДНК в водно-солевом растворе; XV Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, Петрозаводск, 2010, с. 165.

10. Дрибинский Б. А., Касьяненко Н. А.; Конформационные изменения молекулы ДНК в растворе, вызванные присутствием поликатионов и многозарядных ионов. III Международная конференция «Современные Подписано в печать 08.11.2012г.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.

Отпечатано в ООО «Издательство “ЛЕМА”»

199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-