На правах рукописи

ФАДЕЕВ РОМАН СЕРГЕЕВИЧ

РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

К TRAIL-ИНДУЦИРОВАННОМУ АПОПТОЗУ

В КОНФЛЮЕНТНЫХ КУЛЬТУРАХ

Специальность

03.01.02 – Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 2012 1

Работа выполнена в Лаборатории тканевой инженерии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино.

доктор физико-математических наук, Научные руководители:

профессор Акатов Владимир Семенович кандидат биологических наук Чеканов Алексей Владимирович доктор биологических наук

Официальные оппоненты: Корыстов Юрий Николаевич (зав. лаб. окислительного стресса ИТЭБ РАН) доктор биологических наук, профессор Новоселов Владимир Иванович (ИБК РАН) Московский научно-исследовательский

Ведущая организация:

онкологический институт им. П.А.Герцена Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Москва)

Защита диссертации состоится «»_2012 г.

в _ на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, созданном на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу:

142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан «_» _ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физ.-мат. наук Ланина Н. Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Онкологические заболевания занимают второе место в мире по смертности после сердечно–сосудистых патологий.

Недостаточная эффективность лечения онкологических заболеваний обусловлена в первую очередь отсутствием избирательного действия существующих противоопухолевых препаратов, недостаточно эффективным проникновением противоопухолевых субстанций в опухолевую ткань и возникновением, при определенных условиях, резистентности опухолевых клеток к повреждающим воздействиям.

Возникновение резистентности опухолевых клеток к действию химиотерапевтических препаратов связывают, в основном, с внутриклеточными механизмами активации и/или повышенной экспрессии белков-транспортеров суперсемейства ABC (P-гликопротеина (Pgp), MRP1MRP-5, BCRP и LPR), осуществляющих выведение ксенобиотиков различного происхождения из клетки (Gottesman et al., 2002). С другой стороны, известно повышение резистентности опухолевых клеток к различным повреждающим воздействиям в двумерных (конфлюентные монослойные культуры распластанных клеток) и трехмерных (сфероиды) многоклеточных образованиях в условиях in vitro, отражающее резистентность клеток в опухолевой паренхиме к действию химиотерапевтических препаратов (Chitcholtan et al., 2012), окислительного стресса (Акатов и др., 2000), гипертермии (Khoei et al., 2004), радиации (Zou et al., 2010). Это говорит об общности механизмов повышения резистентности опухолевых клеток к различным повреждающим воздействиям в плотных многоклеточных образованиях. Механизм такой резистентности до сих пор остается не выясненным.

В настоящее время одним из наиболее перспективных подходов противоопухолевой терапии является потенциальное применение рекомбинантных белков, созданных на основе цитокина TRAIL (TNF alpha Related Apoptosis Inducing Ligand). Цитокин TRAIL является интегральным мембранным белком, относящимся к семейству фактора некроза опухолей, который обнаруживается у NK-клеток, а также части дендритных клеток (Ashkenazi et al., 2008). Уникальной особенностью цитокина TRAIL является его способность избирательно индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, связываясь со специфическими рецепторами цитоплазматической мембраны, и при этом не повреждать нормальные клетки организма (Gonzalvez et al., 2010). В то же время известно, что не все опухолевые клетки чувствительны к TRAIL-индуцированному апоптозу. В литературе указывается, что около 50% исследованных линий опухолевых клеток обладают конститутивной резистентностью к действию цитокина TRAIL, подобно нормальным клеткам. Это связывают как с изменением структуры рецепторов DR4, DR5 или с повышенной экспрессией рецепторов ловушек (DcR1 и DcR2), так и с конститутивной активностью внутриклеточных сигнальных путей ответственных за выживание клеток (Johnstone et al., 2008). Однако, до сих пор, остается неизвестным, способны ли чувствительные к действию TRAIL опухолевые клетки приобретать резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу в зависимости от условий околоклеточного микроокружения, в частности, в плотных многоклеточных структурах, таких как конфлюентные культуры. Ответ на этот вопрос имеет большое теоретической значение для биологии клетки, а также принципиально важен для создания на основе рекомбинантных белков TRAIL эффективных препаратов для противоопухолевой терапии.

Целью работы является изучение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучение резистентности опухолевых клеток к TRAILиндуцированному апоптозу в зависимости от плотности клеточных культур;

2. Исследование резистентности опухолевых клеток к TRAILиндуцированному апоптозу в зависимости от пролиферативной активности клеток;

3. Изучение резистентности опухолевых клеток к TRAILиндуцированному апоптозу в зависимости от адгезии клеток и параметров околоклеточной среды;

4. Выяснение механизма резистентности опухолевых клеток к TRAILиндуцированному апоптозу и оценка возможности ее подавления.

Новизна работы. В работе впервые показано, что в условиях конфлюентной культуры опухолевые клетки способны приобретать резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу. Формирование приобретенной TRAIL-резистентности показано не только для конфлюентных культур зависимых от прикрепления опухолевых клеток эпителиального и мезенхимального происхождения, но и для независимых от прикрепления (суспензионных) клеток лейкоцитарного происхождения в многоклеточных агрегатах. Обнаружено, что повышение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах осуществляется на фоне снижения пролиферативной активности клеток, однако значительная часть резистентных клеток может оставаться в клеточном цикле.

Установлено, что механизмы конфлюентной резистентности опухолевых клеток различного происхождения могут отличаться.

Конфлюентная TRAIL–резистентность опухолевых клеток может осуществляться с привлечением тирозин-киназных рецепторов некоторых ростовых факторов (IGF и EGF, но не PDGF) и реализоваться через внутриклеточные сигнальные пути, связанные с протеинкиназами PI3K, Akt (PKB).

Установлена возможность подавления конфлюентной TRAIL– резистентности путем нетоксичного воздействия на внутриклеточные молекулярные мишени.

Практическая значимость. Показана возможность подавления резистентности опухолевых клеток к TRAIL- индуцированному апоптозу в плотных многоклеточных структурах при использовании в нетоксичных концентрациях таргетных противоопухолевых препаратов, действующих на мишени внутриклеточных сигнальных путей. Это представляет интерес для разработки на основе рекомбинантных белков TRAIL и таргетных ингибиторов приобретенной TRAIL-резистентности новых противоопухолевых препаратов, вызывающих гибель опухолевых клеток, подавляющих их резистентность и при этом нетоксичных для клеток здоровых тканей и организма в целом.

Апробация. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2011), IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов, «Симбиоз» (Воронеж, 2011), Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2011, 2012), Конференции Экспериментальная и теоретическая биофизика ’10, 11, (Пущино, 2010, 2011, 2012), Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронауки для медицины и психологии» (Судак, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из ведения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на _ страницах, содержит _ рисунков и _ таблиц. Список цитируемой литературы включает _ источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение рекомбинантного белка izTRAIL Последовательность синтетического изолейцинового зиппера (IEKKIEA)4 (RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGE) (Suzuki et al., 1998) была синтезирована de novo. Синтез гена izTRAIL проводили, как описано в (Ganten et al., 2006). Полученный ген был клонирован в плазмидный вектор pET101 (Novagen, USA). Штамм E. coli BL21(DE3) трансформировали полученным экспрессирующим вектором pET101/izTRAIL. Экспрессия белка проводилась в среде TB в течение часов при 18°C. Экстракцию белка из клеточной биомассы, ренатурацию белка, хроматографическую очистку белка выполняли так, как описано в работе (Фадеев и др., 2012). Чистоту полученного белка определяли с использованием SDS-PAGE и окрашиванием Coomassie blue.

Культура клеток В работе использовали клетки эпидермоидной карциномы гортани человека (линия НЕр-2), эпидермоидной карциномы кожи человека (линия A431), немелкоклеточного рака легкого человека (линия А549), карциномы яичника человека (линия OVCAR-3), карциномы шейки матки человека (линия HeLa), карциномы молочной железы человека (линия MCF-7), миелобластного лейкоза человека (линия K562), моноцитарного лейкоза человека (линия THP-1). Клетки были получены из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, СанктПетербург). Нормальные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека (МККМ) предоставлены фирмой «Биолот» (Санкт-Петербург).

Культуру нормальных диплоидных фибробластов человека (HF) получали из участков кожи внутренней поверхности предплечья методом эксплантов (Фадеев и др., 2012). Время удвоения числа клеток в используемых растущих культурах составлял около 20 ч. Рост числа клеток в культурах начинался через 18-20 часов после посева.

Оценка цитотоксичности Для анализа цитотоксичности клетки из растущих культур высевали в 96-луночные культуральные планшеты. Цитотоксичность оценивали по отношению количества живых клеток в опытных и контрольных (необработанных токсическими агентами) культурах через 24 ч после добавления агентов. Для определения количества живых клеток культуры окрашивали кристаллическим фиолетовым с последующим фотометрированием (Nomizu et al., 1995). Жизнеспособность клеток оценивали также по окраске трипановым синим.

апоптотических клеток Наличие аберрантного распределения хроматина, указывающего на апоптотический тип гибели клеток, оценивали методом флуоресцентной микроскопии, одновременно окрашивая клетки флуоресцентными зондами Hoechst 33342 и этидиум бромидом (Акатов и др., 2000).

Анализ митотической активности в клеточных культурах Число митотических клеток в культурах определяли с помощью флуоресцентной микроскопии, используя прижизненное окрашивание флуоресцентным ядерными красителем Hoechst 33342 (Акатов и др., 2000).

Митотические клетки выявляли по распределению хроматина, характерному для метафазы, анафазы, телофазы и цитокинеза.

Ki67p-GFP репортерная система Для выявления пролиферирующих клеток, находящихся в клеточном цикле (вне фазы покоя), использовали Ki67p-GFP репортерную систему, любезно предоставленную доктором А. Замбон (Департамент фармакологии, Университет Калифорнии, США) (Zambon, 2010).

Трансфекция клеток Для трансфекции клеток линии А431 плазмидным вектором Ki67pGFP, был использован Lipofectamin 2000, следуя рекомендациям производителя. Селекцию клеток проводили на среде содержащей 10 мкг/мл бластицидина. Отбор GFP-позитивных клонов осуществляли, используя флуоресцентный микроскопа Leica DM 6000 (Германия).

Проточная цитофлуориметрия Для анализа распределения клеток по содержанию ДНК использовали проточный цитометр (PARTEC III, Германия). Распределение клеток A431/Ki67p-GFP по интенсивности флуоресценции GFP определяли прижизненно после открепления и суспендирования клеток, используя канал FL 1 (510-530нм) проточного цитометра PARTEC III.

Анализ содержания кислорода в среде культивирования клеток Концентрацию кислорода в среде культивирования измеряли, используя электрод Кларка закрытого типа.

Статистический анализ Результаты исследований представлены в виде среднего ± m, где m – стандартная ошибка среднего. Достоверность отличия выборок экспериментальных данных, а также средних значений оценивали с помощью критерия Уилкоксона для выборок с попарно-связанными вариантами, либо критерия Уитни-Манна для независимых выборок. Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторах (n 3).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Избирательность апоптоз-индуцирующего действия рекомбинантного белка izTRAIL на опухолевые клетки.

Исследовали токсическое действие рекомбинантного белка izTRAIL на растущие опухолевые и нормальные клетки человека in vitro.

Добавление izTRAIL в концентрации до 20 мкг/мл в культуру мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МККМ) и диплоидных фибробластов человека через 24 часа после посева плотностью 5х клеток/см2 и 8х103 клеток/см2 соответственно не вызывало гибели клеток (рис.1).

Количество клеток в опытных культурах составляло 98±5% в сравнении с контролем. Добавление белка izTRAIL в концентрации до 1,5 мкг/мл в культуры опухолевых клеток линий НЕр-2, А549, HELA, MCFи OVCAR-3 через 24 часа после посева 1,5х104 клеток/см2 уменьшало количество живых клеток относительно контроля до 10±2%, 11±3%, 13±4%, 5±3%, 0% соответственно (рис.1). Через 2 ч после добавления izTRAIL в большинстве клеток (70-80%) наблюдалось аберрантное распределение хроматина, указывающее на апоптотический тип гибели (Рис.2). Эти результаты свидетельствуют об избирательном апоптоз-индуцирующем действии использованного в работе рекомбинантного белка izTRAIL на опухолевые клетки.

Необходимо отметить, что активность разработанного нами рекомбинантного белка izTRAIL находится на уровне лучших коммерчески доступных зарубежных аналогов, таких как izTRAIL и superkiller TRAIL фирмы Amgen, и значительно (более чем в 200 раз) превосходит эти аналоги по растворимости. Сочетание высокой активности и растворимости принципиально важно для потенциального применения белков TRAIL в противоопухолевой терапии.

Следует также подчеркнуть, что используемый в работе рекомбинантный белок izTRAIL значительно (в 200 и более раз для разных линий клеток) активнее рекомбинантного белка rhApo2L/TRAIL, созданного на основе внеклеточного домена цитокина TRAIL (аа 114-281) без дополнительной стабилизации его тримерной формы посредством применения зипперов и/или других модификаций. Согласно нашим данным, izTRAIL вызывает гибель 50% клеток НЕр-2 при 8 нг/мл, а белок rhApo2L/TRAIL, вызывает гибель 60% клеток при 1,6 мкг/мл.

Рис. 2. Микрофотографии клеток HEp2 через 24 часа после посева плотностью 3х104. клеток/см2 до добавления рекомбинантного белка izTRAIL (а) и через 4 ч после добавления 100 нг/мл izTRAIL (б). Окраска клеток ядерными красителями Hoechst 33342 (проникает в живые клетки) и этидиум бромидом (не проникает в живые клетки). Аберрантное распределение хроматина (показано стрелками) указывает на апоптоз. X Таким образом, используемый в представленной работе рекомбинантный белок izTRAIL индуцирует апоптотическую гибель опухолевых клеток при концентрациях 1-10 нг/мл и не вызывает гибель нормальных клеток человека даже при концентрациях 20 мкг/мл.

2. Повышение резистентности опухолевых клеток к TRAILиндуцированному апоптозу в конфлюентных культурах.

В результате выполненной работы было установлено значительное повышение резистентности опухолевых клеток к действию рекомбинантного белка izTRAIL по мере увеличения плотности клеточной культуры. На рис. 3 представлены результаты изучения цитотоксического действия izTRAIL при его добавлении к клеткам НЕр-2 сразу после посева плотностью 3х104 клеток/см2, а также через 24 и 72 ч после посева. При добавлении белка izTRAIL сразу после посева клеток (0 ч) величина IC (концентрация белка при которой количество клеток в опыте уменьшалось до 50 процентов в сравнении с контролем) составляло 4±1 нг/ мл izTRAIL, а при концентрации белка 50-100 нг/мл и более наблюдалась гибель всех клеток. При добавлении izTRAIL через 24 часа после посева обнаружено, что часть клеток культуры была нечувствительна к апоптозиндуцирующему действию белка. Это выражается в том, что 12% клеток оставались живыми независимо от повышения концентрации izTRAIL от нг/мл до 1,5 мкг/мл (плато на рис.3а, 24 ч). При этом величина IC50 белка izTRAIL для клеток, сохранивших чувствительность к izTRAIL (определяется по уменьшению количества живых клеток от 100% до плато), составляет 9±1 нг/мл. При добавлении белка izTRAIL через 72 ч после посева, когда культура имела вид монослоя прилегающих друг к другу клеток («слившийся монослой», конфлюент), обнаружено, что процент клеток нечувствительных к izTRAIL (плато при 200 нг/мл белка и больше, рис.3а) составляет 50±4%, а величина IC50 белка izTRAIL для субпопуляции чувствительных к нему клеток увеличилась до 30±5 нг/мл.

Рис. 3. Увеличение резистентности опухолевых клеток НЕр-2 по ходу роста культуры, посеянной плотностью 3х104 клеток/см2 (а) и при увеличении плотности посева этих клеток (белок добавляли через 24 часа после посева) (б).

0 ч – сразу после посева суспензии клеток, 24 ч – культура низкой плотности клеток, 72 ч – конфлюентный монослой (культура высокой плотности клеток).

Отличия величины IC50 и доли клеток чувствительных к апоптозу, между культурами клеток НЕр-2 сразу после посева (0 ч), через 24 ч и 72 ч