На правах рукописи

АРХИПОВА ЭРЖЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА POTENTILLA ALBA L. И

КОМПЛЕКСНОГО СРЕДСТВА «ТИРЕОТОН» НА ТЕЧЕНИЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ГИПОТИРЕОЗА

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Улан-Удэ – 2012

Работа выполнена в ФГБУН Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, Николаев Сергей Матвеевич профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Цыренжапова Октябрина Дашипрофессор кафедры «Социальные Дондобовна технологии» ФГБОУ ВПО Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления МО и науки РФ кандидат медицинских наук, зав. Дамдинова Галина Хандажаповкафедрой терапии №1 ФГБОУ ВПО на Бурятский государственный университет МО и науки РФ

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия»

Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится «22» мая 2012 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН.

Автореферат разослан «21» апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук В.Б. Хобракова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Заболевания щитовидной железы связывают с геохимическими, социальными, экологическими и другими факторами (Хмельницкий О.К., 2002; Фадеев В.В., 2005; Дедов И.И., 2005;

Валдина Е.А., 2006; Трошина Е.А., 2010; Fatourechi V., 2003). В наибольшей степени на частоту тиреоидной патологии влияют уровни потребления йода населением (Велданова М.В. и соавт., 2001, 2004; Трошина Е.А., 2010).

Дополнительным средством профилактики является йодирование пищевой поваренной соли, а также назначение таблетированных препаратов йода, особенно наиболее уязвимым слоям населения (дети, беременные и кормящие женщины). Районы, для которых характерна недостаточность йода, называют эндемичными. В России это более 30% территории, где поражения щитовидной железы встречаются более чем у 80% населения.

Известно, что недостаточное содержание в организме тиреоидных гормонов приводит к расстройству структурно-функциональных взаимосвязей нервной, сердечно-сосудистой, иммунной и других систем (Дедов И.И., 2007; Трошина Е.А., 2010; Фадеев В.В., 2010). Гормоны щитовидной железы крайне необходимы для роста тканей, в процессах закладки и функционировании мозга, формировании интеллекта, регуляции и поддержании обмена веществ (Семенова Н.Б., 2005; Дедов И.И., 2006;

Будневский А.В., 2009). Фармакологическая коррекция гипотиреоидного состояния организма основана преимущественно на восполнении дефицита йода и тиреоидных гормонов. Несмотря на имеющийся арсенал лекарственных средств с тиреотропным действием, необходимость в эффективных и безопасных средствах сохраняется. Используемые препараты не всегда отличаются достаточной клинической эффективностью и при длительном применении могут вызывать побочные эффекты.

В связи с этим оправдан значительный интерес к поиску новых средств, способных предупреждать и корригировать гипофункцию щитовидной железы. Задачи в этом плане являются актуальными для фармакологии и клинической практики.

Лекарственные растения являются наиболее перспективным источником биологически активных веществ тиреотропного действия.

Одним из растений, применяемых в народной медицине для лечения и профилактики заболеваний щитовидной железы, является лапчатка белая (Potentilla alba L., семейство розоцветные - Rosaceae). Установлено, что извлечения из Potentilla alba L. могут применяться при коррекции гипофункции и гиперфункции щитовидной железы (Шимко О.М., 2008;

Башилов А.В., 2009, 2010). Наряду с этим, учитывая зависимость ментальных процессов и клинических проявлений гипотиреоза от уровня тиреоидных гормонов в крови, развития вторичного иммунодефицита, целесообразными представляются вопросы коррекции клинических иммуномодулирующим, ноотропным, антигипоксическим действием. В указанном аспекте весьма перспективным является изучение влияния экстракта лапчатки белой сухого, а также комплексного растительного средства «Тиреотон» (условное название), состоящего из экстракта лапчатки белой сухого, экстракта шлемника байкальского сухого и экстракта родиолы розовой сухого в соотношении 50%, 25%, 25% соответственно, на течение экспериментального гипотиреоза.

Цель исследования: определить основные фармакологические свойства и фармакотерапевтическую эффективность экстракта лапчатки белой сухого и созданного на его основе комплексного средства «Тиреотон»

при экспериментальном гипотиреозе.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- определить основные фармакологические свойства экстракта лапчатки белой сухого и «Тиреотона»;

- оценить фармакотерапевтическую эффективность экстракта лапчатки белой сухого и «Тиреотона» при экспериментальном гипотиреозе;

- выявить основные механизмы фармакотерапевтического влияния экстракта лапчатки белой сухого и «Тиреотона» при экспериментальном гипотиреозе.

Научная новизна. Установлено, что экстракт лапчатки белой сухой и в большей степени «Тиреотон» в экспериментально-терапевтических дозах при введении их лабораторным животным per os способны корригировать дисфункцию щитовидной железы, восстанавливая уровень тиреоидных гормонов и структуру железы, стимулируя когнитивные функции животных при гипотиреозе. Показано выраженное фармакотерапевтическое влияние указанных средств на течение экспериментального гипотиреоза, выражающееся в нормализации уровня гормонов, снижении воспалительной реакции, подавлении свободнорадикального окисления биомакромолекул. Выявлена способность экстракта лапчатки белой сухого и «Тиреотона» ослаблять супрессивное действие азатиоприна на показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа и восстанавливать биохимические показатели крови при интоксикации тетрахлорметаном. Основные механизмы фармакотерапевтического влияния указанных средств связаны со способностью их активировать продукцию тиреоидных гормонов на фоне стабилизации мембран клеток, благодаря ингибированию процессов перекисного окисления липидов и повышению антиокислительной защиты организма, а также наличию других свойств.

Практическая значимость работы. Результаты исследований включены в отчет по доклиническим испытаниям экстракта лапчатки белой сухого. Полученные данные используются в преподавании курсов фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии, терапии, эндокринологии на медицинском факультете Бурятского государственного университета (акт внедрения № 7 от 03.02.2012).

Положения, выносимые на защиту:

1. Экстракт лапчатки белой сухой и «Тиреотон» обладают антигипоксическим, противоспалительным, антиоксидантным, мембраностабилизирующим действием.

2. Экстракт лапчатки белой сухой и «Тиреотон» повышают экспериментальном гипотиреозе, увеличивая уровень тиреоидных гормонов и ограничивая повреждение структуры щитовидной железы.

3. Экстракт лапчатки белой сухой и в большей мере «Тиреотон» стимулируют когнитивные функции у животных при экспериментальном гипотиреозе, обладают иммуномодулирующим действием, восстанавливая показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунной системы при азатиоприновой иммунодепрессии.

Апробация материалов диссертации: основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

- Научно-практической конференции с международным участием «Развитие традиционной медицины в России» (Улан-Удэ, 2010г.);

- The 5th International Symposium: “On present situation and future development of Mongolian traditional medicine” (Ulaanbaatar, 2011);

- XIV Всероссийском форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (СанктПетербург, 2011);

- II Международной научной конференции «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2011);

- III Международной научно-практической конференции «Экология, здоровье, спорт» (Чита, 2011);

- Монголын Мэс засал «Эмч нарын нийгэмлэг» (Улан-Батор, 2011);

- XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство»

(Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 7 - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы.

Материал изложен на 137 страницах компьютерного текста; включает таблицу, 11 рисунков в виде диаграмм и микрофотографий. Список литературы состоит из 218 источников, из которых 68 - на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили экстракт лапчатки белой сухой и разработанное на его основе трехкомпонентное средство «Тиреотон»

(условное название). Экстракт лапчатки белой сухой (Potentilla alba L.) (ЭЛБС) получен во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР, г. Москва) путем трехкратной экстракции 40% спиртом этиловым, последующей фильтрацией и сушкой в вакуумно-сушильном шкафу при температуре 50С. Представляет собой порошок темно-коричневого цвета со специфическим запахом. Экстракт содержит комплекс фенольных соединений (антоцианы, кверцетин, рутин, n-кумаровая и эллаговая кислоты), дубильные вещества, макро и микроэлементы (Семенова Е.Ф., 2001; Мешков А.И., 2009). Трехкомпонентное средство «Тиреотон» состоит из экстракта лапчатки белой сухого (50%), экстракта родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) (25%) и экстракта шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi) (25%), полученных аналогичным способом в лаборатории химико-фармацевтических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (г. Улан-Удэ). «Тиреотон» содержит дополнительно фенольные гликозиды (салидрозид, родиолозид), флавоноиды (байкалин, скутеллярин) органические кислоты, углеводы (глюкоза, галактоза, сахароза).

Эксперименты проведены на 480 белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180-200 гр. и 120 мышах линии СВА и F1 (CBAC57/B16) массой 20-22гр. Все животные содержались в стандартных условиях вивария Института общей и экспериментальной биологии СО РАН на сбалансированном пищевом рационе. Эксперименты проводились в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Эвтаназию животных осуществляли методом мгновенной декапитации под легким эфирным наркозом. Протокол исследования согласован с этическим комитетом Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (протокол №3 от 03.02.2009).

Определение острой токсичности ЭЛБС и «Тиреотона» проводили по методу Першина (Руководство…, 2005), класс токсичности определяли по действующей классификации.

Для определения противовоспалительной активности ЭЛБС и «Тиреотона» изучали их влияние на фазу экссудации на моделях острого асептического воспаления задней конечности крысы, которые воспроизводили путем субплантарного введения 3% раствора формалина в объеме 0,1 мл (Стрельников В.Ю., 1960) и 0,1 мл 6% раствора декстрана (Лещинский А.Ф., 1976).

Определение антигипоксической активности проводили на моделях гемической (Костюченков Ю.Ф., 1982), гипобарической, тканевой (Архипова О.Г., 1965) гипоксий.

Мембраностабилизирующую активность определяли по степени перекисного и осмотического гемолиза эритроцитов донорской крови (Ковалев И.Е., 1986).

Антирадикальную активность исследуемых средств in vitro определяли в отношении супероксидного радикала (Chen A.-S., 2003), радикала NO (Govindarajan R., 2003), а также по динамике накопления ТБК-активных продуктов в суспензии липосом яичного желтка (Клебанов Г.И., 1988).

Для определения тиреотропных свойств ЭЛБС и «Тиреотона»

воспроизводили экспериментальный гипотиреоз (Чугунова Л.Г., 2001) путем введения мерказолила белым крысам линии Wistar перорально в дозе 10 мг/кг в течение 28 дней. После окончания введения мерказолила крысам перорально вводили водный раствор экстракта лапчатки белой сухого и «Тиреотона». В качестве препарата сравнения использовали ламинарию («Эвалар», Россия) в дозе 3 мг/кг по аналогичной схеме.

Для определения влияния исследуемых средств на функцию щитовидной железы в крови крыс определяли уровни трийодтиронина (Т3), тироксина (Т4), тиреотропного гормона (ТТГ) методом иммуноферментного анализа. Вычисляли индекс дейодирования (Т4/Т3).

Для патоморфологических исследований парафиновые срезы щитовидной железы крыс окрашивали гематоксилином и эозином (Волкова О.В., 1971). Морфометрические исследования щитовидной железы проводили с помощью алгоритмов по Хмельницкому О.К. (1999).

Определяли среднюю высоту фолликулярного эпителия (мкм), средний диаметр фолликула (мкм), фолликулярно-коллоидный индекс (ФКИ), показатель Брауна (индекс накопления коллоида), митотический индекс (МИ), а также оценивали состояние соединительной ткани, сосудистого русла.

Для определения антиоксидантных свойств исследуемых средств оценивали их влияние на интенсивность процессов свободнорадикального окисления биомакромолекул и состояние эндогенной антиоксидантной системы защиты организма при экспериментальном гипотиреозе. Так, содержание малонового диальдегида (МДА) определяли в сыворотке крови (Темирбулатов Р.А., 1981), активность супероксиддисмутазы (СОД) - в эритроцитах (Чевари С., 1985), активность каталазы (Королюк М.А., 1988) и восстановленного глутатиона (ВГ) (Anderson R.L., 1977) - в сыворотке крови животных.

Для определения влияния ЭЛБС и «Тиреотона» на ориентировочноповеденческую реакцию, тревожность и память лабораторных животных были использованы методы: «открытое поле» (Буреш Я., 1991), приподнятый крестообразный лабиринт (Калуев А.В., 1999; Alicia A Walf, 2007) и условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ).

Иммунодепрессивное состояние у мышей линии F1 и СВА вызывали цитостатиком азатиоприном в дозе 50 мг/кг перорально в течение 5 дней (Лазарева Д.Н., 2005). ЭЛБС вводили в дозе 50 мг/кг, «Тиреотон» - в дозе мг/кг перорально с 6-го дня в течение 14 дней, 1 раз в день, утром.

Состояние гуморального иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза в геле (Cunningham A.J., 1965). Для оценки клеточноопосредованных иммунных реакций определяли гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) согласно стандартной методике локальной ГЗТ (Петров Р.В., 1987). Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов (ПМ) мышей определяли с помощью частиц коллоидной туши, введенной животным внутрибрюшинно в виде 0,05 % суспензии в объеме 2 мл (Руководство …., 2005).

Острый токсический гепатит у белых крыс линии Wistar воспроизводили путем подкожного введения 50% (1:1) масляного раствора четыреххлористого углерода (ССl4) в объеме 0,4 мл/100 г массы тела 1 раз в день в течение 4х дней (Венгеровский А.И., 2005). На 7-й, 14-й, 21-й дни от начала эксперимента в крови животных определяли уровень Т3 методом иммуноферментного анализа, активность мембраносвязанных ферментов печени (АЛТ, АСТ), уровни билирубина, -липопротеидов, общего белка биохимическим методом (Руководство …, 2005).

Статистическую обработку проводили с помощью программы Statistica 6.0 for Windows (Statsoft, США). Для оценки значимости различий между выборками, с распределением, приближающимся к нормальному, использовался парный t-критерий Стьюдента (Ллойд Э., 1989). Данные считали статистически значимыми при р0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение острой токсичности экстракта лапчатки белой и «Тиреотона»

проводили на белых крысах линии Wistаr при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введении. Установлено, что DL50 ЭЛБС при внутрибрюшинном введении составляет 440 мг/кг, DL50 «Тиреотона» - мг/кг (Першин Г.Н., 1959). При введении указанных средств per os в максимально возможных дозах 4500 мг/кг гибели животных не наблюдается в течение 14 суток. В первые часы отмечались явления гиподинамии, учащенное мочеиспускание, отказ от корма, которые к концу дня проходили. Таким образом, полученные данные позволяют отнести ЭЛБС и «Тиреотон» к группе малотоксичных веществ по действующей классификации Сидорова К.К. (1976).

ЭЛБС и «Тиреотон» в дозах 50 мг/кг способствуют снижению систолического артериального давления и незначительной стимуляции биоэлектрической активности миокарда интактных крыс. Наряду с этим при введении исследуемых средств в таких же дозах интактным крысам отмечается стимуляция когнитивных функций, увеличение двигательной активности, сохранение памятного следа в эксперименте.

На моделях гемической, гипобарической и тканевой гипоксий выявлена антигипоксическая активность ЭЛБС и «Тиреотона» в дозах мг/кг. Отмечается увеличение продолжительности жизни животных на 27% и 54% при гемической гипоксии, на 80% и в 2,3 раза – при гипобарической, на 20% и 29% - при тканевой гипоксиях соответственно.

При изучении противовоспалительной активности ЭЛБС и «Тиреотона» установлено, что в дозах 50 мг/кг при их курсовом введении per os животным на фоне острого асептического воспаления, вызванного введением формалина, угнетается развитие отека на 39% и 46% соответственно. При оценке антиэкссудативного действия на модели декстранового отека выявлено угнетение отека на 35% и 45% соответственно по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы животных.

При определении мембраностабилизирующей активности установлено, что при добавлении ЭЛБС и «Тиреотона» в инкубационную среду в концентрации 1 мг/мл, содержащую реактив Фентона, уменьшается выраженность перекисного гемолиза на 20% и 22% соответственно по сравнению с контрольными пробами.

В специальных сериях экспериментов установлена выраженная антирадикальная активность ЭЛБС и «Тиреотона» в отношении супероксидного радикала (IC50 - при 0,25мг/мл и 0,28мг/мл соответственно), радикала NO (IC 50 - при 0,15 мг/мл и 0,16 мг/мл соответственно), ионов Fe2+ (IC50 > 3,00 мг/мл и IC50 – 0,65 мг/мл соответственно). Показано, что содержание ТБК-активных продуктов в системе уменьшаются с увеличением концентрации ЭЛБС и «Тиреотона».

Таким образом, ЭЛБС и «Тиреотон» обладают ноотропной, антигипоксической, противовоспалительной, мембраностабилизирующей, антиоксидантной активностью.

Фармакотерапевтическая эффективность экстракта лапчатки белой сухого и «Тиреотона» при экспериментальном гипотиреозе Результаты исследований показали, что курсовое введение белым крысам линии Wistar мерказолила в дозе 10 мг/кг в течение 28 дней приводит к снижению уровня Т4 и Т3 на 43% и 15% соответственно и увеличению ТТГ в 6,0 раз по сравнению с показателями животных интактной группы. У животных контрольной группы на фоне увеличения массы тела в среднем на 45% по сравнению с таковой интактной группы крыс отмечается выраженная гиподинамия.

Курсовое введение животным опытных групп №1, №2, №3 и №4 ЭЛБС и «Тиреотона» в дозах 10 и 50 мг/кг на фоне экспериментального гипотиреоза приводит к повышению уровней тиреоидных гормонов в крови.

ЭЛБС в дозе 10 мг/кг в течение 21 дня повышает уровень гормона Т4 на 65%, при этом не оказывает влияния на содержание тиреотропного гормона (ТТГ) по сравнению с показателями контрольной группы. Курсовое введение крысам ЭЛБС в дозе 50 мг/кг приводит к повышению Т4 в 2,9 раза, Т3 - на 40%, при этом происходит уменьшение уровня ТТГ на 50% по сравнению с показателями в контрольной группе животных. Увеличение индекса дейодирования у животных данных опытных групп свидетельствует о подавлении периферической конверсии тироксина, причем на фоне введения ЭЛБС в дозе 50 мг/кг оно наиболее выражено.

Введение «Тиреотона» крысам перорально в дозе 50 мг/кг в течение дня сопровождается повышением уровня Т4 в крови крыс в 2,2 раза, Т3 – на 47%, при этом уровень ТТГ уменьшается на 50% по сравнению с данными контрольной группы. Индекс дейодирования составил 7,02, что практически соответствует индексу дейодирования интактных животных (7,12).

Препарат сравнения также оказывает влияние на выработку гормонов, увеличивая уровень Т4 и Т3 в 2,4 и в 1,7 раза соответственно и уменьшая ТТГ в 2,2 раза. На основании этого в дальнейших исследованиях использовали дозу 50 мг/кг для исследуемых экстрактов.

Как видно из таблицы 1, при введении мерказолила наблюдается изменение структуры щитовидной железы крыс (рис.2). Площадь тироцита в контроле в 4,6 раза больше аналогичного показателя интактных крыс. Так, суммарный объем фолликулярного эпителия значительно увеличивается за счет экстрафолликулярных тиреоидных клеток. Установлено увеличение числа митозов. Митозы в основном происходят в клетках экстрафолликулярных островков, которые, как известно, служат резервом для роста тиреоидной ткани. Митотический индекс (МИ) увеличивается в 4,8 раза по сравнению с данными интактной группы. Фолликулярноколлоидный индекс (ФКИ) увеличивается в 2,4 раза, что свидетельствует об увеличении активности щитовидной железы. Диаметр фолликулов уменьшается на 26%, количество коллоида снижается на 24%, высота тироцита увеличивается на 47% по сравнению с показателями интактной группы крыс (табл. 1). Аналогичная картина развития экспериментального гипотиреоза описана Б.В. Алешиным (1987), С.А. Степановым (1997), Ц.Д.

Жамсарановым (2007).

Влияние ЭЛБС и «Тиреотона» на морфометрические показатели щитовидной железы при экспериментальном гипотиреозе * - здесь и далее означает, что различия значимы по сравнению с данными в контрольной группе при Р0,05; ЭЛБС – экстракт лапчатки белой сухой, n – количество животных в группе.

В результате введения животным ЭЛБС в дозе 50 мг/кг по истечении 21 дня на гистологических срезах щитовидной железы опытной группы крыс (рис.4) отмечается уменьшение гиперпластических процессов в строме органа, коллоид приобретает более светлую окраску, однородную консистенцию. Средний диаметр фолликулов увеличивается на 42%, высота тироцитов при этом уменьшается на 47%, объем тироцита уменьшается на 65% по сравнению с данными показателями в контрольной группе. Также наблюдается уменьшение пролиферирующих тироцитов в строме органа, фолликулы приобретают округлую правильную или овальную форму.

Уменьшение митотического индекса в 1,8 раза по сравнению с контролем указывает на снижение экстрафолликулярной пролиферации тироцитов.

Индекс активности щитовидной железы и индекс Брауна приближается к таковым у интактной группы крыс.

В щитовидной железе экспериментальной группы крыс, получавших «Тиреотон» (рис.3) в дозе 50 мг/кг, отмечается ограничение разрастания стромы, укрупнение диаметра фолликулов на 46% за счет расширения внутрифолликулярных полостей, уменьшение средней высоты тироцита на 43%, средней площади тироцита - на 60%, чем в контрольной группе. Митотический индекс снижается в 1,7 раза по сравнению с контролем. Данные показатели приближаются к показателям щитовидной железы интактной крысы. Подобная картина наблюдается и у группы крыс, получавших ламинарию (рис.5).

Известно, что основной эффект тиреоидных гормонов связан с их влиянием на нейрональную передачу. Дефицит йода с гипофункцией щитовидной железы приводит к глубоким расстройствам высшей нервной деятельности, снижению интеллекта, нарушению поведенческих реакций, больные с гипотиреозом предрасположены к развитию депрессивных изменений настроения и тревожных расстройств (Brizzi G., 1997; Сапронов Н.С., 2002; Семенова Н.Б., 2005; Жуков А.О., 2007; Иванова Г.П., 2009), при этом симптомы психической депрессии выступают на первый план, появляясь за несколько лет до манифестации явной клинической картины гипотиреоза (Грекова Т.И., 2003; Demet M.M., 2003). Возможность влияния последствий экспериментального гипотиреоза и его коррекции ЭЛБС и «Тиреотоном» на нервную систему крыс изучали в тестах: «открытое поле»

(табл.2), «приподнятый крестообразный лабиринт», УРПИ.

Курсовое введение крысам в течение 21 дня ЭЛБС перорально в дозе 50 мг/кг приводит к увеличению горизонтальной и вертикальной активности в 8,0 и 3,0 раза соответственно, при введении «Тиреотона» - в 1,1 и 1,8 раза соответственно по сравнению с контролем. Появление исследовательской активности в сочетании с уменьшением актов груминга свидетельствует о более спокойном поведении животных. При введении ЭЛБС и «Тиреотона» наблюдается уменьшение актов дефекации на 24% и 20% соответственно, а в сочетании с возросшей двигательной активностью это позволяет сделать вывод о низком эмоциональном фоне крыс данных опытных групп по сравнению с показателями в контрольной группе.

Рис.1 Щитовидная железа Рис.2 Щитовидная железа гематоксилином и эозином. мерказолил в течение Рис.3 Щитовидная железа «Тиреотон» в течение 21 Рис.4 Щитовидная железа Увеличение об.40ок.10 гематоксилином и эозином.

Рис.5 Щитовидная железа крысы, получавшей ламинарию в течение 21 дня. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение об.40ок. Влияние ЭЛБС и «Тиреотона» на поведенческую активность крыс в тесте «открытое поле» при экспериментальном гипотиреозе Горизонт. 20,10 ± 4,25 2,00 ± 1,15 18,9 ± 3,02* 22,14 ± 3,30* 7,83 ± 2,50* актив-ть актив-ть рефлекс В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» изучали уровень тревожности животных. При курсовом введении ЭЛБС в дозе 50 мг/кг зарегистрировано уменьшение времени проведения в закрытом рукаве лабиринта на 14% по сравнению с данными в контрольной группе. Время пребывания в открытых рукавах и на центральной площадке приближается к таковым у интактной группы животных. При курсовом введении крысам «Тиреотона» в дозе 50 мг/кг в течение 21 дня, также выявлено уменьшение времени проведения животных в закрытых рукавах лабиринта на 19% по сравнению с контролем. Увеличивается время проведения в открытых рукавах и центральной площадке лабиринта.

В тесте УРПИ показано, что у крыс контрольной группы УРПИ не «вырабатывается». Курсовое введение белым крысам экстракта лапчатки белой и «Тиреотона» улучшает выработку УРПИ и способствует сохранению памятного следа, что проявляется в увеличении латентного периода захода животных в темный отсек камеры. При введении крысам экстракта лапчатки белой и «Тиреотона» в дозах 50 мг/кг латентный период увеличивается на 3 сутки наблюдения – в 2,3 и 2,7 раза, на 7 сутки – в 1,9 и 2,0 раза соответственно по сравнению с контролем. Данные показатели были аналогичными таковым у препарата сравнения.

Известно, что расстройства окислительно-восстановительных процессов усугубляют тяжесть течения гипотиреоза, формируя состояние оксидативного стресса (Левченко И.А., Фадеев В.В., 2002; Шакенов Д.И., 2005; Крюк Ю.Я., 2011). По мере прогрессирования гипотиреоза наблюдается смещение прооксидантно-антиоксидантного равновесия в сторону перекисного окисления липидов (Крюк Ю.Я., 2011). Тиреоидные гормоны в физиологических дозах обладают антиоксидантным эффектом, хотя и при их избытке прооксидантные процессы усиливаются (Будневский А.В., 2009).

У крыс контрольной группы отмечается повышение концентрации МДА на 37% и снижение активности ферментов антиоксидантной защиты:

СОД - в 2,7 раза и каталазы - на 27% по сравнению с данными интактной группы животных. Эти данные подтверждают, что при экспериментальном гипотиреозе усиливаются процессы свободнорадикального окисления биомакромолекул с накоплением в крови продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) (табл.3).

Влияние экстракта лапчатки белой сухого и «Тиреотона» на процессы ПОЛ и состояния антиоксидантной системы при экспериментальном усл.ед/мл При курсовом введении животным ЭЛБС в течение 21 дня уменьшается содержание МДА в сыворотке крови на 18%, наблюдается повышение активности ферментов эндогенной антиоксидантной защиты СОД на 43% и каталазы - на 23% по сравнению с показателями контрольной группы. При курсовом введении «Тиреотона» наблюдается снижение МДА на 21%, повышение СОД - в 2,1 раза и каталазы - в 1,3 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, ЭЛБС и «Тиреотон» оказывают выраженное тиреотропное действие, увеличивая уровни тиреоидных гормонов в сыворотке крови, восстанавливая структуру железы, способствуют увеличению исследовательской активности, снижению тревожности, улучшению когнитивных функций, а также стимулированию эндогенной антиоксидантной системы защиты организма при экспериментальном гипотиреозе.

Как известно, недостаток йода сопровождается развитием вторичных иммунодефицитов (Будневский А.В., 2009). При исследовании влияния ЭЛБС и «Тиреотона» на процессы антителообразования установлено, что данные средства восстанавливают показатели гуморального и клеточного иммунного ответа у мышей, а также увеличивают фагоцитарный индекс в условиях азатиоприновой иммуносупрессии (табл. 4). Так, при введении мышам ЭЛБС и «Тиреотона» на фоне иммуносупрессии наблюдали достоверное увеличение количества АОК в абсолютных значениях в 1,7 и 1,8 раза, соответственно, и при расчете на 106 спленоцитов - в среднем в 1, раза по сравнению с данными в контрольной группе.

Влияние ЭЛБС и «Тиреотона» на показатели основных звеньев иммунного ответа у мышей линии СВА и F1 (CBAC57B16) (Н2О), n= (азатиоприн+ Н2О), n= (азатиоприн + ЭЛБС), n= (азатиоприн+« Тиреотон»), n= При введении мышам ЭЛБС и «Тиреотона» на фоне иммунодепрессии наблюдали увеличение индекса реакции (ИР) ГЗТ в 2,6 и 2,3 раза, соответственно, по сравнению с контролем (тогда как введение азатиоприна приводит к снижению ИР ГЗТ на 50% по сравнению с тем же показателем в интактной группе).

При исследовании влияния ЭЛБС и «Тиреотона» на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов в отношении частиц коллоидной туши наблюдается увеличение фагоцитарного индекса в 1,6 и 2,2 раза, соответственно по сравнению с данными в контрольной группе (тогда как введение азатиоприна приводит к снижению фагоцитарного индекса на 32% по сравнению с тем же показателем в интактной группе животных) (табл.4).

Как известно, около 80% периферического дейодирования тироксина происходит в печени (Потемкин В.В., 1986; Балаболкин М.И., 1998;

Кубарко А.И., 1998; Дедов И.И., 2007). Для оценки влияния указанных средств на периферическое дейодирование тироксина воспроизведена модель патологии печени.

При интоксикации крыс тетрахлорметаном (CCl4) отмечается снижение содержания Т3 на 14% в сыворотке крови, что указывает на подавление периферического дейодирования тироксина (рис. 6).

При введении крысам ЭЛБС в дозе 50 мг/кг уровень Т3 увеличивается на 4,4% на 7 день эксперимента, на 23% - на 14 день, и на 20% - на 21 день.

При введении «Тиреотона» на 7, 14 и 21 дни эксперимента отмечается повышение Т3 на 2%, 19% и 17% соответственно по сравнению с показателями в контрольной группе животных. При интоксикации крыс CCl4 на 7 день отмечается снижение содержания общего белка на 28% по сравнению с показателями интактной группы крыс, а введение крысам ЭЛБС и «Тиреотона» на этом фоне сопровождается повышением уровня общего белка.

Рис. 6 Влияние экстракта лапчатки белой сухого и «Тиреотона» на периферическое дейодирование тироксина при повреждении печени CCl

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При коррекции экспериментального гипотиреоза ЭЛБС и созданным на его основе «Тиреотоном» в экспериментально-терапевтических дозах и 50 мг/кг отмечается достоверное увеличение уровней тиреоидных гормонов, в частности Т3 и Т4. Уровень ТТГ при этом уменьшается вдвое.

Происходит нормализация структуры щитовидной железы в виде снижения высоты тироцитов, уменьшения участков пролиферации, уменьшения среднего объема тироцитов и увеличения среднего диаметра фолликулов по сравнению с контролем. На основании полученных данных можно утверждать, что ЭЛБС и «Тиреотон» в дозе 50 мг/кг способны подавлять выработку тиреотропного гормона гипофиза крыс, что, очевидно, обусловлено входящими в состав экстракта лапчатки белой производных кофейной кислоты, в частности эллаговой. Производные кофейной кислоты способны связываться с ТТГ, обращая его неактивным (Алефиров А.Н., 2008). Очевидно, в малых дозах (10 мг/кг) экстракт лапчатки белой сухой оказывает влияние на уровне рецепторов к ТТГ, расположенных на базальной мембране тироцитов. В результате изменения структуры рецептора или его аффинности к ТТГ снижается чувствительность тироцита к действию ТТГ или же происходит снижение процессов, следующих после связывания гормонов с рецептором. Таким образом, ЭЛБС можно отнести к регуляторам гипофункционального состояния щитовидной железы.

Установлено, что ЭЛБС и в большей мере «Тиреотон» способны восстанавливать когнитивные функции у крыс на фоне экспериментального гипотиреоза, проявляющиеся в стимуляции ориентировочноисследовательской активности, ускорении выработки условных рефлексов и улучшении антиамнестической функции, уменьшении тревожности животных. Как показали наши исследования, выявленное иммуномодулирующее действие указанных средств, способствует восстановлению уровня тиреоидных гормонов в крови животных, которые, как известно, стимулируют антителогенез, нейтрофильный и макрофагальный фагоцитоз (Адамов А.К., 1968). При изучении влияния исследуемых средств на модели повреждения печени тетрахлорметаном отмечена тенденция к повышению уровня Т3 на 7й, 14-й и 21-й дни от начала эксперимента, что свидетельствует о восстановлении периферического дейодирования тироксина в печени.

Одним из ключевых моментов в их действии является обнаружение у экстрактов мембраностабилизирующих свойств, о чем свидетельствует повышение устойчивости мембран эритроцитов к повреждающему действию перекиси водорода. В основе механизма стабилизации мембран биологических клеток лежит наличие у исследуемых экстрактов способности подавлять процессы свободнорадикального окисления биомакромолекул, в частности липидов, и активизировать эндогенную систему антиоксидантной защиты. При этом антиоксидантная активность испытуемых средств подтверждена на модели экспериментального гипотиреоза и в опытах in vitro. Очевидно, что торможение свободнорадикальных процессов обеспечивается благодаря содержанию в составе указанных средств биологически активных веществ фенольной природы, которые обладают радикалперехватывающим действием, а также наличием аминокислот, минералов-«антиоксидантов» (Cu, Zn, Mn, Fe), витаминов, обладающих опосредованным антиокислительным действием (Барабой В.А., 1997; Зенков Н.К., 2001), с которыми также связано установленное выраженное противовоспалительное действие указанных средств. Наличие антигипоксической активности также вносит вклад в проявление фармакотерапевтического эффекта указанных средств (Хмельницкий О.К., 1999; Фадеев В.В., 2004; Петунина М.А., 2007).

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что экстракт лапчатки белой сухой и в большей степени «Тиреотон» оказывают выраженное тиреотропное действие, нормализуют морфофункциональное состояние щитовидной железы, а также оказывают комплексное воздействие на организм при гипотиреозе, влияя на основные патогенетические звенья заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Установлено тиреотропное, иммуномодулирующее, ноотропное, противовоспалительное, антиоксидантное, антигипоксическое, мембраностабилизирующее действие экстракта лапчатки белой сухого и «Тиреотона».

2. Экстракт лапчатки белой сухой и «Тиреотон» в экспериментальнотерапевтических дозах при курсовом введении крысам повышают функциональную активность щитовидной железы и восстанавливают ее морфофункциональное состояние при экспериментальном гипотиреозе.

3. Экстракт лапчатки белой сухой и в большей степени «Тиреотон»

стимулируют когнитивные функции у животных, что выражается в активации ориентировочно-исследовательской реакции, ускорении выработки условных рефлексов и сохранении следа памяти в отдаленные сроки после обучения, а также способствуют уменьшению тревожности крыс при экспериментальном гипотиреозе.

4. «Тиреотон» при экспериментальном гипотиреозе обладает более выраженным фармакотерапевтическим влиянием, чем экстракт лапчатки белой сухой, благодаря входящим в его состав экстрактам шлемника байкальского и родиолы розовой.

5. Основным механизмом фармакотерапевтического влияния экстракта лапчатки белой сухого и «Тиреотона» являются их способности активировать продукцию гормонов щитовидной железы при экспериментальном гипотиреозе на фоне мембраностабилизирующего, противовоспалительного действия, связанных с торможением процессов свободнорадикального окисления биомакромолекул, а также наличием выраженных иммуномодулирующих и ноотропных свойств.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Водопьянова А.М. Определение острой токсичности Potentilla alba L. / А.М. Водопьянова, Э.В. Архипова, Э.А. Алексеева, Л.Н. Шантанова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2009. - № 2 (66). – С.234-235.

2. Архипова Э.В. Тиреотропное действие экстракта Potentilla alba L. / Э.В. Архипова, А.М. Водопьянова, А.И. Мешков, В.К. Колхир // Сборник материалов конференции «Развитие традиционной медицины в России». – Улан-Удэ, 2010.- С.324.

3. Архипова Э.В. Влияние экстракта лапчатки белой на течение экспериментального гипотиреоза /Э.В. Архипова, А.М. Водопьянова, В.К.

Колхир // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН.- 2011.- №1 (77).- С. 116-118.

4. Архипова Э.В. Влияние экстракта лапчатки белой и «Тиреотона»

на функциональное состояние центральной нервной системы у крыс / Э.В.

Архипова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН.- 2011.- № 1 (77).- С.113-115.

5. Водопьянова А.М. Лапчатка белая как перспективное средство для лечения заболеваний щитовидной железы / А.М. Водопьянова, Э.В.

Архипова, Л.Н. Шантанова, С.М. Николаев // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН.С. 131-134.

6. Хобракова В.Б. Влияние сухого экстракта лапчатки белой на состояние клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа / В.Б.

Хобракова, Э.В. Архипова, А.М. Водопьянова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН.- 2011.- №1 (77).- С. 195-197.

7. Хобракова В.Б. Иммуномодулирующие свойства экстракта лапчатки белой и созданного на его основе «Тиреотона» / В.Б. Хобракова, Э.В. Архипова // Сибирский медицинский журнал. – 2011. - №7. – С. 121Архипова Э.В. Иммуномодулирующие свойства экстракта лапчатки белой и полученного на его основе лекарственного средства «Тиреотон» / Э.В. Архипова, В.Б. Хобракова // Медицинская иммунология.Т.13.- №4-5.- С.515-516.

9. Arkhipova E.V. The influence of extracts of cinquefoil white and “Thyreoton” on the functional status of central nervous system of rats / E.V.

Arkhipova, S.M. Nikolaev // Abstracts of 5th International symposium on present situation and future development of Mongolian traditional medicine. – Ulaanbaatar, 2011. - P.45.

10.Arkhipova E.V. The potentional source for treatment of thyroid gland’s diseases is cinquefoil white (Potentilla alba L.) / E.V. Arkhipova, A.M.

Vodopyanova, S.M. Nikolaev, V.K. Kolkhir // Мэс засал. - 2011.-№ 13. - Р.140.

11.Архипова Э.В. Влияние экстракта лапчатки белой при гипотиреоидном состоянии у крыс / Э.В. Архипова, А.М. Водопьянова, С.М. Николаев, В.К. Колхир // Тезисы докладов II междунар. научной конференции «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии».

- Улан-Удэ, 2011. – С.59.

12.Архипова Э.В. Влияние экстракта лапчатки белой и «Тиреотона»

на функциональное состояние ЦНС крыс / Э.В. Архипова, А.М.

Водопьянова, С.М. Николаев // Мат-лы III междунар. науч.-практич.

конферен. «Экология, здоровье, спорт». – Чита, 2011. – С.93.

13.Архипова Э.В. Влияние экстракта лапчатки белой сухого на экспериментальном гипотиреозе / Э.В. Архипова, В.К. Колхир, С.М.

Николаев, Н.С. Кухаренко, С.М. Гуляев, И.М. Дамбаева // Вестник БГУ.

Серия 12: Медицина, фармация. – 2012. – С.121-125.

14.Колхир В.К. Влияние экстракта лапчатки белой сухого и «Тиреотона» на течение экспериментального гипотиреоза / В.К. Колхир, Э.В. Архипова, И.М. Дамбаева // XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». – Москва, 2012. – С.201.