На правах рукописи

Коломин Тимур Александрович

ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО РЕГУЛЯТОРНОГО

ПЕПТИДА СЕЛАНК НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ

В МОЗГЕ И СЕЛЕЗЁНКЕ

03.01.03 – Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук доктор биологических наук, профессор

Научный руководитель:

Сломинский Пётр Андреевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Брага Элеонора Александровна ФГУП «ГосНИИгенетика»

доктор биологических наук, профессор Шишкин Сергей Сергеевич Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук Федеральное государственное бюджетное

Ведущая организация:

учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН)

Защита диссертации состоится «_» _ 2012 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: ГСП-1, 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Автореферат разослан «»_2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук А.М. Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы В настоящее время в медицинской практике для профилактики и лечения различных заболеваний применяется множество лекарственных средств разной природы. Но, несмотря на огромное количество разработанных лекарственных препаратов, проблема лечения многих из ныне существующих заболеваний остаётся нерешённой. В связи с этим одной из важнейших задач молекулярной биологии является разработка и изучение механизма действия новых лекарственных препаратов, которые окажутся более эффективными по сравнению с существующими продуктами фармации. На данный момент одним из ведущих направлений разработки лекарственных препаратов является использование соединений на основе природных регуляторных пептидов, которые с одной стороны оказывают направленное воздействие на организм, а с другой практически не имеют побочных эффектов. Синтетические регуляторные пептиды обладают широким спектром клинического действия, однако до настоящего времени точный механизм их действия на организм остаётся неясным. Поэтому изучение механизма действия синтетических регуляторных пептидов является одной из наиболее актуальных задач современной молекулярной биологии. В данном контексте большой интерес для изучения представляет изменение экспрессии генов, функционирующих в здоровом организме и реагирующих в ответ на различные физиологические воздействия.

К числу лекарственных препаратов на основе природных регуляторных пептидов относится разработанный в Институте молекулярной генетики РАН в сотрудничестве с НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН и недавно вошедший в клиническую практику в качестве анксиолитического и нооторопного средства пептидный препарат селанк. Селанк является синтетическим аналогом тафтцина – короткого фрагмента Thr-Lis-Pro-Arg тяжёлой цепи иммуноглобулина G человека, удлинённого с С-концевой части молекулы трипептидом Pro-Gly-Pro для повышения метаболической стабильности и продолжительности действия пептида. В клинике было показано, что данный препарат эффективно купирует чувство тревоги и страха и наряду с этим обладает ноотропным действием, оказывая позитивное влияние на формирование памяти и процессы обучения. Благодаря наличию данных свойств, селанк приобрёл широкое применение в лечении и профилактике стрессовых и тревожных состояний, генерализованных тревожных расстройств и неврастении, а также в качестве стимулирующего средства при повышенных психоэмоциональных нагрузках. В исследованиях in vitro и in vivo было показано, что селанк также обладает выраженными противовирусными свойствами в отношении вирусов гриппа А человека, вируса простого герпеса, цитомегаловируса и др.

Ранее было установлено, что пептидные препараты способны изменять экспрессию генов. Так, семакс, синтетический аналог фрагмента АКТГ4-7, обладающий выраженным ноотропным и нейропротективным действием, способствует повышению экспрессии нейротрофинов как на уровне белка, так и на уровне мРНК. В отношении селанка подобные исследования практически не проводились, и, несмотря на имеющиеся сведения о его способности оказывать действие на экспрессию мРНК гена Bdnf в мозге крысы, механизм действия пептида пока остаётся неясным. Кроме того, исследования деградации селанка в плазме крови и мозге крысы, а также выявление самостоятельных эффектов его фрагментов, ставит вопрос о влиянии на экспрессию генов каждого из них в отдельности.

Цели и задачи исследования транскрипционный профиль клеток мозга и селезёнки крыс и мышей. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение транскрипционного профиля клеток гиппокампа крысы с использованием технологии кДНК-микрочипов.

Отбор генов с наиболее значительным изменением экспрессии мРНК в гиппокампе крысы после однократного и курсового введения селанка и анализ экспрессии отобранных генов в лобной коре, мозжечке и селезёнке крысы.

Анализ экспрессии генов, вовлечённых в процессы воспаления, в селезёнке мыши через 6 и 24 часа после введения селанка и трёх его фрагментов – тафтцина, Arg-Pro-Gly-Pro (ArgPGP) и дипептида Gly-Pro (GP) и отбор генов с наиболее значительным изменением экспрессии.

Анализ временной динамики экспрессии гена Bcl6, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка BCL6 в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов.

Научная новизна и практическая значимость работы Показано, что однократное и курсовое введение селанка приводит к широкомасштабному изменению транскрипционного профиля клеток гиппокампа крысы. Большинство генов, уровень мРНК которых изменился более чем в 2 раза, кодируют белки, ассоциированные с плазматической мембраной (в том числе трансмембраннные белки). Это позволяет говорить о наличии у селанка способности регулировать ионный гомеостаз клеток гиппокампа и, тем самым, модулировать на молекулярно-генетическом уровне различные ион-зависимые процессы, к которым относятся процессы обучения и формирования памяти.

Показано, что как однократное, так и курсовое введение селанка приводит к изменению в экспрессии генов Actn1, Cx3cr1, Fgf7, Ptprn2 и Slc6a в гиппокампе крысы. Действие селанка на экспрессию данных генов носит тканеспецифичный характер, при этом наиболее близкий паттерн изменения экспрессии их мРНК наблюдается в лобной коре и мозжечке. Наиболее сильный ответ отобранных генов был отмечен в селезёнке после однократного введения селанка.

Показано, что селанк и его фрагменты (тафтцин, ArgPGP и GP) изменяет экспрессию мРНК генов цитокинов, хемокинов, их рецепторов и некоторых других генов, вовлечённых в процессы воспаления, в селезёнке мыши. При этом наибольшее количество генов изменили экспрессию после введения дипептида GP.

мультинаправленное действие на динамику экспрессии гена Bcl6, который играет ведущую роль в формировании и развитии иммунной системы, а также на динамику экспрессии генов-мишеней и генов-корепрессоров белка BCL6.

Полученные результаты позволяют расширить представления о механизме действия синтетического регуляторного пептида селанк на уровне транскрипции генов и объяснить некоторые аспекты клинического действия этого пептида с молекулярно-генетической точки зрения. Быстрое и мощное действие селанка и его фрагментов на экспрессию генов, вовлечённых в процессы воспаления, даёт основания предложить этот пептид в качестве иммуномодулирующего средства для профилактики и лечения вирусных и бактериальных инфекций разных типов.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них статьи и 5 сообщений в материалах тезисов научных конференций и симпозиумов.

Апробация диссертации Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих конференциях и конгрессах: конференции Европейского Общества Генетики Человека (ESHG) в 2009 и 2010 гг., VI Съезд Российского общества медицинских генетиков (14-18 мая 2010 г., Ростов-на-Дону, Россия), Седьмой Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (3-13 июня 2011 г., Судак, Крым, Украина).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов исследования, заключение, выводы и библиографический указатель. Список литературы состоит из источников, среди которых 79 источников отечественной и 193 источников зарубежной литературы. Диссертация содержит 8 таблиц и 11 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования На первом этапе исследования проводили оценку влияния однократного и курсового введения селанка на экспрессию генов в мозге и селезёнке крысы. В эксперименте использовали самцов крыс линии Вистар со средней массой 260 г., содержавшихся в виварии со свободным доступом к воде и пище и 12-ти часовым циклом освещения. Все крысы (n=24) были разделены на 3 группы:

контрольную (К) и группы однократного (ОВ) и курсового (КВ) введения по особей в каждой. В течение 5 суток животным из групп К и ОВ один раз в сутки интраназально вводили дистиллированную воду, животным из группы КВ – водный раствор селанка (200 мкг/кг). На шестые сутки животным из группы ОВ вводили водный раствор селанка (200 мкг/кг). Спустя час животных всех групп декапитировали и выделяли ткани мозга (гиппокамп, лобная кора и мозжечок) и селезёнки. Суммарную РНК из полученных тканей выделяли с использованием набора Promega RNAgents® Total RNA Isolation System (Promega, США). На основе полученной из ткани гиппокампа РНК синтезировали меченную флуоресцентными красителями (Cy3 и Су5) кДНК, которая затем подвергалась гибридизации на микроматрице SBC-R-RC-100- Rat 12K expression cDNA array (V1.3) (Shanghai BioChip, Китай). В состав микроматрицы вошли 11060 последовательностей транскриптома крысы (известные гены, EST-последовательности). Массив генов, изменивших экспрессию в 2 или более раз после введения селанка, анализировали с использованием Интернет-ресурса Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) V6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) с целью установления их структурно-функциональных связей.

Анализ относительной экспрессии генов Actn1, Cx3cr1, Fgf7, Ptprn2, Slc6a20 и гена сравнения Rpl3 проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием набора для синтеза первой цепи кДНК RevertAid™H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва), реактивов для ПЦР (Синтол, Россия) и коммерческих праймеров RT2 qPCR Primer Assay SYBR® Green (SABioscience, США).

На втором этапе исследования проводили оценку влияния селанка и трёх его фрагментов (тафтцина, ArgPGP и GP) на экспрессию генов, вовлечённых в процессы воспаления, в селезёнке мыши через 6 и 24 часа после введения пептидов. В эксперименте использовали самцов белых мышей со средней массой 20 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Всех мышей (n=100) разделили на 4 группы – 2 контрольные (n1=10; n2=10) и экспериментальные (n1=40; n2=40) для 6- и 24-часовой временных точек.

Каждая экспериментальная группа делилась на 4 подгруппы в соответствии с вводимым пептидом по 10 особей в каждой. Животным из экспериментальных групп путём внутрибрюшинной инъекции однократно вводили раствор селанка или его фрагментов (100 мкг/кг), контрольным животным – эквивалентный объем физиологического раствора. Через 6 и 24 часа мышей декапитировали и выделяли ткань селезёнки. Суммарную РНК выделяли с использованием набора RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Израиль).

Анализ относительной экспрессии генов, вовлечённых в процессы воспаления, проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени на панели RT2Profile PCR Array (SABiosciences, США), которая содержала праймеры для 84 генов.

На третьем этапе исследования анализировали временную динамику экспрессии гена Bcl6, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка BCL6 в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов. В эксперименте использовали самцов белых мышей со средней массой 20 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Всех мышей (n=150) разделили на 6 групп – контрольные (n1=10; n2=10; n3=10) и 3 экспериментальные (n1=40; n2=40; n3=40) по числу временных точек (30 мин, 90 мин и 3 ч). Каждая экспериментальная группа делилась на 4 подгруппы в соответствии с вводимым пептидом по особей в каждой. Животным из экспериментальных групп путём внутрибрюшинной инъекции однократно вводили раствор селанка или его фрагментов (100 мкг/кг), контрольным животным – эквивалентный объем физиологического раствора. Через 30 мин, 90 мин и 24 часа мышей декапитировали и выделяли ткань селезёнки. Суммарную РНК выделяли с использованием набора RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Израиль).

Анализ относительной экспрессии гена Bcl6, генов-мишеней (Ccnd1, Ccnd2, Cd44, Cd69, Stat1) и генов-корепрессоров (Bcor, Ncor1 и Ncor2) белка BCL6, а также генов сравнения (Gapdh, Hprt1 и Hsp90ab1) проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени.

использованием программного обеспечения Relative Expression Software Tool 384 (REST-384©) v.2 (Pfaffl et al., 2001, 2002, 2004).

Результаты исследования Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение транскриптома клеток гиппокампа крысы с использованием кДНК-микрочипов Использование кДНК-микрочиповых технологий в экспрессионном анализе позволяет проводить быструю и широкомасштабную оценку изменения транскрипционного профиля клеток. Особенно часто данные технологии применяются при оценке влияния фармакологических препаратов разной природы на изменение экспрессии генов. В настоящей работе был проведён анализ влияния однократного и курсового введения селанка на экспрессию 11060 известных последовательностей транскриптома крысы в гиппокампе здоровых животных с использованием микроматриц SBC-R-RC-100-13 Rat 12K expression cDNA array. Было показано, что после однократного введения селанка более чем в 2 раза изменился уровень мРНК 36 генов (Рис. 1А), после курсового введения – 20 генов (Рис.1Б).

Рисунок 1. Относительное изменение уровня мРНК генов в гиппокампе